專利名稱：磷酸激酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的具有抗腫瘤功能的磷酸激酶-RX238蛋白以及編碼RX238蛋白的多核苷酸。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和蛋白質(zhì)的制法和用途，以及含該RX238蛋白的組合物。
背景技術(shù)：
“高質(zhì)量”的藥物靶點(diǎn)基因(簡稱藥靶)是新藥開發(fā)的源頭。人類基因組計(jì)劃的完成雖然為人類帶來了治療疾病的令人向往的前景，但除大分子蛋白藥外，基因本身并不一定是藥靶。從基因到新藥，這一鏈條仍然缺少許多必不可少的環(huán)節(jié)。其中，基因功能研究，因其可以在分子層面上揭示人類健康和疾病的奧秘，尋找出最重要的致病基因，而成為確定基因能否成為藥靶的關(guān)鍵步驟。
國外大型制藥廠已發(fā)現(xiàn)，單靠基因序列數(shù)據(jù)和生物信息分析雖然能夠找到大量潛在藥物靶點(diǎn)基因，但這類基因只能被歸類為“低質(zhì)量”藥靶。藥物開發(fā)人員面對數(shù)目巨大的低質(zhì)量藥靶變得無所適從，迫切需要大量的基因功能研究加以驗(yàn)證，才能篩選出新藥開發(fā)可以依賴的“高質(zhì)量”靶點(diǎn)。所以，功能基因組學(xué)研究蘊(yùn)藏著巨大的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)前景。
在目前可以作為靶點(diǎn)的5,000個(gè)基因中，磷酸激酶(kinase)的序列有很大的保守性，是公認(rèn)的藥物篩選基因靶點(diǎn)，與磷酸酶(phosphatase)、蛋白酶(protease)以及各類受體統(tǒng)稱為一類靶點(diǎn)。磷酸激酶(kinase)將ATP或GTP位的磷酯基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上，催化蛋白質(zhì)磷酸化。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)其功能/活性的一種重要方式。如MAPK和轉(zhuǎn)錄因子CREB，Jun等，在磷酸化狀態(tài)時(shí)具有活性，而在非磷酸化狀態(tài)時(shí)沒有活性；而轉(zhuǎn)錄因子IκBα等則相反，在磷酸化狀態(tài)時(shí)沒有活性，而在非磷酸化狀態(tài)時(shí)具有活性。
目前已發(fā)現(xiàn)的磷酸激酶的種類較多，但已知的人磷酸激酶的種類很少。由于磷酸激酶與多種生理活動(dòng)如細(xì)胞分裂等密切相關(guān)，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的磷酸激酶及其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的磷酸激酶-RX238蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)的方法以及該蛋白質(zhì)和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的RX238蛋白，它選自下組具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或其具有激酶活性的保守性變異蛋白質(zhì)、活性片段、或活性衍生物。
較佳地，該蛋白質(zhì)選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(如1-10，較佳地1-8個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有磷酸化功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，該蛋白具有SEQ ID NO2氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼上述的RX238蛋白。
較佳地，所述的多核苷酸多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。更佳地，該多核苷酸含有SEQ ID NO1中1-1038位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有上述編碼RX238蛋白的多核苷酸，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種蛋白質(zhì)的制備方法，該方法包含步驟(a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞；(c)從培養(yǎng)物中分離出蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種能與上述的RX238蛋白特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種組合物(如藥物組合物)，它含有安全有效量的上述的RX238蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種RX238蛋白的用途，它被用作依賴于細(xì)胞周期蛋白H的特異性磷酸激酶。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1顯示了RX238的部分結(jié)構(gòu)，其中SEQ ID NO2的第10-33位的氨基酸IGEGAHGIVFKAKHVETGEIVALK構(gòu)成ATP結(jié)合位點(diǎn)，第4-288位氨基酸構(gòu)成激酶結(jié)構(gòu)域。
圖2顯示了RX238和細(xì)胞周期蛋白H(cyclin H)之間存在著相互作用。其中，在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染1)flag-RX238和myc-CyclinH；2)flag-RX238和myc-P21。Flag-RX238、myc-CyclinH和myc-P21蛋白表達(dá)情況良好、表達(dá)量穩(wěn)定。細(xì)胞提取物用anti-myc抗體和Protein G免疫沉淀后，共沉淀產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，分別用酶標(biāo)anti-flag抗體行蛋白免疫印跡雜交。可以看見RX238和Cyclin H之間有相互作用(泳道1)，而RX238和P21之間無相互作用(泳道2)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，首次分離出了新的人磷酸激酶RX238的全長cDNA，其編碼含346個(gè)氨基酸的RX238蛋白。RX238蛋白含有磷酸激酶的結(jié)構(gòu)域，磷酸化實(shí)驗(yàn)證實(shí)RX238確是磷酸激酶。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了RX238和Cyclin H之間確實(shí)具有直接的相互作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語“磷酸激酶RX238”“RX238蛋白”或“RX238多肽”可互換使用，都指基本上具有RX238蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2)的多肽或蛋白質(zhì)。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的RX238蛋白。這些術(shù)語還包括含有或不含有信號肽的RX238蛋白。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和蛋白質(zhì)是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或蛋白質(zhì)如從天然狀態(tài)中與存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化。
