專利名稱：人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及cDNA文庫領(lǐng)域，具體涉及一種人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫及制備方法。
背景技術(shù)：
口腔頜面部惡性腫瘤，行手術(shù)切除仍然是目前最重要和最有效的治療手段，而晚期、復(fù)發(fā)或已轉(zhuǎn)移的頭頸癌患者預(yù)后往往很差，據(jù)報道平均生存期僅6個月左右，局部復(fù)發(fā)率≥50％，嚴(yán)重威脅人類的生命和健康。因而必須尋找更為有效的診斷治療方法。
隨著對多種重要生物的大規(guī)?；驕y序工作的完成，對基因功能的研究引起了研究者的普遍重視。生物體系的運(yùn)作與蛋白質(zhì)之間的相互作用密不可分，蛋白復(fù)合體幾乎參與了細(xì)胞內(nèi)所有生理過程，包括DNA復(fù)制，基因轉(zhuǎn)錄激活，蛋白質(zhì)的翻譯、修飾和定位，細(xì)胞周期調(diào)控、代謝等一系列重要的生物過程。能夠發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證在生物體內(nèi)相互作用的蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)是認(rèn)識生物學(xué)功能的第一步。傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)之間相互作用的方法包括蛋白親和層析、雜交、免疫共沉淀和酶聯(lián)免疫等技術(shù)。而這些方法主要是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。體外可檢測到蛋白質(zhì)間所有可能發(fā)生的相互作用，而事實(shí)上其中很多相互作用在體內(nèi)可能從不會發(fā)生，而且很多轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)的修飾作用在體外環(huán)境中無法正確進(jìn)行，必然影響了正常的蛋白質(zhì)之間的相互作用。
自1989年Fields和Song首次提出采用酵母雙雜交體系來研究蛋白質(zhì)間的相互作用以來[Fields D，Song OA novel system to detectprotein-protein interactions.Nature 1989，340245-246]，酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺，得到了廣泛的應(yīng)用，成功的檢測到許多具有相互作用的蛋白質(zhì)，甚至，研究者們還利用這種技術(shù)成功的操縱了一些蛋白質(zhì)之間的相互作用〖Jacob-S.Seeler，Agnes Marcio，Delphine Sitterlin，Catherine Transy andAnne Dejean.Interaction of SP100 with HP1 proteinsA link between thepromyelocytic leukemia-associated nuclear bodies and the chromatincompartment.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998，957316-7321。WalhoutAJ，Vidal M.A genetic strategy to eliminate self-activator batis prior tohigh-throughput yeast two-hybrid screens.Genome Res.1999，91128-34〗。因此，這種方法也稱為功能篩選。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的，往往有兩個或兩個以上結(jié)構(gòu)上可以分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域(DNA binding domain，DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，DNA-AD)。這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)⑺鼈兎珠_時仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上接近時，才能重新呈現(xiàn)完整地GAL4轉(zhuǎn)錄因子的活性，并可使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。根據(jù)這個特征，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)(誘餌蛋白)的基因構(gòu)建在同一表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Baiting protein。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-Library表達(dá)載體上。同時將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成Leu，Trp，His，Ade，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠互相作用時，功能重建的作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因His，Ade，Lacz等，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-Library載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進(jìn)行測序和分析工作，即可獲得有相互作用的蛋白〖Zhong J，Zhang H，StanyonCA，Tromp G，F(xiàn)inley FL Jr.A strategy for constructing large proteininteraction maps using the yeast two-hybrid systemregulated expressionarrays and two-phase mating.Genome Res.2003，132691-9〗。
