專利名稱：：RecQL4基因高表達(dá)作為新型的靶點(diǎn)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種RecQL4(DNA雙鏈解旋酶)基因高表達(dá)作為新型的靶點(diǎn)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，屬于基因新用途
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：RecQL4是RecQ解旋酶家族中的一員。它是由Kitao等人在1998年克隆并以大腸桿菌(E.Coli)RecQ蛋白來(lái)命名的(見Genomics,1998，CloningoftwonewhumanhelicasegenesoftheRecQfamily:Biologicalsignificanceofmultiplespeciesinhighereukaryotes，54，443-452)。其主要功能是打開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)用于脂A轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及損傷修復(fù)(見GeneticsinMedicine,2006，TheversatileRecQL4，8(4):213-216)，因此，RecQL4對(duì)于維持基因組的穩(wěn)定性是非常重要的。而基因的不穩(wěn)定性在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中起重要作用。RecQL4功能缺失可弓I起人類基因組不穩(wěn)定性疾病Rothmund-Thomson綜合癥(RTS)，表現(xiàn)為皮膚紅斑、骨骼異常、早衰和腫瘤特別是骨肉瘤高發(fā)(見J.Natl.CancerInst"2003,AssociationbetweenosteosarcomaanddeleteriousmutationsintheRecQL4geneinRothmund-Thomsonsyndrom,95:669-674)。除了RTS，RecQL4功能缺失也與RAPADILIN0和BALLER-GER0LD綜合癥相關(guān)(見HumMol.Genet.，2003,MoleculardefectofRAPADILINOsyndromeexpandsthephenotypespectrumofRecQLdiseases,12:2837-2844禾口J.Med.Genet.,2006,Revisitingthecraniosynostosis-radialrayhypoplasiaassociation:Baller-GeroldsymdromcausedbymutationsintheRecQL4gene,43:148-152)。這三種臨床疾病癥候群的共同特征是個(gè)矮和骨髂異常，然而腫瘤高發(fā)只存在于RTS及RAPADILINO疾病癥候群(見HumGenet.,2008,SensitivityofRecQL4-deficientfibroblastsfromRothmund-Thomsonsyndromepatientstogenotoxicagents,123:643-653)。使用RecQL4基因敲除小鼠模型進(jìn)一步證實(shí)了在人類中的發(fā)現(xiàn)。小鼠在RecQL4基因功能缺失之后，表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、早死、以及其它的類似于人類Rothmund-Thomson綜合癥的缺陷(見HumMolGenet.,2003，GrowthretardationandskinabnomalitiesoftheRECQL4-deficientmouse,12:2293-2299和HumMolGenet，2005，Defectivesister-chromatidcohesion,aneuploidyandcancerpredispositioninamousemodeloftypeIIRothmund-Thomsonsyndrome,14:813-825)。所有這些石開究都是關(guān)于RecQL4基因表達(dá)缺失與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，而關(guān)于RecQL4高表達(dá)(over-expression)與人類腫瘤的關(guān)系目前在國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有任何報(bào)道。關(guān)于RecQL4的堿基序列、制備方法及鑒定方法如下1、RecQL4的堿基序列堿基序列美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院癌癥研究所基因序列號(hào)麗—004260;網(wǎng)址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez"db二nuccore。2、RecQL4的制備方法全長(zhǎng)RecQL4基因序列合成利用胍類裂解試劑提取人類組織或細(xì)胞的核酸RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成模板cDNA。