如本文所用，“分離的RX238多肽蛋白質(zhì)基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)(尤其是FPLC)分離純化出RX238蛋白。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是重組蛋白質(zhì)、天然蛋白質(zhì)、合成蛋白質(zhì)，優(yōu)選重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括RX238蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然RX238蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的蛋白質(zhì)，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的蛋白質(zhì)，或(iii)成熟蛋白質(zhì)與另一個(gè)化合物(比如延長蛋白質(zhì)半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白質(zhì)，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白質(zhì)序列而形成的蛋白質(zhì)(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此蛋白質(zhì)的序列或酶原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“RX238蛋白”指具有RX238蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括具有與RX238蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸殘基如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸殘基取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括RX238蛋白的活性片段和活性衍生物。
該蛋白質(zhì)的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體(SEQ ID NO6和8所示的天然變異體)、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與RX238DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)以及利用抗RX238蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了其他蛋白質(zhì)，如包含RX238蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的蛋白質(zhì)外，本發(fā)明還包括了RX238蛋白序列的可溶性片段。通常，該片段具有RX238蛋白序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
發(fā)明還提供RX238蛋白的類似物。這些類似物與天然RX238蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白質(zhì)包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的蛋白質(zhì)并不限于上述例舉的代表性的蛋白質(zhì)。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的蛋白質(zhì)的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白質(zhì)的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。這種修飾可以通過將蛋白質(zhì)暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明中，“RX238保守性變異蛋白質(zhì)”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸殘基所替換而形成蛋白質(zhì)。這些保守性變異蛋白質(zhì)最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1


本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟蛋白質(zhì)的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟蛋白質(zhì)的多核苷酸包括只編碼成熟蛋白質(zhì)的編碼序列；成熟蛋白質(zhì)的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟蛋白質(zhì)的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸”可以是包括編碼此蛋白質(zhì)的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的蛋白質(zhì)的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少60％，較佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％同源性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的同源性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2所示的成熟蛋白質(zhì)有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼RX238蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的蛋白質(zhì)和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的RX238核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。也可直接通過RT-PCR的方法擴(kuò)增得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白質(zhì)序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或RX238蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的RX238蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼RX238蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，RX238蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含RX238蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法原生質(zhì)體法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的蛋白質(zhì)。