根據(jù)上述技術(shù)描述，建立惡性腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)文庫，從中篩選有效的治療分子是目前認(rèn)為最有希望的重要途徑之一。并且采用表達(dá)文庫的方法，已在一些類型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)成功篩選到特異的診治分子，表明利用表達(dá)文庫的方法尋找腫瘤診治分子是可行的〖Neystat M，Rzhetskaya M，Kholodilov N，Burke RE.Analysis of synphilin-1 andsynuclein interactions by yeast two-hybrid beta-galactosidase liquid assay.Neurosci Lett.2002，325119-23。Engelender S，Kaminsky Z，Guo X，Sharp AH，Amaravi RK，Kleiderlein JJ，Margolis RL，Tronocoso JC，Lanahan AA，Worley PF，Dawson VL，Dawson TM，Ross CA.Synphilin-1associates wit alpha-synuclein and promotes the formation of cytosolicinclusions.Nat Genet.1999，22110-4〗。和其它部位的腫瘤相比，口腔腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)行為具有一定的獨(dú)特性，但目前口腔腫瘤相關(guān)的研究進(jìn)行得很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫，為深入研究口腔癌發(fā)生的機(jī)制、尋找有效的治療分子標(biāo)靶點(diǎn)提供依據(jù)。
本發(fā)明再一目的是提供一種制備人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫的方法。
本發(fā)明的思路是這樣的從人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞中提取mRNA，合成cDNA多核苷酸產(chǎn)物，將cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體，即得人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA文庫。
本發(fā)明一方面公開了一種人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫，優(yōu)選地從人口腔上皮源性癌腫分離并建立的細(xì)胞系制備的cDNA文庫，更優(yōu)選地從人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系和/或人口腔腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-2制備的cDNA文庫。
本發(fā)明另一方面提供了制備人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫的方法，包括如下步驟a)提取細(xì)胞mRNA，b)合成cDNA多核苷酸產(chǎn)物，c)cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體。
可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)提取人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞mRNA，如先抽提細(xì)胞總RNA，然后用poly(T)層析純化mRNA。
可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，以O(shè)ligod(T)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。優(yōu)選地，在合成cDNA第一鏈時引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列。可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的PCR技術(shù)擴(kuò)增cDNA多核苷酸產(chǎn)物，優(yōu)選地，采用LD-PCR方法合成并擴(kuò)增cDNA多核苷酸產(chǎn)物，更優(yōu)選地LD-PCR引物為SEQ ID No.3序列和SEQ IDNo.4序列。
有多種方法可以將cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體。優(yōu)選地采用將載體和cDNA多核苷酸產(chǎn)物共同轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞使它們在胞內(nèi)同源重組，從而cDNA多核苷酸片段得以插入載體。并且cDNA片斷插入融合蛋白結(jié)構(gòu)域元件下，從而可以與文庫蛋白形成融合蛋白。
因而含有cDNA文庫基因的載體和含有該載體的轉(zhuǎn)化體也在主張保護(hù)范圍內(nèi)。
制備人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫的方法，還包括轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞步驟，有多種方法可以使cDNA文庫和/或載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，優(yōu)選地采用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法。
根據(jù)需要，寄主細(xì)胞可以是細(xì)菌或酵母，優(yōu)選地寄主細(xì)胞是酵母。
制備人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞cDNA的方法，合成的cDNA多核苷酸產(chǎn)物可以經(jīng)過純化，提取200bp-5kp的組分插入載體，優(yōu)選地提取500bp-3kp的組分插入載體。
以下結(jié)合實(shí)施例說明本發(fā)明的有意技術(shù)效果。
人類細(xì)胞基因數(shù)目大約有30000-40000個左右，其表達(dá)型文庫理論上講需要約5-10×106個重組子。本發(fā)明所構(gòu)建的文庫容量為4×107，基本達(dá)到了要求。該人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫建立后，即可以應(yīng)用誘餌蛋白來篩選分離目的基因，而一旦發(fā)現(xiàn)有價值的分子，就可以很方便地對其進(jìn)一步分析研究。
如本發(fā)明實(shí)施例一構(gòu)建的人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫中，所有的文庫基因片斷插入轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD元件下，在寄主細(xì)胞中結(jié)構(gòu)性表達(dá)，產(chǎn)物與AD融合，可與攜帶有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的誘餌蛋白相互作用，從而可以方便地篩選分離目的基因。
因而構(gòu)建口腔上皮源性腫瘤細(xì)胞的cDNA文庫，對于從分子水平上研究口腔腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展機(jī)理，尋找診斷、治療和預(yù)后靶點(diǎn)等都有重要意義。