同時(shí)根據(jù)RecQL4基因的兩端序列合成一對(duì)引物[引物1:gcaagcgcggaggccgggcgggcgcgcgcgccatggagcggctg(位置1-44);弓I物2為反義序歹U:tattctgcattttggagcctcctcgttc(位置3753-3780)]。然后使用這對(duì)引物和前面合成的模板cDNA在PCR儀器上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。3、RecQL4的鑒定方法(1)RecQL4全長(zhǎng)基因序列鑒定可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物在測(cè)序儀上直接進(jìn)行測(cè)序。其結(jié)果可與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院癌癥研究所網(wǎng)址所公布的序列進(jìn)行比較。即可確知所制備的RecQL4基因產(chǎn)物是否正確。(2)腫瘤細(xì)胞RecQL4信息RNA(mRNA)水平鑒定(用定量的Real-TimeRT-PCR方法)利用胍類裂解試劑提取腫瘤細(xì)胞的核酸RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成模板cDNA。然后利用Real-TimeRT-PCR方法對(duì)RecQL4mRNA水平進(jìn)行定量分析。(3)腫瘤細(xì)胞RecQL4蛋白水平鑒定(WesternBlot):將獲取的人類組織或細(xì)胞在裂解緩沖液中進(jìn)行勻槳，離心，獲取蛋白上清。然后通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離。分離之后再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，并與RecQL4抗體(已經(jīng)商業(yè)銷售)進(jìn)行孵育。然后再與RecQL4抗體相匹配的第二類抗體進(jìn)行孵育，并用化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)RecQL4在人類組織或細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種RecQL4基因高表達(dá)作為新型的靶點(diǎn)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案本發(fā)明涉及RecQL4基因高表達(dá)作為新型的靶點(diǎn)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于將RecQL4基因高表達(dá)作為一種新的耙點(diǎn)來(lái)篩選新型的抗腫瘤藥物，即特異的RecQL4基因高表達(dá)抑制劑。所述的特異的RecQL4基因高表達(dá)抑制劑的第一種篩選方法如下根據(jù)RecQL4蛋白ATP結(jié)合區(qū)三維結(jié)構(gòu)圖，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析軟件高通量地篩選小分子化合物文庫(kù)以確定哪些化合物能全部或部分地結(jié)合到ATP活性位點(diǎn)，即找到ATP結(jié)合位點(diǎn)的拮抗劑；在篩選過(guò)程中，化合物和ATP結(jié)合位點(diǎn)相配合的質(zhì)量通過(guò)形狀匹配或相互作用來(lái)判斷；一旦篩選到合適的小分子化合物，將通過(guò)化學(xué)的方法來(lái)合成它們，同時(shí)利用生物學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)它們對(duì)RecQL4酶活性的特異抑制。所述特異的RecQL4基因高表達(dá)抑制劑的第二種篩選方法如下因?yàn)镽ecQL4蛋白N-末端的磷酸化對(duì)于DNA復(fù)制的起始是必須的；因此將根據(jù)RecQL4蛋白N-末端磷酸化位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)圖來(lái)篩選這一磷酸化過(guò)程的特異阻斷劑，這樣通過(guò)阻斷RecQL4蛋白磷酸化修飾而達(dá)到抑制DNA復(fù)制和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的；這一抑制劑的篩選將利用RecQL4蛋白三維結(jié)構(gòu)圖和計(jì)算機(jī)分析軟件高通量地篩選化合物文庫(kù)而最終找到RecQL4蛋白N-末端磷酸化修飾的特異拮抗劑。