專利名稱：Ump激酶的晶體結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及UMP激酶的晶體以及篩選、鑒定和設(shè)計(jì)UMP激酶的抑制劑和別構(gòu)調(diào)節(jié)物的計(jì)算機(jī)輔助方法。
背景技術(shù)：
UMP激酶催化磷酸基團(tuán)從ATP到UMP的可逆轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生UDP，這是導(dǎo)致UTP產(chǎn)生的嘧啶核苷酸合成途徑中的必需步驟。細(xì)菌UMP激酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)與其它的細(xì)菌和真核生物核苷一磷酸激酶差別很大(Serina等，1995，Biochemistry，345066-5074；Brzu等，1999，Paths toPyrimidines，786-95；Labesse等，2002，Biochem.Biophys.Res.Commun.，294173-179；Gagyi等，2003，Eur.J.Biochem.，2703196-3204)，因此它們作為設(shè)計(jì)或鑒定抗菌藥物的靶標(biāo)具有重要意義。真核生物UMP-CMP激酶在溶液中是單體。已測(cè)定了幾種來自真核生物的UMP-CMP激酶的結(jié)構(gòu)(Mueller-Dieckmann等，1994，J.Biol.，236362-367；Scheffzek等，1996，Biochemistry，359716-9727；Schlichting等，1999，Nature Struct.Biol.，6721-723)。來自細(xì)菌的UMP激酶(pyrH基因的產(chǎn)物)在溶液中是同型六聚體，其活性由GTP(激活劑)和UTP(抑制劑)進(jìn)行別構(gòu)調(diào)控。序列比對(duì)證實(shí)，細(xì)菌UMP激酶在序列的有限區(qū)域范圍內(nèi)顯示與N-乙酰谷氨酸激酶、氨基甲酸激酶、天冬氨酸激酶、谷氨酸5-激酶和吡咯啉-5-甲酸合酶的同源性(Labesse等，2002，出處同上；Gagyi等，2003，出處同上)。
已描述了激烈熱球菌(P.furiosus)氨基甲酸激酶樣氨基甲酰磷酸合成酶的晶體結(jié)構(gòu)(CK-like CPS，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(pdb)條目1e19；Ramón-Maiques等，2000，J.Mol.Biol.，299463-476)。已描述了大腸桿菌(E.coli)N-乙酰谷氨酸激酶的晶體結(jié)構(gòu)(NAGK，pdb條目1gs5、1gsj、1oh9、1oha和1ohb；Ramón-Maiques等，2002，Structure，10329-342；Gil-Ortiz等，2003，J.Mol.Biol.，331231-244)。Labesse等(2002，出處同上)提出了大腸桿菌UMP激酶(pyrH)的同源性模型。Gagyi等(2003，出處同上)提出了枯草芽胞桿菌(B.subtilis)UMP激酶(pyrH)的同源性模型。WO 03/025004描述了致病細(xì)菌的多肽靶標(biāo)。
發(fā)明概述本文公開的是與GTP和磷酸復(fù)合的細(xì)菌UMP激酶(pyrH)的三維結(jié)構(gòu)；pyrH的結(jié)合位點(diǎn)；鑒定和/或設(shè)計(jì)能結(jié)合PyrH的化合物或物質(zhì)(agent)的方法，所述化合物或物質(zhì)包括部分或完全抑制pyrH活性的配體、藥物或抑制劑，結(jié)合pyrH的蛋白質(zhì)和有機(jī)小分子；使pyrH結(jié)晶的方法；鑒定、篩選和/或設(shè)計(jì)能結(jié)合pyrH的物質(zhì)的計(jì)算機(jī)輔助方法；確認(rèn)提出可結(jié)合pyrH的物質(zhì)的核磁共振波譜學(xué)輔助方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描繪了一個(gè)分子的pyrH同型六聚集合體(homohexamericassembly)的三維結(jié)構(gòu)，繪出了pyrH折疊的結(jié)構(gòu)元件和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。α螺旋由A至H標(biāo)示，β折疊鏈由1至11標(biāo)示。
圖2和3是描繪pyrH六聚體的兩個(gè)正交視圖的草圖(cartoondepiction)，顯示了活性位點(diǎn)(六聚體的外表面，由X標(biāo)示)和別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)(六聚體的中央腔，由A標(biāo)示)。在預(yù)測(cè)的活性中心的結(jié)合磷酸根離子和在別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)的GTP分子(模型標(biāo)示為GDP)在全圖中用球-棍表示。
圖4描繪了以pyrH晶體不對(duì)稱單元存在的八個(gè)分子當(dāng)中觀察到的構(gòu)象柔性。
圖5顯示了在1mM UTP存在下0.4mM2H/15N/13C標(biāo)記的流感嗜血桿菌(H.influenzae)的核磁共振(NMR)TROSY-HSQC譜。y軸和x軸分別表示在氮和質(zhì)子維度(dimension)的化學(xué)位移，單位ppm。
圖6描繪了來自以下的pyrH的氨基酸序列的比對(duì)肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(SPN；SEQ ID NO1)；釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(SPY；SEQ ID NO2)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SAU；SEQ ID NO3)；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(SEP；SEQ ID NO4)；枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)(BSU；SEQ ID NO5)；腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)(NME；SEQ ID NO6)；大腸桿菌(Escherichia coli)(ECO；SEQ ID NO7)；流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)(HIN；SEQ IDNO8)；肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)(CPN；SEQ ID NO9)和肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)(MPN；SEQ ID NO10)。
圖7是來自流感嗜血桿菌的與GTP和磷酸復(fù)合的pyrH的晶體結(jié)構(gòu)的三維原子坐標(biāo)列表。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于流感嗜血桿菌pyrH的結(jié)晶和流感嗜血桿菌pyrH與GTP和磷酸的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(三維結(jié)構(gòu))的測(cè)定。
PyrH多肽、晶體和空間群本發(fā)明提供有關(guān)pyrH的分離多肽或pyrH多肽的一部分的信息，所述多肽當(dāng)在正確的三維方向上折疊時(shí)起到結(jié)合位點(diǎn)的作用。本文所用的指向多肽的術(shù)語“分離的”，指這樣的多肽或其部分，由于其來源或經(jīng)過操作的原因，已脫離其天然狀態(tài)，或者以別的方式不處在其天然狀態(tài)。所謂“分離的”還指這樣的蛋白質(zhì)，其(i)是化學(xué)合成的；(ii)在宿主細(xì)胞中表達(dá)并從結(jié)合的蛋白質(zhì)和污染性蛋白質(zhì)中純化出來；或者(iii)從結(jié)合的蛋白質(zhì)和污染性蛋白質(zhì)中純化出來。該術(shù)語通常指這樣的多肽，其已與天然伴隨出現(xiàn)的其它蛋白質(zhì)和核酸分離。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，多肽還與用以純化它的物質(zhì)如抗體或凝膠基質(zhì)(例如聚丙烯酰胺)分離。
各分離的多肽序列都可以是pyrH的天然序列，或者是與SEQ IDNO14表示的氨基酸序列有至少40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的序列。
分離的pyrH可以是pyrH的變體。在一個(gè)實(shí)例中，變體的氨基酸序列與SEQ ID NO14公開序列的差別在一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換。還設(shè)想了包含氨基酸缺失和/或添加的實(shí)施方案。變體可具有保守變化(氨基酸相似性)，其中置換氨基酸的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性與它所取代的氨基酸殘基類似(例如用異亮氨酸取代亮氨酸)。根據(jù)本公開內(nèi)容，可合理地推斷出有關(guān)指導(dǎo)原則，來確定可進(jìn)行哪些和多少氨基酸殘基的置換、插入和缺失，而不破壞生物或藥學(xué)活性，用本領(lǐng)域公知的計(jì)算機(jī)程序如DNAStar軟件還可進(jìn)一步得到有關(guān)指導(dǎo)原則。
可例如根據(jù)各殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親特性方面的相似性，作出氨基酸置換，只要能保持天然分子的生物和/或藥學(xué)活性即可。
置換的實(shí)例在下表1中列出表1
在本發(fā)明中，“氨基酸同源性”是一級(jí)氨基酸序列的同一性的度量。為表征同源性，將主題序列進(jìn)行比對(duì)以獲得最高同源性(匹配)百分比，必要時(shí)引入空位以便達(dá)到最大同源性百分比。N或C末端突出端不應(yīng)認(rèn)為影響同源性?！巴恍浴北旧碛斜绢I(lǐng)域公認(rèn)的含義，可用公開的技術(shù)進(jìn)行計(jì)算。用以測(cè)定兩個(gè)序列之間的同一性的計(jì)算機(jī)程序方法包括例如DNAStar軟件(DNAStar Inc.，美國威斯康星州麥迪遜市)；GCG程序包(Devereux等，1984，Nucl.Acids Res.，12387)；BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215403)。本文定義的同源性(同一性或相似性)測(cè)定如下用BLAST 2Sequences計(jì)算機(jī)程序(Tatusova和Madden，1999，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.174247-250；可獲自NCBI)，采用所有參數(shù)的默認(rèn)設(shè)置值，以在進(jìn)行比對(duì)序列的全長范圍內(nèi)計(jì)算同一性和/或相似性百分比，允許同源性空位最多占參考序列核苷酸或氨基酸總數(shù)的約90％。
本發(fā)明還包括pyrH的晶體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述晶體是pyrH與磷酸和三磷酸鳥苷(GTP)的復(fù)合物。pyrH可來自任何細(xì)菌，包括流感嗜血桿菌。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括與磷酸和GTP復(fù)合的結(jié)晶流感嗜血桿菌pyrH，其特征在于原子坐標(biāo)如圖7所示。在本發(fā)明中，晶體可衍射至約2.3。
結(jié)晶復(fù)合物的一個(gè)實(shí)例被表征為屬于斜方六面體空間群R32，晶胞參數(shù)為a＝b＝c＝(146.5+/-0.7)，α＝β＝γ＝(97.38+/-0.07)°。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，斜方六面體空間群的六角形等同物方便操作，其中本發(fā)明的pyrH晶體的晶胞參數(shù)是a＝b＝(215+/-1.0)，c＝(233.6+/-1.5)和α＝β＝90°，γ＝120°。
本發(fā)明的pyrH晶體具有含八個(gè)分子的pyrH的不對(duì)稱單元，所述不對(duì)稱單元包含同型六聚集合體和另外的同型二聚集合體，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，應(yīng)用斜方六面體空間群固有的晶體學(xué)對(duì)稱性操作，可從所述同型二聚集合體產(chǎn)生六聚集合體。每個(gè)同型六聚集合體可描述為二聚體的三聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)二聚體包含分子間二聚體界面，所述界面包含SEQ ID NO14的氨基酸殘基Ile25、Pro27、Leu30、Asp31、Phe57、Lys61、Leu62、Ala65、Gly66、Met67、Asn68、Arg69、Val71、His74、Met75、Gly76、Leu78、Ala79、Val81、Met82、Leu85、Ala86、Arg87、Asp88、Arg89、Phe104、Gln105、Leu106、Asn107、Gly108和Ile109。
制造晶體的方法是本領(lǐng)域公知的。在一個(gè)實(shí)例中，上述晶體復(fù)合物可用以下方法生產(chǎn)在適當(dāng)?shù)木彌_液(例如50mM Tris-HCl pH8.5)中制備含有足夠純度(例如＞95％)的流感嗜血桿菌pyrH的第一溶液；制備含有合適的沉淀劑(例如鹽或聚乙二醇)的第二溶液；將第一溶液和第二溶液組合，從而產(chǎn)生組合溶液；用結(jié)晶方法從組合溶液形成液滴，使得pyrH進(jìn)入過飽和狀態(tài)，由此產(chǎn)生pyrH的晶體。
PyrH晶體結(jié)構(gòu)pyrH晶體的不對(duì)稱單元由八個(gè)拷貝的pyrH多肽鏈組成，其特征在于原子坐標(biāo)由圖7列表所示，對(duì)應(yīng)于一個(gè)同型六聚集合體和一個(gè)二聚體，通過結(jié)晶學(xué)對(duì)稱性轉(zhuǎn)化操作從所述二聚體可產(chǎn)生六聚集合體。流感嗜血桿菌pyrH的活性形式是同型六聚體。每個(gè)pyrH分子由單一結(jié)構(gòu)域組成，所述結(jié)構(gòu)域包含由九個(gè)β折疊鏈(在圖1中由1至6和9至11標(biāo)示)組成的中央β片層，其兩側(cè)翼上各有四個(gè)α螺旋(圖1一邊由D、E、F和G標(biāo)示的α螺旋和圖1另一邊由A、B、C和H標(biāo)示的α螺旋)。磷酸根離子的結(jié)合可識(shí)別出活性位點(diǎn)(圖2中由X標(biāo)示)，所述活性位點(diǎn)跨越被環(huán)區(qū)包圍的寬闊而暴露于溶劑的腔中β折疊鏈的C末端邊緣。六個(gè)活性位點(diǎn)位于六聚集合體的外表面上。在pyrH分子的另一個(gè)表面(圖2中由A標(biāo)示)上，接近六聚集合體的中央，在三個(gè)pyrH分子的界面處，是別構(gòu)效應(yīng)物(例如激活劑如GTP)的結(jié)合位點(diǎn)。
流感嗜血桿菌pyrH六聚集合體可描述為二聚體的三聚體。二聚體是通過穩(wěn)定、保守的疏水核心維持在一起的，所述疏水核心由順著兩個(gè)伸展反向平行α螺旋的表面的甲硫氨酸殘基(殘基68至95，螺旋C，參見圖1)之間的互鎖產(chǎn)生。另外的相互作用發(fā)生在反向平行定向各pyrH分子的保守β3-β4環(huán)(包含殘基104至109)之間。在一個(gè)pyrH分子中β1-αA環(huán)的殘基25、27、30和31和αA螺旋的N末端(參見圖1)與另一個(gè)分子中短螺旋區(qū)域(螺旋B，參見圖1)的殘基57、61、62和65之間，也存在穩(wěn)定化接觸。因此分子間二聚體界面包括SEQ ID NO14的氨基酸殘基Ile25、Pro27、Leu30、Asp31、Phe57、Lys61、Leu62、Ala65、Gly66、Met67、Asn68、Arg69、Val71、His74、Met75、Gly76、Leu78、Ala79、Val81、Met82、Leu85、Ala86、Arg87、Asp88、Arg89、Phe104、Gln105、Leu106、Asn107、Gly108和Ile109。
三個(gè)二聚體集合在一起，通過相互作用形成六聚集合體，所述相互作用涉及來自第一二聚體的第一分子的殘基Asn68、Arg69、Val70、Val71、His74、Arg88、Phe92、Lys99、Gln105、Leu106、Asn107、Gly108、Ile109、Cys110、Asp111、Thr112、Tyr113、Asn114、Trp115、Glu117、Thr134、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Leu147、Arg148、Ile150、Glu151、Glu153、Leu198、Ser199、Thr202、Leu203和His207，來自第二二聚體的第二分子的殘基Asn68、Arg69、Val70、Val71、His74、Thr134、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Leu147、Arg148、Ile150、Glu151、Glu153、Leu198、Ser199、Thr202、Leu203和His207，來自所述第二二聚體的第三分子的殘基Arg88、Phe92、Lys99、Asn107、Gly108、Ile109、Cys110和Asp111以及來自第三二聚體的第四分子的殘基Gln105、Leu106、Thr112、Tyr113、Asn114、Trp115和Glu117。接觸情況用Contact程序(CCP4，1994，Acta Cryst.，D50760-763)按5半徑進(jìn)行測(cè)定。因此，分子間二聚體-二聚體界面包含SEQ ID NO14的氨基酸殘基Asn68、Arg69、Val70、Val71、His74、Arg88、Phe92、Lys99、Gln105、Leu106、Asn107、Gly108、Ile109、Cys110、Asp111、Thr112、Tyr113、Asn114、Trp115、Glu117、Thr134、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Leu147、Arg148、Ile150、Glu151、Glu153、Leu198、Ser199、Thr202、Leu203和His207。
結(jié)合位點(diǎn)術(shù)語“結(jié)合位點(diǎn)”指pyrH上與結(jié)合pyrH的分子發(fā)生相互作用的特定區(qū)域(或原子)。結(jié)合位點(diǎn)可以是例如保守結(jié)構(gòu)元件或幾個(gè)保守結(jié)構(gòu)元件的組合、底物結(jié)合位點(diǎn)、激活劑結(jié)合位點(diǎn)、抑制劑結(jié)合位點(diǎn)、別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)或分子間界面。