本發(fā)明采用PCR技術(shù)尤其采用LD-PCR技術(shù)進(jìn)行人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫的合成擴(kuò)增，可以保證一些稀有cDNA片斷被擴(kuò)增，因而擴(kuò)增片斷具有很高的代表性，這有利于文庫的篩選和鑒定。如實(shí)施例三所述，隨機(jī)挑選的cDNA文庫的7個克隆鑒定結(jié)果，插入片斷大小范圍約為500bp-3kb，且多集中在1kb左右，圖4。插入片斷的測序結(jié)果與基因庫(Genebank)進(jìn)行比對分析，分別與gi13235762，gi20760177，gi17726676，gi31770609，gi10682445，gi2531004，gi16876900基因序列99％-100％一致。實(shí)施例四對其在酵母AH109內(nèi)翻譯蛋白質(zhì)結(jié)果進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，這7個序列均能在AH109內(nèi)表達(dá)出蛋白產(chǎn)物，且具有HA的融合標(biāo)簽，如圖5所示。


圖1為人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系總RNA1％瓊脂糖電泳結(jié)果，A為rRNA電泳結(jié)果，分別為28Sr RNA及18S rRNA條帶，其中，28S rRNA較18S rRNA明亮，說明總RNA的完整性較好；B為純化后的mRNA電泳結(jié)果，為從加樣孔至28S rRNA至18S rRNA的彌散條帶，其中，28S rRNA及18S rRNA隱約可見。
圖2為人口腔腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-2總RNA1％瓊脂糖電泳結(jié)果，A為rRNA電泳結(jié)果，分別為28Sr RNA及18S rRNA條帶，其中，28S rRNA較18S rRNA明亮，說明總RNA的完整性較好；B為純化后的mRNA電泳結(jié)果，為從加樣孔至28S rRNA至18S rRNA的彌散條帶，其中，28S rRNA及18S rRNA隱約可見。
圖3為人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系cDNA的LD-PCR產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，可見500bp至3Kb之間的彌散條帶。上樣量為每泳道7μlPCR產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖4為人口腔腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞系cDNA的LD-PCR產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，可見500bp至3Kb之間的彌散條帶。上樣量為每泳道7μl PCR產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖5為pGADT7-Rec-Library示意圖，LD-PCR產(chǎn)物經(jīng)兩端的SMARTIII和CDS III序列與線性化的pGADT7質(zhì)粒在酵母AH109內(nèi)同源重組，成為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
圖6為人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系cDNA文庫插入片斷鑒定結(jié)果，隨機(jī)挑選的7個克隆，抽取重組質(zhì)粒，對插入片斷行LD-PCR擴(kuò)增結(jié)果，其插入片斷為從500bp-3Kb大小不等的片斷，多集中在1Kb左右。
圖7為人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系cDNA文庫蛋白產(chǎn)物鑒定結(jié)果，隨機(jī)挑選7個克隆，提取AH109總蛋白，anti-HA行WesternBlot檢測結(jié)果，可見每個克隆中均有HA融合蛋白表達(dá)。
圖8為人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系cDNA文庫克隆6在基因庫中比對結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例一，人口腔鱗癌細(xì)胞系Tca8113cDNA文庫的構(gòu)建本實(shí)施例的步驟如下1.人口腔鱗癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞的培養(yǎng)人口腔鱗癌細(xì)胞系Tca8113傳代細(xì)胞系于含10％小牛血清的RMPI1640中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃、5％CO2，收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。
2.細(xì)胞總RNA提取按照Invitrogen公司的TrizolTM試劑總RNA提取操作指南，從細(xì)胞中提取總RNA。按照Qiagen公司Mini-Rneasy分離試劑盒說明書進(jìn)一步純化RNA?？捎梅止夤舛扔?jì)測定總RNA的得率。紫外燈下鑒定RNA的質(zhì)量，結(jié)果見28S條帶清晰，亮度約為18S兩倍，沒有明顯的5S條帶，如附圖1A為人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系總RNA1％瓊脂糖電泳結(jié)果，A為rRNA電泳結(jié)果，分別為28Sr RNA及18S rRNA條帶，其中，28S rRNA較18S rRNA明亮，說明總RNA的完整性較好。
3.純化mRNA按照Qiagen公司mRNA純化試劑盒操作指南從總RNA中純化mRNA，電泳檢測mRNA的質(zhì)量，附1B為純化后的mRNA電泳結(jié)果，為從加樣孔至28S rRNA至18S rRNA的彌散條帶，其中，28S rRNA及18S rRNA隱約可見。
4.cDNA雙鏈合成與純化按照Clontech公司cDNA文庫構(gòu)建和篩選試劑盒(cDNA libraryconstruction and screening kit)說明書推薦的方法，用Oligo d(T)作為反轉(zhuǎn)錄引物，反應(yīng)體系中加入SMARTIII和CDSIII序列，利用模板轉(zhuǎn)換，在反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈的同時分別引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列。采用LD-PCR的方法，利用引入的SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列，設(shè)計(jì)SEQ ID No.3序列和SEQ ID No.4引物，擴(kuò)增cDNA，循環(huán)數(shù)為24。取7μl產(chǎn)物在1％瓊脂糖上電泳鑒定cDNA多核苷酸產(chǎn)物的質(zhì)量。電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片斷大小集中于500bp-3kb之間，附圖3為人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系cDNA的LD-PCR產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，可見500bp至3Kb之間的彌散條帶。上樣量為每泳道7μl PCR產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。隨后，產(chǎn)物采用CHROMA SPIN+TE-400柱子純化，去除200bp以下的產(chǎn)物及反應(yīng)體系中殘留的一些引物片段。