所述特異的RecQL4基因高表達(dá)抑制劑的第三種篩選方法如下以蛋白結(jié)構(gòu)類似集群結(jié)合自然化合物引導(dǎo)的化合物文庫(kù)建立的方法，此法是利用不同類型蛋白盡管其基因序列沒(méi)有明顯同源性，但其功能保守區(qū)蛋白三維結(jié)構(gòu)都是類似的；這樣只要發(fā)現(xiàn)一種自然化合物對(duì)集群蛋白中的一個(gè)成員具有明顯抑制作用，那么就依據(jù)這一化合物作為引導(dǎo)結(jié)構(gòu)，通過(guò)化學(xué)合成的方法來(lái)組建化合物文庫(kù)，經(jīng)篩選后最終找到特異的化合物抑制劑；通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析，解旋酶RecQL4和真核細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)錄起始因子elF4A以及切除核酸酶亞單位B被歸類6為蛋白結(jié)構(gòu)類似集群，由于從珊瑚中提取的自然化合物Hi卯uristanol已經(jīng)被證實(shí)為elF4A的小分子抑制劑，因此將Hippuristanol作為導(dǎo)引結(jié)構(gòu)來(lái)合成一系列的衍生化合物，從而形成自己的化合物文庫(kù)，然后使用生物化學(xué)的方法逐一檢測(cè)它們對(duì)RecQL4酶活性的抑制，只要化合物的IG?！?0uM就被認(rèn)為中標(biāo)。本發(fā)明的理論根據(jù)如下本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)了RecQL4基因的新功能，這一新功能是RecQL4基因在人類腫瘤中的高表達(dá)可促進(jìn)人類腫瘤的形成，并利用這一新功能而作出的用途發(fā)明。RecQL4基因的這一新功能從以下四個(gè)方面得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)(1)RecQL4蛋白水平在人乳腺上皮和前列腺上皮永生化細(xì)胞株中是增高的體細(xì)胞永生化即細(xì)胞獲得無(wú)限增殖的能力是細(xì)胞癌變的前期階段。經(jīng)過(guò)對(duì)4例乳腺永生化細(xì)胞株(MCF-IOF、HMEC-hTl、HMEC-hT2和HMEC-hT3)及2例前列腺永生化細(xì)胞株(RWEP1和PEHC-hT)的分析，發(fā)現(xiàn)所有6例細(xì)胞株盡管無(wú)致瘤性，但其RecQL4蛋白水平明顯高于相對(duì)應(yīng)的正常乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)及前列腺上皮細(xì)胞(PHEC)，經(jīng)定量分析，平均增高2.4-9.7倍。因此，在細(xì)胞癌變?cè)缙陔A段，RecQL4水平是增高的(見圖1)。(2)RecQL4在大多數(shù)(4/6)體外培養(yǎng)的人乳腺癌腫瘤細(xì)胞株中也是增高的利用WesternBlot技術(shù)，以正常人類乳腺上皮細(xì)胞為參照，對(duì)RecQL4在體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)?？偣矙z測(cè)了6例乳腺癌細(xì)胞株，其中4例包括MCF-7、MDA-MB-361、MM-MB-436和MDA-MB453，其RecQL4蛋白表達(dá)水平比正常乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)增高3.4-14.2倍(見圖2)，因此，RecQL4在大多數(shù)的乳腺癌細(xì)胞株中也是高表達(dá)的。(3)乳腺腫瘤細(xì)胞在其RecQL4表達(dá)水平受到抑制后可明顯降低它在裸鼠中的腫瘤生長(zhǎng)速度為了確定是否RecQL4高表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞形成過(guò)程，申請(qǐng)人選擇一例腫瘤細(xì)胞株MDA-MB453，通過(guò)反義RNA技術(shù)抑制RecQL4在其內(nèi)的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)流程如下首先根據(jù)RecQL4mRNA序列設(shè)計(jì)一段含有21堿基序列的發(fā)夾式結(jié)構(gòu)。通過(guò)DNA合成儀進(jìn)行合成后，連接到表達(dá)載體(Vector)中.然后將載有RecQL4寡核苷酸序列的載體導(dǎo)入MDA-MB453腫瘤細(xì)胞中。因?yàn)檩d體本身含有抗生素篩選基因，因此，有載體表達(dá)的細(xì)胞就會(huì)在抗生素的篩選下存活下來(lái)，并形成細(xì)胞克隆，然后使用克隆環(huán)將每個(gè)細(xì)胞克隆分離出來(lái)，并擴(kuò)增形成克隆細(xì)胞株。最后，通過(guò)Westernblot技術(shù)對(duì)所有的克隆細(xì)胞株進(jìn)行鑒定，結(jié)果有兩株克隆細(xì)胞(MB453-ShRNAl和MB453-ShRNA2)其RecQL4蛋白水平受到了明顯的抑制，而MDA-MB453和只導(dǎo)入空白載體(不含RecQL4寡核苷酸序列)的MDA-MB453-Vector細(xì)胞仍表達(dá)高水平的RecQL4蛋白(見圖3)。然后將這4種細(xì)胞株(MDA-MB453、MDA-MB453-vector、MB453-ShRNAl和MB453-ShRNA2)分別注射到裸鼠的皮下，每株細(xì)胞共注射5個(gè)點(diǎn)即5只裸鼠，每只裸鼠注射一個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射5X106細(xì)胞，然后觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果證實(shí)在第四周時(shí)，100%(5/5)的裸鼠在注射了MDA-MB453或是MDA-MB453-vector腫瘤細(xì)胞后都形成了持續(xù)生長(zhǎng)的腫瘤結(jié)節(jié)，其腫瘤體積平均為240.5-272.8mm3。