底物結(jié)合位點(diǎn)包括pyrH上與底物如三磷酸腺苷(ATP)或一磷酸尿苷(UMP)發(fā)生相互作用的特定區(qū)域(或原子)。底物結(jié)合位點(diǎn)可包含折疊多肽當(dāng)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的三維排列，或者由所述三維排列定義。在本發(fā)明中，底物可以是諸如ATP或UMP的化合物，pyrH可將它們分別可逆轉(zhuǎn)化為二磷酸腺苷(ADP)或二磷酸尿苷(UDP)。因此，產(chǎn)物也可作為底物。底物可以是天然或人造化合物。兩種底物，例如UMP和ATP，可同時(shí)或分別結(jié)合到單獨(dú)但鄰近的結(jié)合位點(diǎn)上。因此，確定每個(gè)這些鄰近結(jié)合位點(diǎn)的殘基子集也可能涵括在其它結(jié)合位點(diǎn)的定義中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，流感嗜血桿菌pyrH的底物結(jié)合位點(diǎn)包括SEQ ID NO14的氨基酸Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Ala16、Leu17、Val50、Leu51、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Arg58、Thr80、Asn83、Thr140、Thr141、Asp142、Ser143、Ala145、Lys159、Ala160、Thr161、Lys162、Val163、Gly165、Val166、Tyr167、Asp168、Cys169、Asp170、Pro171、Lys173、Asp174、Ala177、Lys178、Tyr180、Lys191、Glu192、Leu193、Lys194、Val195、Met196、Asp197、Val213和Phe214。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，流感嗜血桿菌pyrH的底物結(jié)合位點(diǎn)另外包括SEQ ID NO14的氨基酸Phe57、Gly59、Arg69、Val70、Val71、Gly72、Asp73、His74、Met75、Gly76、Met77、Leu78、Ala79、Ala103、Phe104、Ser131、Ala132、Gly133、Thr134、Gly135、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Thr144、Leu147和Arg148。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，流感嗜血桿菌pyrH的底物結(jié)合位點(diǎn)包括SEQ ID NO14的氨基酸Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Val50、Leu51、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Phe57、Arg58、Gly59、Arg69、Val70、Val71、Gly72、Asp73、His74、Met75、Gly76、Met77、Leu78、Ala79、Thr80、Asn83、Ala103、Phe104、Ser131、Ala132、Gly133、Thr134、Gly135、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Thr140、Thr41、Asp142、Ser143、Thr144、Ala145、Leu147和Arg148。在又一個(gè)實(shí)施方案中，流感嗜血桿菌pyrH的底物結(jié)合位點(diǎn)包括氨基酸Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Ala16、Leu17、Val50、Leu51、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Phe57、Arg58、Gly59、Arg69、Val70、Val71、Gly72、Asp73、His74、Met75、Gly76、Met77、Leu78、Ala79、Thr80、Asn83、Ala103、Phe104、Ser131、Ala132、Gly133、Thr134、Gly135、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Thr140、Thr141、Asp142、Ser143、Thr144、Ala145、Leu147、Arg148、Lys159、Ala160、Thr161、Lys162、Val163、Gly165、Val166、Tyr167、Asp168、Cys169、Asp170、Pro171、Lys173、Asp174、Ala177、Lys178、Tyr180、Lys191、Glu192、Leu193、Lys194、Val195、Met196、Asp197、Val213和Phe214。
抑制劑結(jié)合位點(diǎn)包括pyrH上與起到防止pyrH活性的作用的抑制劑(如5’-腺苷酰亞胺二磷酸(AMP-PNP))發(fā)生相互作用的特定區(qū)域(原子)。抑制劑結(jié)合位點(diǎn)可包含折疊多肽當(dāng)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的三維排列，或者由所述三維排列定義。在本發(fā)明中，抑制劑可以是能進(jìn)行催化反應(yīng)，結(jié)合到pyrH上的底物結(jié)合位點(diǎn)或另一位點(diǎn)如別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)的化合物，其可競(jìng)爭(zhēng)ATP和/或UMP底物周轉(zhuǎn)，或者以別的方式防止pyrH活性。本發(fā)明的抑制劑可以是在底物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的化合物如AMP-PNP，或者是在別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的UTP。抑制劑可以是天然或人造化合物。
“別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)”包括pyrH上與別構(gòu)效應(yīng)物如GTP或UTP發(fā)生相互作用的特定區(qū)域(原子)。別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)可包含折疊多肽當(dāng)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的三維排列，或者由所述三維排列定義。別構(gòu)效應(yīng)物可以是激活劑如GTP。別構(gòu)效應(yīng)物可以是天然或人造化合物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，流感嗜血桿菌pyrH的別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)包括SEQ ID NO14的氨基酸Arg7、Gly66、Met67、Asn68、Arg69、Val70、Val71、Gly72、His74、Gly84、Leu85、Ala86、Met87、Arg88、Asp89、Ser90、Leu91、Phe92、Arg93、Asp95、Val96、Asn97、Ala98、Lys99、Leu100、Met101、Ile109、Cys110、Asp111、Asn114、Trp115、Ser116、Glu117、Ala118、Ile119、Lys120、Met121、Arg123、Glu124、Arg126、Val127、Ile129、Glu151、Ile152和Glu153。
機(jī)器可讀數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)確定pyrH晶體結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)列表可以以電子方式存儲(chǔ)，例如在機(jī)器可讀存儲(chǔ)介質(zhì)如磁盤上存儲(chǔ)，以便計(jì)算機(jī)可訪問和操縱所述坐標(biāo)。例如，使用3D可視化軟件，有可能在計(jì)算機(jī)圖形屏幕上描繪出原子坐標(biāo)所表示的結(jié)構(gòu)，研究與候選抑制劑的假設(shè)相互作用。這樣，本發(fā)明的原子坐標(biāo)是設(shè)計(jì)作為新抗菌藥物候選者的新型抑制劑的有用工具。
鑒定pyrH結(jié)合物質(zhì)的計(jì)算機(jī)輔助方法本發(fā)明包括用以鑒定潛在的pyrH結(jié)合物質(zhì)如調(diào)節(jié)物，特別是潛在的pyrH活性抑制劑的計(jì)算機(jī)輔助方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解到，可通過數(shù)學(xué)方法(例如通過旋轉(zhuǎn)或平移)來操縱一組原子坐標(biāo)(如圖7列表所示的原子坐標(biāo))，使得與圖7列表所示的原子坐標(biāo)完全不同的一組原子坐標(biāo)，也能確定相似或完全相同的形狀，因此該組原子坐標(biāo)代表了同樣的發(fā)明。
本文描述的pyrH晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)用于設(shè)計(jì)能抑制pyrH，從而可用作抗菌藥物的物質(zhì)特別是選擇性抑制物質(zhì)。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明涵括抑制pyrH活性的物質(zhì)的基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法。
更具體的說，本發(fā)明抑制pyrH的化合物的設(shè)計(jì)通常要考慮兩個(gè)因素。首先，所述化合物必須能夠通過共價(jià)和/或非共價(jià)相互作用與pyrH在物理上或結(jié)構(gòu)上發(fā)生締合。在pyrH與其底物、別構(gòu)效應(yīng)物或抑制劑的締合中重要的非共價(jià)分子相互作用，包括氫鍵鍵合、范德華力和疏水相互作用。
其次，所述化合物必須能夠呈現(xiàn)能讓其與pyrH發(fā)生締合的構(gòu)象。雖然所述化合物的某些部分不會(huì)直接參與這一與pyrH的締合，但這些部分仍可影響到分子的總體構(gòu)象。而這又會(huì)對(duì)功效具有顯著的影響。這種構(gòu)象要求包括化學(xué)實(shí)體(chemical entity)或化合物涉及全部或一部分結(jié)合位點(diǎn)(例如底物結(jié)合位點(diǎn)、別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn))的總體三維結(jié)構(gòu)和方向、pyrH的分子間界面或者包含幾個(gè)直接與pyrH發(fā)生相互作用的化學(xué)實(shí)體的化合物其各官能團(tuán)之間的間距。
在合成和測(cè)試某化學(xué)化合物之前，可用計(jì)算機(jī)建模技術(shù)先對(duì)其對(duì)pyrH的潛在抑制作用進(jìn)行估計(jì)。如果給定的化合物的理論結(jié)構(gòu)提示其與pyrH的相互作用和締合作用不足，則可避免該化合物的合成和測(cè)試。但是，如果計(jì)算機(jī)建模結(jié)果表明存在強(qiáng)相互作用，則可合成該分子并用合適的測(cè)定法測(cè)試其結(jié)合pyrH的能力。這樣，就可避免合成無活性的化合物。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及任何用已知的pyrH結(jié)合物質(zhì)如ATP、ADP、UTP、UMP、UDP或GTP來確定用于與候選抑制劑作比較的已知物質(zhì)的擬合情況的計(jì)算機(jī)輔助方法。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，鑒定某種物質(zhì)是否是pyrH的結(jié)合物質(zhì)的計(jì)算機(jī)輔助方法包括以下步驟(1)給計(jì)算機(jī)建模應(yīng)用程序提供已知物質(zhì)的原子坐標(biāo)，所述已知物質(zhì)如結(jié)合pyrH的結(jié)合位點(diǎn)的pyrH別構(gòu)效應(yīng)物和/或底物；(2)給計(jì)算機(jī)建模應(yīng)用程序提供圖7所提供的pyrH原子坐標(biāo)，或者所列氨基酸序列的保守骨架原子方面與圖7原子坐標(biāo)的均方根偏差不超過1.0的原子坐標(biāo)，或所述均方根偏差不超過1.5的原子坐標(biāo)；(3)對(duì)結(jié)合pyrH的結(jié)合位點(diǎn)的物質(zhì)與pyrH的擬合情況進(jìn)行定量；(4)給計(jì)算機(jī)建模應(yīng)用程序提供待評(píng)估物質(zhì)的一組原子坐標(biāo)，以確定它是否能結(jié)合pyrH的結(jié)合位點(diǎn)；(5)用擬合函數(shù)對(duì)受試物質(zhì)在所述結(jié)合位點(diǎn)中的擬合情況進(jìn)行定量；(6)將已知物質(zhì)的擬合計(jì)算結(jié)果與受試物質(zhì)的擬合計(jì)算結(jié)果進(jìn)行比較；和(7)選出擬合情況好于或接近已知物質(zhì)的擬合情況的受試物質(zhì)。例如，用于上述方法的已知結(jié)合物質(zhì)的原子坐標(biāo)可以是結(jié)合本發(fā)明pyrH的GDP分子的原子坐標(biāo)，由圖7列表所示的原子坐標(biāo)定義。GDP分子與pyrH的結(jié)合位點(diǎn)的擬合情況可通過例如用諸如Areaimol的程序(CCP4，1994，出處同上)，計(jì)算GDP與所述結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合時(shí)GDP分子和pyrH分子上去除溶劑的表面積(內(nèi)埋表面積)來進(jìn)行定量。由這兩種分子的計(jì)算值之比可估計(jì)GDP與pyrH結(jié)合位點(diǎn)的表面或形狀互補(bǔ)性。然后可將受試物質(zhì)如UTP(其結(jié)合的pyrH結(jié)合位點(diǎn)與GDP相同或相似)的擬合情況與GDP的擬合情況例如如下進(jìn)行比較將UTP對(duì)接(docking)到觀察發(fā)現(xiàn)GDP能結(jié)合的pyrH結(jié)合位點(diǎn)中，并再次進(jìn)行計(jì)算以比較UTP結(jié)合時(shí)UTP分子和pyrH分子上去除溶劑的表面積。兩個(gè)內(nèi)埋表面積之比越接近1，則表明擬合情況越好。
本發(fā)明行得通的另一個(gè)方法，是用計(jì)算方法篩選小分子數(shù)據(jù)庫，尋找能全部或部分結(jié)合pyrH的結(jié)合位點(diǎn)的化學(xué)實(shí)體或化合物。在這個(gè)篩選中，這種化學(xué)實(shí)體或化合物與所述結(jié)合位點(diǎn)的擬合的質(zhì)量，可通過形狀互補(bǔ)性(DesJarlais等，1988，J.Med.Chem.31722-729)或者通過估計(jì)的相互作用能量(Meng等，1992，J.Comp.Chem.，13505-524)來判斷。
篩選化學(xué)實(shí)體或片斷與pyrH，更具體的說與pyrH的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生締合的能力的方法，是本領(lǐng)域公知的。這種方法可包括將計(jì)算機(jī)應(yīng)用于稱為對(duì)接的過程中?？捎弥T如Quanta和Sybyl的軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)接，然后用諸如CHARMM和AMBER的軟件以標(biāo)準(zhǔn)分子動(dòng)力學(xué)力場(chǎng)進(jìn)行能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)。
專門的計(jì)算機(jī)程序在選擇片斷或化學(xué)實(shí)體的過程中也可起到幫助作用。這些程序包括1.GRID(Goodford，1985，J.Med.Chem.，28849-857)。GRID可獲自英國牛津大學(xué)；2.MCSS(1991，Miranker和Karplus，ProteinsStructure，F(xiàn)unction andGenetics，1129-34)。MCSS可獲自美國馬薩諸塞州Burlington市的Molecular Simulations公司；3.AUTODOCK(Goodsell和Olsen，1990，ProteinsStructure，F(xiàn)unctionand Genetics，8195-202)。AUTODOCK可獲自美國加州La Jolla市的Scripps研究所；4.DOCK(Kuntz等，1982，J.Mol.Biol.，161269-288)。DOCK可獲自美國加州大學(xué)舊金山分校。
另外的市售的小分子化合物計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫包括CambridgeStructural Database和Fine Chemical Database(Rusinko，1993，Chem.Des.Auto.News，844-47)。
一旦選出了合適的化學(xué)實(shí)體或片斷，可將它們裝配成單一化合物或抑制劑?？蛇@樣進(jìn)行裝配相對(duì)pyrH的結(jié)構(gòu)/原子坐標(biāo)目視檢查計(jì)算機(jī)屏幕上顯示的3D圖像上各片斷相互間的關(guān)系。然后用諸如Quanta或Sybyl的軟件進(jìn)行手工建模。
幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員將各單個(gè)化學(xué)實(shí)體或片斷連接起來的有用程序包括1.CAVEAT(Bartlett等，1989，Molecular Recognition in Chemical andBiological Problems，Special Pub.，Royal Chem.Soc.，78182-196)。CAVEAT可獲自美國加州大學(xué)伯克利分校；2.3D數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)如MACCS-3D(MDL Information Systems，美國加州San Leandro市)。這個(gè)領(lǐng)域在Martin，1992，Med.Chem.，352145-2154中有綜述；3.HOOK(可獲自美國馬薩諸塞州Burlington市MolecularSimulations公司)。
可使用空活性位點(diǎn)或者任選包括已知抑制劑的一些部分，將抑制性或其它類型的結(jié)合成分作為一個(gè)整體或“從頭”來設(shè)計(jì)，而不是如上所述以逐步方式每次一個(gè)片斷或化學(xué)實(shí)體繼續(xù)進(jìn)行pyrH抑制劑的構(gòu)建。這些方法包括1.LUDI(Bohm，J.Comp.Aid.Molec.Design 661-78，1992)。LUDI可獲自美國加州San Diego市Biosym Technologies公司；2.LEGEND(Nishibata和Itai，Tetrahedron，478985，1991)。LEGEND可獲自美國馬薩諸塞州Burlington市Molecular Simulations公司；3.LeapFrog(可獲自美國密蘇里州St.Louis市Tripos Associates公司)。