5.感受態(tài)細(xì)胞的制備寄主細(xì)胞為酵母AH109，從YPDA培養(yǎng)板上挑選新鮮的，直徑在2-4mm的AH109克隆，在新鮮配置的YPDA培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，收集處于對數(shù)生長期的酵母細(xì)胞，用乙酸鋰法制備感受態(tài)細(xì)胞。
6.cDNA文庫構(gòu)建將純化后的cDNA多核苷酸產(chǎn)物和線性化的pGADT7-Rec同時轉(zhuǎn)入AH109的感受態(tài)細(xì)胞中，雙鏈cDNA和pGADT7-Rec在AH109內(nèi)經(jīng)SEQID No.1和SEQ ID No.2序列進(jìn)行同源重組，形成pGADT7-Rec-Library閉環(huán)結(jié)構(gòu)，附圖5為pGADT7-Rec-Library示意圖，LD-PCR產(chǎn)物經(jīng)兩端的SMART III和CDS III序列與線性化的pGADT7質(zhì)粒在酵母AH109內(nèi)同源重組，成為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在SD/-Leu培養(yǎng)板上倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，至克隆長出，篩選含重組質(zhì)粒的AH109，最終AH109酵母的轉(zhuǎn)化效率為1×106轉(zhuǎn)化體/3μg pGADT7-Rec。在4℃預(yù)冷平板，加入預(yù)冷的凍存液，收集所有平板上的克隆，混勻，分裝成1ml，-80℃凍存。取100μl凍存文庫，分別稀釋100，1000，10000倍，取100μl涂板于SD/-Leu，30℃倒置培養(yǎng)至克隆長出。計(jì)數(shù)長出的克隆數(shù)(cfu)。文庫大小為4×107cfu/ml。
實(shí)施例二人口腔腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-2的cDNA文庫制備人口腔腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-2于含10％小牛血清的RMPI1640中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃，5％CO2，收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。其他步驟同實(shí)施例一。附圖2為人口腔腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-2總RNA1％瓊脂糖電泳結(jié)果，A為rRNA電泳結(jié)果，分別為28Sr RNA及18S rRNA條帶，其中，28S rRNA較18S rRNA明亮，說明總RNA的完整性較好；B為純化后的mRNA電泳結(jié)果，為從加樣孔至28S rRNA至18S rRNA的彌散條帶，其中，28S rRNA及18S rRNA隱約可見。
cDNA文庫LD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果見附圖4。圖4為人口腔腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞系cDNA的LD-PCR產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，可見500bp至3Kb之間的彌散條帶。上樣量為每泳道7μl PCR產(chǎn)物，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。
文庫大小為4×107cfu/ml。
實(shí)施例三人口腔鱗癌細(xì)胞系Tca8113cDNA文庫的鑒定從SD/-Leu培養(yǎng)板上隨機(jī)挑選7個克隆，接種于10ml SD/-Leu培養(yǎng)液中，30℃震蕩培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)物，使用lyticase破壁，酚、氯仿抽提質(zhì)粒，采用Taqara公司的Ex-premix對插入片斷進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃，30秒；68℃，5分鐘；30個循環(huán)。擴(kuò)增用上游引物為SEQ ID No.5，下游引物為SEQ ID No.6。產(chǎn)物6μl進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，觀察插入片斷大小。同時測序，測序引物為SEQ ID No.5，測序結(jié)果在基因庫中進(jìn)行比對。結(jié)果見附圖6，為人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系cDNA文庫插入片斷鑒定結(jié)果，隨機(jī)挑選的7個克隆，抽取重組質(zhì)粒，對插入片斷行LD-PCR擴(kuò)增結(jié)果，其插入片斷為從500bp-3Kb大小不等的片斷，多集中在1Kb左右。測序結(jié)果分別與gi13435962，gi22760187，gi27526476，gi31873609，gi12862475，gi5531804，gi34782763基因序列99％-100％一致，圖8為人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系cDNA文庫克隆6在基因庫中比對結(jié)果。
實(shí)施例四人口腔鱗癌細(xì)胞系Tca8113cDNA文庫蛋白產(chǎn)物鑒定常規(guī)Western Blotting，利用pGADT7-Rec提供的融合蛋白標(biāo)簽HA，采用Anti-HA多抗(Clontech)，對AH109蛋白產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。2×SDSLoading Buffe裂解酵母，蛋白裂解產(chǎn)物于10％SDS-PAGE上進(jìn)行分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，7.5％Blotto過夜封閉，anti-HA一抗孵育1小時，PBST洗膜3×5分鐘，HRP標(biāo)記的二抗孵育1小時，PBST洗膜3×5分鐘，ECL發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)。檢測結(jié)果如附圖7為人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系cDNA文庫蛋白產(chǎn)物鑒定結(jié)果，隨機(jī)挑選7個克隆，提取AH109總蛋白，anti-HA行WesternBlot檢測結(jié)果，可見每個克隆中均有HA融合蛋白表達(dá)。