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白質(zhì)。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白質(zhì)沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的RX238蛋白有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)用于篩選促進(jìn)或?qū)筊X238蛋白功能的抗體、蛋白質(zhì)或其它配體。用表達(dá)的重組RX238蛋白篩選蛋白質(zhì)庫可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激RX238蛋白功能的蛋白質(zhì)分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對RX238編碼DNA或是其片段編碼的蛋白質(zhì)具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于RX238蛋白或片段。較佳地，指那些能與RX238蛋白或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制RX238蛋白的分子，也包括那些并不影響RX238蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的RX238蛋白結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的RX238蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)RX238蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用RX238蛋白的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用蛋白質(zhì)合成儀合成。與RX238蛋白的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
利用本發(fā)明RX238蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與RX238蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。通常，建立適用于高通量篩選的分子和細(xì)胞水平篩選模型并進(jìn)行高通量篩選等相關(guān)研究工作。應(yīng)用E.coli或Baculovirus表達(dá)系統(tǒng)，克隆與表達(dá)RX238蛋白或其活性片段，分離純化重組蛋白，并應(yīng)用這些重組的RX238蛋白，建立適用于高通量篩選的分子水平篩選模型。通過對大量來源于傳統(tǒng)中草藥的粗提物和純化合物的篩選，尋找有效的活性部位或純化合物。活性指導(dǎo)從有效的活性部位中分離單體。應(yīng)用高通量篩選獲得小分子抑制劑，檢測對RX238抑制效果，確定小分子抑制劑對RX238的特異性。并應(yīng)用高通量篩選獲得的小分子抑制劑檢測細(xì)胞水平抑制效果。
本發(fā)明RX238蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、或拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明RX238蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這些組合物可用于抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1納克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的RX238蛋白施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約1微克/天，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約1微克/天-約0.5毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
一種檢測樣品中是否存在RX238蛋白的方法是利用RX238蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與RX238蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在RX238蛋白。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的RX238是一種新的磷酸激酶，與Cyclin H有相互作用，因此可作為藥物靶點(diǎn)進(jìn)行小分子化合物的篩選，建立針對RX238的藥物篩選模型，尋找能調(diào)節(jié)RX238激酶活性的小分子化合物，為疾病的診斷、治療帶來新途徑。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1、RX238基因的篩選從已建立的由Genbank中的EST序列合成、沒有任何功能注釋或注釋不完全的“新”基因的cDNA文庫中，應(yīng)用現(xiàn)代生物信息學(xué)PFAM/Profile模式對磷酸激酶、磷酸酶、蛋白酶、單過膜受體進(jìn)行優(yōu)先篩選，預(yù)測到一個(gè)新的沒有任何功能注釋的基因，含有磷酸激酶結(jié)構(gòu)域，命名為RX238。
實(shí)施例2、RX238基因的獲得為了獲得RX238基因的全長，合成如下引物，以常規(guī)方法抽提的人體組織混合RNA為模板，通過常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。
上游引物5’GGCCAATCCGGCCATGGACCAGTACTGCATCCTGGGCC 3’(SEQ IDNO3)下游引物5’GGCCTCTAAGGCCTCACCCCTCCAGGATGAAGGGCC 3’(SEQ ID NO4)該對引物含有SfiI穿梭克隆位點(diǎn)、起始密碼子和終止密碼子，在該酶切位點(diǎn)之間是RX238的編碼序列；利用該對引物PCR擴(kuò)增獲得了三個(gè)大小不同的條帶，將此片段回收、克隆入載體后測序得到RX238基因的三個(gè)不同剪切體的序列，分別命名為RX238-3、RX238-14、RX238-15，其長度分別為843、1064、1041bp(SEQ ID NO5，7，1)。
實(shí)施例3、RX238序列分析和定位所克隆的三個(gè)不同剪切體序列中都包含完整編碼區(qū)，其中1041bp的序列編碼最長的346個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。其中，第10-33位的氨基酸IGEGAHGIVFKAKHVETGEIVALK構(gòu)成ATP結(jié)合位點(diǎn)，4-288位氨基酸構(gòu)成激酶結(jié)構(gòu)域(圖1)。根據(jù)RX238的EST信息，將其定位于人染色體9q22.2。