對(duì)候選抑制劑對(duì)pyrH活性的潛在干擾能力進(jìn)行評(píng)估，并按需對(duì)候選抑制劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，產(chǎn)生出修飾候選抑制劑的一組原子坐標(biāo)。使用計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)和任選的體外和/或體內(nèi)測(cè)試，對(duì)修飾候選抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估，且如有必要作進(jìn)一步的修飾，以產(chǎn)生性能增強(qiáng)(例如抑制活性比起始候選抑制劑更大)的修飾候選抑制劑。有多種常規(guī)技術(shù)可用來執(zhí)行每個(gè)上述評(píng)估以及篩選候選化合物抑制pyrH的能力所必須進(jìn)行的評(píng)估。一般這些技術(shù)涉及確定給定部分(moiety)的位置和結(jié)合接近度、結(jié)合抑制劑所占據(jù)的空間、抑制劑與蛋白質(zhì)之間的互補(bǔ)接觸表面的量、給定化合物的結(jié)合的變形能，和對(duì)氫鍵鍵合強(qiáng)度和/或靜電相互作用能的某些估計(jì)?？捎糜谏鲜鲈u(píng)估的技術(shù)的實(shí)例包括量子力學(xué)、分子力學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)、Monte-Carlo抽樣、系統(tǒng)搜索和距離幾何的方法(Marshall，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，27193，1987)。已開發(fā)出具體的計(jì)算機(jī)軟件供用于執(zhí)行這些方法。為這種用途而設(shè)計(jì)的程序的實(shí)例包括Gaussian 92[美國賓夕法尼亞州匹茲堡市M.J.Frisch，Gaussian，Inc.公司，1993]；AMBER[P.A.Kollman，美國加州大學(xué)舊金山分校，1993]；QUANTA/CHARMM[美國加州San Diego市Molecular Simulations，Inc.公司，1992]。也可應(yīng)用其它的分子建模技術(shù)來篩選pyrH的抑制劑。參見例如Cohen等，1990，J.Med.Chem.，33883-894；Navia和Murcko，1992，Curr.Opin.Struct.Biol.，2202-210。本文描述的建模技術(shù)和計(jì)算機(jī)評(píng)估系統(tǒng)對(duì)本發(fā)明來說不是限制因素，但它們的及時(shí)執(zhí)行都依賴于如圖7所提供的pyrH原子坐標(biāo)的有效性。
其它的硬件系統(tǒng)和軟件包對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的和明顯適用的。
因此，使用這些計(jì)算機(jī)評(píng)估系統(tǒng)，可既快速又容易地檢查大量的化合物，避免昂貴費(fèi)時(shí)的生化測(cè)試。此外，實(shí)際合成許多化合物的需要也有效地得到排除。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過化學(xué)方法、酶學(xué)方法或其它合成方法產(chǎn)生pyrH的候選調(diào)節(jié)物的方法。按本文所描述進(jìn)行鑒定或設(shè)計(jì)的候選調(diào)節(jié)物可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)來產(chǎn)生。
抑制劑一旦用本文描述的建模技術(shù)進(jìn)行了鑒定，就可用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來測(cè)試其pyrH結(jié)合和抑制生物活性。例如，pyrH可用于使用常規(guī)方式(format)的結(jié)合測(cè)定法中來篩選抑制劑。適用的測(cè)定法包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或熒光猝滅測(cè)定。也可使用其它測(cè)定方式，例如產(chǎn)物的產(chǎn)生可用分光光度法檢測(cè)的偶聯(lián)測(cè)定法；這些測(cè)定方式對(duì)于本發(fā)明來說不是限制因素。
體外和體內(nèi)結(jié)合分析本發(fā)明的方法包括用本文描述的晶體結(jié)構(gòu)和新型結(jié)合位點(diǎn)鑒定pyrH抑制劑的方法。包括在本發(fā)明中的抑制劑包括任何能結(jié)合pyrH的整體或結(jié)合位點(diǎn)的抑制劑，可以是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。這些抑制劑一旦得到鑒定和篩選了生物活性，就可作治療性或預(yù)防性使用，以阻斷細(xì)菌生長和傳播。
一種設(shè)計(jì)方法是用由多種不同化學(xué)實(shí)體組成的分子探查本發(fā)明的pyrH，以確定候選pyrH結(jié)合物質(zhì)和pyrH之間的相互作用的最佳位點(diǎn)。用含有目的化合物的溶液浸泡晶體，從晶體收集到的高分辨率X射線衍射數(shù)據(jù)為確定每種類型的分子在哪里結(jié)合提供了可能。本文所用的術(shù)語“浸泡”指將晶體轉(zhuǎn)移到含有目的化合物、抑制劑、底物或別構(gòu)調(diào)節(jié)物的溶液(例如有機(jī)溶劑)中的過程。然后可設(shè)計(jì)、合成能緊密結(jié)合這些位點(diǎn)的小分子，并測(cè)試它們的pyrH抑制活性(Bugg等，1993，Scientific American，Dec92-98；West等，1995，TIPS，1667-74)。
本發(fā)明的pyrH也可用來確認(rèn)結(jié)合情況和提供有關(guān)所鑒定出的物質(zhì)的結(jié)合模式的信息，所述物質(zhì)例如通過本文描述的任何計(jì)算機(jī)建模方法、體外結(jié)合測(cè)定法或高通量篩選來鑒定。例如，可將從在提議結(jié)合物質(zhì)存在下生長的pyrH晶體收集到的高分辨率衍射數(shù)據(jù)與圖7列表所示的pyrH原子坐標(biāo)組合使用，來用下文描述的分子置換方法獲得pyrH和提議結(jié)合物質(zhì)之間的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)?；蛘?，可將圖7所列的pyrH分子原子坐標(biāo)直接與實(shí)驗(yàn)X射線衍射數(shù)據(jù)組合使用，產(chǎn)生差值傅里葉電子密度圖，由該圖可鑒定出所述物質(zhì)的結(jié)合情況?；蛘呖蓪㈩A(yù)先存在的pyrH晶體轉(zhuǎn)移到含有提議結(jié)合物質(zhì)的溶液中，保持足以讓所述物質(zhì)擴(kuò)散穿過晶體點(diǎn)陣而結(jié)合pyrH的結(jié)合位點(diǎn)的時(shí)間。然后可從這些晶體收集X射線衍射數(shù)據(jù)，如上所述用以確定所述物質(zhì)與pyrH的結(jié)合的性質(zhì)。這些方法能確認(rèn)所述物質(zhì)與pyrH的結(jié)合，另外還能闡明pyrH與結(jié)合物質(zhì)之間的任何相互作用的性質(zhì)，使得可以對(duì)結(jié)合物質(zhì)再作多輪最優(yōu)化。
本發(fā)明的pyrH還可例如與NMR波譜學(xué)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)組合使用，以確認(rèn)所鑒定出的物質(zhì)的結(jié)合情況，所述物質(zhì)例如通過上述任何計(jì)算機(jī)建模方法，或者通過任何其它方法如體外結(jié)合測(cè)定法或高通量篩選來鑒定。例如，測(cè)量在存在或不存在結(jié)合物質(zhì)下進(jìn)行分析的pyrH樣品的NMR化學(xué)位移變化，可測(cè)定出所述物質(zhì)對(duì)pyrH的結(jié)合親和力(KD)。此外，將引起化學(xué)位移變化的殘基映射到本發(fā)明pyrH的結(jié)構(gòu)上，可以鑒定目的物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。參見例如Otting，1993，CurrentOpinion in Structural Biology，3760-768；Hensmann等，1994，ProteinScience，31020-1030；Craik等，1990，Annual Reports on NMRSpectroscopy，2261-128。
本發(fā)明涵括用以鑒定pyrH抑制劑的體外生物測(cè)定法。該測(cè)定法可以是如2004年5月19日提交的PCT/GB2004/002158(通過引用整體結(jié)合到本文中)所詳細(xì)描述的單酶或雙酶活性測(cè)定法，或者是等同的體外測(cè)定系統(tǒng)，在這種系統(tǒng)中先將小分子、蛋白質(zhì)或其片斷加入到細(xì)菌中，然后再加入別構(gòu)效應(yīng)物和/或底物。當(dāng)細(xì)菌與對(duì)照(缺乏抑制劑)相比其生長受到抑制時(shí)，就鑒定出pyrH的抑制劑。
本發(fā)明還包括受試結(jié)合物質(zhì)的抗菌活性的體內(nèi)分析。該方法包括用足以在哺乳動(dòng)物受試對(duì)象(優(yōu)選非人靈長類動(dòng)物或嚙齒動(dòng)物)中引起感染的臨床相關(guān)量的細(xì)菌感染所述受試對(duì)象。細(xì)菌引起感染后，就可將受試抑制劑(例如抗菌結(jié)合物質(zhì))給予受試對(duì)象。單獨(dú)的對(duì)照組可給予安慰劑?？稍诓煌臅r(shí)間點(diǎn)收集組織、血液和血制品，以確定感染進(jìn)程，將能減少(部分上或全部)感染程度的物質(zhì)確定為感染的有效抑制劑(參見例如Sande等，1988，Reviews of Infectious Diseases，10 Suppl.1S113-6或者Jacobs，2003，International Journal of InfectiousDiseases，7 Suppl 1S13-20)
同源建模在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用圖7所描述的流感嗜血桿菌pyrH的原子坐標(biāo)，產(chǎn)生流感嗜血桿菌pyrH蛋白質(zhì)同系物或變體的3D原子坐標(biāo)的方法，所述方法包括a.鑒定出一個(gè)或多個(gè)與流感嗜血桿菌pyrH同源的多肽序列；b.將所述序列與包含具有SEQ ID NO14氨基酸序列的多肽的流感嗜血桿菌pyrH的序列進(jìn)行比對(duì)；c.鑒定出同源序列和流感嗜血桿菌pyrH之間的結(jié)構(gòu)保守區(qū)和結(jié)構(gòu)可變區(qū)；d.用流感嗜血桿菌pyrH的原子坐標(biāo)如圖7所列的原子坐標(biāo)，產(chǎn)生流感嗜血桿菌pyrH同源序列的結(jié)構(gòu)保守殘基的3D原子坐標(biāo)；e.產(chǎn)生同源序列的結(jié)構(gòu)可變區(qū)中的螺旋、鏈、環(huán)和/或轉(zhuǎn)角的構(gòu)象；f.建立同源序列的側(cè)鏈構(gòu)象；g.將保守殘基、環(huán)和側(cè)鏈構(gòu)象的3D原子坐標(biāo)進(jìn)行組合，產(chǎn)生同源序列的完全或部分3D原子坐標(biāo)。
因此，本文描述的pyrH結(jié)構(gòu)為實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)信息不容易獲得的同源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)建模提供了可能。
分子置換pyrH可以以不止一種形式結(jié)晶。因此，本文描述的pyrH原子坐標(biāo)對(duì)于解析pyrH另外的晶型或pyrH另外的晶型的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特別有用。本發(fā)明的pyrH的某些部分起到活性位點(diǎn)(底物結(jié)合位點(diǎn))的作用。它們也可用來解析pyrH突變體、pyrH復(fù)合物、pyrH同工酶的結(jié)構(gòu)，或者與pyrH功能域有顯著氨基酸序列同源性或結(jié)構(gòu)同源性的其它蛋白質(zhì)的晶型的結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，顯著的氨基酸序列同源性包括與pyrH的任何功能域有至少40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
為此目的可采用的一種方法是分子置換。用這種方法，未知的晶體結(jié)構(gòu)，無論它是流感嗜血桿菌pyrH的另一種晶型、pyrH同工酶或pyrH共復(fù)合物，還是與任何pyrH功能域有顯著氨基酸序列同源性的某些其它蛋白質(zhì)的晶體，都可用本發(fā)明的pyrH原子坐標(biāo)進(jìn)行確定。用這種方法為未知晶體提供準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)形式，比試圖從頭開始確定這種結(jié)構(gòu)信息要快得多和有效得多。
可用于執(zhí)行分子置換的各步驟的程序的實(shí)例包括MOLREP(Vagin和Teplyakov，1997，J.Appl.Cryst.，301022-1025)、AMoRe(Navaza，2001，Acta Cryst.，D57(10)1367-1372)、Beast(Read，2001，ActaCryst.，D57(10)1373-1382)、GLRF(Tong和Rossmann，1990，ActaCryst.，A46783-792)、COMO(Jogl等，2001，Acta Cryst.，D57(8)1127-1134)、EPMR(Kissinger等，1999，Acta Cryst.，D55(2)484-491)。MOLREP、AmoRe和Beast軟件是作為CCP4軟件包(CCP4，Acta Cryst.，D50760-763，1994)的一部分來分銷的。舉例說，MOLREP是一種集成的分子置換軟件，用以下兩步程序?qū)ふ曳肿又脫Q解決方案(1)旋轉(zhuǎn)函數(shù)(RF)搜索，以鑒定模型的方向；(2)交叉平移函數(shù)(TF)和堆積函數(shù)(packing function，PF)搜索，以鑒定定向模型的位置。平移函數(shù)通過給旋轉(zhuǎn)函數(shù)的各個(gè)峰計(jì)算相關(guān)系數(shù)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序，來檢核這幾個(gè)峰。堆積函數(shù)在排除對(duì)應(yīng)于重疊對(duì)稱性的不正確解決方案方面很重要。可將MOLREP設(shè)定成可搜索每個(gè)不對(duì)稱單元任何數(shù)量的分子，且可在添加另外的分子也不能實(shí)現(xiàn)解決方案的進(jìn)一步改進(jìn)時(shí)自動(dòng)停止運(yùn)行。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供涉及分子置換的方法，其用上述軟件程序或本領(lǐng)域公知的等同程序以及本文描述和圖7列表所示的原子坐標(biāo)，來獲得結(jié)構(gòu)未知的分子或分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息。
本發(fā)明的實(shí)施除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)施可采用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA操作、X射線晶體學(xué)、核磁共振波譜學(xué)和分子建模的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。這種技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的說明。參見例如Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis編輯(ColdSpring Harbor Laboratory Press1989)；DNA Cloning，第I和II卷(D.N.Glover編輯，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編輯，1984)；Mullis等，美國專利第4,683,195號(hào)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯.1984)；B.Perbal，A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；論文集，Methods In Enzymology(AcademicPress，Inc.，美國紐約州)；Methods In Enzymology，第154和155卷(Wu等編輯)，Crystallography made crystal cleara guide for users ofmacromolecular models(Gale Rhodes，第2版，San DiegoAcademicPress，2000)。
等同方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，可不背離本發(fā)明的范圍和精神，作出本發(fā)明的各種修改和變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過考慮本說明書和實(shí)施本文描述的本發(fā)明，會(huì)明白本發(fā)明的其它實(shí)施方案。我們的意圖是，應(yīng)認(rèn)為說明書和實(shí)施例只是示例性的，本發(fā)明的真正范圍和精神由權(quán)利要求書來指明。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步的說明，這些實(shí)施例旨在詳細(xì)闡述本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案。這些實(shí)施例不意在或不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1流感嗜血桿菌pyrH的克隆、純化和表征流感嗜血桿菌pyrH UMP激酶基因(HI-1065)克隆自由已測(cè)序RdKW20株提取(Fleischmann等，1995 Science，269496-512)的基因組DNA?？寺∈怯脤ｉT設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增HI-1065的蛋白質(zhì)編碼序列來實(shí)現(xiàn)的。將NcoI限制酶(RE)位點(diǎn)工程改造到5’引物中，SalI RE位點(diǎn)工程改造到3’引物中，以促進(jìn)亞克隆到pET28b中進(jìn)行過表達(dá)。5’引物包括ATG起始密碼子上游的9bp，3’引物包括TAG終止密碼子下游的16bp(包括SalI)。當(dāng)引入NcoI位點(diǎn)時(shí)，pyrH第二密碼子的第一個(gè)核苷酸從A(GC)變成G(GC)，導(dǎo)致由絲氨酸(在HI1065編碼蛋白質(zhì)序列中)向甘氨酸(在pSM143編碼蛋白質(zhì)序列中)的置換。