序列表<110>上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院<120>人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫及制備方法<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>59<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>1
attctagagg ccgaggcggc cgacatgttt tttttttttt tttttttttt tttttttvn59<210>2<211>39<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>2aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt atggccggg 39<210>3<211>39<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>3gtatcgatgc ccaccctcta gaggccgagg cggccgaca 39<210>4<211>33<212>DNA<213>合成的
<220>
<223>引物<400>4ttccacccaa gcagtggtat caacgcagag tgg33<210>5<211>33<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>5ctattcgatg atgaagatac cccaccaaac cca33<210>6<211>27<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>6ttgcggggtt tttcagtatc tacgatt 2權(quán)利要求
1.一種人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA文庫，其特征在于該文庫是從人口腔上皮源性癌腫分離并建立的細(xì)胞系制備的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的cDNA文庫，其特征在于該文庫是從人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系或人口腔腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-2制備的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的cDNA文庫，其特征在于該文庫是從人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系制備的。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的cDNA文庫，其特征在于該文庫是從人口腔腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-2制備的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一所述的cDNA文庫的制備方法，其特征在于包括如下步驟a)提取細(xì)胞mRNA，b)合成cDNA多核苷酸產(chǎn)物，c)cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的cDNA文庫的制備方法，其特征在于，在合成cDNA第一鏈時引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列，用PCR技術(shù)擴(kuò)增cDNA多核苷酸產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的cDNA文庫的制備方法，其特征在于用LD-PCR方法擴(kuò)增cDNA多核苷酸產(chǎn)物，引物為SEQ ID No.3序列和SEQID No.4序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的cDNA文庫的制備方法，其特征在于cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體融合蛋白結(jié)構(gòu)域元件下。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的cDNA文庫的制備方法，其特征在于通過將載體和cDNA多核苷酸產(chǎn)物共同轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞使在胞內(nèi)同源重組，從而cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的cDNA的制備方法，其特征在于通過將載體和cDNA多核苷酸產(chǎn)物共同轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞使在胞內(nèi)同源重組，從而cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體融合蛋白結(jié)構(gòu)域元件下。
全文摘要
本發(fā)明涉及cDNA文庫領(lǐng)域，具體涉及一種人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫及制備方法。該文庫是從人口腔上皮源性癌腫分離并建立的細(xì)胞系制備的。所述cDNA文庫的制備方法依序包括提取細(xì)胞mRNA、合成cDNA多核苷酸產(chǎn)物、cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體。本發(fā)明提供的人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫為深入研究口腔癌發(fā)生的機(jī)制、尋找有效的治療分子標(biāo)靶點(diǎn)提供了依據(jù)；同時，提供了一種制備人口腔上皮源性癌腫細(xì)胞cDNA文庫的有效方法；對于從分子水平上研究口腔腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展機(jī)理，尋找診斷、治療和預(yù)后靶點(diǎn)等都有重要意義。
文檔編號C12N15/10GK1587410SQ20041005393
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月20日
發(fā)明者陳萬濤, 何榮根, 張萍, 徐骎, 張志愿, 潘紅芽, 邱蔚六 申請人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院