而與此相對(duì)比，盡管80%(4/5)裸鼠在注射了MB453-ShRNAl細(xì)胞，以及100%(5/5)的裸鼠在注射了MB453-ShRNA2細(xì)胞后也形成了腫瘤結(jié)節(jié)，但其平均體積只有19.7-37.6mm3，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其體積明顯小于由MDA-MB453和MDA-MB453-vector腫瘤細(xì)胞形成的腫瘤體積(P〈0.01)。因此，MDA-MB453腫瘤細(xì)胞在其RecQL4蛋白水平受到抑制后可明顯減緩和抑制其在裸鼠中的腫瘤生長(zhǎng)速度(見附表1及圖4)。(4)RecQL4mRNA水平在88.4%乳腺癌組織中超過(guò)正常組織3倍以上，特別是在轉(zhuǎn)移癌中，其水平超過(guò)正常組織46倍以上為了確定RecQL4在人類乳腺腫瘤中的表達(dá)水平，申請(qǐng)人利用定量Real-TimeRT-PCR方法對(duì)5例正常乳腺組織以及43例乳腺癌標(biāo)本中的RecQL4mRNA水平進(jìn)行了定量檢測(cè)。從臨床病理分級(jí)來(lái)分，43例乳腺癌中包括11例I級(jí)，14例IIA-IIB，14例IIIA-IIIB和4例轉(zhuǎn)移癌(IV級(jí))。結(jié)果證實(shí)(a)有88.4%(38/43)的乳腺癌組織其RecQL4mRNA水平超過(guò)正常組織3倍以上；(b)從病理分級(jí)上來(lái)分，72.7%(8/11)1級(jí)、92,9%(13/14)工IA-IIB級(jí)、92.9%(13/14)IIIA-niB級(jí)和100%(4/4)IV級(jí)其RecQL4mRNA水平增高3倍以上，因此，隨著腫瘤惡性程度的升高，有更高比例的腫瘤組織發(fā)生RecQL4的高表達(dá)；(c)從增高程度上，I級(jí)平均增高7.5倍，IIA-IIB級(jí)平均增高16.65倍，IIIA-IIIB級(jí)平均增高13.14倍，轉(zhuǎn)移癌(IV級(jí))平均增高62.5倍。因此在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，RecQL4mRNA水平是超乎異常地增高的(見圖5)。本發(fā)明的有益效果是RecQL基因高表達(dá)提供了一個(gè)非常有價(jià)值而且在藥理上非常有前途的抗腫瘤靶位點(diǎn)，為研制新的抗腫瘤藥物開拓了新思路，并且開創(chuàng)了抗腫瘤藥物的新領(lǐng)域。圖1-1為RecQL4在人乳腺和前列腺上皮永生化細(xì)胞株中蛋白表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖1-2為圖1-1中RecQL4蛋白表達(dá)水平的定量結(jié)果。圖2-1為RecQL4在人類乳腺癌細(xì)胞株中蛋白表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。.圖2-2為圖2-1中RecQL4蛋白表達(dá)水平的定量結(jié)果。圖3為反義寡核苷酸(ShRNA)介導(dǎo)的RecQL4在人乳腺腫瘤細(xì)胞中受到抑制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4為MDA-MB453腫瘤細(xì)胞在其RecQL4水平受到抑制后其腫瘤生長(zhǎng)速度明顯降低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5為88.4%(38/45)的人乳腺癌標(biāo)本其RecQL4m廳水平超過(guò)正常組織3倍以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在圖1中，Y1為增加的倍數(shù);HMEC為正常乳腺上皮細(xì)胞；MCF-10F為自發(fā)永生化的人乳腺上皮細(xì)胞；HMEC-hTl、HMEOhT2和HMEC-hT3為端粒酶高表達(dá)介導(dǎo)的永生化人乳腺上皮細(xì)胞；PHEC為正常人前列腺上皮細(xì)胞；RWEP1為病毒SV40-largeT抗原介導(dǎo)的人前列腺永生化上皮細(xì)胞株；PHEC-hT為端粒酶高表達(dá)介導(dǎo)的人前列腺永生化上皮細(xì)胞。圖1是利用Westernblot的方法，分別提取每株細(xì)胞的蛋白上清，經(jīng)變性聚丙烯酰胺電泳分離之后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，然后與抗RecQL4—抗孵育，再與相匹配的二抗孵育后，用化學(xué)發(fā)光的方法來(lái)觀察RecQL4蛋白條帶的強(qiáng)弱。卩-actin水平被用來(lái)標(biāo)定每株細(xì)胞的蛋白加樣量。在圖2中，Y2為增加的倍數(shù)；麗EC為正常人乳腺上皮細(xì)胞；MCF-10F為自發(fā)轉(zhuǎn)化而且無(wú)致瘤性的人乳腺永生化上皮細(xì)胞；MCF-7、MDA-MB231、MDA-MB361、MDA_MB436、MDA-MB453和MDA-MB468為體外培養(yǎng)的人乳腺癌上皮細(xì)胞株。