本發(fā)明涉及一種基于Hg²⁺輔助及雙聚合酶等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的microRNA檢測(cè)方法，屬于光學(xué)生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

MicroRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度在19-23個(gè)堿基、內(nèi)源性非蛋白編碼的RNA分子，在許多生物過(guò)程中起著舉足輕重的作用。生物體內(nèi)microRNA通過(guò)抑制翻譯或降解目標(biāo)信使核糖核酸分子的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控作用。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)microRNA表達(dá)水平的改變與癌癥的種類(lèi)、發(fā)展階段甚至藥物療效等息息相關(guān)。所以，探索靈敏度高、選擇性好的microRNA檢測(cè)新方法具有重要意義。Northern印跡技術(shù)和微陣列技術(shù)都是microRNA檢測(cè)的常用方法，但是它們的靈敏度較低，選擇性較差，而且操作步驟費(fèi)力耗時(shí)，限制了以上方法在生化分析方面的應(yīng)用，尤其是其在臨床診斷方面的推廣。

基于序列擴(kuò)增的檢測(cè)方法由于具有顯著的信號(hào)放大能力而成為強(qiáng)有力的生物分析工具，尤其在研究microRNA的檢測(cè)新方法方面，基于序列擴(kuò)增的信號(hào)放大方法顯示出巨大的潛能。目前，常用的序列擴(kuò)增方法有聚合酶鏈反應(yīng)、鏈置換反應(yīng)和滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)等，且大多基于熒光分析的檢測(cè)方法以SYBR Green ?熒光染料作為信號(hào)源。SYBR Green ?具有良好的光學(xué)性能、溫度穩(wěn)定性和靈敏性，可以插入DNA雙鏈中，與DNA雙鏈結(jié)合后發(fā)出強(qiáng)的熒光信號(hào)，但是它對(duì)單鏈核酸也有一定的非特異性吸附。因此，需要發(fā)展一種既可以形成雙鏈又可以避免非特異性吸附的檢測(cè)方法?；诖?，我們提出一種基于Hg²⁺輔助及雙聚合酶等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的microRNA檢測(cè)方法，利用T-Hg²⁺-T雙鏈結(jié)構(gòu)避免了因雜交而引入單鏈的非特異性吸附、錯(cuò)配以及鏈置換反應(yīng)的發(fā)生，提高了SYBR Green ?與雙鏈DNA的結(jié)合效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種基于Hg²⁺輔助及雙聚合酶等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的microRNA檢測(cè)方法，該方法對(duì)microRNA檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、靈敏和快速的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)的，一種基于Hg²⁺輔助及雙聚合酶等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的microRNA檢測(cè)方法，其特征在于，當(dāng)microRNA存在時(shí)，引物microRNA與模板DNA雜交形成引物-模板復(fù)合物；加入聚合酶Klenow片段使其綁定在引物-模板復(fù)合物中引物的3'-羥基末端，催化引物延伸反應(yīng)，生成與模板DNA互補(bǔ)的短DNA序列；加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，將脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷添加到生成的短DNA序列的3'-羥基末端，催化短DNA序列從5'端向3'端延伸而形成聚胸腺嘧啶堿基序列；加入Hg²⁺，形成T-Hg²⁺-T雙鏈結(jié)構(gòu)，SYBR Green ?熒光染料可插入到T-Hg²⁺-T雙鏈結(jié)構(gòu)中并使SYBR Green ?的熒光顯著增強(qiáng)，SYBR Green ?熒光增強(qiáng)的程度與microRNA濃度呈正相關(guān)，據(jù)此實(shí)現(xiàn)microRNA的靈敏檢測(cè)。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

（1）將microRNA與模板DNA混合，80 °C退火雜交5 min后慢慢冷卻至室溫，加入含聚合酶Klenow片段、脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液，在37 °C水浴中反應(yīng)3 h，制成聚胸腺嘧啶堿基序列，加入Hg²⁺并完全混合后，在37 °C水浴中等溫反應(yīng)1 h，形成T-Hg²⁺-T雙鏈結(jié)構(gòu)溶液；

（2）將SYBR Green ?加入步驟（1）反應(yīng)形成的T-Hg²⁺-T雙鏈結(jié)構(gòu)溶液中，混合后移入離心管中，用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液稀釋至200 μL，室溫下反應(yīng)10 min，在光程為1 cm的石英池中，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm和掃描范圍為510-650 nm時(shí)，采用熒光光譜儀測(cè)量發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm處的熒光。

