本發(fā)明涉及一種新的西紅花酸衍生物，具體涉及西紅花酸的可藥用酰胺及其制備方法，以及該衍生物在預防和治療心腦血管疾病中的應用。
背景技術：
：西紅花(CrocussativusL.)又稱藏紅花，是鳶尾科番紅花屬植物番紅花CrocussativusL.的干燥柱頭。西紅花是一種名貴的中藥材，在治療或預防心腦血管疾病，以及腫瘤、炎癥、疼痛抑制及對肝臟、腎臟、神經系統(tǒng)的保護作用等方面臨床應用廣泛，且療效顯著。西紅花的主要藥效物質包括西紅花酸、藏紅花素、西紅花酸二甲酯、西紅花苦素等，此外還含有桉腦、蒎烯、多種維生素。國內外現(xiàn)代研究表明，西紅花酸(crocetin)是西紅花在體內發(fā)揮心腦血管療效的主要活性組分。西紅花酸具有多不飽和共軛烯酸結構，屬類胡蘿卜素物質，在抗心血管系統(tǒng)疾病、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、防治糖尿病并發(fā)癥等方面有明確的生物活性。近年來，西紅花酸在心血管系統(tǒng)疾病中的防治作用成為許多學者的研究熱點，大量研究成果也表明西紅花酸具有很好的心血管保護作用，且其作用是多靶點、多途徑的。這些研究成果預示著西紅花酸有良好的開發(fā)前景，很有希望開發(fā)成為新型的防治心血管系統(tǒng)疾病的藥物，值得深入研究。然而，西紅花酸的脂溶性和水溶性較差，極難溶于水以及除吡啶和與吡啶相似的有機堿以外的常用有機溶劑，難以達到較高的藥物濃度及給藥劑量，另外，由于藥物脂溶性較高才能容易被胃腸道上皮細胞黏膜所吸收，而西紅花酸由于其脂溶性極差，從而造成生物利用度低，臨床應用受到極大的限制。同時，通過西紅花酸衍生物解決溶解性問題，仍有許多技術難點，比如衍生物結構不穩(wěn)定，活性降低等問題。為此，本研究以西紅花酸為基礎進行結構修飾，以期獲得到溶解性較好，且心腦血管活性與西紅花酸本體相當甚至更優(yōu)的新藥先導化合物。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種西紅花酸酰胺類衍生物以及其制備方法與用途。本發(fā)明的技術方案如下：一種西紅花酸酰胺GX-F，其結構式為：一種制備西紅花酸酰胺GX-F的方法，包括下列步驟：(1)取西紅花酸、EDCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽)、HOBt(1-羥基苯并三唑)于反應瓶中；冰浴條件下，加入Et3N(三乙胺)、CH2Cl2，再加入有機胺類化合物，在0℃下反應2-8小時，室溫過夜；(2)反應完全后，停止反應；將反應液過濾，除去溶劑，加入EA溶解，洗滌；除去溶劑后，得到粗品；(3)將粗品用硅膠柱進行分離，洗脫，得到產物。具體地，步驟(1)中加入的西紅花酸、EDCl、HOBt三者的摩爾投料比為2∶5∶5。具體地，步驟(1)中有機胺類化合物為乙胺。具體地，步驟(1)中反應時間優(yōu)選為4小時。具體地，步驟(1)中反應的西紅花酸與乙胺的摩爾比為1∶1-10；優(yōu)選地，步驟(1)中反應的西紅花酸與乙胺的摩爾比為1∶2。具體地，步驟(2)反應中的洗滌方法為：依次用鹽酸、碳酸氫鈉、水洗滌，分別洗滌2-5次；優(yōu)選地，步驟(2)反應中的洗滌方法為：依次用鹽酸、碳酸氫鈉、水洗滌，分別洗滌3次。具體地，步驟(3)中洗脫的方法為：先用CHCl3洗脫，再用CHCl3∶CH3OH＝10∶1進行洗脫。目前，西紅花酸存在脂溶性極低的問題，0.1g西紅花酸不溶于1000ml乙醇、氯仿-乙醇等有機溶劑，西紅花酸生物利用度極低，臨床應用受限。西紅花酸GX-1結構如下式2所示：式2：西紅花酸GX-1本發(fā)明通過篩選大量的西紅花酸衍生物，用以解決西紅花酸脂溶性低導致的生物利用度降低的問題。本發(fā)明合成了一系列西紅花酸衍生物，如GX-M、GX-N等。