本發(fā)明涉及血清腺苷脫氨酶檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種血清腺苷脫氨酶檢測試劑，還涉及使用此檢測試劑的檢測方法。

背景技術(shù)：

腺苷脫氨酶(ADA)是人體嘌吟核苷酸代謝中的重要酶類，廣泛分布于人體各組織中，其中以胸腺、脾和其他淋巴組織中含量最高，而肝、肺、腎和骨胳肌等含量較低；血清中的ADA主要來自肝臟，是反映肝損傷的敏感指標，可作為肝功能常規(guī)檢查項目之一，依據(jù)該酶活性增高或降低反映肝細胞損傷和恢復(fù)程度；慢性溶血患者紅細胞ADA活性顯著升高；腫瘤患者血清及組織中ADA活性均升高；結(jié)核性腦膜炎患者CSF-ADA明顯升高。

目前，腺苷脫氨酶的測定方法有波氏顯色法、氨氣敏電極法、酶法、酶偶聯(lián)法等；波氏顯色法試劑簡單、易于操作，但該法易受外源性銨根離子的影響；氨氣敏電極法雖然抗干擾能力較強，但難以控制電極的響應(yīng)信號和響應(yīng)時間，不適于臨床大批量樣品的測定；酶法較靈敏、可實現(xiàn)自動化分析，但重復(fù)性和準確度較差；酶偶聯(lián)法結(jié)果準確、簡便實用，但易受抗壞血酸和膽紅素等物質(zhì)干擾。

鑒于此，本發(fā)明在酶偶聯(lián)法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化反應(yīng)體系，添加膽紅素氧化酶和抗壞血酸氧化酶，可以有效避免膽紅素和抗壞血酸的干擾，大大增強試劑的抗干擾能力，并且采用新的Trinder反應(yīng)色原物質(zhì)HTBA（3-羥基-2,4,6-三碘苯甲酸），顯著增強了試劑的穩(wěn)定性和準確度；此外，通過添加穩(wěn)定劑如丙三醇、聚乙二醇6000、甘露醇、海藻糖、BSA、乙二醇等可有效提高試劑的穩(wěn)定性；且優(yōu)選的新型非離子表面活性劑烷基糖苷（APG）的加入可防止反應(yīng)體系渾濁，增強底物的穩(wěn)定性，提高試劑的抗干擾能力；該試劑操作簡便快速，適用于自動化分析，是一種更加穩(wěn)定、抗干擾能力強的血清腺苷脫氨酶（ADA）試劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測血清腺苷脫氨酶（ADA）的試劑及使用該試劑檢測血清腺苷脫氨酶活性的方法。該試劑盒采用酶偶聯(lián)法，可以有效檢測血清腺苷脫氨酶的活性，抗干擾能力強，穩(wěn)定性好等優(yōu)點。

基本原理：

ADA（腺苷脫氨酶）催化底物腺苷脫氨生成次黃嘌呤核苷，次黃嘌呤核苷再經(jīng) PNP（嘌呤核苷磷酸化酶）作用生成次黃嘌呤。次黃嘌呤在XOD（黃嘌呤氧化酶）作用下，生成尿酸和過氧化氫（H2O2）。過氧化氫(H2O2) 在過氧化物酶存在的情況下，可與3-羥基-2,4,6-三碘苯甲酸（HTBA）和4-氨基氨替吡啉（4-AA）反應(yīng)產(chǎn)生有色醒類化合物，有色醒類化合物的生成速率與ADA（腺苷脫氨酶）的活性相關(guān)。通過測定550nm波長處吸光度的上升速率，即有色醒類化合物生成速率來測定腺苷脫氨酶的活性。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

