專利名稱：L－抗壞血酸不飽和脂肪酸酯酶催合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯的制備方法，具體涉及一種L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯酶催合成方法。
背景技術(shù)：
L-抗壞血酸(Vc)是一種廣泛應(yīng)用的天然抗氧化物，是人類不可缺少的營養(yǎng)要素之一。它是生物體內(nèi)活性氧化物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)的抑制劑，而ROS與各種疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)。
不飽和脂肪酸如花生四烯酸AA、亞麻酸ALA、二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸DHA等人體內(nèi)不能合成，需要從食物中攝取，所以是人類的必需脂肪酸，它們在機(jī)體內(nèi)具有較廣泛的生理功能和生物學(xué)效應(yīng)，而且雙鍵愈多，不飽和程度愈高，營養(yǎng)價值也愈高，不飽和脂肪酸具有維護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能、治療心血管疾病、抗炎、抗癌以及促進(jìn)大腦發(fā)育、減肥、增加動物的產(chǎn)仔率和成活率等生理功能。
對于L-抗壞血酸棕櫚酰酯功能，特別是抗氧化作用的研究，近年來研究很多，Jian-Wen Liu等人報道該種物質(zhì)因其抗氧化作用，從而抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
相對于L-抗壞血酸棕櫚酰酯，L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯非水相酶催合成研究在國內(nèi)外極少。不飽和脂肪酸在化妝品、醫(yī)藥、食品中廣泛應(yīng)用，其本身就有氧化保護(hù)的性質(zhì)，如果其與Vc連接，將賦予新的分子更加優(yōu)良的性質(zhì)，較之抗L-壞血酸棕櫚酰酯，L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯更容易透過細(xì)胞膜，更容易在脂質(zhì)層中分布，對ROS有更強(qiáng)的抑制作用，前期的研究表明，L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯具有非常好的兩相溶解性、強(qiáng)的抗氧化保護(hù)作用等。又因為不飽和脂肪酸與棕櫚酸在溶解性等物理化學(xué)性質(zhì)等方面差別較大，因此其合成機(jī)理與工藝同L-抗壞血酸棕櫚酰酯的酶催合成有很大的差別，L-抗壞血酸棕櫚酰酯的酶催合成方法不能用于L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯。
非水相酶催化是一迅速發(fā)展的研究領(lǐng)域，自從1984年Zaks andKlibanov研究報道在非水相中可進(jìn)行酶的催化反應(yīng)以來，對非水相酶催化反應(yīng)的研究取得了大量的進(jìn)展，脂肪酶是非水相酶催化研究中應(yīng)用最為廣泛的一種酶，脂肪酶種類很多，不同來源不同微生物產(chǎn)生的脂肪酶其功能不同，其催化的轉(zhuǎn)酯及酯合成反應(yīng)各有特點。
目前，L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯的合成方法一般采用如Journal ofMolecular Catalysis BEnzymatic，5(1998)19-23文獻(xiàn)公開的方法，該方法反應(yīng)脂肪酸轉(zhuǎn)化率不足20％，因此不能滿足有關(guān)方面的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯酶催合成方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，滿足有關(guān)領(lǐng)域發(fā)展的需要。
本發(fā)明是通過酶催化反應(yīng)將不飽和脂肪酸和L-抗壞血酸反應(yīng)合成相應(yīng)的酯，使該酯能夠穩(wěn)定溶于水，從而能夠在水溶性飲品和食品中加入不飽和脂肪酸這類人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)。
所說的L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯的結(jié)構(gòu)通式如下 R代表C17H33、C17H31、C17H29、C19H31、C19H29或C21H31。
本發(fā)明的方法包括如下步驟
將L-抗壞血酸與不飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸酯，在反應(yīng)介質(zhì)中，以固定化脂肪酶為催化劑，反應(yīng)體系中，以重量計水含量為0.01～0.06％，40～60℃反應(yīng)1～16小時，然后采用常規(guī)的方法從反應(yīng)產(chǎn)物中收集L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯。