圖2是分別提取每株細(xì)胞的蛋白上清，然后利用Westernblot的方法對(duì)RecQL4的水平進(jìn)行檢測(cè)和定在圖3中，MDA-MB453為乳腺癌上皮細(xì)胞株；MB453-vector為只轉(zhuǎn)染空載體的MDA-MB453乳腺癌上皮細(xì)胞；MB453-ShRNAl和MB453-sh-RNA2為MDA-MB453乳腺癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸后分離到的兩個(gè)克隆細(xì)胞株，它們的RecQL4表達(dá)水平都受到了明顯的抑制。圖4是將MDA-MB453、MB453-vector、MB453-ShRNAl和MB453-ShRNA2分別注射到裸鼠的皮下。裸鼠是具有免疫缺陷的種系，專門用于檢測(cè)人類腫瘤細(xì)胞的致瘤性。在注射上述細(xì)胞之后，分別觀察它們的腫瘤生長(zhǎng)速度，并用電子刻度尺來(lái)測(cè)量腫瘤的直徑。腫瘤的體積用下列公式來(lái)計(jì)算腫瘤體積=(最長(zhǎng)直徑_最短直徑2)X0.5。圖5是利用定量的Real-TimeRT-PCR方法來(lái)測(cè)定RecQL4在人類乳腺癌標(biāo)本中的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果證實(shí)與正常人乳腺組織相比，43例腫瘤標(biāo)本中有38例顯示RecQL4mRNA水平超過(guò)正常組織三倍以上。如果按臨床病理分級(jí)來(lái)區(qū)分，72.7%(8/11)I級(jí)、92.9%(13/14)工工A-IIB級(jí)、92.9%(13/14)IIIA-IIIB級(jí)和100%(4/4)IV級(jí)(轉(zhuǎn)移癌)其RecQL4mRNA水平增高3倍以上，因此，隨著腫瘤惡性程度的升高，有更高比例的腫瘤會(huì)發(fā)生RecQL4的高表達(dá)。如果從增高程度上來(lái)區(qū)分，轉(zhuǎn)移瘤其RecQL4mRNA水平比正常組織超出至少46倍以上，因此，在轉(zhuǎn)移瘤當(dāng)中，RecQL4mRNA水平是異常增高的。在圖5中，病理分級(jí)"0"代表正常人乳腺上皮組織。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例的理論根據(jù)如下人類腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多歩驟過(guò)程，大致分為起始、促進(jìn)和進(jìn)展三個(gè)階段，在此過(guò)程中，上皮細(xì)胞要經(jīng)過(guò)一系列的惡前表型的改變直到形成有浸潤(rùn)能力的腫瘤細(xì)胞。正常體細(xì)胞的分裂增殖是有限的，即經(jīng)過(guò)一定次數(shù)的分裂增殖以后會(huì)老化死亡。因此，潛在的腫瘤細(xì)胞必須首先克服細(xì)胞老化控制機(jī)制而獲得無(wú)限增殖能力，也可以說(shuō)細(xì)胞永生化即細(xì)胞獲得無(wú)限增殖的能力是腫瘤細(xì)胞形成的先決條件。同時(shí)，腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是造成腫瘤病人死亡的主要原因之一，然而臨床上還缺少更為有效或新的治療戰(zhàn)略來(lái)預(yù)防或降低腫瘤轉(zhuǎn)移所引起的癌癥病人的高死亡率。盡管以前的研究結(jié)果證實(shí)了RecQL4功能缺失與人類早衰和骨肉瘤高發(fā)相關(guān)，但是，RecQL4高表達(dá)與人類腫瘤發(fā)生的關(guān)系目前還沒(méi)有任何報(bào)道，因此，RecQL4高表達(dá)提供了一個(gè)非常有價(jià)值而且在藥理上非常有前途的抗腫瘤靶位點(diǎn)，依據(jù)如下(1)RecQL4蛋白水平在所有檢測(cè)的永生化細(xì)胞株中都是高表達(dá)的，而細(xì)胞永生化是癌癥發(fā)展過(guò)程中的早期階段；(2)多數(shù)體外培養(yǎng)的乳腺癌腫瘤細(xì)胞株其RecQL4蛋白水平與正常相比也是異常增高的；(3)在乳腺癌腫瘤細(xì)胞中，通過(guò)RecQL4表達(dá)的下調(diào)將能抑制其腫瘤生長(zhǎng)的速度；(4)在43例臨床乳腺癌標(biāo)本中，88.4%(38/43)的乳腺癌標(biāo)本其RecQL4mRNA水平超過(guò)正常組織3倍以上，特別是在4例轉(zhuǎn)移癌中，RecQL4mRNA水平增高至少46倍以上。因此，異常增高的RecQL4水平與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，RecQL4高表達(dá)可作為一種新的耙位點(diǎn)來(lái)篩選新型的抗腫瘤藥物，即特異的RecQL4高表達(dá)抑制劑。實(shí)施例1:DNA代謝過(guò)程中的一個(gè)共同特征是通過(guò)DNA解旋酶(Helicase)來(lái)打開互補(bǔ)的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。