西紅花酸酰胺GX-M，其結構式如下式3所示：式3：西紅花酰胺衍生物GX-M西紅花酸酰胺GX-N，其結構式如下式4所示：式4：西紅花酰胺衍生物GX-N本發(fā)明涉及的西紅花酸酰胺衍生物GX-F，與同類西紅花酸衍生物GX-M、GX-N相比，在相同藥物濃度下，通過線粒體活性試劑檢測，GX-F活性明顯優(yōu)于GX-M、GX-N，甚至優(yōu)于西紅花酸GX-1，對缺氧小室誘導H9c2心肌細胞缺氧損傷有明顯的保護作用，可以有效預防或治療心腦血管疾病。本發(fā)明涉及的西紅花酸酰胺衍生物GX-F，脂溶性也遠高于西紅花酸GX-1，更容易被胃腸道上皮細胞黏膜所吸收，生物利用度相比于西紅花酸而言得到極大提升。本發(fā)明涉及的西紅花酰胺衍生物GX-F通過細胞毒性實驗證明該化合物安全有效，GX-F脂溶性提升的同時生物活性并沒有降低，甚至優(yōu)于西紅花酸，克服了西紅花酸脂溶極低導致的生物利用度低的問題，GX-F可以制備成片劑、緩釋片劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、注射劑等劑型用于預防或治療心腦血管疾病，其臨床應用更為廣泛。附圖說明圖1、GX-F的高分辨MS圖譜：GX-FC24H34N2O2Found：[M+H]+383.2699Calcd：[M+H]+383.2693(-1.55ppm)圖2、GX-F的高分辨NMR圖譜：GX-F：1HNMRspectrum圖3、GX-F的高分辨NMR圖譜：GX-F：13CNMRspectrum具體實施例實施例1制備西紅花酸衍生物GX-F取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于100ml反應瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入乙胺(1.0mmol，62μl)，在0℃條件下反應4h，然后室溫反應過夜。利用TLC和LC-MS檢測產物是否生成。停止反應，將反應液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml洗滌3次，真空除去溶劑得到粗品。將得到的粗產物GX-F用硅膠柱進行分離，先兩個柱體積的CHCl3進行洗脫，然后加大洗脫劑極性CHCl3∶CH3OH＝10∶1進行洗脫。得到GX-F，并用NMR表征其結構。黃色粉末，產率：75％。實施例2：制備西紅花酸衍生物GX-M：分別取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于25ml反應瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入4-氟苯甲胺(1.1mmol，125μl)，在0℃條件下反應4h，然后室溫反應過夜。利用TCL和LC-MS檢測產物是否生成，確定反應完全后，停止反應。將反應液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml分別洗滌3次，最后真空除去溶劑EA得到粗品。將得到的粗產物用硅膠柱進行分離，用三個柱體積的CHCl3進行洗脫。得到產物GX-M粗品，然后再次硅膠柱分離，用兩個柱體積的溶劑(石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1)進行洗脫，最終得到產物GX-M，并用NMR表征其結構，產率：75％。實施例3：制備西紅花酸衍生物GX-N：分別取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于25ml反應瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入3，5-二氟芐胺(1.1mmol，130μl)，在0℃條件下反應4h，然后室溫反應過夜。利用TCL和LC-MS檢測產物是否生成，確定反應完全后，停止反應。將反應液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml分別洗滌3次，最后真空除去溶劑EA得到粗品。將得到的粗產物用硅膠柱進行分離，用三個柱體積的CHCl3進行洗脫。