用于擴(kuò)增的兩個(gè)引物如下5′HI1065-NcoI5’GAAAAAACCATGGGCCAACCAATTTATAAACG 3’SEQ ID NO113′HI1065R-SalI5’TTCTTGTCGACATTCACTAACAAATAGTGGTGCC 3’SEQ ID NO12用上述引物進(jìn)行pyrH的PCR擴(kuò)增后，將所得DNA凝膠純化，并克隆到pGEM-T(Promega)中。此克隆(pSM143)中的DNA插入物經(jīng)分析確認(rèn)存在正確的序列，沒有非預(yù)計(jì)的錯(cuò)誤。它經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)3’SalIRE位點(diǎn)沒有按設(shè)計(jì)那樣存在(極有可能由于引物合成中的錯(cuò)誤)。但是，蛋白質(zhì)編碼序列卻是正確的，因此將pyrH基因首先作為PstI-SacII片斷(pSM144)從pSM143亞克隆到pUC128中(Keen等，1988，Gene，70(1)191-197)，隨后作為NcoI-EcoRI片斷克隆到pET28b中，產(chǎn)生pSM145。將pSM145轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)株中進(jìn)行過表達(dá)。表達(dá)在30℃下進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到OD600在0.35-0.5之間時(shí)，用1mM IPTG誘導(dǎo)生長中的培養(yǎng)物。細(xì)胞再生長2小時(shí)后，離心收集細(xì)胞，冷卻至4℃。將所得細(xì)胞團(tuán)(cell paste)凍藏。硒代甲硫氨酸(SeMet)標(biāo)記的pyrH的生產(chǎn)如下實(shí)現(xiàn)使大腸桿菌BL21(DE3)/pSM145細(xì)胞在補(bǔ)加0.05mg/ml SeMet和40μg/ml卡那霉素的2L M9基本培養(yǎng)基中室溫下生長5.5小時(shí)，然后用1mM IPTG室溫下過夜誘導(dǎo)pyrH表達(dá)。2H13C15N標(biāo)記的pyrH的生產(chǎn)如下實(shí)現(xiàn)使大腸桿菌BL21(DE3)/pSM145細(xì)胞在補(bǔ)加40μg/ml卡那霉素的1L Silante大腸桿菌OD2 CDN培養(yǎng)基(VLI Research)中30℃下生長6.5小時(shí)，然后用1mM IPTG 30℃下過夜誘導(dǎo)pyrH表達(dá)。
pSM145中的克隆插入物的核苷酸序列ATGGGCCAACCAATTTATAAACGTATTTTATTGAAATTAAGCGGTGAAGCATTACAAGGAGAAGATGGTCTTGGTATCGATCCTGCGATTCTCGATCGTATGGCTGTTGAAATTAAAGAATTAGTGGAGATGGGTGTGGAAGTCAGTGTCGTTCTCGGTGGTGGCAACTTATTCCGTGGCGCAAAACTAGCAAAAGCGGGGATGAATCGCGTGGTGGGCGATCATATGGGAATGCTTGCTACTGTGATGAATGGTTTGGCAATGCGTGATTCTTTATTCCGTGCTGATGTGAACGCAAAATTAATGTCCGCTTTCCAATTAAATGGTATTTGCGATACTTATAACTGGTCTGAAGCTATCAAAATGTTACGCGAAAAACGCGTAGTCATTTTCTCTGCGGGAACGGGAAATCCATTCTTTACCACTGATTCTACCGCTTGTTTGCGTGGTATTGAAATTGAAGCTGATGTTGTGTTGAAAGCGACTAAAGTTGATGGTGTGTATGATTGTGATCCTGCGAAAAATCCTGATGCAAAACTTTATAAAAATTTAAGTTATGCAGAAGTGATCGATAAAGAATTAAAAGTGATGGACTTATCGGCGTTTACTTTAGCTCGCGATCATGGCATGCCGATTAGAGTGTTCAATATGGGTAAACCTGGAGCATTACGTCAAGTAGTGACTGGTACTGAAGAAGGCACCACTATTTGTTAG(SEQ ID NO13)pSM145中的克隆插入物的氨基酸序列MGQPIYKRILLKLSGEALQGEDGLGIDPAILDRMAVEIKELVEMGVEVSVVLGGGNLFRGAKLAKAGMNRVVGDHMGMLATVMNGLAMRDSLFRADVNAKLMSAFQLNGICDTYNWSEAIKMLREKRVVIFSAGTGNPFFTTDSTACLRGIEIEADVVLKATKVDGVYDCDPAKNPDAKLYKNLSYAEVIDKELKVMDLSAFTLARDHGMPIRVFNMGKPGALRQVVTGTEEGTTIC(SEQ ID NO14)
用于結(jié)晶的流感嗜血桿菌pyrH的純化將冰凍的細(xì)胞團(tuán)懸浮于40ml的裂解緩沖液[50mM Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA，2mM DTT，2mM UTP，1mM PMSF，1片蛋白酶抑制劑混合物片劑(Roche Molecular Biochemical)]中。使細(xì)胞兩次通過在18,000psi下操作的法式壓濾器(French press)進(jìn)行破裂，粗提取物在4℃下25,000rpm(45Ti rotor，Beckman)離心30分鐘。上清液以1.5ml/min的流速加樣到用緩沖液A(50mM Tris-HCl，pH 8.0，2mMEDTA，2mM DTT，2mM UTP)預(yù)平衡的20ml Q-Sepharose HP(HR16/10)柱(Amersham Biosciences)上。然后用緩沖液A洗滌該柱，蛋白質(zhì)以緩沖液A中0-1M NaCl的線性梯度洗脫。集中含有pyrH的級(jí)分，加入固體(NH4)2SO4(0.4g/ml)使所有的蛋白質(zhì)沉淀，并在冰上混合1小時(shí)。將樣品在4℃下11,000rpm(JA12 rotor，Beckman)離心30分鐘。將沉淀溶于7ml的緩沖液A中。將該7ml樣品以1.0ml/min的流速加樣到用緩沖液B(50mM Tris-HCl，pH 8.0，2mM EDTA，2mM DTT，2mM UTP，150mM NaCl)預(yù)平衡的320ml Sephacryl S-300(HR 26/60)柱(Amersham Biosciences)上。集中含有pyrH的級(jí)分，對(duì)1L儲(chǔ)存緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM UTP，150mM NaCl，2mM DTT，20％甘油)進(jìn)行透析。
蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分析和分析型LC-MS進(jìn)行表征。測(cè)定出的蛋白質(zhì)質(zhì)量表明，從DNA序列預(yù)測(cè)出的多肽的N末端甲硫氨酸不存在[預(yù)期分子量＝25569.0Da(-N末端Met)，觀測(cè)分子量＝25565Da(-N末端Met)]。將該蛋白質(zhì)在193K下保藏。
用于結(jié)晶的SeMet標(biāo)記流感嗜血桿菌PyrH的純化將冰凍的細(xì)胞團(tuán)懸浮于40ml的裂解緩沖液[50mM Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA，2mM DTT，2mM UTP，1mM PMSF，1片蛋白酶抑制劑混合物片劑(Roche Molecular Biochemical)]中。使細(xì)胞兩次通過在18,000psi下操作的法式壓濾器進(jìn)行破裂，粗提取物在4℃下25,000rpm(45Ti rotor，Beckman)離心30分鐘。上清液以1.5ml/min的流速加樣到用緩沖液A(50mM Tris-HCl，pH 8.0，2mM EDTA，2mM DTT，2mM UTP)預(yù)平衡的20ml Q-Sepharose HP(HR16/10)柱(AmershamBiosciences)上。然后用緩沖液A洗滌該柱，蛋白質(zhì)以緩沖液A中0-1M NaCl的線性梯度洗脫。集中含有pyrH的級(jí)分，加入固體(NH4)2SO4(0.4g/ml)以使所有的蛋白質(zhì)沉淀，并在冰上混合1小時(shí)。將樣品在4℃下11,000rpm(JA12 rotor，Beckman)離心30分鐘。將沉淀溶于6ml的緩沖液A中。將該6ml樣品以1.0ml/min的流速加樣到用緩沖液B(50mM Tris-HCl，pH 8.0，2mM EDTA，2mM DTT，2mM UTP，150mM NaCl)預(yù)平衡的320ml Sephacryl S-300(HR 26/60)柱(AmershamBiosciences)上。集中含有pyrH的級(jí)分，對(duì)1L儲(chǔ)存緩沖液(50mMTris-HCl，pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM UTP，150mM NaCl，2mM DTT，20％甘油)進(jìn)行透析。
蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分析和分析型LC-MS進(jìn)行表征。測(cè)定出的蛋白質(zhì)質(zhì)量表明，從DNA序列預(yù)測(cè)出的多肽的N末端甲硫氨酸不存在，且所有其它甲硫氨酸都被硒代甲硫氨酸(SeMet)正確置換[預(yù)期分子量＝26127.6Da(-N末端SeMet)，觀測(cè)分子量＝26126.0Da(-N末端SeMet)]。將該蛋白質(zhì)在193K下保藏。
用于核磁共振波譜學(xué)實(shí)驗(yàn)的同位素標(biāo)記流感嗜血桿菌pyrH的純化2H13C15N標(biāo)記流感嗜血桿菌pyrH的純化按對(duì)SeMet標(biāo)記pyrH的描述來進(jìn)行。
實(shí)施例2流感嗜血桿菌pyrH的結(jié)晶將純化的流感嗜血桿菌pyrH以約10mg/ml的蛋白質(zhì)濃度在288K溫度下和在核苷酸(1mM UMP，1mM UTP，1mM GTP和1mM ATP)存在下進(jìn)行稀疏矩陣結(jié)晶篩選。篩選先導(dǎo)物(lead)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化。
具有圖7的原子坐標(biāo)的晶體用懸滴法(參見例如“ProteinCrystallization”，Terese M.Bergfors(編輯)，International University Line，第7-15頁，1999)通過蒸汽擴(kuò)散來獲得。純化的SeMet標(biāo)記流感嗜血桿菌pyrH已經(jīng)以93mg/ml的濃度在儲(chǔ)存緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.0，0.1mM EDTA，1mM UTP，150mM氯化鈉，2mM DTT，20％甘油)中193K下保藏。將含有大約2.3mg蛋白質(zhì)的單一等分試樣從冷藏中解凍出來，并在以下緩沖液中充分洗滌50mM Tris-HCl pH 8.5，50mMNaCl，10mM DTT，0.1mM EDTA，1mM ATP，1mM GTP，1mM UMP，1mM UTP。將最終蛋白質(zhì)濃度調(diào)整至10mg/ml。晶體也可用約5至約20mg/ml的最終蛋白質(zhì)濃度來獲得。在最終蛋白質(zhì)溶液中AMP-PNP、2’-BrATP或2’-IATP都成功地代替了ATP。池液(reservoirsolution)通常含有22-27％(w/v)聚乙二醇(PEG)1000、100mM硫酸鋰和100mM磷酸-檸檬酸緩沖液pH 5.0。磷酸-檸檬酸緩沖液是通過用檸檬酸滴定磷酸氫二鈉至達(dá)到所需的pH來制備的。PEG1000在池液中的濃度可在約15％(w/v)至約30％(w/v)之間，而晶體通過相應(yīng)調(diào)整蛋白質(zhì)溶液中的pyrH濃度或者懸滴中的蛋白質(zhì)溶液與池液之比來獲得。晶體也可用其中多種不同分子量的PEG(PEG600至PEG8000)代替了PEG1000，且其中多種其它鹽類(例如硫酸鈉、氯化鈉、氯化鋰)代替了硫酸鋰的池液來獲得。硫酸鋰在池液中的濃度可在約50mM至約400mM之間，約100至約250mM硫酸鋰時(shí)觀察到最佳結(jié)果。
懸滴是如下建立的將2微升的蛋白質(zhì)溶液與2微升的池液混合，并將該液滴懸浮在500微升的池液的上面。觀察到在288K的環(huán)境溫度下5天內(nèi)有尺寸最大至400×200×100微米的晶體生長出來。在更寬的溫度范圍內(nèi)(約285K至約295K)也獲得晶體。懸滴的大小和蛋白質(zhì)與池液之比都可加以改變。未標(biāo)記pyrH在類似于SeMet標(biāo)記蛋白質(zhì)的條件下結(jié)晶，例外的是蛋白質(zhì)溶液中用2mM DTT代替10mMDTT。
按以下方式將冷凍保護(hù)劑引入到含有選定晶體的液滴中。制備含有池液的儲(chǔ)備溶液(stock solution)，該池液對(duì)應(yīng)于補(bǔ)加5、10、15和20％(v/v)乙二醇的選定液滴。假定如上所述建立(即將2微升的蛋白質(zhì)溶液與2微升的池液混合)的含有晶體的完全平衡液滴的名義(nominal)液滴體積是2微升。將一名義液滴體積(即2微升)的補(bǔ)加5％(v/v)乙二醇的池液加入到含有晶體的選定液滴中，輕輕混合，讓其平衡30秒。將一名義液滴體積(即2微升)的補(bǔ)加10％(v/v)乙二醇的池液加入到該液滴中，輕輕混合，讓其平衡30秒。然后將兩名義液滴體積(即4微升)的補(bǔ)加15％(v/v)乙二醇的池液加入到含有晶體的該液滴中，輕輕混合，讓其平衡30秒。然后用晶體支撐環(huán)(mounting loop)(美國加州Hampton Research公司)吸取該液滴溶液的樣品，在冷(100K)氮?dú)饬髦锌焖倮鋮s進(jìn)行測(cè)試。如果該溶液形成透明玻璃狀物，則從該液滴取出選定的晶體，同樣進(jìn)行快速冷卻。如果該溶液形成不透明的冰狀物，則將兩名義液滴體積(即4微升)的補(bǔ)加20％(v/v)乙二醇的池液加入到含有晶體的該液滴中，輕輕混合，讓其平衡30秒，然后再用晶體支撐環(huán)從該液滴移取選定的晶體，并在冷(100K)氮?dú)饬髦锌焖倮鋮s。快速冷卻的晶體通常先在公司內(nèi)(in-house)的Mar345監(jiān)測(cè)器(MarResearch，德國漢堡市)上進(jìn)行測(cè)試，然后再在同步加速器輻射源進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。
實(shí)施例3X射線衍射數(shù)據(jù)收集用公司內(nèi)的X射線源(MarResearch 345mm成像板探測(cè)器系統(tǒng)，X射線在以45kV和90mA操作的Bruker-Nonius FR591旋轉(zhuǎn)陽極上產(chǎn)生)使晶體衍射至約3.2分辨率。晶體屬于斜方六面體空間群R32，晶胞參數(shù)為a＝b＝c＝(146.5+/-0.7)，α＝β＝γ＝(97.38+/-0.07)°。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，斜方六面體空間群的六角形等同物方便操作，其中本發(fā)明的pyrH晶體的晶胞參數(shù)是a＝b＝(215+/-1.0)，c＝(233.6+/-1.5)和α＝β＝90°，γ＝120°。這一晶型為圖7的原子坐標(biāo)所涵括。完全數(shù)據(jù)集在英國Daresbury PX14.2 SRS(同步輻射源)收集至2.3分辨率(參見表2峰1)。
MAD(多波長反常散射法)數(shù)據(jù)在英國Daresbury PX14.2 SRS從SeMet標(biāo)記流感嗜血桿菌pyrH的單晶收集得到。在三個(gè)不同波長下(0.9600、0.9794和0.9797)收集了四個(gè)數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)分別用以下程序進(jìn)行自動(dòng)索引和集中(autoindexed and integrated)、定標(biāo)和歸并(scaled and merged)及舍項(xiàng)(truncated)MOSFLMv6.2.3(Leslie，JntCCP4/ESF EACMB Newslett.Protein Crystallogr.，26，1992；Powell，1999，Acta Cryst.D55(10)1690-1695)、SCALA和TRUNCATE(CollaboratiVe Computational Project，Number 4(CCP4)，Acta Cryst.，D50760-763，1994)。MAD數(shù)據(jù)收集的統(tǒng)計(jì)資料在表2中顯示。
表2.在PX14.2 SRS收集的MAD數(shù)據(jù)；最大分辨率2.3
Rfac＝Sum|<I>-Ij|/Sum|Ij|R反常＝Sum|<I+>-<I->|/Sum|<I+>-<I->|實(shí)施例4使用MAD數(shù)據(jù)的相位測(cè)定用Xprep程序(Bruker，Madison，USA)從表1描述的四個(gè)數(shù)據(jù)集分析、定標(biāo)和計(jì)算deltaF值(deltaF＝|F+-F-|)。
晶胞含量的分析表明，晶體不對(duì)稱單元可能含有6-12個(gè)分子的pyrH。鑒于已知流感嗜血桿菌pyrH在溶液中作為同型六聚體存在，我們起初設(shè)想不對(duì)稱單元會(huì)含有單一的六聚集合體(即六個(gè)pyrH分子，因此72硒原子(Se))。將Xprep的deltaF值輸出用作ShelxD程序(Schneider等，2002，Acta Cryst.，D581772-1779)的輸入，要求ShelxD程序?qū)ふ?2個(gè)Se位點(diǎn)。最高等級(jí)解決方案(CC＝59.4％)含有101個(gè)潛在的Se位點(diǎn)，在第70個(gè)位點(diǎn)后占有率(occupancy)明顯下降。對(duì)這頭72個(gè)Se位點(diǎn)進(jìn)行核實(shí)，并用ShelxE程序(Sheldrick，2002，Zeitschriftfur Kristallographie，217(12)644-650)確定其正確的對(duì)映體對(duì)比度值(0.46，這個(gè)值可指示實(shí)驗(yàn)電子密度圖中的大波動(dòng)區(qū)域(在蛋白質(zhì)包膜當(dāng)中)和小波動(dòng)區(qū)域(在溶劑當(dāng)中)的存在)和連通度值(0.91，這個(gè)值是電子密度圖中分別被歸為溶劑和非溶劑的相鄰像素的分?jǐn)?shù))高，表明是正確的溶液。用溶劑翻轉(zhuǎn)法(solvent flipping)(一種密度修飾方法)對(duì)這72個(gè)Se位點(diǎn)進(jìn)行精修、相位計(jì)算和改進(jìn)，并用以下程序自動(dòng)建立和精修多肽骨架的部分模型SHARP(La Fortelle等，1997，MethodsEnzymol.，276472-494)、SOLOMON(Abrahams等，1996.Acta Cryst.，D5230-42，1996；CCP4，1994，出處同上)、ARP/wARP(Perrakis等，1999，Nature Struct.Biol.，6(5)458-463)和Refmac(Murshudov等，1997，Acta Cryst.，D53(3)240-255；CCP4，1994，出處同上)，這些程序是在AutoSHARP程序集(Bricogne等，2003，Acta Cryst.，D59(11)2023-2030)中執(zhí)行的。四個(gè)數(shù)據(jù)集之中的三個(gè)——峰1(用作天然的)、彎曲和遠(yuǎn)程(參見表2)用作AutoSHARP的輸入。ARP/wARP的部分模型輸出含有1236個(gè)殘基，歸類為70個(gè)單獨(dú)的鏈。對(duì)這個(gè)部分模型和相關(guān)的電子密度圖進(jìn)行檢查，確認(rèn)晶體不對(duì)稱單元中存在pyrH分子的六聚集合體。但是，還鑒定出pyrH分子的另外的二聚體。這個(gè)二聚體靠近晶體三重軸，其結(jié)果是可通過晶體學(xué)對(duì)稱性操作從晶體點(diǎn)陣當(dāng)中的二聚體產(chǎn)生六聚體。因此，所述晶體在不對(duì)稱單元中具有八個(gè)分子的pyrH。