此外，843bp的序列(SEQ ID NO5)編碼280個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(SEQ IDNO6)。1064bp的序列(SEQ ID NO7)編碼239個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(SEQ IDNO8)，這兩個(gè)蛋白也含有ATP結(jié)合位點(diǎn)。
實(shí)施例4、篩選與RX238相互作用的蛋白在本實(shí)施例中，采用Clontech公司的Gal4酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行篩選，確定與RX238具有相互作用的蛋白。方法如下將測序驗(yàn)證的RX238基因的三個(gè)剪切體通過SfiI克隆位點(diǎn)穿梭轉(zhuǎn)移到融合質(zhì)粒pGBKT 7載體(購自Clontech公司，參見US6770446，US6376652)上，以此作為誘餌(bait)，先后通過轉(zhuǎn)化法(transformation)和點(diǎn)陣法(mating)對Hela、淋巴和胎腦文庫進(jìn)行大規(guī)模的篩選。
其中RX238-15用兩種方法均獲得了Cyclin H陽性克隆，即酵母雙雜交方法篩選出與RX238-15具有相互作用的蛋白Cyclin H，然而其他兩種剪切形式與Cyclin H均不能發(fā)生相互作用。
RX238-15核苷酸序列推導(dǎo)的蛋白序列(SEQ ID NO2)與CDK7蛋白質(zhì)序列的有一定同源度(39.4％)，本實(shí)施例用酵母雙雜交方法篩選到了CyclinH，表明RX238是一種與細(xì)胞周期蛋白相互作用的激酶。此外，結(jié)構(gòu)域分析表明它是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)。
以前的研究結(jié)果表明，Cyclin和特定的CDK相結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞周期。因此，這提示，RX238極有可能是一個(gè)尚未被發(fā)現(xiàn)的活性和Cyclin H相關(guān)的CDK家族的一員。
為了進(jìn)一步確定與RX238對應(yīng)的特異性細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)，又進(jìn)一步在酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證了RX238是否與其余的Cyclin有相互作用。即將已知的Cyclin A，Cyclin B，Cyclin C，Cyclin D1，Cyclin D2，Cyclin D3，Cyclin E1，CyclinE2，Cyclin F，Cyclin G，Cyclin I，Cyclin K等編碼細(xì)胞周期蛋白的基因通過SfiI克隆位點(diǎn)穿梭轉(zhuǎn)移到融合質(zhì)粒pACT2載體(購自Clontech公司，US6770446)上，然后與誘餌質(zhì)粒pGB-RX238共同轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，待長出克隆后檢測報(bào)告基因LacZ的表達(dá)情況，據(jù)此判斷RX238與其是否有相互作用。
結(jié)果表明RX238只和Cyclin H有相互作用，這證明Cyclin H是RX238的特異性周期蛋白。
實(shí)施例5、用免疫共沉淀法驗(yàn)證RX238與Cyclin H在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的相互作用由于酵母雙雜交系統(tǒng)本身可能產(chǎn)生假陽性，因此利用免疫共沉淀技術(shù)(Coimmunoprecipitation，Co.IP)進(jìn)一步在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中驗(yàn)證RX238和CyclinH的關(guān)系。
用常規(guī)方法在pcDNA3.1(Invitrogen公司)的多克隆位點(diǎn)中添加SfiI位點(diǎn)，在分別將flag-tag和myc-tag引入SfiI位點(diǎn)N端，獲得分別帶有上述tag的pcDNA3.1載體。將PCR擴(kuò)增的RX238(實(shí)施例2)和Cyclin H基因通過SfiI位點(diǎn)分別克隆入已構(gòu)建好的帶有flag-tag和myc-tag的pcDNA3.1真核表達(dá)載體。用上述重組載體轉(zhuǎn)染常規(guī)的293T細(xì)胞。培養(yǎng)24小時(shí)后，離心收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液裂解后，離心收集上清上樣。分別利用anti-flag和anti-myc的單克隆抗體(購自Sigma公司)，通過Western印跡法檢測RX238和Cyclin H蛋白的表達(dá)情況。
結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，RX238和Cyclin H蛋白表達(dá)情況良好、表達(dá)量穩(wěn)定。
在本實(shí)施例所選用的免疫共沉淀系統(tǒng)中，Cyclin H蛋白通過anti-myc的單克隆抗體與Protein-G珠結(jié)合，而用于顯色的酶標(biāo)二抗(anti-flag HRP)與帶有flag-tag的RX238蛋白結(jié)合。RX238蛋白只有在能與Cyclin H蛋白相互作用、形成緊密復(fù)合體的情況下，才能在實(shí)驗(yàn)過程中的充分洗滌后，仍存在于beads上，從而被HRP催化的顯色反應(yīng)檢測到。簡言之，只有當(dāng)RX238和Cyclin H蛋白相互作用、結(jié)合時(shí)，免疫共沉淀反應(yīng)才有條帶出現(xiàn)，呈陽性結(jié)果。從圖2的第三張圖可以看出，RX238蛋白和不相關(guān)蛋白-P21(第2泳道)顯色后均無條帶出現(xiàn)；而RX238和Cyclin H蛋白同時(shí)存在的第1泳道，顯色后有明顯的蛋白條帶出現(xiàn)。即免疫共沉淀反應(yīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中驗(yàn)證了RX238與Cyclin H確實(shí)具有相互作用，排除了酵母雙雜交結(jié)果是假陽性的可能。
因此，酵母雙雜交和免疫共沉淀共同證明了，與RX238具有直接相互作用的細(xì)胞周期蛋白是Cyclin H。
實(shí)施例6.RX238的磷酸化作用在本實(shí)施例中，通過體外自身磷酸化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RX238確實(shí)具有激酶的磷酸化功能。