所有的解旋酶家族成員都擁有一個(gè)非常保守的ATP結(jié)合功能區(qū)，解旋酶就利用水解ATP而獲得的能量在基因重組、轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制及修復(fù)中起重要作用，因此，有效且特異的針對(duì)RecQL4蛋白ATP結(jié)合位點(diǎn)的抑制劑就會(huì)成為潛在的有臨床抗腫瘤作用的候選者。隨著靶蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)的完成以及計(jì)算機(jī)新技術(shù)手段的發(fā)展，基于蛋白結(jié)構(gòu)以及計(jì)算機(jī)分析軟件輔助的新藥設(shè)計(jì)已經(jīng)成為當(dāng)今尋找新的導(dǎo)引結(jié)構(gòu)藥的重要手段。RecQL4蛋白保守的ATP結(jié)合功能區(qū)的三維晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)完成，其結(jié)構(gòu)圖可在如下網(wǎng)站獲取ProteinDataBank(PDBID:IOYW)，http://www.rcsb.org(見EMBOJ,2003,StructureoftheRecQCatalyticcore,22:4910-4921)。然后，根據(jù)RecQL4的三維結(jié)構(gòu)圖，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析軟件高通量地篩選化合物小分子文庫(kù)以確定哪些化合物能全部或部分地結(jié)合到ATP活性位點(diǎn)，即找到ATP結(jié)合位點(diǎn)的拮抗劑；在篩選過(guò)程中，化合物和ATP結(jié)合位點(diǎn)相配合的質(zhì)量通過(guò)形狀匹配或相互作用能量來(lái)判斷(見Proteins,2004,Adetailedcomparisonofcurrentdockingandscoringmethodsonsystemsofpharmaceuticalrelevance,56(2):235-49禾口liProtein:Structure,Function,andGenetics,1990,Automateddockingofsubstratestoproteinsbysimulatedannealing,8:195-202);—旦f帝選至廿合適的小分子化合物，即可通過(guò)化學(xué)的方法來(lái)合成它們，同時(shí)利用生物學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)它們對(duì)RecQL4ATP酶活性的特異抑制；只要化合物的IC5?！?0uM就可以被認(rèn)為中標(biāo)(hits)。IC5。(InhibitoryConcentration)是指當(dāng)50%的RecQL4酶活性受到抑制時(shí)所需的化合物濃度。實(shí)施例2:目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)RecQL4蛋白的N-末端與酵母Sld2/Drcl蛋白序列同源，它可以被細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶磷酸化，而且這一修飾過(guò)程對(duì)于DNA復(fù)制過(guò)程的起始是必須的(見MolCellBiol.，2006,TheN-terminalnoncatalyticregionofXenopusRecQL4.isrequiredforchromatinbindingofDNApolymerasealphaintheinitiationofDNAreplication,26:4843-4852禾口CurrentBiol.,2002，CDKphosphorylationofDrclregulatesDNAreplicationinfissionyeast,12:599-605禾口Nature,2007,2007，PhosphorylationofSld2andSld3bycyclin-dependentkinasespromotesDNAreplicationinbuddingyeast,445:281-285)。因此，只要篩選到這一磷酸化過(guò)程的特異阻斷劑，那么就將通過(guò)阻斷RecQL4蛋白N-末端的磷酸化修飾而達(dá)到抑制DNA復(fù)制的目的，DNA復(fù)制受到抑制后，相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)也會(huì)受到抑制。同樣的，此種特異抑制劑的尋找也可以通過(guò)RecQL4蛋白三維結(jié)構(gòu)結(jié)合計(jì)算機(jī)分析軟件的戰(zhàn)略來(lái)完成。