重復(fù)運(yùn)行ShelxD定位出96個(gè)可能的Se位點(diǎn)中的87個(gè)。再次對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行核實(shí)，并用ShelxE程序確定正確的對(duì)映體。對(duì)比度值(0.60)和連通度值(0.93)高，表明是正確的溶液。定位出了另外5個(gè)Se位點(diǎn)，用溶劑翻轉(zhuǎn)法對(duì)總共92個(gè)Se位置進(jìn)行精修、相位計(jì)算和改進(jìn)，并用AutoSHARP程序集里的各程序如前自動(dòng)建立和精修多肽骨架的部分模型。ARP/wARP的部分模型輸出含有1888個(gè)可能殘基中的1244個(gè)，歸類為65個(gè)單獨(dú)的鏈。用SHARP、SOLOMON和DM進(jìn)行的相位測(cè)定統(tǒng)計(jì)資料在表3中給出。
表3.用SHARP、SOLOMON和DM進(jìn)行的相位測(cè)定統(tǒng)計(jì)資料(2.3)
FOM(密度修飾前)非中0.314，中心0.147FOM(溶劑扁平化(solvent flattening)后(SOLOMON))0.710FOM(作ncs平均(DM)密度修飾后)0.769實(shí)施例5流感嗜血桿菌pyrH晶體結(jié)構(gòu)的建模和精修AutoSHARP的電子密度圖輸出通過按DM程序(CCP4，1994，出處同上)作八重非晶體學(xué)對(duì)稱性(ncs)平均進(jìn)行密度修飾有少量改進(jìn)。多肽鏈可容易地通過組合使用得自AutoSHARP的溶劑扁平化圖和得自DM的密度修飾圖來追蹤，并由所述部分模型和所述92個(gè)SeMet位點(diǎn)來指引。建立了pyrH的單個(gè)分子(單體)的初始模型除兩個(gè)環(huán)區(qū)(SEQ ID NO14的氨基酸殘基18-24和氨基酸殘基168-179)外，整個(gè)主鏈和大部分的側(cè)鏈都是明確界定的。由殘基168-179組成的后一環(huán)區(qū)的電子密度在晶體不對(duì)稱單元中的分子子集中可見，這使得可以以一定的置信度建立這個(gè)區(qū)的模型。觀察到差值傅里葉(mFo-DmFc)電子密度圖中對(duì)應(yīng)于結(jié)合磷酸根離子的主要峰，接近保守的富甘氨酸區(qū)(SEQ ID NO14的Gly52-Gly53-Gly54)。所述磷酸極有可能衍生自結(jié)晶池液中存在的磷酸-檸檬酸緩沖液。
然后用來自部分模型的非晶體對(duì)稱性操作，從初始單體模型產(chǎn)生晶體不對(duì)稱單元中的八個(gè)分子。
用Refmac5程序(CCP4，1994，出處同上)使含有八個(gè)分子的這個(gè)模型進(jìn)行20循環(huán)的剛體精修(每個(gè)分子被定義為單個(gè)剛體)。這樣獲得一組改進(jìn)的ncs算子(operator)，供用于隨后各輪ncs限制精修(ncsconstrained refinement)中。使用CNX程序(Accelrys)，實(shí)施主體溶劑(bulk solvent)和總體(overall)各向異性B因子修正，繼續(xù)進(jìn)行精修。針對(duì)從模型計(jì)算的相位，進(jìn)行兩輪ncs限制模擬扭轉(zhuǎn)角動(dòng)力學(xué)退火(ncsconstrained simulated annealing with torsion angle dynamics)(起始溫度2500K)，接著進(jìn)行20循環(huán)的能量最小化，最后進(jìn)行15循環(huán)的單個(gè)各向同性B因子精修。然后用QUANTA程序(Accelrys；Oldfield，ActaCryst.，D57(1)82-94，2001)執(zhí)行一輪交互式建模。此時(shí)發(fā)現(xiàn)差值傅里葉電子密度圖中不屬于任何蛋白質(zhì)側(cè)鏈的另一組主要峰，接近界定二聚體界面的長螺旋(αC，參見圖1-3)C末端近旁的Arg88殘基。這一密度被解釋為由結(jié)合的核苷酸引起。在精修的后面各階段，這個(gè)區(qū)域中的電子密度變得充分透明，足以將七個(gè)分子的別構(gòu)效應(yīng)物GTP放入不對(duì)稱單元中存在的八個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合的GTP分子的三磷酸部分有序性欠佳，其中β-磷酸采取至少三個(gè)不同的構(gòu)象。γ-磷酸的位置沒有得到完全確定，因此在最終模型中將它省略掉。再作一輪交互式重建后，用CNX程序使單體模型再進(jìn)行一輪ncs限制精修。然后和前面一樣通過應(yīng)用ncs算子從精修的單體模型再產(chǎn)生不對(duì)稱單元的整個(gè)內(nèi)容。使用QUANTA程序的交互式建模和使用CNX程序的ncs限制精修(隨著模型質(zhì)量的改進(jìn)而逐步放開ncs限制)再交替進(jìn)行幾輪，產(chǎn)生R值為0.25和R-free值為0.28的模型。用Refmac5程序再作兩輪精修，不應(yīng)用ncs限制對(duì)TLS(平移、擺動(dòng)(libration)和轉(zhuǎn)動(dòng)(screw))、位置和各向同性B參數(shù)進(jìn)行精修，得出R值為0.22和R-free值為0.25的最終模型。
R值描述觀察數(shù)據(jù)與從模型計(jì)算的合成數(shù)據(jù)之間的差異。R-free值也一樣，但從通常占總數(shù)5％的反射測(cè)試組(test set of reflection)計(jì)算，所述反射在精修開始時(shí)留出來充當(dāng)無偏參考(unbiased reference)以避免數(shù)據(jù)的過度擬合。R值不依賴于分辨率，但通常應(yīng)等于或小于0.25，R-free值通常比R值高出不到0.05。
最終模型由最多達(dá)236個(gè)氨基酸(SEQ ID NO14和圖7所定義的分子A的氨基酸殘基1-20、23-168和179-236，分子B的氨基酸殘基1-18和24-236，分子C、D、F、G和H的氨基酸殘基1-236以及分子E的氨基酸殘基1-18和23-236)的八個(gè)多肽鏈、七個(gè)分子的GDP、八個(gè)磷酸根離子、一個(gè)硫酸根離子和358個(gè)有序水分子組成。盡管結(jié)晶溶液中存在1mM ATP、1mM UMP和1mM UTP，但在流感嗜血桿菌pyrH晶體結(jié)構(gòu)中沒有觀察到這些核苷酸。最終模型的統(tǒng)計(jì)資料在表4中給出。
表4.流感嗜血桿菌pyrH最終模型的精修統(tǒng)計(jì)資料
圖7是與GTP和磷酸復(fù)合的流感嗜血桿菌pyrH的晶體結(jié)構(gòu)的三維原子坐標(biāo)列表。所給出的原子坐標(biāo)是晶體非對(duì)稱單元的所有八個(gè)多肽鏈的原子坐標(biāo)。C、D、E、F、G和H鏈構(gòu)成一個(gè)六聚集合體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可用晶體學(xué)對(duì)稱性操作，從由A和B鏈組成的二聚集合體產(chǎn)生類似的六聚集合體。在圖中，原子列表的前面是標(biāo)題CRYST1和緊跟其后的晶胞三維度。接著的三個(gè)數(shù)字定義將原子坐標(biāo)從正交ngstrm坐標(biāo)轉(zhuǎn)換成晶胞分?jǐn)?shù)坐標(biāo)的矩陣。標(biāo)注ATOM的每一行給出了(假定)原子數(shù)、給予每條氨基酸主鏈的標(biāo)示、每種原子類型、氨基酸殘基類型、蛋白質(zhì)鏈標(biāo)示(A包含第一個(gè)分子(鏈)，B包含第二個(gè)分子(鏈)，C包含第三個(gè)分子(鏈)，D包含第四個(gè)分子(鏈)，E包含第五個(gè)分子(鏈)，F(xiàn)包含第六個(gè)分子(鏈)，G包含第六個(gè)分子(鏈)，H包含第六個(gè)分子(鏈))以及氨基酸殘基數(shù)。各行中的頭三個(gè)數(shù)字給出了原子的正交X、Y、Z坐標(biāo)。接著的數(shù)字是占有數(shù)(occupancynumber)，如果該原子在不止一個(gè)位置被看見(氨基酸可在不止一個(gè)方向看見)，則該數(shù)字小于1.0。最后一個(gè)數(shù)字是與該原子的熱振幅有關(guān)的溫度因子。列表末尾的各行數(shù)據(jù)表明包括在模型中的結(jié)合GTP分子(GDP)、磷酸根離子(PO4)、硫酸根離子(SO4)和有序水分子(HOH)。
實(shí)施例6界定流感嗜血桿菌pyrH的結(jié)合位點(diǎn)pyrH晶體的不對(duì)稱單元由八個(gè)拷貝的pyrH多肽鏈(對(duì)應(yīng)于同型六聚集合體)和同型二聚體組成，所述同型二聚體通過結(jié)晶學(xué)對(duì)稱性轉(zhuǎn)化操作可產(chǎn)生六聚集合體。流感嗜血桿菌pyrH六聚集合體可描述為二聚體的三聚體。二聚體是通過穩(wěn)定、保守的疏水核心維持在一起的，所述疏水核心由順著兩個(gè)伸展反向平行α螺旋的表面的甲硫氨酸殘基(殘基68至95，螺旋C，參見圖1)之間的互鎖產(chǎn)生的。另外的相互作用發(fā)生在反向平行定向的各pyrH分子的保守β3-β4環(huán)(包含殘基104至109)之間。一個(gè)pyrH分子中β1-αA環(huán)的殘基25、27、30和31以及αA螺旋的N末端(參見圖1)與另一個(gè)分子中短螺旋區(qū)域(螺旋B，參見圖1)的殘基57、61、62和65之間也存在穩(wěn)定化接觸。因此分子間二聚體界面包括SEQ ID NO14的氨基酸殘基Ile25、Pro27、Leu30、Asp31、Phe57、Lys61、Leu62、Ala65、Gly66、Met67、Asn68、Arg69、Val71、His74、Met75、Gly76、Leu78、Ala79、Val81、Met82、Leu85、Ala86、Arg87、Asp88、Arg89、Phe104、Gln105、Leu106、Asn107、Gly108和Ile109。
三個(gè)二聚體集合在一起，通過相互作用形成六聚集合體，所述相互作用涉及來自第一二聚體的第一分子(鏈)的殘基Asn68、Arg69、Val70、Val71、His74、Arg88、Phe92、Lys99、Gln105、Leu106、Asn107、Gly108、Ile109、Cys110、Asp111、Thr112、Tyr113、Asn114、Trp115、Glu117、Thr134、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Leu147、Arg148、Ile150、Glu151、Glu153、Leu198、Ser199、Thr202、Leu203和His207，來自第二二聚體的第二分子(鏈)的殘基Asn68、Arg69、Va170、Val71、His74、Thr134、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Leu147、Arg148、Ile150、Glu151、Glu153、Leu198、Ser199、Thr202、Leu203和His207，來自所述第二二聚體的第三分子(鏈)的殘基Arg88、Phe92、Lys99、Asn107、Gly108、Ile109、Cys110和Asp111以及來自第三二聚體的第四分子(鏈)的殘基Gln105、Leu106、Thr112、Tyr113、Asn114、Trp115和Glu117。所有的接觸情況用Contact程序(CCP4，1994，出處同上)按5半徑進(jìn)行測(cè)定。因此，分子間二聚體-二聚體界面包含SEQ IDNO14的氨基酸殘基Asn68、Arg69、Val70、Val71、His74、Arg88、Phe92、Lys99、Gln105、Leu106、Asn107、Gly108、Ile109、Cys110、Asp111、Thr112、Tyr113、Asn114、Trp115、Glu117、Thr134、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Leu147、Arg148、Ile150、Glu151、Glu153、Leu198、Ser199、Thr202、Leu203和His207。
別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)別構(gòu)效應(yīng)物GTP在兩個(gè)二聚體的界面結(jié)合，所述界面靠近六聚集合體中央。每個(gè)結(jié)合的GTP分子在對(duì)應(yīng)于一個(gè)二聚體的第一分子的殘基88-99和126、該相同二聚體的第二分子的殘基68-71和相鄰另一二聚體的第三分子的殘基115-123的序列中的位點(diǎn)結(jié)合，而與三個(gè)pyrH分子的殘基接觸(參見圖2-3)。因此，GTP結(jié)合既依賴于也有助于六聚體形成。六聚體在UTP存在下得到穩(wěn)定化，所述UTP可在相鄰二聚單元的界面在與GTP相同的位點(diǎn)結(jié)合。
蛋白質(zhì)和結(jié)合的GTP之間形狀匹配良好。嘌呤環(huán)夾在第一分子的Phe92側(cè)鏈、第二分子的Val71側(cè)鏈和第三分子的Trp115側(cè)鏈中間。結(jié)合并不是完全由有利的范德華相互作用驅(qū)動(dòng)的。有多種極性相互作用存在，例如第一分子的Arg88的側(cè)鏈胍基與鳥嘌呤環(huán)的N7和O6原子之間，以及第一分子的Asp89的骨架氨基和側(cè)鏈羧基與鳥嘌呤環(huán)的N1原子和2-NH2基團(tuán)之間的極性相互作用。核糖羥基通過與第三分子的Arg123胍基之間的二齒合相互作用(bidentate interaction)而得到穩(wěn)定化。另外，第三分子的Ser116和核糖環(huán)之間也存在接觸。結(jié)合的GTP分子的三磷酸部分有序性欠佳，其中β-磷酸采取至少三個(gè)不同的構(gòu)象。α-磷酸通過與第一分子的Arg126側(cè)鏈和第三分子的Ser116側(cè)鏈的相互作用而得到穩(wěn)定化。在一個(gè)觀測(cè)到的構(gòu)象中，β-磷酸通過與第一分子的Asn97和Arg126的側(cè)鏈的相互作用而得到穩(wěn)定化。在另一個(gè)構(gòu)象中，β-磷酸通過與第三分子的Ser116的側(cè)鏈和第一分子的Ala98的骨架羰基的相互作用而得到穩(wěn)定化。在第三個(gè)構(gòu)象中，β-磷酸通過與第一分子的Lys99和Arg126的側(cè)鏈和第三分子的Lys120的側(cè)鏈的相互作用而得到穩(wěn)定化。γ-磷酸的位置沒有得到完全確定，因此在最終模型中將它省略掉。對(duì)晶體不對(duì)稱單元中的八個(gè)分子的相對(duì)構(gòu)象(參見圖4)的分析提示，GTP在別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合可通過調(diào)節(jié)螺旋B(殘基60-65)和其后連接螺旋B與螺旋C(殘基66-69)的環(huán)(αB-αC)(參見圖1)的位置來調(diào)節(jié)活性。我們主張這些殘基形成UMP結(jié)合位點(diǎn)的一部分。
位于結(jié)合GTP分子的5半徑內(nèi)的殘基包括SEQ ID NO14的Gly66、Asn68、Val71、Leu85、Arg88、Asp89、Phe92、Arg93、Asn97、Ala98、Lys99、Leu100、Asp111、Asn114、Trp115、Ser116、Glu117、Ile119、Lys120、Met121、Arg123和Arg126。在其側(cè)鏈與結(jié)合GTP發(fā)生顯著的極性或疏水接觸的殘基當(dāng)中，Val71、Asp89、Asn97、Lys99、Lys120和Arg126在10種細(xì)菌UMP激酶(pyrH)中相當(dāng)保守(參見圖6)。因此，pyrH的別構(gòu)效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)最低限度地包含SEQ IDNO14的殘基Asn68、Val71、Arg88、Asp89、Phe92、Asn97、Lys99、Trp115、Ser116、Ile119、Lys120、Arg123和Arg126，或者在更為擴(kuò)大的定義中包含SEQ ID NO14的殘基Gly66、Asn68、Val71、Leu85、Arg88、Asp89、Phe92、Arg93、Asn97、Ara98、Lys99、Leu100、Asp111、Asn114、Trp115、Ser116、Glu117、Ile119、Lys120、Met121、Arg123和Arg126，或者在使用8測(cè)頭半徑得到的還更為擴(kuò)大的定義中，包含殘基Arg7、Gly66、Met67、Asn68、Arg69、Val70、Val71、Gly72、His74、Gly84、Leu85、Ala86、Met87、Arg88、Asp89、Ser90、Leu91、Phe92、Arg93、Asp95、Val96、Asn97、Ala98、Lys99、Leu100、Met101、Ile109、Cys110、Asp111、Asn114、Trp115、Ser116、Glu117、Ala118、Ile119、Lys120、Met121、Arg123、Glu124、Arg126、Val127、Ile129，Glu151、Ile152和Glu153。