上述方法中，步驟（1）中，所述的三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液的濃度為20 mM，pH 7.9，含50 mM KAc、10 mM Mg(Ac)₂和0.25 mM CoCl₂。步驟（2）中，所述的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液的濃度為10 mM，pH為7.5，含50 mM NaCl和10 mM MgCl₂。

本發(fā)明的技術(shù)效果是：本發(fā)明利用聚合酶Klenow片段和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷在microRNA-DNA復(fù)合物上延伸的共同催化作用，形成聚胸腺嘧啶堿基序列，加入Hg²⁺后形成T-Hg²⁺-T雙鏈結(jié)構(gòu)，SYBR Green ?熒光染料插入到T-Hg²⁺-T雙鏈結(jié)構(gòu)中使SYBR Green ?的熒光增強(qiáng)，熒光增強(qiáng)的程度與microRNA的濃度呈正相關(guān)，據(jù)此實(shí)現(xiàn)microRNA的靈敏檢測(cè)，該方法具有簡(jiǎn)單、靈敏和快速的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是基于Hg²⁺輔助及雙聚合酶等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的microRNA檢測(cè)原理圖。

圖2是（A）熒光光譜圖：(a)不含和(b)含microRNA-21。內(nèi)插圖：瓊脂糖凝膠電泳圖。條帶M：ladder marker；條帶0和1分別是(0)不含和(1)含microRNA-21的樣品。（B）含microRNA-21時(shí)產(chǎn)物的原子力顯微鏡圖。

圖3是熒光光譜圖：(a) cpDNA+microRNA-21+KFexo^-+TdTase，(b) cpDNA+microRNA-21+KFexo^-，(c) cpDNA+microRNA-21+TdTase，(d) cpDNA+microRNA-21，(e) cpDNA。內(nèi)插圖：聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。條帶M：ladder marker；條帶1：cpDNA+microRNA-21；條帶2：cpDNA+microRNA-21+KFexo^-；條帶3：cpDNA+microRNA-21+TdTase；條帶4：cpDNA；條帶5：cpDNA+microRNA-21+KFexo^-+TdTase。

圖4是不同濃度的microRNA-21（0，10，20，30，50，100，200，500，1000，2000，5000，10000 pM）存在時(shí)的熒光光譜圖。內(nèi)插圖：熒光光譜強(qiáng)度與microRNA-21濃度的對(duì)數(shù)線(xiàn)性相關(guān)曲線(xiàn)。

圖5是分析方法的特異性：Blank，microRNA-141，microRNA-210，單堿基錯(cuò)配的microRNA-21（SM），完全互補(bǔ)的microRNA-21（PM）。

圖6是實(shí)際樣品檢測(cè)：Blank，人類(lèi)肺癌表皮細(xì)胞（A549），人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，本發(fā)明并不限于此。

實(shí)施例1

（1）將microRNA與模板DNA（cpDNA）混合，80 °C退火雜交5 min后慢慢冷卻至室溫，加入含聚合酶Klenow片段（KFexo^-）、脫氧三磷酸胸腺嘧啶核苷和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdTase）的20 mM pH 7.9且含50 mM KAc、10 mM Mg(Ac)₂和0.25 mM CoCl₂的三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液，在37 °C水浴中反應(yīng)3 h，制成聚胸腺嘧啶堿基序列，加入Hg²⁺并完全混合后，在37 °C水浴中等溫反應(yīng)1 h，形成T-Hg²⁺-T雙鏈結(jié)構(gòu)溶液；

（2）將5 μL SYBR Green ?加入T-Hg²⁺-T雙鏈結(jié)構(gòu)溶液中，混合后移入離心管中，用10 mM pH 7.5且含50 mM NaCl和10 mM MgCl₂的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液稀釋至200 μL，室溫下反應(yīng)10 min，在光程為1 cm的石英池中，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm和掃描范圍為510-650 nm時(shí)，采用熒光光譜儀測(cè)量發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm處的熒光。檢測(cè)原理如圖1所示。

由圖2A可見(jiàn)，當(dāng)microRNA-21存在時(shí)，出現(xiàn)了SYBR Green ?的強(qiáng)熒光（曲線(xiàn)a），表明microRNA-21引發(fā)聚合反應(yīng)并生成大量的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。沒(méi)有microRNA-21的空白對(duì)照的熒光則很微弱（曲線(xiàn)b），表明沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)雙聚合酶延伸胸腺嘧啶的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析（內(nèi)插圖），當(dāng)存在microRNA-21時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)出明顯的拖尾條帶（條帶1），表明生成了高分子量的聚胸腺嘧啶堿基結(jié)構(gòu)；而當(dāng)沒(méi)有microRNA-21存在時(shí)，則未獲得高分子量的產(chǎn)物（條帶0），表明沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。進(jìn)一步采用原子力顯微鏡表征反應(yīng)產(chǎn)物，由圖2B可見(jiàn)，當(dāng)存在microRNA-21時(shí)，形成了不同長(zhǎng)度的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，這個(gè)結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳相符合。