盡管RecQL4全長(zhǎng)蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖還未完成，但基于同一家族蛋白一RecQLl的三維晶體結(jié)構(gòu)(PDBID:2vlx)和蛋白結(jié)構(gòu)分析軟件(見Bioinformatics,2002,ESyPred3D:Predictionofproteins3Dstructures,18(9):1250-1256),將通過(guò)計(jì)算機(jī)分析軟件來(lái)模擬RecQL4蛋白的三維結(jié)構(gòu)，根據(jù)這一結(jié)構(gòu)和實(shí)施例1中描述的方法來(lái)高通量地篩選化合物小分子文庫(kù)以確定哪些化學(xué)物能全部或部分地結(jié)合到RecQL4的磷酸化位點(diǎn)，即找到RecQL4磷酸化位點(diǎn)的拮抗劑。因此，RecQL4ATP結(jié)合位點(diǎn)以及N-末端磷酸化位點(diǎn)的特異抑制劑都可以通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合計(jì)算機(jī)分析軟件輔助的高通量篩選戰(zhàn)略來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例3:第三種尋找特異的化合物抑制劑的戰(zhàn)略是以蛋白結(jié)構(gòu)類似集群(Proteinstructuresililarityclustering,PSSC)結(jié)合自然化合物引導(dǎo)的化合物文庫(kù)建立的方法(見DrugDiscovToday,2005，Proteinstructuresimilarityclusteringandnaturalproductstructureasguidingpronciplesindrugdiscovery,10(7):471-83)，此法是利用不同類型蛋白盡管其基因序列沒(méi)有明顯的同源性，但其功能保守區(qū)蛋白三維結(jié)構(gòu)卻是非常的類似；這樣只要發(fā)現(xiàn)一種自然化合物對(duì)集群蛋白中的一個(gè)成員具有明顯抑制作用，那么就能依據(jù)這一化合物作為導(dǎo)引結(jié)構(gòu)，通過(guò)化學(xué)合成的方法來(lái)組建化合物文庫(kù)，經(jīng)篩選后最終找到特異的化合物抑制劑；應(yīng)用這一戰(zhàn)略，RecQL4蛋白結(jié)構(gòu)類似集群可通過(guò)Dali資料庫(kù)來(lái)搜尋分析(網(wǎng)站http:〃www.ebi.ac.uk/dali，見NucleicAcidsRes.，1997,Dali/FSSPclassificationofthree-dimensionalproteinfolds,25:231-234)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，解旋酶RecQL4、真核細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)錄起始因子elF4A以及切除核酸酶亞單位B(EXCINUCLEASEABCSUBUNITB)盡管它們的基因序列同源性非常低，但它們保守的催化功能區(qū)的空間結(jié)構(gòu)卻非常類似；如果并列比較它們的三維結(jié)構(gòu)，其RMSD(RootMeanSquareDeviation)值在大約3-4A之間。RMSD是指兩種蛋白結(jié)構(gòu)在并列放置時(shí)的Ca位置，通常被用來(lái)比較兩種不同蛋白的結(jié)構(gòu)類似性。因此，解旋酶RecQL4、真核細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)錄起始因子elF4A以及切除核酸酶亞單位B可以被歸為蛋白結(jié)構(gòu)類似集群(PSSC)。Hippuristanol已經(jīng)被證實(shí)是elF4A的小分子抑制劑(見PLoSONE，2008,SelectivepharmacologicaltargetingofaDEADboxRNAhelicase，3(2):e1583)，它是從珊瑚中提取的自然化合物，因此，將Hippuristanol用作導(dǎo)引結(jié)構(gòu)來(lái)合成一系列的衍生化合物，從而形成自己的化合物文庫(kù)；然后使用生物化學(xué)的方法逐一檢測(cè)它們對(duì)RecQL4蛋白N-末端磷酸化修飾的抑制；自然化合物是理想的導(dǎo)引結(jié)構(gòu)，原因是這些自然化學(xué)結(jié)構(gòu)是經(jīng)過(guò)自然界長(zhǎng)期進(jìn)化篩選過(guò)的而且在生物學(xué)上與蛋白質(zhì)保守功能區(qū)有很強(qiáng)親和力的基本化學(xué)支架結(jié)構(gòu)。因此，以這些導(dǎo)引結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)來(lái)設(shè)計(jì)和合成一系列針對(duì)蛋白功能保守區(qū)的衍生化合物可大大提高中標(biāo)(Hits)的幾率。附表l:乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB453在RecQL4受抑制后的腫瘤生長(zhǎng)情況細(xì)胞類型裸鼠腫瘤形成率平均腫瘤體積(mm3)13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在附表中，*代表？<0.01，t檢驗(yàn)方法。