磷酸結(jié)合位點(diǎn)用TOP程序(CCP4，Acta Cryst.，D50760-763，1994；Lu，ProteinData Bank Quarterly Newsletter，7810-11，1996)將最終模型疊置在糞腸球菌(E.faecalis)氨基甲酸激酶(pdb條目1b7b，Marina等，Protein Sci.，8934-940，1999)的晶體結(jié)構(gòu)上。TOP是一種基于原子坐標(biāo)定義的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)比較蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)的自動(dòng)程序。當(dāng)有具有共同二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的同源蛋白質(zhì)時(shí)，TOP程序能自動(dòng)疊置三維模型，檢測(cè)所有結(jié)構(gòu)中結(jié)構(gòu)上等同的殘基，并提供殘基對(duì)殘基的比對(duì)。該程序可計(jì)算出拓?fù)浜徒Y(jié)構(gòu)多樣性的分?jǐn)?shù)，并可產(chǎn)生目的結(jié)構(gòu)在參考結(jié)構(gòu)上的覆蓋。這個(gè)方法可用來對(duì)盡管顯示有限的一級(jí)序列同源性，但卻表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)相似性的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定、比對(duì)和比較。這表明流感嗜血桿菌pyrH晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)合磷酸根近乎精確地覆蓋在糞腸球菌氨基甲酸激酶結(jié)構(gòu)中觀察到的硫酸分子上。我們主張糞腸球菌氨基甲酸激酶結(jié)構(gòu)中的結(jié)合硫酸根離子占據(jù)了從ATP轉(zhuǎn)移到底物氨基甲酸鹽的γ-磷酸基團(tuán)的位點(diǎn)。這個(gè)假設(shè)由與MgADP復(fù)合的激烈熱球菌(P.furiosus)CK樣CPS的晶體結(jié)構(gòu)(Ramón-Maiques等，2000，出處同上)及與底物和過渡態(tài)類似物復(fù)合的大腸桿菌NAGK的晶體結(jié)構(gòu)(Ramón-Maiques等，2002，出處同上；Gil-Ortiz等，2003，出處同上)所證實(shí)。因此我們主張，流感嗜血桿菌pyrH晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)合磷酸根離子占據(jù)了從ATP轉(zhuǎn)移到UMP的磷酸基團(tuán)的位點(diǎn)。兩個(gè)與流感嗜血桿菌pyrH中接觸磷酸根離子的殘基對(duì)等的殘基，在大腸桿菌pyrH中已被突變(Bucurenci等，J.Bacteriol.，180(3)473-477，1998)。突變Arg62His和Asp146Asn(分別與流感嗜血桿菌殘基Arg58和Asp142對(duì)等)導(dǎo)致催化作用的速度下降。因此，包圍著磷酸根離子的區(qū)域可能對(duì)應(yīng)于pyrH酶的活性中心。位于結(jié)合磷酸根分子的5半徑內(nèi)的殘基包括SEQ ID NO14的Lys11、Ser13、Gly14、Glu15、Gly52、Gly53、Gly54、Thr141和Asp142。所有這些殘基在10種細(xì)菌UMP激酶當(dāng)中是完全保守的，例外的是Glu15在肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)的pyrH中是丙氨酸(參見圖6)。更具體的說，磷酸根離子通過與Gly14、Gly53和Gly54的骨架氨基和與Thr141的側(cè)鏈羥基形成氫鍵而得到穩(wěn)定化。在晶體中的磷酸結(jié)合位點(diǎn)子集中，Glu15的側(cè)鏈羥基也接觸到磷酸氧原子。因此，pyrH的磷酸結(jié)合位點(diǎn)最低限度地包含SEQ IDNO14的殘基Ser13、Gly14、Gly52、Gly53、Gly54和Thr141，或者在更為擴(kuò)大的定義中包含SEQ ID NO14的殘基Lys11、Ser13、Gly14、Glu15、Gly52、Gly53、Gly54、Thr141和Asp142，或者在使用8測(cè)頭半徑得到的還更為擴(kuò)大的定義中包含SEQ ID NO14的殘基Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Ala16、Gln18、Val50、Leu51、Gly52、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Leu56、Phe57、Asn58、Gly76、Met77、Ala79、Thr80、Asn83、Phe139、Thr140、Thr141、Asp142、Ile159和Ala160。
推定的ATP結(jié)合位點(diǎn)在與激烈熱球菌(P.furiosus)CK樣CPS-ADP復(fù)合物(Ramón-Maiques等，2000，出處同上)和大腸桿菌NAGK-底物復(fù)合物(Ramón-Maiques等，2002，出處同上；Gil-Ortiz等，2003，出處同上)的疊加的基礎(chǔ)上，使用TOP程序(CCP4，(1994，出處同上)，提出了ATP結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)位點(diǎn)包括SEQ ID NO14的氨基酸殘基Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Ala16、Leu17、Val50、Leu51、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Arg58、Thr80、Asn83、Thr140、Thr141、Asp142、Ser143、Ala145、Lys159、Ala160、Thr161、Lys162、Val163、Gly165、Val166、Tyr167、Asp168、Cys169、Asp170、Pro171、Lys173、Asp174、Ala177、Lys178、Tyr180、Lys191、Glu192、Leu193、Lys194、Val195、Met196、Asp197、Val213和Phe214。在這些殘基當(dāng)中，Lys11、Ser13、Gly14、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Thr80、Asn83、Thr141、Asp142、Val163、Gly165、Val166、Asp170、Pro171、Ala177、Leu193、Met196、Asp197和Phe214在10種細(xì)菌UMP激酶(pyrH)中完全保守。Leu12、Glu15、Ala16、Leu17、Val50、Leu51 Arg58、Ser143、Ala145、Tyr167、Val195和Val213也顯示出高水平的保守性(參見圖6)。通過與糞腸球菌CK(Marina等，1999，出處同上)、激烈熱球菌(P.furiosus)CK樣CPS-ADP復(fù)合物(Ramón-Maiques等，2000，出處同上)和大腸桿菌NAGK-底物復(fù)合物(Ramón-Maiques等，2002，出處同上；Gil-Ortiz等，2003，出處同上)的結(jié)構(gòu)的類比發(fā)現(xiàn)，ATP結(jié)合有可能得到包含殘基168-176的柔性環(huán)的構(gòu)象變化的配合(accommodate)。Tyr167骨架羰基和氨基分別與腺嘌呤的6-NH2和N1之間形成兩個(gè)氫鍵，這與腺嘌呤環(huán)向Pro171側(cè)鏈和Cys169-Asp170肽鍵的堆積(packing)相結(jié)合，可能有助于這個(gè)位點(diǎn)對(duì)ATP的特異性。Asp170的側(cè)鏈可能接觸結(jié)合ATP核糖的2’-羥基，而核糖與Gly14、Gly53、Gly54和Thr161的骨架氨基及Lys11、Ser13和Lys159的側(cè)鏈原子的極性相互作用可能有助于三磷酸部分的結(jié)合。殘基Lys11、Asp142和Lys159的三聯(lián)體(triad)(結(jié)構(gòu)上分別與激烈熱球菌(P.furiosus)CK-樣CPS殘基的Lys215，Asp216和Lys277及大腸桿菌NAGK的Lys8、Asp162和Lys217對(duì)等)很可能在催化磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)中起到重要的作用。Lys11的位置被安排至使過渡態(tài)的五價(jià)磷穩(wěn)定化，而Lys159的位置被安排至使反應(yīng)產(chǎn)物ADP的β-磷酸上發(fā)展中的負(fù)電荷穩(wěn)定化。Asp142使兩個(gè)賴氨酸側(cè)鏈保持在適當(dāng)?shù)奈恢?，且可參與配合將與結(jié)合底物ATP的三磷酸部分復(fù)合的鎂離子。
已證明pyrH中與激烈熱球菌(P.furiosus)CK樣CPS和大腸桿菌NAGK中接觸結(jié)合腺嘌呤核苷酸的殘基對(duì)應(yīng)的殘基，其突變會(huì)降低催化作用的速度，這進(jìn)一步證實(shí)了所提出的ATP結(jié)合位點(diǎn)。這些突變?cè)诖竽c桿菌pyrH中是Arg62His、Asp146Asn和Asp174Asn(Bucurenci等，1998，出處同上)。在流感嗜血桿菌pyrH中對(duì)應(yīng)的殘基是Arg58、Asp142和Asp170。因此，所提出的pyrH ATP結(jié)合位點(diǎn)的最低限度定義包含SEQ ID NO14的殘基Lys11、Ser13、Gly14、Glu15、Gly53、Gly54、Asp142、Lys159、Thr161、Val166、Tyr167、Cys169、Asp170和Pro171，更為擴(kuò)大的定義包含SEQ ID NO14的殘基Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Ala16、Gly52、Gly53、Gly54、Arg58、Thr141、Asp142、Lys159、Ala160、Thr161、Lys162、Val163、Gly165、Val166、Tyr167、Asp168、Cys169、Asp170、Pro171、Lys191、Glu192、Leu193、Lys194、Val195和Val213，使用8測(cè)頭半徑得到的還更為擴(kuò)大的定義包含SEQ ID NO14的殘基Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Ala16、Leu17、Val50、Leu51、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Arg58、Thr80、Asn83、Thr140、Thr141、Asp142、Ser143、Ala145、Lys159、Ala160、Thr161、Lys162、Val163、Gly165、Val166、Tyr167、Asp168、Cys169、Asp170、Pro171、Lys173、Asp174、Ala177、Lys178、Tyr180、Lys191、Glu192、Leu193、Lys194、Val195、Met196、Asp197、Val213和Phe214。
推定的UMP結(jié)合位點(diǎn)在表面殘基的保守性和與大腸桿菌NAGK-底物復(fù)合物pdblohb(Ramón-Maiques等，2002，出處同上；Gil-Ortiz等，2003，出處同上)的疊加的基礎(chǔ)上，用TOP程序(CCP4，(1994，出處同上)提出了UMP結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)位點(diǎn)包括SEQ ID NO14的氨基酸殘基Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Val50、Leu51、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Phe57、Arg58、Gly59、Arg69、Val70、Val71、Gly72、Asp73、His74、Met75、Gly76、Met77、Leu78、Ala79、Thr80、Asn83、Ala103、Phe104、Ser131、Ala132、Gly133、Thr134、Gly135、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Thr140、Thr141、Asp142、Ser143、Thr144、Ala145、Leu147和Arg148。所有這些殘基在10種細(xì)菌UMP激酶(pyrH)中高度保守(參見圖6)。對(duì)晶體不對(duì)稱單元中的八個(gè)分子的構(gòu)象進(jìn)行比較，證明某些包圍所提出的UMP結(jié)合位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件即螺旋B(殘基60-65)和其后連接螺旋B和螺旋C的環(huán)(αB-αC)(殘基66-69)的位置具有柔性。有可能UMP結(jié)合得到這些柔性區(qū)域的構(gòu)象變化的配合，因此UMP的結(jié)合可能受別構(gòu)調(diào)節(jié)物在別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合的影響。已證明所提出的結(jié)合位點(diǎn)當(dāng)中的殘基突變會(huì)降低催化作用的速度，這進(jìn)一步證實(shí)了所提出的UMP結(jié)合位點(diǎn)。這些突變?cè)诖竽c桿菌pyrH中是Arg62His、Asp73Asn和Asp142Asn(Bucurenci等，1998，出處同上)。在流感嗜血桿菌pyrH中對(duì)應(yīng)的殘基是Arg58、Asp73和Asp142。因此，所提出的pyrH UMP結(jié)合位點(diǎn)的最低限度定義包含SEQ ID NO14的殘基Gly52、Gly53、Asp73、Gly76、Met77、Thr134、Asn136、Pro137、Phe139、Thr141和Thr144，更為擴(kuò)大的定義包含SEQ ID NO14的殘基Ser13、Gly14、Gly52、Gly53、Gly54、Gly72、Asp73、His74、Gly76、Met77、Thr80、Gly133、Thr134、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139和Thr140，使用8測(cè)頭半徑得到的的還更為擴(kuò)大的定義包含SEQ ID NO14的殘基Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Val50、Leu51、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Phe57、Arg58、Gly59、Arg69、Val70、Val71、Gly72、Asp73、His74、Met75、Gly76、Met77、Leu78、Ala79、Thr80、Asn83、Ala103、Phe104、Ser131、Ala132、Gly133、Thr134、Gly135、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Thr140、Thr141、Asp142、Ser143、Thr144、Ala145、Leu147和Arg148。
實(shí)施例7流感嗜血桿菌PyrH的核磁共振波譜學(xué)研究核磁共振(NMR)波譜學(xué)提供了在氨基酸水平上監(jiān)測(cè)溶液中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的方法。波譜中信號(hào)的位置對(duì)氨基酸的環(huán)境極其敏感，可將這些信號(hào)位置的變化與蛋白質(zhì)和另一個(gè)分子之間的相互作用關(guān)聯(lián)起來。
對(duì)流感嗜血桿菌pyrH的NMR波譜學(xué)實(shí)驗(yàn)是在裝備有三共振(1H/13C/15N)單梯度5mm冷探頭的Bruker Avance 600MHz系統(tǒng)上在298K下進(jìn)行的。蛋白質(zhì)用2H、15N和13C作三重標(biāo)記，并于緩沖液B(50mM Tris/HCl，pH 8.0，2mM EDTA，2mM UTP，150mM NaCl和2mM DTT)中提供。在進(jìn)行HNMR波譜學(xué)實(shí)驗(yàn)之前，先用Millipore的Amicon Ultra-15離心過濾裝置(Billerica，MA，USA)將蛋白質(zhì)樣品充分透析到NMR緩沖液(50mM HEPES，pH 7.8，1mM DTT和1mMUTP或1mM GTP)中。蛋白質(zhì)單體濃度是0.4mM。TROSY-HSQC(Pervushin等，J.Biomol.NMR，12345-348，1998)實(shí)驗(yàn)以85毫秒的質(zhì)子維度演化時(shí)間(evolution time)和32毫秒的氮維度演化時(shí)間進(jìn)行記錄。總?cè)?shù)據(jù)時(shí)間是15小時(shí)。數(shù)據(jù)集用nmrPipe程序(Delaglio等，J.Biomol.NMR，6277-293，1995)進(jìn)行處理，用SPARKY程序(Goddard和Kneller，美國加州大學(xué)舊金山分校)進(jìn)行分析。
用這個(gè)方案獲得的流感嗜血桿菌pyrH的波譜的質(zhì)量非常高，這樣大小的蛋白質(zhì)的預(yù)期峰數(shù)是明顯的。這個(gè)測(cè)定對(duì)于檢測(cè)NMR緩沖液中UTP被GTP替換時(shí)蛋白質(zhì)環(huán)境的變化來說是足夠靈敏的。因此，NMR可用來確認(rèn)旨在發(fā)現(xiàn)pyrH特異性抑制劑的高通量和虛擬篩選活動(dòng)的命中結(jié)果(hit)。此外，NMR可與高分辨率X射線數(shù)據(jù)組合用于基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)中。NMR可用來確認(rèn)抑制劑與pyrH的結(jié)合。
上述實(shí)施例意在說明本發(fā)明，不應(yīng)被解釋為以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解落入本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的修改方案。
序列表<110>AstraZeneca AB<120>激酶的晶體結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用<130>101364<150>US 60/601,765<151>2004-08-16<160>14<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>237<212>PRT<213>肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)<400>1Met Ala Asn Pro Lys Tyr Lys Arg Ile Leu Ile Lys Leu Ser Gly Glu1 5 10 15Ala Leu Ala Gly Glu Arg Gly Val Gly Ile Asp Ile Gln Thr Val Gln20 25 30Thr Ile Ala Lys Glu Ile Gln Glu Val His Ser Leu Gly Ile Glu Ile35 40 45Ala Leu Val Ile Gly Gly Gly Asn Leu Trp Arg Gly Glu Pro Ala Ala50 55 60Glu Ala Gly Met Asp Arg Val Gln Ala Asp Tyr Thr Gly Met Leu Gly65 70 75 80Thr Val Met Asn Ala Leu Val Met Ala Asp Ser Leu Gln Gln Val Gly85 90 95Val Asp Thr Arg Val Gln Thr Ala Ile Ala Met Gln Gln Val Ala Glu100 105 110
Pro Tyr Val Arg Gly Arg Ala Leu Arg His Leu Glu Lys Gly Arg Ile115 120 125Val Ile Phe Gly Ala Gly Ile Gly Ser Pro Tyr Phe Ser Thr Asp Thr130 135 140Thr Ala Ala Leu Arg Ala Ala Glu Ile Glu Ala Asp Ala Ile Leu Met145 150 155 160Ala Lys Asn Gly Val Asp Gly Val Tyr Asn Ala Asp Pro Lys Lys Asp165 170 175Lys Thr Ala Val Lys Phe Glu Glu Leu Thr His Arg Asp Val Ile Asn180 185 190Lys Gly Leu Arg Ile Met Asp Ser Thr Ala Ser Thr Leu Ser Met Asp195 200 205Asn Asp Ile Asp Leu Val Val Phe Asn Met Asn Gln Ser Gly Asn Ile210 215 220Lys Arg Val Val Phe Gly Glu Asn Ile Gly Thr Thr Val225 230 235<210>2<211>238<212>PRT<213>釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)<400>2Glu Pro Lys Tyr Gln Arg Ile Leu Ile Lys Leu Ser Gly Glu Ala Leu1 5 10 15Ala Gly Glu Lys Gly Val Gly Ile Asp Ile Pro Thr Val Gln Ala Ile20 25 30