得到產物GX-N粗品，然后再次硅膠柱分離，用兩個柱體積的溶劑(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)進行洗脫。最終得到產物GX-N，并用NMR表征其結構，產率：68％。實施例4制備西紅花酸衍生物GX-F取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于100ml反應瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入乙胺(1.0mmol，62μl)，在0℃條件下反應2h，然后室溫反應過夜。利用TLC和LC-MS檢測產物是否生成。停止反應，將反應液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml洗滌2次，真空除去溶劑得到粗品。將得到的粗產物GX-F用硅膠柱進行分離，先兩個柱體積的CHCl3進行洗脫，然后加大洗脫劑極性CHCl3∶CH3OH＝10∶1進行洗脫。得到GX-F，并用NMR表征其結構。黃色粉末，產率：69％。實施例5制備西紅花酸衍生物GX-F取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于100ml反應瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入乙胺(0.5mmol)，在0℃條件下反應8h，然后室溫反應過夜。利用TLC和LC-MS檢測產物是否生成。停止反應，將反應液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml洗滌5次，真空除去溶劑得到粗品。將得到的粗產物GX-F用硅膠柱進行分離，先兩個柱體積的CHCl3進行洗脫，然后加大洗脫劑極性CHCl3∶CH3OH＝10∶1進行洗脫。得到GX-F，并用NMR表征其結構。黃色粉末，產率：56％。實施例6制備西紅花酸衍生物GX-F取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于100ml反應瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入乙胺(5mmol)，在0℃條件下反應8h，然后室溫反應過夜。利用TLC和LC-MS檢測產物是否生成。停止反應，將反應液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml洗滌3次，真空除去溶劑得到粗品。將得到的粗產物GX-F用硅膠柱進行分離，先兩個柱體積的CHCl3進行洗脫，然后加大洗脫劑極性CHCl3∶CH3OH＝10∶1進行洗脫。得到GX-F，并用NMR表征其結構。黃色粉末，產率：70％。實施例7制備西紅花酸衍生物GX-F取西紅花酸GX-1(購自于Sigma公司)(0.5mmol，164mg)，EDCI(1.25mmol，239mg)，HOBt(1.25mmol，169mg)于100ml反應瓶。在冰浴條件下，加入Et3N(2.5mmol，350μl)及CH2Cl220ml，最后加入乙胺(2.5mmol)，在0℃條件下反應2h，然后室溫反應過夜。利用TLC和LC-MS檢測產物是否生成。停止反應，將反應液過濾，真空除去溶劑，加入10mlEA溶解，依次用2％HCl，5％NaHCO3，H2O各10ml洗滌2次，真空除去溶劑得到粗品。將得到的粗產物GX-F用硅膠柱進行分離，先兩個柱體積的CHCl3進行洗脫，然后加大洗脫劑極性CHCl3∶CH3OH＝10∶1進行洗脫。得到GX-F，并用NMR表征其結構。黃色粉末，產率：64％。實施例8GX及其結構修飾物抗心肌細胞缺氧作用實驗1、按實施例1-3，取GX-1、GX-M、GX-N、GX-F適量，用無水乙醇配制成1mm濃度，貯存于-20℃。