本發(fā)明優(yōu)選的方法包括如下步驟將L-抗壞血酸與不飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸酯，在反應(yīng)介質(zhì)中，以固定化脂肪酶為催化劑，反應(yīng)體系中，以重量計水含量為0.04％-0.06％，40～60℃反應(yīng)1～3小時，然后再在水含量為0.01～0.04％的條件下反應(yīng)8-16小時，采用常規(guī)的方法從反應(yīng)產(chǎn)物中收集L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯。
水含量的控制可通過在反應(yīng)體系中加入分子篩實現(xiàn)，以L-抗壞血酸與不飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸酯的總重量計，分子篩的加入量為5～20wt％；或采用減壓蒸發(fā)干燥回流控制體系中的水分含量。
術(shù)語“減壓蒸發(fā)干燥回流”指的是反應(yīng)器內(nèi)壓力減小，反應(yīng)溶劑夾帶水分蒸發(fā)，經(jīng)過冷凝，流回時經(jīng)過干燥劑干燥，水分被吸收?？沙檎婵?，將體系的壓力控制在真空度0.08～0.1Mpa，使體系中的水分蒸發(fā)，冷凝后干燥，溶劑部分回流，以達(dá)到控制體系中水含量的目的。
L-抗壞血酸與不飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸酯的摩爾比為1∶1～5；所說的反應(yīng)反應(yīng)介質(zhì)包括叔戊醇、乙腈或四氫呋喃中的一種；所說的不飽和脂肪酸包括油酸、亞油酸、共厄亞油酸、花生四烯酸、α-亞麻酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸(DHA)等中的一種；所說的不飽和脂肪酸酯包括油酸甲酯、油酸乙酯、亞油酸甲酯、亞油酸乙酯、二十碳五烯酸乙酯、二十二碳六烯酸乙酯等中的一種；所說的固定化脂肪酶選自來源于假絲酵母的脂肪酶，可采用Journal ofMolecular Catalysis BEnzymatic，18(2002)261-266.文獻(xiàn)公開的方法進(jìn)行制備，或采用市售產(chǎn)品，如諾維信公司生產(chǎn)的牌號為Novozym 435的固定化脂肪酶，該酶是Candida antarctica的B型脂肪酶固定在丙烯型大孔樹脂上。
在非水相酶催化中，水分是一個非常重要的因素，酶分子維持其活性構(gòu)型需要一定的水分，另外，在相同的水活度下卻又因反應(yīng)溶劑和載體的極性或親水性不同，酶分子的微環(huán)境中水活度也不同。在L-抗壞血酸亞油酸酯的酶法合成中，我們發(fā)現(xiàn)，不管是在轉(zhuǎn)酯還是在酯合成反應(yīng)中，水活度對產(chǎn)率的影響都非常大，當(dāng)反應(yīng)體系中含有一定量的水分時，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中水活度不僅影響脂肪酶的活性，而且對底物亞油酸甲酯的水解、產(chǎn)物的水解及合成都有影響，水分對整個反應(yīng)會產(chǎn)生復(fù)雜的影響。
發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗，發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)體系中水分的含量對轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)效率的影響十分顯著，對反應(yīng)體系中不同的水分含量，如分別為0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％等進(jìn)行試驗，測定反應(yīng)的初速度和達(dá)到平衡后的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明水分含量在0.04％-0.06％時初速度最大，而小于0.03％時轉(zhuǎn)化率最大。
因此，反應(yīng)時，在前兩個小時水分控制在0.04％-0.06％，而兩小時后控制在0.03％以下，這樣可以在減少反應(yīng)周期的情況下得到最大轉(zhuǎn)化率采用本發(fā)明的方法，以不飽和脂肪酸計，轉(zhuǎn)化率為35％以上，反應(yīng)時間可縮短為16小時以下。
由此可見，本發(fā)明的方法，能在較短的反應(yīng)時間內(nèi)獲得高的轉(zhuǎn)化率，為一種具有工業(yè)化實施前景的制備L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯的方法。


圖1為反應(yīng)體系中水分含量對反應(yīng)初速度和產(chǎn)率的影響。
圖2為不同水分含量對產(chǎn)物合成的影響。
具體實施例方式
實施例1取50ml的具塞三角瓶，在瓶中稱取大約0.3g的維生素C，稱取0.6g亞油酸甲酯。加入10ml叔戊醇，加入分子篩1.0g。密封。將三角瓶放入高溫?fù)u床中預(yù)熱30分鐘(高溫?fù)u床溫度50℃、200rps)，加入諾維信公司生產(chǎn)的牌號為Novozym 435固定化脂肪酶0.3g，整個體系水分含量控制在0.06％，反應(yīng)2小時后，加入分子篩3g，整個體系水分含量控制在0.03％，反應(yīng)10小時，反應(yīng)完畢，柱層析分離，得到0.15g純度92％的亞油酸Vc酯。