Ala Lys Glu Ile Ala Glu Val His Val Ser Gly Val Gln Ile Ala Leu35 40 45Val Ile Gly Gly Gly Asn Leu Trp Arg Gly Glu Pro Ala Ala Asp Ala50 55 60Gly Met Asp Arg Val Gln Ala Asp Tyr Thr Gly Met Leu Gly Thr Val65 70 75 80Met Asn Ala Leu Val Met Ala Asp Ser Leu Gln His Tyr Gly Val Asp85 90 95Thr Arg Val Gln Thr Ala Ile Pro Met Gln Asn Val Ala Glu Pro Tyr100 105 110Ile Arg Gly Arg Ala Leu Arg His Leu Glu Lys Asn Arg Ile Val Val115 120 125Phe Gly Ala Gly Ile Gly Ser Pro Tyr Phe Ser Thr Asp Thr Thr Ala130 135 140Ala Leu Arg Ala Ala Glu Ile Glu Ala Asp Ala Ile Leu Met Ala Lys145 150 155 160Asn Gly Val Asp Gly Val Tyr Asn Ala Asp Pro Lys Lys Asp Ala Asn165 170 175Ala Val Lys Phe Asp Glu Leu Thr His Gly Glu Val Ile Lys Arg Gly180 185 190Leu Lys Ile Met Asp Ala Thr Ala Ser Thr Leu Ser Met Asp Asn Asp195 200 205Ile Asp Leu Val Val Phe Asn Met Asn Glu Ala Gly Asn Ile Gln Arg210 215 220Val Val Phe Gly Glu His Ile Gly Thr Thr Val Ser Asn Lys
225 230 235<210>3<211>233<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<400>3Lys Tyr Lys Arg Val Val Leu Lys Leu Ser Gly Glu Ala Leu Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Gly Phe Gly Ile Asn Pro Val Ile Ile Lys Ser Val Ala Glu20 25 30Gln Val Ala Glu Val Ala Lys Met Asp Cys Glu Ile Ala Val Ile Val35 40 45Gly Gly Gly Asn Ile Trp Arg Gly Lys Thr Gly Ser Asp Leu Gly Met50 55 60Asp Arg Gly Thr Ala Asp Tyr Met Gly Met Leu Ala Thr Val Met Asn65 70 75 80Ala Leu Ala Leu Gln Asp Ser Leu Glu Gln Leu Asp Cys Asp Thr Arg85 90 95Val Leu Thr Ser Ile Glu Met Lys Gln Val Ala Glu Pro Tyr Ile Arg100 105 110Arg Arg Ala Ile Arg His Leu Glu Lys Lys Arg Val Val Ile Phe Ala115 120 125Ala Gly Ile Gly Asn Pro Tyr Phe Ser Thr Asp Thr Thr Ala Ala Leu130 135 140Arg Ala Ala Glu Val Glu Ala Asp Val Ile Leu Met Gly Lys Asn Asn145 150 155 160
Val Asp Gly Val Tyr Ser Ala Asp Pro Lys Val Asn Lys Asp Ala Val165 170 175Lys Tyr Glu His Leu Thr His Ile Gln Met Leu Gln Glu Gly Leu Gln180 185 190Val Met Asp Ser Thr Ala Ser Ser Phe Cys Met Asp Asn Asn Ile Pro195 200 205Leu Thr Val Phe Ser Ile Met Glu Glu Gly Asn Ile Lys Arg Ala Val210 215 220Met Gly Glu Lys Ile Gly Thr Leu Ile225 230<210>4<211>240<212>PRT<213>表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)<400>4Met Ala Gln Thr Ser Lys Tyr Lys Arg Val Val Leu Lys Leu Ser Gly1 5 10 15Glu Ala Leu Ala Gly Asp Lys Gly Phe Gly Ile Asn Pro Ile Ile Ile20 25 30Lys Ser Val Ala Gln Gln Val Ala Glu Val Ala Lys Met Asp Cys Glu35 40 45Ile Ala Val Ile Val Gly Gly Gly Asn Ile Trp Arg Gly Lys Thr Gly50 55 60Ser Asp Leu Gly Met Asp Arg Gly Thr Ala Asp Tyr Met Gly Met Leu65 70 75 80Ala Thr Val Met Asn Ala Leu Ala Leu Gln Asp Ser Leu Glu Gln Leu
85 90 95Asp Cys Asp Thr Arg Val Leu Thr Ser Ile Glu Met Lys Gln Val Ala100 105 110Glu Pro Tyr Ile Arg Arg Arg Ala Ile Arg His Leu Glu Lys Lys Arg115 120 125Val Val Ile Phe Ala Ala Gly Ile Gly Asn Pro Tyr Phe Ser Thr Asp130 135 140Thr Thr Ala Ala Leu Arg Ala Ala Glu Val Glu Ala Asp Val Ile Leu145 150 155 160Met Gly Lys Asn Asn Val Asp Gly Val Tyr Ser Ala Asp Pro Lys Val165 170 175Asp Ala Asn Ala Ile Lys Tyr Glu His Leu Thr His Ile Gln Met Leu180 185 190Gln Glu Gly Leu Gln Val Met Asp Ser Thr Ala Ser Ser Phe Cys Met195 200 205Asp Asn Asn Ile Pro Leu Asn Val Phe Ser Ile Met Glu Glu Gly Asn210 215 220Ile Lys Arg Ala Val Met Gly Glu Lys Ile Gly Thr Leu Ile Thr Lys225 230 235 240<210>5<211>240<212>PRT<213>枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)<400>5Met Glu Lys Pro Lys Tyr Lys Arg Ile Val Leu Lys Leu Ser Gly Glu1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Glu Gln Gly Asn Gly Ile Asn Pro Thr Val Ile Gln20 25 30Ser Ile Ala Lys Gln Val Lys Glu Ile Ala Glu Leu Glu Val Glu Val35 40 45Ala Val Val Val Gly Gly Gly Asn Tyr Gly Ala Glu Lys Thr Gly Ser50 55 60Asp Leu Gly Met Asp Arg Ala Thr Ala Asp Tyr Met Gly Met Leu Ala65 70 75 80Thr Val Met Asn Ser Leu Ala Leu Gln Asp Ser Leu Glu Thr Leu Gly85 90 95Ile Gln Ser Arg Val Gln Thr Ser Ile Glu Met Arg Gln Val Ala Glu100 105 110Pro Tyr Ile Arg Arg Lys Ala Ile Arg His Leu Glu Lys Lys Arg Val115 120 125Val Ile Phe Ala Ala Gly Thr Gly Asn Pro Tyr Phe Ser Thr Asp Thr130 135 140Thr Ala Ala Leu Arg Ala Ala Glu Ile Glu Ala Asp Val Ile Leu Met145 150 155 160Ala Lys Asn Asn Val Asp Gly Val Tyr Asn Ala Asp Pro Arg Lys Asp165 170 175Glu Ser Ala Val Lys Tyr Glu Ser Leu Ser Tyr Leu Asp Val Leu Lys180 185 190Asp Gly Leu Glu Val Met Asp Ser Thr Ala Ser Ser Leu Cys Met Asp195 200 205
Asn Asp Ile Pro Leu Ile Val Phe Ser Ile Met Glu Glu Gly Asn Ile210 215 220Lys Arg Ala Val Ile Gly Glu Ser Ile Gly Thr Ile Val Arg Gly Lys225 230 235 240<210>6<211>239<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)<400>6Met Thr Gln Gln Ile Lys Tyr Lys Arg Val Leu Leu Lys Leu Ser Gly1 5 10 15Glu Ser Leu Met Gly Ser Asp Pro Phe Gly Ile Asn His Asp Thr Ile20 25 30Val Gln Thr Val Gly Glu Ile Ala Glu Val Val Lys Met Gly Val Gln35 40 45Val Gly Ile Val Val Gly Gly Gly Asn Ile Phe Arg Gly Val Ser Ala50 55 60Gln Ala Gly Ser Met Asp Arg Ala Thr Ala Asp Tyr Met Gly Met Met65 70 75 80Ala Thr Val Met Asn Ala Leu Ala Leu Lys Asp Ala Phe Glu Thr Leu85 90 95Gly Ile Lys Ala Arg Val Gln Ser Ala Leu Ser Met Gln Gln Ile Ala100 105 110Glu Thr Tyr Ala Arg Pro Lys Ala Ile Gln Tyr Leu Glu Glu Gly Lys115 120 125Val Val Ile Phe Ala Ala Gly Thr Gly Asn Pro Phe Phe Thr Thr Asp130 135 140
Thr Ala Ala Ala Leu Arg Gly Ala Glu Met Asn Cys Asp Val Met Leu145 150 155 160Lys Ala Thr Asn Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Lys Lys Asp165 170 175Pro Ser Ala Thr Arg Tyr Glu Thr Ile Thr Phe Asp Glu Ala Leu Leu180 185 190Lys Asn Leu Lys Val Met Asp Ala Thr Ala Phe Ala Leu Cys Arg Glu195 200 205Arg Lys Leu Asn Ile Val Val Phe Gly Ile Ala Lys Glu Gly Ser Leu210 215 220Lys Arg Val Ile Thr Gly Glu Asp Glu Gly Thr Leu Val His Cys225 230 235<210>7<211>241<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>7Met Ala Thr Asn Ala Lys Pro Val Tyr Lys Arg Ile Leu Leu Lys Leu1 5 10 15Ser Gly Glu Ala Leu Gln Gly Thr Glu Gly Phe Gly Ile Asp Ala Ser20 25 30Ile Leu Asp Arg Met Ala Gln Glu Ile Lys Glu Leu Val Glu Leu Gly35 40 45Ile Gln Val Gly Val Val Ile Gly Gly Gly Asn Leu Phe Arg Gly Ala50 55 60
Gly Leu Ala Lys Ala Gly Met Asn Arg Val Val Gly Asp His Met Gly65 70 75 80Met Leu Ala Thr Val Met Asn Gly Leu Ala Met Arg Asp Ala Leu His85 90 95Arg Ala Tyr Val Asn Ala Arg Leu Met Ser Ala Ile Pro Leu Asn Gly100 105 110Val Cys Asp Ser Tyr Ser Trp Ala Glu Ala Ile Ser Leu Leu Arg Asn115 120 125Asn Arg Val Val Ile Leu Ser Ala Gly Thr Gly Asn Pro Phe Phe Thr130 135 140Thr Asp Ser Ala Ala Cys Leu Arg Gly Ile Glu Ile Glu Ala Asp Val145 150 155 160Val Leu Lys Ala Thr Lys Val Asp Gly Val Phe Thr Ala Asp Pro Ala165 170 175Lys Asp Pro Thr Ala Thr Met Tyr Glu Gln Leu Thr Tyr Ser Glu Val180 185 190Leu Glu Lys Glu Leu Lys Val Met Asp Leu Ala Ala Phe Thr Leu Ala195 200 205Arg Asp His Lys Leu Pro Ile Arg Val Phe Asn Met Asn Lys Pro Gly210 215 220Ala Leu Arg Arg Val Val Met Gly Glu Lys Glu Gly Thr Leu Ile Thr225 230 235 240Glu<210>8
<211>237<212>PRT<213>流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)<400>8Met Ser Gln Pro Ile Tyr Lys Arg Ile Leu Leu Lys Leu Ser Gly Glu1 5 10 15Ala Leu Gln Gly Glu Asp Gly Leu Gly Ile Asp Pro Ala Ile Leu Asp20 25 30Arg Met Ala Val Glu Ile Lys Glu Leu Val Glu Met Gly Val Glu Val35 40 45Ser Val Val Leu Gly Gly Gly Asn Leu Phe Arg Gly Ala Lys Leu Ala50 55 60Lys Ala Gly Met Asn Arg Val Val Gly Asp His Met Gly Met Leu Ala65 70 75 80Thr Val Met Asn Gly Leu Ala Met Arg Asp Ser Leu Phe Arg Ala Asp85 90 95Val Asn Ala Lys Leu Met Ser Ala Phe G1n Leu Asn Gly Ile Cys Asp100 105 110Thr Tyr Asn Trp Ser Glu Ala Ile Lys Met Leu Arg Glu Lys Arg Val115 120 125Val Ile Phe Ser Ala Gly Thr Gly Asn Pro Phe Phe Thr Thr Asp Ser130 135 140Thr Ala Cys Leu Arg Gly Ile Glu Ile Glu Ala Asp Val Val Leu Lys145 150 155 160Ala Thr Lys Val Asp Gly Val Tyr Asp Cys Asp Pro Ala Lys Asn Pro165 170 175
Asp Ala Lys Leu Tyr Lys Asn Leu Ser Tyr Ala Glu Val Ile Asp Lys180 185 190Glu Leu Lys Val Met Asp Leu Ser Ala Phe Thr Leu Ala Arg Asp His195 200 205Gly Met Pro Ile Arg Val Phe Asn Met Gly Lys Pro Gly Ala Leu Arg210 215 220Gln Val Val Thr Gly Thr Glu Glu Gly Thr Thr Ile Cys225 230 235<210>9<211>248<212>PRT<213>肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)<400>9Met Ala Lys Gln Thr Arg Arg Val Leu Phe Lys Ile Ser Gly Glu Ala1 5 10 15Leu Ser Lys Asp Ser Ser Asn Arg Ile Asp Glu Met Arg Leu Ser Arg20 25 30Leu Val Ser Glu Leu Arg Ala Val Arg Asn Asn Asp Ile Glu Ile Ala35 40 45Leu Val Ile Gly Gly Gly Asn Ile Leu Arg Gly Leu Ala Glu Gln Lys50 55 60Glu Leu Gln Ile Asn Arg Val Ser Ala Asp Gln Met Gly Met Leu Ala65 70 75 80Thr Leu Ile Asn Gly Met Ala Val Ala Asp Ala Leu Lys Ala Glu Asp85 90 95Ile Pro Cys Leu Leu Thr Ser Thr Leu Ser Cys Pro Gln Leu Ala Asp
