本發(fā)明涉及外周血PBMC分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速獲取外周血PBMC的方法
背景技術(shù)：
自體免疫T細(xì)胞技術(shù)，是從患者的外周血中分離出T細(xì)胞，通過(guò)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、制劑，回輸患者體內(nèi)，誘導(dǎo)人體自身產(chǎn)生免疫應(yīng)答。目前T細(xì)胞的獲得主要來(lái)源于人外周血PBMC中。主要的分離方法是將人外周血直接與PBS等量混合，然后加入淋巴分離液中進(jìn)行梯度分離，最后獲得PBMC。這種方法對(duì)血量少的樣本來(lái)說(shuō)尚可操作，但是在分離大量的血量時(shí)(>100ML)，操作步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，不利于PBMC的分離和細(xì)胞的活率；另外比較大量的采血(>100ml)使用的是一次性塑料血袋，使用過(guò)程中需要先剪短塑料血袋的血管，將血樣轉(zhuǎn)入離心管中再進(jìn)行后續(xù)的PBMC操作，操作步驟繁瑣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提出了一種快速獲取外周血PBMC的方法，使用過(guò)程中不需要剪短塑料血袋的血管，將血樣放入離心管中再進(jìn)行相關(guān)的操作。該方法對(duì)于大量人外周血PBMC分離不僅可減少操作步驟，縮短了操作時(shí)間，保證了細(xì)胞活率，且節(jié)約了實(shí)驗(yàn)耗材及試劑用量，有利于PBMC的成本控制。
本發(fā)明提出的一種快速獲取外周血PBMC的方法，包括如下步驟：
S1、將裝有血液樣本的塑料血袋放入離心管適配器中，配平后離心；
S2、除去上層血漿后，將中間的灰黃層取出，向取出的灰黃層中加入生理鹽水稀釋；
S3、將S2得到的產(chǎn)物送入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位于淋巴細(xì)胞分離液上層；
S4、離心分離，吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到外周血PBMC。
優(yōu)選地，在S1中，離心速度為1200-1800rpm，離心時(shí)間為10-20min。
優(yōu)選地，在S1中，將裝有血液樣本的塑料血袋放入適配250ml離心管的適配器中。
優(yōu)選地，在S2中，吸取灰黃層至離心管中，加入生理鹽水稀釋至離心管總體積的70-80％。
優(yōu)選地，在S3中，吸取20-30ml S2得到的產(chǎn)物，加入到含有15-30ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中。
優(yōu)選地，在S3中，吸取25ml S2得到的產(chǎn)物，加入到含有20ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中。
優(yōu)選地，在S4中，離心速度為1500-1800rpm，離心時(shí)間為10-30min。
本發(fā)明可快速獲取大量血PBMC后的T細(xì)胞，方法簡(jiǎn)便，易于操作，本發(fā)明直接將采血后的血袋放入適配離心管的離心機(jī)中直接離心，人工擠出血漿后，輕輕擠出中間的灰黃層到離心管中進(jìn)行后續(xù)的操作，從而節(jié)約了時(shí)間、試劑、耗材。
具體實(shí)施方式
下面，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1
一種快速獲取外周血PBMC的方法，包括如下步驟：
S1、將裝有血液樣本的塑料血袋放入離心管適配器中，配平后離心；
S2、除去上層血漿后，將中間的灰黃層取出，向取出的灰黃層中加入生理鹽水稀釋；
S3、將S2得到的產(chǎn)物送入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位于淋巴細(xì)胞分離液上層；
S4、離心分離，吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到外周血PBMC。
實(shí)施例2
一種快速獲取外周血PBMC的方法，包括如下步驟：
S1、將30ml裝有血液樣本的塑料血袋放入離心管適配器中，配平后離心，離心速度為1800rpm，離心時(shí)間為10min；
S2、除去上層血漿后，將中間的灰黃層取出，向取出的灰黃層中加入生理鹽水稀釋；