首先用常規(guī)的定點(diǎn)誘變法構(gòu)建了RX238將SEQ ID NO1中第436、437位A、A分別置換為G、C，從而獲得ATP結(jié)合位點(diǎn)中第146位K→A的突變型RX238(RX238mut)，將RX238及其突變型都構(gòu)建到帶有Flag-tag的pcDNA3真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。培養(yǎng)24小時(shí)后，裂解細(xì)胞，收集上清。用帶有anti-flag抗體的Protein G免疫沉淀后，取一半用于Western印跡法以鑒定RX238的表達(dá)；另一半用激酶反應(yīng)緩沖液(20mM Tris/HCL pH＝7.4，150mM NaCl，10mM MnCl2，50μM ATP，10mM MgCl2)平衡，然后加入10μCiγ-32P ATP，于30℃反應(yīng)30min。加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液，95℃變性5min后，離心將樣品加入15％SDS-PAGE梯度膠電泳。電泳完畢，經(jīng)干膠后，壓X光片放射自顯影。
結(jié)果顯示野生型RX238具有激酶的活性，能夠磷酸化其自身。當(dāng)ATP結(jié)合位點(diǎn)突變之后，激酶的活性也消失了。
實(shí)施例7兔抗RX238蛋白抗體的制備取體重為2公斤左右的雄性新西蘭大耳兔一只。以1mg RX238蛋白樣品(實(shí)施例5)加弗氏完全佐劑研磨成乳膠狀，在兔頸部多點(diǎn)注射。飼養(yǎng)半個(gè)月后，以1mg RX238蛋白樣品加弗氏不完全佐劑研磨成乳膠狀，再在兔頸部多點(diǎn)注射。一個(gè)月后，用1.5mgRX238蛋白樣品加弗氏不完全佐劑以同樣的方法加強(qiáng)免疫。半個(gè)月后，再用1mgRX238蛋白樣品加弗氏不完全佐劑再次加強(qiáng)免疫。飼養(yǎng)半個(gè)月后，頸動(dòng)脈取血，4℃靜置過夜，2,000轉(zhuǎn)離心3分鐘。上層血清即為兔抗RX238蛋白抗體。
雜交結(jié)果顯示，抗RX238蛋白抗體可與RX238蛋白與專一性地結(jié)合。
討論本發(fā)明人成功地克隆了RX238全長cDNA和其他兩個(gè)剪切體。根據(jù)其cDNA全長推測，RX238編碼346個(gè)氨基酸，含有磷酸激酶的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)其在Genbank中進(jìn)行Blast和與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK(Cyclin dependent kinase)進(jìn)行同源比對結(jié)果，提示RX238為一個(gè)新的CDK家族成員。
酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典工具之一，使用Clontech公司的Gal4酵母雙雜交系統(tǒng)，用RX238這一“新”基因作為誘餌對全長cDNA小文庫進(jìn)行了篩選，獲得了細(xì)胞周期蛋白(Cyclin H)陽性克隆。為了排除酵母雙雜交技術(shù)可能引起的假陽性，本發(fā)明人又將這些基因分別與含F(xiàn)lag、Myc等tag的真核表達(dá)載體連接，然后共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了RX238和Cyclin H之間確實(shí)具有直接的相互作用。這證明磷酸激酶RX50和Cyclin H之間的相互作用。而且，根據(jù)RX238不同剪切體的序列差異，證明了RX238有完整的C端才能和Cyclin H之間的相互作用。
細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)是調(diào)控細(xì)胞周期正常運(yùn)行的關(guān)鍵性蛋白。細(xì)胞周期的最主要任務(wù)是將其基因組DNA在DNA合成期(S期)完整地復(fù)制成兩份拷貝，而后在分裂期(M期)將這兩份拷貝正確無誤地分配給兩個(gè)子代細(xì)胞，分為G1、S、G2和M期。CDK是一類重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸化其靶蛋白而控制細(xì)胞周期的進(jìn)行。CDK的活性受其伴侶蛋白-細(xì)胞周期蛋白Cyclin的控制，Cyclin與CDKs形成復(fù)合物，激活CDKs的激酶活性，為CDK指出特定的靶蛋白對其磷酸化，進(jìn)而再影響其下游蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞周期G1-S、G2-M的轉(zhuǎn)換。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)提示，RX238具有特殊的CDK活性，即細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活化激酶CAK(CDK-activiting kinase)活性。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行是受CDK調(diào)控的，CAK可以磷酸化CDK的一個(gè)蘇氨酸殘基從而激活CDK的活性。由此可見，CAK是細(xì)胞周期的一個(gè)非常重要的正調(diào)控因子。Cyclin與CDK的結(jié)合可以決定其底物特異性。因此本發(fā)明實(shí)驗(yàn)提示Cyclin H可以決定RX238的底物特異性。
鑒于Cyclin在細(xì)胞周期中的關(guān)鍵作用，以及因此在腫瘤、炎癥、自身免疫等多種重大疾病中的關(guān)鍵作用，RX238與Cyclin H的結(jié)合，可以用于新藥開發(fā)過程中，作為藥物篩選模型。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海睿星基因技術(shù)有限公司<120>磷酸激酶及其應(yīng)用<130>037798<160>8<170>Patentln version 3.1<210>1<211>1041<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atggaccagt actgcatcct gggccgcatc ggggagggcg cccacggcat cgtcttcaag60gccaagcacg tggagactgg cgagatagtt gccctcaaga aggtggccct aaggcggttg120gaagacggct tccctaacca ggccctgcgg gagattaagg ctctgcagga gatggaggac180aatcagtatg tggtacaact gaaggctgtg ttcccacacg gtggaggctt tgtgctggcc240tttgagttca tgctgtcgga tctggccgag gtggtgcgcc atgcccagag gccactagcc300caggcacagg tcaagagcta cctgcagatg ctgctcaagg gtgtcgcctt ctgccatgcc360aacaacattg tacatcggga cctgaaacct gccaacctgc tcatcagcgc ctcaggccag420ctcaagatag cggactttgg cctggctcga gtcttttccc cagacggcag ccgcctctac480acacaccagg tggccgccag gtggtaccga gcccccgagc tcctgtatgg tgcccgccag540tatgaccagg gcgtcgatct gtggtctgtg ggctgcatca tgggggagct gttgaatggg600tccccccttt tcccgggcaa gaacgatatt gaacagcttt gctatgtgct tcgcatcttg660ggcaccccaa accctcaagt