實施例2取50ml的具塞三角瓶，在瓶中稱取大約0.3g的維生素C，稱取0.6g油酸。加入10ml乙腈，加入分子篩2g。密封。將三角瓶放入高溫?fù)u床中預(yù)熱30分鐘(高溫?fù)u床溫度60℃、200rps)，加入諾維信公司生產(chǎn)的牌號為Novozym 435固定化脂肪酶0.3g，整個體系水分含量控制在0.05％，反應(yīng)3小時后，加入分子篩1.5g，整個體系水分含量控制在0.02％，反應(yīng)8小時，反應(yīng)完畢，柱層析分離，得到0.12g純度92％以上油酸Vc酯。
實施例3取50ml的反應(yīng)器，稱取大約0.3g的維生素C，稱取0.6gDHA(純度85％以上)。加入15ml四氫呋喃，40℃、200轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，30分鐘，加入諾維信公司生產(chǎn)的牌號為Novozym 435固定化脂肪酶0.3g，利用減壓蒸發(fā)干燥回流控制水分，體系的壓力為真空度0.08～0.1Mpa，使體系水分含量控制在0.02％，反應(yīng)16小時，反應(yīng)完畢，柱層析分離，得到0.1g純度92％以上DHAVc酯。
權(quán)利要求
1.L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯酶催合成方法，其特征在于，包括如下步驟將L-抗壞血酸與不飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸酯，在反應(yīng)介質(zhì)中，以固定化脂肪酶為催化劑，反應(yīng)體系中，以重量計水含量為0.01～0.06％，40～60℃反應(yīng)1～16小時，然后采用常規(guī)的方法從反應(yīng)產(chǎn)物中收集L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟將L-抗壞血酸與不飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸酯，在反應(yīng)介質(zhì)中，以固定化脂肪酶為催化劑，反應(yīng)體系中，以重量計水含量為0.04％-0.06％，40～60℃反應(yīng)1～3小時，然后再在水含量為0.01～0.04％的條件下反應(yīng)2-16小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在反應(yīng)體系中加入分子篩，以L-抗壞血酸與不飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸酯的總重量計，分子篩的加入量為5～20wt％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用減壓蒸發(fā)干燥回流控制體系中的水分含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，L-抗壞血酸與不飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸酯的摩爾比為1∶1～5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項所述的方法，其特征在于，所說的反應(yīng)反應(yīng)介質(zhì)包括叔戊醇、乙腈或四氫呋喃中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項所述的方法，其特征在于，所說的不飽和脂肪酸包括油酸、亞油酸、共厄亞油酸、花生四烯酸、α-亞麻酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸等中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項所述的方法，其特征在于，所說的不飽和脂肪酸酯包括油酸甲酯、油酸乙酯、亞油酸甲酯、亞油酸乙酯、二十碳五烯酸乙酯、二十二碳六烯酸乙酯中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項所述的方法，其特征在于，所說的固定化脂肪酶選自來源于假絲酵母的脂肪酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種L－抗壞血酸不飽和脂肪酸酯酶促合成方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟將L－抗壞血酸與不飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸酯，在反應(yīng)介質(zhì)中，以固定化脂肪酶為催化劑，反應(yīng)體系中，以重量計水含量為0.01～0.06％，40～60℃反應(yīng)1～16小時，然后采用常規(guī)的方法從反應(yīng)產(chǎn)物中收集L－抗壞血酸不飽和脂肪酸酯。本發(fā)明的方法，能在較短的反應(yīng)時間內(nèi)獲得高的轉(zhuǎn)化率，為一種具有工業(yè)化實施前景的制備L－抗壞血酸不飽和脂肪酸酯的方法。
文檔編號C12P17/04GK1629303SQ20041005397
公開日2005年6月22日 申請日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者魏嘉士 申請人:魏嘉士