KRBculturalbuffer(NaCl115mM，KCl4.7mM，CaCl22.5mM，NaHCO324mM，KH2PO41.2mM，MgSO4·7H2O1.2mM，HEPES10mm，0.01％BSA)，KRBwashbuffer(KRBculturalbufferwithoutFBS)，使用前氮氣平衡過夜；MTT，購自于Sigma公司；線粒體活性測定試劑盒，購自于Abcam公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購自與Gibco公司。RSE為人參提取物(澳門科技大學中藥質量研究國家重點實驗室自制)，該樣品已被證實在該模型上具有缺氧損傷心肌細胞保護作用。2、細胞培養(yǎng)：實驗用心肌細胞選用大鼠成纖維心肌細胞，H9c2(CRL-1446)，購自于ATCC公司。取出培養(yǎng)中的細胞，傾去培養(yǎng)基，用PBS潤洗一遍，傾去PBS，加入1ml的胰蛋白酶，37℃消化1min，加入培養(yǎng)基中止消化，1000rpm離心5min，棄上清液，加入培養(yǎng)基重懸細胞。用細胞計數板調整細胞濃度為5×104/ml，將細胞懸液加入96孔板中，每孔100μl，放入CO2培養(yǎng)箱(5％CO2，37℃)中培養(yǎng)48h。3、實驗分組：將H9c2心肌細胞分為正常對照組、缺氧模型組(心肌細胞缺氧誘導損傷模型組)、RSE陽性對照組(人參提取物RSE作為陽性對照組)、GX-1組、GX-B組、GX-D組及GX-F組。正常對照組不做任何處理，其余各組傾去培養(yǎng)基，加入KRBwashbuffer潤洗一次，傾去KRBwashbuffer，加入含藥KRBculturalbuffer：RSE陽性對照組中RSE終濃度為200μg/ml，GX各組終濃度均為10nM。4、心肌細胞缺氧誘導損傷：各組給藥后，立即將96孔板置入缺氧小室(billups-rothenberg，Inc.)，用氮氣飽和缺氧小室5min，密封缺氧小室，使其內部形成低氧環(huán)境，并將其置入37℃CO2培養(yǎng)箱中，開始缺氧。3h后，將96孔板從缺氧小室中取出，傾去含藥KRBculturalbuffer，加入100μl培養(yǎng)基。5、細胞活性及線粒體活性檢測：細胞活性檢測：每孔加入10μlMTT，37℃避光孵育4h，再加入10％SDS-HCL(0.01M)過夜，570nm波長下檢測。線粒體活性檢測：每孔加入100μl線粒體活性測定試劑，37℃避光孵育4h，檢測熒光強度(激發(fā)波長：550nm，發(fā)射波長590nm)。通過檢測表明，與正常對照組(100％±0.04)相比，缺氧小室誘導缺氧顯著降低了H9c2心肌細胞存活率(18.9％±0.03，p＜0.001)；陽性對照RSE200μg/ml組H9c2心肌細胞存活率(33.5％±0.01)較缺氧損傷組有顯著提高(p＜0.001)。結果顯示缺氧損傷心肌細胞模型成功。GX-F對缺氧誘導心肌細胞損傷保護作用具體如下表1所示：表1：GX四種化合物對缺氧誘導心肌細胞損傷保護作用(線粒體活性試劑檢測結果)序號組別H9c2心肌細胞線粒體存活率1NORMAL(正常對照組)1.002HYPOXIA(缺氧模型組)0.423GX-10.654GX-M0.295GX-N0.396GX-F0.73結論：線粒體活性試劑檢測結果如表1所示，GX系列化合物在1μM劑量下分別呈現(xiàn)對缺氧心肌細胞的不同作用，在相同藥物濃度下，GX-F活性明顯優(yōu)于藏紅花酸GX-1，同時與藏紅花酸衍生物GX-M、GX-N相比，GX-F的活性更優(yōu)，對缺氧小室誘導H9c2心肌細胞缺氧損傷有明顯的保護作用。實施例9GX-1、GX-F溶解性實驗比較取0.1g固體試樣(西紅花酸(GX-1)及其衍生物(GX-F))于試管中，加1mL乙醇/氯仿-甲醇(10∶1)振蕩后，如不溶解可加至100mL和1000mL觀察是否溶解，具體結果如下表2所示：表2試驗報告表注：表中“+”表示溶解；“-”表示不溶解；若介于溶解和不溶解之間的現(xiàn)象，則用符號“±”表示；“/”表示不需試驗的項目。結論：由上述表2的實驗結果可以看出，經過結構修飾后的GX-F的脂溶性優(yōu)于西紅花酸。當前第1頁1 2 3