ctggccggag ctcactgagc tgccggacta caacaagatc720tcctttaagg agcaggtgcc catgcccctg gaggaggtgc tgcctgacgt ctctccccag780gcattggatc tgctgggtca attccttctc taccctcctc accagcgcat cgcagcttcc840aaggctctcc tccatcagta cttcttcaca gctcccctgc ctgcccatcc atctgagctg900ccgattcctc agcgtctagg gggacctgcc cccaaggccc atccagggcc cccccacatc960catgacttcc acgtggaccg gcctcttgag gagtcgctgt tgaacccaga gctgattcgg1020cccttcatcc tggaggggtg a 1041<210>2<211>346<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Asp Gln Tyr Cys Ile Leu Gly Arg Ile Gly Glu Gly Ala His Gly1 5 10 15Ile Val Phe Lys Ala Lys His Val Glu Thr Gly Glu Ile Val Ala Leu20 25 30Lys Lys Val Ala Leu Arg Arg Leu Glu Asp Gly Phe Pro Asn Gln Ala35 40 45Leu Arg Glu Ile Lys Ala Leu Gln Glu Met Glu Asp Asn Gln Tyr Val
50 55 60Val Gln Leu Lys Ala Val Phe Pro His Gly Gly Gly Phe Val Leu Ala65 70 75 80Phe Glu Phe Met Leu Ser Asp Leu Ala Glu Val Val Arg His Ala Gln85 90 95Arg Pro Leu Ala Gln Ala Gln Val Lys Ser Tyr Leu Gln Met Leu Leu100 105 110Lys Gly Val Ala Phe Cys His Ala Asn Asn Ile Val His Arg Asp Leu115 120 125Lys Pro Ala Asn Leu Leu Ile Ser Ala Ser Gly Gln Leu Lys Ile Ala130 135 140Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Phe Ser Pro Asp Gly Ser Arg Leu Tyr145 150 155 160Thr His Gln Val Ala Ala Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Tyr165 170 175Gly Ala Arg Gln Tyr Asp Gln Gly Val Asp Leu Trp Ser Val GIy Cys180 185 190Ile Met Gly Glu Leu Leu Asn Gly Ser Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asn195 200 205Asp Ile Glu Gln Leu Cys Tyr Val Leu Arg Ile Leu Gly Thr Pro Asn210 215 220Pro Gln Val Trp Pro Glu Leu Thr Glu Leu Pro Asp Tyr Asn Lys Ile225 230 235 240Ser Phe Lys Glu Gln Val Pro Met Pro Leu Glu Glu Val Leu Pro Asp245 250 255Val Ser Pro Gln Ala Leu Asp Leu Leu Gly Gln Phe Leu Leu Tyr Pro260 265 270Pro His Gln Arg Ile Ala Ala Ser Lys Ala Leu Leu His Gln Tyr Phe275 280 285Phe Thr Ala Pro Leu Pro Ala His Pro Ser Glu Leu Pro Ile Pro Gln290 295 300Arg Leu Gly Gly Pro Ala Pro Lys Ala His Pro Gly Pro Pro His Ile305 310 315 320His Asp Phe His Val Asp Arg Pro Leu Glu Glu Ser Leu Leu Asn Pro325 330 335Glu Leu Ile Arg Pro Phe Ile Leu Glu Gly340 345<210>3<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(38)<223>引物<400>3ggccaatccg gccatggacc agtactgcat cctgggcc 38
<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(36)<223>引物<400>4ggcctctaag gcctcacccc tccaggatga agggcc 36<210>5<211>843<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(843)<223>
<400>5atg gac cag tac tgc atc ctg ggc cgc atc ggg gag ggc gcc cac ggc 48Met Asp Gln Tyr Cys Ile Leu Gly Arg Ile Gly Glu Gly Ala His Gly1 5 10 15atc gtc ttc aag gcc aag cac gtg gag act ggc gag ata gtt gcc ctc 96Ile Val Phe Lys Ala Lys His Val Glu Thr Gly Glu Ile Val Ala Leu20 25 30aag aag gtg gcc cta agg cgg ttg gaa gac ggc ttc cct aac cag gcc 144Lys Lys Val Ala Leu Arg Arg Leu Glu Asp Gly Phe Pro Asn Gln Ala35 40 45ctg cgg gag att aag gct ctg cag gag atg gag gac aat cag tat gtg 192Leu Arg Glu Ile Lys Ala Leu Gln Glu Met Glu Asp Asn Gln Tyr Val50 55 60gta caa ctg aag gct gtg ttc cca cac ggt gga ggc ttt gtg ctg gcc 240Val Gln Leu Lys Ala Val Phe Pro His Gly Gly Gly Phe Val Leu Ala65 70 75 80ttt gag ttc atg ctg tcg gat ctg gcc gag gtg gtg cgc cat gcc cag 288Phe Glu Phe Met Leu Ser Asp Leu Ala Glu Val ValArg His Ala Gln85 90 95agg cca cta gcc cag gca cag gtc aag agc tac ctg cag atg ctg ctc 336Arg Pro Leu Ala Gln Ala Gln Val Lys Ser Tyr Leu Gln Met Leu Leu100 105 110aag ggt gtc gcc ttc tgc cat gcc aac aac att gta cat cgg gac ctg 384Lys Gly Val Ala Phe Cys His Ala Asn Asn Ile Val His Arg Asp Leu115 120 125aaa cct gcc aac ctg ctc atc agc gcc tca ggc cag ctc aag ata gcg 432