100 105 110Leu Tyr Thr Pro Gln Lys Ser Ile Glu Ala Leu Asp Gln Gly Lys Ile115 120 125Leu Ile Cys Thr Thr Gly Ala Gly Ser Pro Tyr Leu Thr Thr Asp Thr130 135 140Gly Ala Ala Leu Arg Ala Cys Glu Leu Asn Val Asp Val Leu Ile Lys145 150 155 160Ala Thr Met His Val Asp Gly Val Tyr Asp Lys Asp Pro Arg Leu Phe165 170 175Pro Asp Ala Val Lys Tyr Asp Phe Val Ser Tyr Lys Asp Phe Leu Ser180 185 190Asn Gln Leu Gly Val Met Asp Ala Ser Ala Ile Ser Leu Cys Met Asp195 200 205Ser His Ile Pro Ile Arg Val Phe Ser Phe Leu Gln His Ser Leu Glu210 215 220Lys Ala Leu Phe Asp Pro Thr Ile Gly Thr Leu Val Ser Glu Asp Val225 230 235 240Asn His Val Cys Ser Pro Arg His245<210>10<211>235<212>PRT<213>肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)<400>10Met Arg Leu Lys Ile Leu Ile Lys Leu Ser Gly Ala Gly Met Ser Ala1 5 10 15
Asp Ser Ser Glu Pro Phe Ser Asn Gln Phe Leu Glu Thr Val Ile Ala20 25 30Gln Leu Lys Gln Leu Val Pro Asn Tyr Gln Ile Gly Ile Val Ile Gly35 40 45Gly Gly Asn Ile Met Arg Gly Lys Ser Cys Ser Asp Tyr Asn Ile Thr50 55 60Glu Ile Ala Gly His His Leu Gly Ile Met Ala Thr Val Ile Asn Gly65 70 75 80Ala Phe Leu Lys Ala Lys Phe Asp Ser His Lys Leu Asn Ser Thr Leu85 90 95Leu Ser Ala Val Ser Cys Pro Ser Leu Ala Thr His Ile Val Ser Gln100 105 110Thr Thr Ile Asp Asp Ala Phe Lys Asn His Asp Ile Val Ile Phe Ala115 120 125Gly Gly Thr Gly Asn Pro Tyr Phe Ser Thr Asp Thr Ala Val Ala Leu130 135 140Arg Ala Thr Gln Met Gln Ala Asp Ile Ile Leu Ile Gly Lys Asn Gly145 150 155 160Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Lys Lys Asp Lys His Ala Lys165 170 175Phe Leu Ala Ser Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Ile Lys Asn Asp Leu Gln180 185 190Ile Met Asp Ile Thr Ala Phe Thr Met Cys Lys Glu Asn Asn Leu Lys195 200 205
Val Ile Ile Phe Asn Ile Asn Ala Glu His Ala Ile Ile Lys Ala Leu210 215 220Ser Lys Gln Gly Lys Tyr Thr Leu Ile Glu Lys225 230 235<210>11<211>32<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物1<400>11gaaaaaacca tgggccaacc aatttataaa cg 32<210>12<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物2<400>12ttcttgtcga cattcactaa caaatagtgg tgcc34<210>13<211>714<212>DNA<213>流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)<400>13atgggccaac caatttataa acgtatttta ttgaaattaa gcggtgaagc attacaagga 60gaagatggtc ttggtatcga tcctgcgatt ctcgatcgta tggctgttga aattaaagaa 120ttagtggaga tgggtgtgga agtcagtgtc gttctcggtg gtggcaactt attccgtggc 180gcaaaactag caaaagcggg gatgaatcgc gtggtgggcg atcatatggg aatgcttgct 240actgtgatga atggtttggc aatgcgtgat tctttattcc gtgctgatgt gaacgcaaaa 300ttaatgtccg ctttccaatt aaatggtatt tgcgatactt ataactggtc tgaagctatc 360
aaaatgttac gcgaaaaacg cgtagtcatt ttctctgcgg gaacgggaaa tccattcttt 420accactgatt ctaccgcttg tttgcgtggt attgaaattg aagctgatgt tgtgttgaaa 480gcgactaaag ttgatggtgt gtatgattgt gatcctgcga aaaatcctga tgcaaaactt 540tataaaaatt taagttatgc agaagtgatc gataaagaat taaaagtgat ggacttatcg 600gcgtttactt tagctcgcga tcatggcatg ccgattagag tgttcaatat gggtaaacct 660ggagcattac gtcaagtagt gactggtact gaagaaggca ccactatttg ttag714<210>14<211>237<212>PRT<213>流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)<400>14Met Gly Gln Pro Ile Tyr Lys Arg Ile Leu Leu Lys Leu Ser Gly Glu1 5 10 15Ala Leu Gln Gly Glu Asp Gly Leu Gly Ile Asp Pro Ala Ile Leu Asp20 25 30Arg Met Ala Val Glu Ile Lys Glu Leu Val Glu Met Gly Val Glu Val35 40 45Ser Val Val Leu Gly Gly Gly Asn Leu Phe Arg Gly Ala Lys Leu Ala50 55 60Lys Ala Gly Met Asn Arg Val Val Gly Asp His Met Gly Met Leu Ala65 70 75 80Thr Val Met Asn Gly Leu Ala Met Arg Asp Ser Leu Phe Arg Ala Asp85 90 95Val Asn Ala Lys Leu Met Ser Ala Phe Gln Leu Asn Gly Ile Cys Asp100 105 110
Thr Tyr Asn Trp Ser Glu Ala Ile Lys Met Leu Arg Glu Lys Arg Val115 120 125Val Ile Phe Ser Ala Gly Thr Gly Asn Pro Phe Phe Thr Thr Asp Ser130 135 140Thr Ala Cys Leu Arg Gly Ile Glu Ile Glu Ala Asp Val Val Leu Lys145 150 155 160Ala Thr Lys Val Asp Gly Val Tyr Asp Cys Asp Pro Ala Lys Asn Pro165 170 175Asp Ala Lys Leu Tyr Lys Asn Leu Ser Tyr Ala Glu ValIle Asp Lys180 185 190Glu Leu Lys Val Met Asp Leu Ser Ala Phe Thr Leu Ala Arg Asp His195 200 205Gly Met Pro Ile Arg Val Phe Asn Met Gly Lys Pro Gly Ala Leu Arg210 215 220Gln Val Val Thr Gly Thr Glu Glu Gly Thr Thr Ile Cys225 230 23權(quán)利要求
1.一種pyrH的晶體。
2.一種與別構(gòu)調(diào)節(jié)物復(fù)合的pyrH的晶體。
3.權(quán)利要求2的晶體，其中所述晶體進(jìn)一步與磷酸根復(fù)合。
4.一種與底物復(fù)合的pyrH的晶體。
5.權(quán)利要求4的晶體，其中所述底物是ATP。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的晶體，其中所述pyrH來自細(xì)菌。
7.權(quán)利要求6的晶體，其中所述pyrH來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。
8.權(quán)利要求2的晶體，其中所述別構(gòu)調(diào)節(jié)物在包含SEQ ID NO14的氨基酸殘基Arg7、Gly66、Met67、Asn68、Arg69、Val70、Val71、G1y72、His74、G1y84、Leu85、Ala86、Met87、Arg88、Asp89、Ser90、Leu91、Phe92、Arg93、Asp95、Val96、Asn97、Ala98、Lys99、Leu100、Met101、Ile109、Cys110、Asp111、Asn114、Trp115、Ser116、Glu117、Ala118、Ile119、Lys120、Met121、Arg123、Glu124、Arg126、Val127、Ile129、Glu151、Ile152和Glu153的全部或任何組合的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。
9.權(quán)利要求4的晶體，其中所述底物在包含SEQ ID NO14的氨基酸殘基Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Ala16、Leu17、Val50、Leu51、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Arg58、Thr80、Asn83、Thr140、Thr141、Asp142、Ser143、Ala145、Lys159、Ala160、Thr161、Lys162、Val163、Gly165、Val166、Tyr167、Asp168、Cys169、Asp170、Pro171、Lys173、Asp174、Ala177、Lys178、Tyr180、Lys191、Glu192、Leu193、Lys194、Val195、Met196、Asp197、Val213和Phe214的全部或任何組合的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。
10.權(quán)利要求4的晶體，其中所述底物在包含SEQ ID NO14的氨基酸殘基Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Val50、Leu51、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Phe57、Arg58、Gly59、Arg69、Val70、Val71、Gly72、Asp73、His74、Met75、Gly76、Met77、Leu78、Ala79、Thr80、Asn83、Ala103、Phe104、Ser131、Ala132、Gly133、Thr134、Gly135、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Thr140、Thr141、Asp142、Ser143、Thr144、Ala145、Leu147和Arg148的全部或任何組合的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。
11.權(quán)利要求4的晶體，其中所述底物在包含SEQ ID NO14的氨基酸殘基Lys11、Leu12、Ser13、Gly14、Glu15、Ala16、Leu17、Val50、Leu51、Gly52、Gly53、Gly54、Asn55、Phe57、Arg58、Gly59、Arg69、Val70、Val71、Gly72、Asp73、His74、Met75、Gly76、Met77、Leu78、Ala79、Thr80、Asn83、Ala103、Phe104、Ser131、Ala132、Gly133、Thr134、Gly135、Asn136、Pro137、Phe138、Phe139、Thr140、Thr141、Asp142、Ser143、Thr144、Ala145、Leu147、Arg148、Lys159、Ala160、Thr161、Lys162、Val163、Gly165、Val166、Tyr167、Asp168、Cys169、Asp170、Pro171、Lys173、Asp174、Ala177、Lys178、Tyr180、Lys191、Glu192、Leu193、Lys194、Val195、Met196、Asp197、Val213和Phe214的全部或任何組合的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。
12.權(quán)利要求4的晶體，其中所述底物在包含SEQ ID NO14的氨基酸殘基Lys11、Ser13、Gly14、Glu15、Gly52、Gly53、Gly54、Thr141和Asp142的全部或任何組合的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。
13.權(quán)利要求1的晶體，其中所述晶體包含三個(gè)二聚體，每個(gè)二聚體包含分子間二聚體界面，所述界面包含SEQ ID NO14的氨基酸殘基Ile25、Pro27、Leu30、Asp31、Phe57、Lys61、Leu62、Ala65、Gly66、Met67、Asn68、Arg69、Val71、His74、Met75、Gly76、Leu78、Ala79、Val81、Met82、Leu85、Ala86、Arg87、Asp88、Arg89、Phe104、Gln105、Leu106、Asn107、Gly108和Ile109的全部或任何組合。
14.一種鑒定結(jié)合pyrH的分子的方法，所述方法包括a)將三維分子建模算法應(yīng)用于pyrH的原子坐標(biāo)；b)以電子方式針對(duì)pyrH的原子坐標(biāo)篩選所儲(chǔ)存的一組候選化合物的原子坐標(biāo)，以鑒定結(jié)合pyrH的化合物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述原子坐標(biāo)是pyrH的分子界面的原子坐標(biāo)。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述原子坐標(biāo)在圖7中給出。
17.一種鑒定作為pyrH抑制劑的物質(zhì)的計(jì)算機(jī)輔助方法，所述方法包括(a)向計(jì)算機(jī)建模應(yīng)用程序提供pyrH晶體的一組原子坐標(biāo)；(b)向計(jì)算機(jī)建模應(yīng)用程序提供待評(píng)估物質(zhì)的一組原子坐標(biāo)，以確定其是否結(jié)合pyrH的分子界面；(c)對(duì)兩組原子坐標(biāo)進(jìn)行比較；(d)確定該物質(zhì)是否預(yù)期結(jié)合pyrH；其中如果該物質(zhì)預(yù)期結(jié)合pyrH，則該物質(zhì)是pyrH的抑制劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述原子坐標(biāo)組在圖7中給出。
16.一種設(shè)計(jì)pyrH活性抑制劑的計(jì)算機(jī)輔助方法，所述方法包括(a)向計(jì)算機(jī)建模應(yīng)用程序提供pyrH的一組原子坐標(biāo)；(b)用計(jì)算方法建立由一組原子坐標(biāo)代表的物質(zhì)；(c)確定該物質(zhì)是否預(yù)期結(jié)合pyrH，其中如果該物質(zhì)預(yù)期結(jié)合pyrH，則該物質(zhì)是pyrH的抑制劑。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述原子坐標(biāo)組在圖7中給出。
20.一種鑒定作為pyrH別構(gòu)調(diào)節(jié)物的物質(zhì)的計(jì)算機(jī)輔助方法，所述方法包括(a)向計(jì)算機(jī)建模應(yīng)用程序提供pyrH晶體或其別構(gòu)調(diào)節(jié)物結(jié)合位點(diǎn)的一組原子坐標(biāo)；(b)向計(jì)算機(jī)建模應(yīng)用程序提供待評(píng)估物質(zhì)的一組原子坐標(biāo)，以確定其是否結(jié)合pyrH的分子界面；(c)對(duì)兩組原子坐標(biāo)進(jìn)行比較；(d)確定該物質(zhì)是否預(yù)期結(jié)合pyrH；其中如果該物質(zhì)預(yù)期結(jié)合pyrH的別構(gòu)調(diào)節(jié)物結(jié)合位點(diǎn)，則該物質(zhì)是pyrH的別構(gòu)調(diào)節(jié)物。
21.權(quán)利要求20的計(jì)算機(jī)輔助方法，其中所述原子坐標(biāo)組在圖7中給出。
22.一種獲得未知結(jié)構(gòu)的分子或分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息的方法，所述方法使用圖7給出的原子坐標(biāo)，包括以下步驟a)從結(jié)晶的分子或分子復(fù)合物產(chǎn)生X射線衍射數(shù)據(jù)；b)將圖7給出的原子坐標(biāo)的至少一部分與X射線衍射數(shù)據(jù)組合使用，產(chǎn)生分子或分子復(fù)合物的至少一部分的三維電子密度圖；c)使用圖7給出的原子坐標(biāo)的全部或一部分，并任選與三維電子密度圖組合，產(chǎn)生所述分子或分子復(fù)合物的模型。
23.一種獲得pyrH活性測(cè)試抑制劑或別構(gòu)調(diào)節(jié)物的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)信息的方法，所述方法包括以下步驟a)分析抑制劑與同位素標(biāo)記pyrH蛋白的樣品的組合所導(dǎo)致的NMR化學(xué)位移變化；b)將產(chǎn)生這些變化的殘基映射到圖7給出的原子坐標(biāo)上，其中預(yù)期這些殘基界定抑制劑或調(diào)節(jié)物結(jié)合位點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及UMP激酶的晶體以及篩選、鑒定和設(shè)計(jì)UMP激酶的抑制劑和別構(gòu)調(diào)節(jié)物的計(jì)算機(jī)輔助方法。
文檔編號(hào)G06F19/00GK101048499SQ200580035167
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2005年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月16日
發(fā)明者J·布里德, P·多伊格, C·埃弗曼, R·鮑普蒂特, J·圖克克 申請(qǐng)人:阿斯利康(瑞典)有限公司