S3、將S2得到的產(chǎn)物送入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位于淋巴細(xì)胞分離液上層；
S4、離心分離，吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到外周血PBMC。
實(shí)施例3
一種快速獲取外周血PBMC的方法，包括如下步驟：
S1、將150ml裝有血液樣本的塑料血袋放入適配250ml離心管的適配器中，配平后離心，離心速度為1200rpm，離心時(shí)間為20min；
S2、除去上層血漿后，將中間的灰黃層取出，向取出的灰黃層中加入生理鹽水稀釋；
S3、將S2得到的產(chǎn)物送入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位于淋巴細(xì)胞分離液上層；
S4、離心分離，吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到外周血PBMC。
實(shí)施例4
一種快速獲取外周血PBMC的方法，包括如下步驟：
S1、將40ml裝有血液樣本的塑料血袋送入適配50ml離心管適配器中，配平后離心，離心速度為1500rpm，離心時(shí)間為16min；
S2、擠出上層血漿后，擠出10ml灰黃層至1個(gè)50ml離心管中，加入生理鹽水稀釋至離心管體積的70％，剩余灰黃層按上述步驟稀釋處理；
S3、將30ml S2得到的產(chǎn)物送入含有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位于淋巴細(xì)胞分離液上層；
S4、離心分離，離心速度為1500rpm，離心時(shí)間為30min，剩余S2得到的產(chǎn)物按上述步驟離心處理；吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到外周血PBMC。
實(shí)施例5
一種快速獲取外周血PBMC的方法，包括如下步驟：
S1、將40ml裝有血液樣本的塑料血袋送入適配50ml離心管適配器中，配平后離心，離心速度為1600rpm，離心時(shí)間為14min；
S2、擠出上層血漿后，吸取17.5ml灰黃層至50ml離心管中，加入生理鹽水稀釋至離心管體積的80％，剩余灰黃層按上述步驟稀釋處理；
S3、將20ml S2得到的產(chǎn)物送入含有30ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位于淋巴細(xì)胞分離液上層；
S4、離心分離，離心速度為1800rpm，離心時(shí)間為10min，剩余S2得到的產(chǎn)物按上述步驟離心處理；吸取中間白膜層，洗滌，離心棄上清，得到外周血PBMC。
實(shí)施例6
一種快速獲取外周血PBMC的方法，包括如下步驟：
S1、將120ml裝有血液樣本的塑料血袋送入適配250ml離心管的適配器中，配平后離心，離心速度為1500rpm，離心時(shí)間為15min；
S2、擠出上層血漿后，吸取15ml灰黃層至50ml離心管中，加入生理鹽水稀釋至離心管總體積的75％，剩余灰黃層按上述步驟稀釋處理；
S3、將25ml S2得到的產(chǎn)物送入含有20ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，其中S2得到的產(chǎn)物位于淋巴細(xì)胞分離液上層；
S4、離心分離，離心速度為1600rpm，離心時(shí)間為20min，剩余S2得到的產(chǎn)物按上述步驟離心處理；吸取中間白膜層至50ml離心管中，洗滌，離心棄上清，得到外周血PBMC。
將采用實(shí)施例6的方法與傳統(tǒng)方法對(duì)比，其中傳統(tǒng)方法為將人外周血和PBS等量混合，然后加入淋巴分離液進(jìn)行梯度分離，最后獲得PBMC。
將兩者使用的淋巴分離液的使用量、移液管數(shù)量、離心管數(shù)量、操作時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，測(cè)試結(jié)果如下表1所示：
表1本發(fā)明方法與傳統(tǒng)方法測(cè)試結(jié)果對(duì)比表
本發(fā)明可節(jié)約大量的淋巴分離液，用本方法只需要60ml的淋巴分離液，而傳統(tǒng)的方法卻需要近280mL淋巴分離液；大約只需要傳統(tǒng)方法1/10的耗材，如離心管、移液管等；相比傳統(tǒng)的方法節(jié)約大量的時(shí)間。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。