Lys Pro Ala Asn Leu Leu Ile Ser Ala Ser Gly Gln Leu Lys Ile Ala130 135 140gac ttt ggc ctg gct cga gtc ttt tcc cca gac ggc agc cgc ctc tac 480Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Phe Ser Pro Asp Gly Ser Arg Leu Tyr145 150 155 160aca cac cag gag ctc act gag ctg ccg gac tac aac aag atc tcc ttt 528Thr His Gln Glu Leu Thr Glu Leu Pro Asp Tyr Asn Lys Ile Ser Phe165 170 175aag gag cag gtg ccc atg ccc ctg gag gag gtg etg cct gac gtc tct 576Lys Glu Gln Val Pro Met Pro Leu Glu Glu Val Leu Pro Asp Val Ser180 185 190ccc cag gca ttg gat ctg ctg ggt caa ttc ctt ctc tac cct cct cac 624Pro Gln Ala Leu Asp Leu Leu Gly Gln Phe Leu Leu Tyr Pro Pro His195 200 205cag cgc atc gca gct tcc aag gct ctc ctc cat cag tacttc ttc aca 672Gln Arg Ile Ala Ala Ser Lys Ala Leu Leu His Gln Tyr Phe Phe Thr210 215 220gct ccc ctg cct gcc cat cca tct gag ctg ccg att cct cag cgt cta 720Ala Pro Leu Pro Ala His Pro Ser Glu Leu Pro Ile Pro Gln Arg Leu225 230 235 240ggg gga cct gcc ccc aag gcc cat cca ggg ccc ccc cac atc cat gac 768Gly Gly Pro Ala Pro Lys Ala His Pro Gly Pro Pro His Ile His Asp245 250 255ttc cac gtg gac cgg cct ctt gag gag tcg ctg ttg aac cca gag ctg 816Phe His Val Asp Arg Pro Leu Glu Glu Ser Leu Leu Asn Pro Glu Leu260 265 270att cgg ccc ttc atc ctg gag ggg tga 843Ile Arg Pro Phe Ile Leu Glu Gly275 280<210>6<211>280<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6Met Asp Gln Tyr Cys Ile Leu Gly Arg Ile Gly Glu Gly Ala His Gly1 5 10 15Ile Val Phe Lys Ala Lys His Val Glu Thr Gly Glu Ile Val Ala Leu20 25 30Lys Lys Val Ala Leu Arg Arg Leu Glu Asp Gly Phe Pro Asn Gln Ala35 40 45Leu Arg Glu Ile Lys Ala Leu Gln Glu Met Glu Asp Asn Gln Tyr Val50 55 60Val Gln Leu Lys Ala Val Phe Pro His Gly Gly Gly Phe Val Leu Ala65 70 75 80Phe Glu Phe Met Leu Ser Asp Leu Ala Glu Val Val Arg His Ala Gln85 90 95Arg Pro Leu Ala Gln Ala Gln Val Lys Ser Tyr Leu Gln Met Leu Leu100 105 110
Lys Gly Val Ala Phe Cys His Ala Asn Asn Ile Val His Arg Asp Leu115 120125Lys Pro Ala Asn Leu Leu Ile Ser Ala Ser Gly Gln Leu Lys Ile Ala130 135 140Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Phe Ser Pro Asp Gly Ser Arg Leu Tyr145 150 155 160Thr His Gln Glu Leu Thr Glu Leu Pro Asp Tyr Asn Lys Ile Ser Phe165 170 175Lys Glu Gln Val Pro Met Pro Leu Glu Glu Val Leu Pro Asp Val Ser180 185 190Pro Gln Ala Leu Asp Leu Leu Gly Gln Phe Leu Leu Tyr Pro Pro His195 200 205Gln Arg Ile Ala Ala Ser Lys Ala Leu Leu His Gln Tyr Phe Phe Thr210 215 220Ala Pro Leu Pro Ala His Pro Ser Glu Leu Pro Ile Pro Gln Arg Leu225 230 235 240Gly Gly Pro Ala Pro Lys Ala His Pro Gly Pro Pro His Ile His Asp245 250 255Phe His Val Asp Arg Pro Leu Glu Glu Ser Leu Leu Asn Pro Glu Leu260 265 270Ile Arg Pro Phe Ile Leu Glu Gly275 280<210>7<211>1064<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(720)<223>
<400>7atg gac cag tac tgc atc ctg ggc cgc atc ggg gag ggc gcc cac ggc 48Met Asp Gln Tyr Cys Ile Leu Gly Arg Ile Gly Glu Gly Ala His Gly1 5 10 15atc gtc ttc aag gcc aag cac gtg gag act ggc gag ata gtt gcc ctc 96Ile Val Phe Lys Ala Lys His Val Glu Thr Gly Glu Ile Val Ala Leu20 25 30aag aag gtg gcc cta agg cgg ttg gaa gac ggc ttc cct aac cag gcc 144Lys Lys Val Ala Leu Arg Arg Leu Glu Asp Gly Phe Pro Asn Gln Ala35 40 45ctg cgg gag att aag gct ctg cag gag atg gag gac aat cag tat gtg 192Leu Arg Glu Ile Lys Ala Leu Gln Glu Met Glu Asp Asn Gln Tyr Val50 55 60gta caa ctg aag gct gtg ttc cca cac ggt gga ggc ttt gtg ctg gcc 240Val Gln Leu Lys Ala Val Phe Pro His Gly Gly Gly Phe Val Leu Ala65 70 75 80ttt gag ttc atg ctg tcg gat ctg gcc gag gtg gtg cgc cat gcc cag 288