實(shí)施例2

通過(guò)熒光光譜和聚丙烯酰胺凝膠電泳研究聚合反應(yīng)過(guò)程中兩種聚合酶對(duì)反應(yīng)的影響。由圖3可見(jiàn)，在cpDNA+microRNA-21溶液中，只有當(dāng)聚合酶KFexo^-和TdTase都存在時(shí)，SYBR Green ?的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)（曲線(xiàn)a），而只有其中一種聚合酶或無(wú)聚合酶時(shí)，只有很弱的熒光信號(hào)（曲線(xiàn)b-e），以上結(jié)果表明，熒光信號(hào)的放大取決于聚合酶KFexo^-和TdTase的共同作用。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)雙聚合酶延伸胸腺嘧啶的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析（內(nèi)插圖），當(dāng)只有聚合酶TdTase或KFexo^-時(shí)，沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物生成（條帶1-4）；而當(dāng)聚合酶TdTase和KFexo^-同時(shí)加入時(shí)（條帶5），生成了大量擴(kuò)增產(chǎn)物，因產(chǎn)物太長(zhǎng)以至于留在樣品孔中，沒(méi)有進(jìn)入電泳凝膠。以上結(jié)果證實(shí)了所提出的檢測(cè)方法是由目標(biāo)microRNA引發(fā)，兩種聚合酶協(xié)同催化擴(kuò)增反應(yīng)，當(dāng)加入Hg²⁺輔助時(shí)，以SYBR Green ?為熒光信號(hào)，可在均相體系中實(shí)現(xiàn)microRNA的檢測(cè)。

實(shí)施例3

圖4為SYBR Green ?熒光強(qiáng)度隨microRNA-21濃度的變化。SYBR Green ?的熒光強(qiáng)度隨microRNA-21濃度的增加而增強(qiáng)， microRNA-21濃度為10 pM-10 nM范圍內(nèi)，SYBR Green ?熒光強(qiáng)度與microRNA-21濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（內(nèi)插圖），對(duì)microRNA-21的檢測(cè)限為5 pM。

為了評(píng)估本方法對(duì)microRNA-21檢測(cè)的特異性，開(kāi)展了對(duì)照實(shí)驗(yàn)：采用microRNA-210、microRNA-141和單堿基錯(cuò)配（SM）microRNA-21為陰性對(duì)照，不含microRNA-21的樣品為空白對(duì)照（Blank），結(jié)果如圖5所示。MicroRNA-210和microRNA-141存在時(shí)，SYBR Green ?的熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照相近；單堿基錯(cuò)配microRNA-21存在時(shí)，SYBR Green ?的熒光強(qiáng)度比空白對(duì)照的熒光強(qiáng)度稍有增強(qiáng)；然而，完全互補(bǔ)（PM）microRNA-21存在時(shí)，SYBR Green ?的熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照的熒光強(qiáng)度相比顯著增強(qiáng)。由此可見(jiàn)，本方法可區(qū)別完全互補(bǔ)和非互補(bǔ)的microRNA，即使只有一個(gè)堿基的差異也能識(shí)別，具有良好的特異性。

為了探討本方法在復(fù)雜生物基質(zhì)中定量檢測(cè)microRNA的可行性，我們將本方法應(yīng)用于定量檢測(cè)從人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和人類(lèi)肺癌表皮細(xì)胞（A549）提取的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中microRNA-21的表達(dá)含量。由圖6可見(jiàn)，A549細(xì)胞溶解產(chǎn)物中SYBR Green ?的熒光強(qiáng)度比空白對(duì)照的熒光強(qiáng)度有所增加，表明在A(yíng)549肺癌細(xì)胞中含有少量microRNA-21。而MCF-7細(xì)胞溶解產(chǎn)物中SYBR Green ?的熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照的熒光強(qiáng)度相比顯著增強(qiáng)，表明MCF-7乳腺癌細(xì)胞中microRNA-21的含量比較高。以上結(jié)果表明，本方法可用于細(xì)胞溶解產(chǎn)物等復(fù)雜生物樣品中microRNA的定量分析，具有廣泛的應(yīng)用前景。