權(quán)利要求1、RecQL4基因高表達(dá)作為新型的靶點(diǎn)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于將RecQL4基因高表達(dá)作為一種新的靶點(diǎn)來(lái)篩選新型的抗腫瘤藥物，即特異的RecQL4基因高表達(dá)抑制劑。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的RecQL4基因高表達(dá)作為新型的耙點(diǎn)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述特異的RecQL4基因高表達(dá)抑制劑的篩選方法如下根據(jù)RecQL4蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析軟件高通量地篩選化合物小分子庫(kù)以確定哪些化合物能全部或部分地結(jié)合到ATP活性位點(diǎn)，即找到ATP結(jié)合位點(diǎn)的拮抗劑；在篩選過(guò)程中，化合物和ATP結(jié)合位點(diǎn)相配合的質(zhì)量將通過(guò)形狀匹配或相互作用能量來(lái)判斷；一旦篩選到合適的小分子化合物，即通過(guò)化學(xué)的方法來(lái)合成它們，同時(shí)利用生物學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)它們對(duì)RecQL4酶活性的特異抑制，只要化合物的ICs。《10uM就被認(rèn)為中標(biāo)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的RecQL4基因高表達(dá)作為新型的耙點(diǎn)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述特異的RecQL4基因高表達(dá)抑制劑的篩選方法如下因?yàn)镽ecQL4蛋白N-末端的磷酸化對(duì)于DNA復(fù)制的起始是必須的；因此將根據(jù)RecQL4蛋白N-末端磷酸化位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)圖來(lái)篩選這一磷酸化過(guò)程的特異阻斷劑，這樣通過(guò)阻斷RecQL4蛋白磷酸化修飾而達(dá)到抑制DNA復(fù)制和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的；這一抑制劑的篩選將利用RecQL4蛋白三維結(jié)構(gòu)圖和計(jì)算機(jī)分析軟件高通量地篩選化合物文庫(kù)而最終找到RecQL4蛋白N-末端磷酸化修飾的特異拮抗劑。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的RecQL4基因高表達(dá)作為新型的靶點(diǎn)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述特異的RecQL4基因高表達(dá)抑制劑的篩選方法如下以蛋白結(jié)構(gòu)類似集群結(jié)合自然化合物引導(dǎo)的化合物文庫(kù)建立的方法，此法是利用不同類型蛋白盡管其基因序列沒(méi)有明顯同源性，但其功能保守區(qū)蛋白三維結(jié)構(gòu)都是類似的；這樣只要發(fā)現(xiàn)一種自然化合物對(duì)集群蛋白中的一個(gè)成員具有明顯抑制作用，那么就依據(jù)這一化合物作為引導(dǎo)結(jié)構(gòu)，通過(guò)化學(xué)合成的方法來(lái)組建化合物文庫(kù)，經(jīng)篩選后最終找到特異的化合物抑制劑；通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析，解旋酶RecQL4和真核細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)錄起始因子elF4A以及切除核酸酶亞單位B被歸類為同一蛋白結(jié)構(gòu)類似集群，由于從珊瑚中提取的自然化合物Hippuristanol已經(jīng)被證實(shí)是elF4A的小分子抑制劑，因此將Hippuristanol作為導(dǎo)引結(jié)構(gòu)來(lái)合成一系列的衍生化合物，從而形成自己的化合物文庫(kù)，然后使用生物化學(xué)的方法逐一檢測(cè)它們對(duì)RecQL4酶活性的特異抑制，只要化合物的IC5?！?0uM就被認(rèn)為中標(biāo)。全文摘要本發(fā)明涉及一種RecQL4基因高表達(dá)作為新型的靶點(diǎn)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于將RecQL4基因高表達(dá)作為一種新的靶點(diǎn)來(lái)篩選新型的抗腫瘤藥物，即特異的RecQL4基因高表達(dá)抑制劑。本發(fā)明的有益效果是RecQL高表達(dá)提供了一個(gè)非常有價(jià)值而且在藥理上非常有前途的抗腫瘤靶位點(diǎn)，為研制新的抗腫瘤藥物開拓了新思路，并且開創(chuàng)了抗腫瘤藥物的新領(lǐng)域。文檔編號(hào)C40B30/04GK101476163SQ20091007373公開日2009年7月8日申請(qǐng)日期2009年2月3日優(yōu)先權(quán)日2009年2月3日發(fā)明者趙永良申請(qǐng)人:趙永良