Phe Glu Phe Met Leu Ser Asp Leu Ala Glu Val Val Arg His Ala Gln85 90 95agg cca cta gcc cag gca cag gtc aag agc tac ctg cag atg ctg ctc 336Arg Pro Leu Ala Gln Ala Gln Val Lys Ser Tyr Leu Gln Met Leu Leu100 105 110aag ggt gtc gcc ttc tgc cat gcc aac aac att gta cat cgg gac ctg 384Lys Gly Val Ala Phe Cys His Ala Asn Asn Ile Val His Arg Asp Leu115 120 125aaa cct gcc aac ctg ctc atc agc gcc tca ggc cag ctc aag ata gcg 432Lys Pro Ala Asn Leu Leu Ile Ser Ala Ser Gly Gln Leu Lys Ile Ala130 135 140gac ttt ggc ctg gct cga gtc ttt tcc cca gac ggc agc cgc ctc tac 480Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Phe Ser Pro Asp Gly Ser Arg Leu Tyr145 150 155 160aca cac cag gtg gcc acc agg tgg tac cga gcc ccc gag ctc ctg tat 528Thr His Gln Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Tyr165 170 175ggt gcc cgg cag tat gac cag ggc gtc gat ctg tgg tct gtg ggc tgc 576Gly Ala Arg Gln Tyr Asp Gln Gly Val Asp Leu Trp Ser Val Gly Cys180 185 190atc atg ggg gag ctg ttg aat ggg tcc ccc ctt ttc ccg ggc aag aac 624Ile Met Gly Glu Leu Leu Asn Gly Ser Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asn195 200 205gat att gaa cag ctt tgc tat gtg ctt cgc atc ttg ggc acc cca aac 672Asp Ile Glu Gln Leu Cys Tyr Val Leu Arg Ile Leu Gly Thr Pro Asn210 215 220cct caa gtc tgg ccg ggg ttt gta ggg gcc ctt ggt gaa gct cac tga 720Pro Gln Val Trp Pro Gly Phe Val Gly Ala Leu Gly Glu Ala His225230 235gctgccggac tacaacaaga tctcctttaa ggagcaggtg cccatgcccc tggaggaggt780gctgcctgac gtctctcccc aggcattgga tctgctgggt caattccttc tctaccctcc840tcaccagcgc atcgcagctt ccaaggctct cctccatcag tacttcttca cagctcccct900gcctgcccat ccatctgagc tgccgattcc tcagcgtcta gggggacctg cccccaaggc960ccatccaggg ccccccccac atccatgact tccacgtgga ccggcctctt gaggagtcgc1020tgttgaaccc agagctgatt cggcccttca tcctggaggg gtga 1064<210>8<211>239<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Met Asp Gln Tyr Cys Ile Leu Gly Arg Ile Gly Glu Gly Ala His Gly1 5 10 15Ile Val Phe Lys Ala Lys His Val Glu Thr Gly Glu Ile Val Ala Leu20 25 30Lys Lys Val Ala Leu Arg Arg Leu Glu Asp Gly Phe Pro Asn Gln Ala3540 45Leu Arg Glu Ile Lys Ala Leu Gln Glu Met Glu Asp Asn Gln Tyr Val50 55 60
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1.一種分離的蛋白質(zhì)，其特征在于，它選自下組具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或其具有激酶活性的保守性變異蛋白質(zhì)、活性片段、或活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過1-10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有磷酸化功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸含有SEQ ID NO1中1-1038位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，該方法包含步驟(a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(c)從培養(yǎng)物中分離出蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體。
10.一種組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的磷酸激酶－RX238蛋白，編碼RX238蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種RX238蛋白的方法。RX238蛋白可與Cyclin H相互作用，因而可作為藥物靶點(diǎn)篩選新藥。
文檔編號C12N15/54GK1743452SQ200410054259
公開日2006年3月8日 申請日期2004年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月3日
發(fā)明者孫筱清, 過瑩立 申請人:上海睿星基因技術(shù)有限公司