一種血清腺苷脫氨酶檢測試劑，包括試劑R1和試劑R2，所述試劑R1和試劑R2的組成如下：

試劑R1中含有

緩沖液_{··························}100mmol/L，

4-氨基氨替吡啉_{··················}5mmol/L，

PNP（嘌呤核苷磷酸化酶）_{···········}1.5KU/L，

XOD（黃嘌呤氧化酶）_{···············}3.1KU/L，

POD（過氧化物酶）_{·················}5KU/L，

膽紅素氧化酶_{····················}3KU/L，

抗壞血酸氧化酶_{··················}3.5KU/L，

丙三醇_{··························}4ml/L，

聚乙二醇6000_{····················}5g/L，

乙二醇_{··························}6ml/L，

甘露醇_{··························}25g/L，

海藻糖_{··························}15g/L，

BSA_{·····························}1g/L，

烷基糖苷（APG）_{···················}1g/L，

防腐劑_{··························}0.5g/L；

2）試劑R2的組分為：

緩沖液_{··························}100mmol/L，

腺苷_{····························}14mmol/L，

HTBA（3-羥基-2,4,6-三碘苯甲酸）_···5mmol/L，

丙三醇_{··························}4ml/L，

聚乙二醇6000_{····················}5g/L，

乙二醇_{··························}6ml/L，

甘露醇_{··························}25g/L，

海藻糖_{··························}15g/L，

BSA_{·····························}1g/L，

烷基糖苷（APG）_{···················}1g/L，

防腐劑_{··························}0.5g/L。

所述的血清腺苷脫氨酶檢測試劑，試劑R1中緩沖液為25℃，pH為8.0的HEPES緩沖液。

所述的血清腺苷脫氨酶檢測試劑，試劑R2中緩沖液為25℃，pH為4.0的Tris緩沖液。

所述的血清腺苷脫氨酶檢測試劑，所述防腐劑為NaN3。

所述的血清腺苷脫氨酶檢測試劑來檢測血清腺苷脫氨酶含量的檢測方法，使用全自動生化分析儀利用速率法進行測定，檢測主波長為550nm。

所述的檢測方法，R1試劑和R2試劑的比例為2:1。

本發(fā)明的有益效果：

1）添加膽紅素氧化酶和抗壞血酸氧化酶，可以有效避免膽紅素和抗壞血酸的干擾，大大增強試劑的抗干擾能力；

2）采用新的Trinder反應(yīng)色原物質(zhì)HTBA（3-羥基-2,4,6-三碘苯甲酸），顯著增強了試劑的穩(wěn)定性和準確度；

3）新型非離子表面活性劑烷基糖苷（APG）的加入可防止反應(yīng)體系渾濁，增強底物的穩(wěn)定性，提高試劑的抗干擾能力；

4）優(yōu)化反應(yīng)體系并添加丙三醇、聚乙二醇6000、甘露醇、海藻糖、BSA、乙二醇等多種穩(wěn)定劑，可以顯著改善試劑的穩(wěn)定性；

5）試劑的準確度和穩(wěn)定性良好，抗干擾性強，使用方便，完全可以滿足臨床需要。

附圖說明

圖1為兩種試劑的相關(guān)性曲線圖，

圖2為兩種試劑效期穩(wěn)定性曲線圖，

圖3為實施例1試劑檢測方法，

圖4為實施例試劑抗干擾性能比較，

圖5為實施例1試劑與市場常見并得到認可的血清腺苷脫氨酶測定試劑盒對比檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明。

實施例1

血清腺苷脫氨酶的檢測試劑，包括試劑R1和試劑R2：

1）其R1的組成為：

HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）緩沖液(pH=8.0，25℃) _··100mmol/L，

4-氨基氨替吡啉_{·································}5mmol/L，

PNP（嘌呤核苷磷酸化酶）_{··························}1.5KU/L，

XOD（黃嘌呤氧化酶）_{······························}3.1KU/L，

POD（過氧化物酶）_{································}5KU/L，

膽紅素氧化酶_{···································}3KU/L，

抗壞血酸氧化酶_{·································}3.5KU/L，

丙三醇_{·········································}4ml/L，

聚乙二醇6000_{···································}5g/L，

乙二醇_{·········································}6ml/L，

甘露醇_{·········································}25g/L，

海藻糖_{·········································}15g/L，

BSA_{············································}1g/L，

烷基糖苷（APG）_{··································}1g/L，

防腐劑NaN3_{·····································}0.5g/L；

2）試劑R2的組分為：

Tris（三羥甲基氨基甲烷）緩沖液(pH=4.0，25℃) _·····100mmol/L，

腺苷_{···········································}14mmol/L，

HTBA（3-羥基-2,4,6-三碘苯甲酸）_{··················}5mmol/L，

丙三醇_{·········································}4ml/L，

聚乙二醇6000_{···································}5g/L，

乙二醇_{·········································}6ml/L，

甘露醇_{·········································}25g/L，

海藻糖_{·········································}15g/L，

BSA_{············································}1g/L，

烷基糖苷（APG）_{··································}1g/L，

防腐劑NaN3_{·····································}0.5g/L；

3）本實施例試劑的使用方法：

本實施例描述的血清腺苷脫氨酶檢測試劑，在使用時采用具有雙試劑功能的全自動生化分析儀，如日立7180全自動分析儀等，利用速率法進行測定；將R1和R2按照2:1的比例放置到對應(yīng)的試劑位上，在樣品盤的對應(yīng)位置放置好蒸餾水、標準品和樣本，操作如圖3。

實施例2

干擾性試驗：取新鮮混合血清，分成2等份，然后將每等份再分成5等份，加入不同的干擾物質(zhì)，使其在血清中的濃度達到圖4的要求；然后分別用實施例1所得試劑，與市場常見并認可的血清腺苷脫氨酶(ADA)試劑同時對比測定血清中ADA的活性，對照組測定結(jié)果與加入不同干擾物質(zhì)后各組的測定結(jié)果見圖4；相對偏差(％)＝(干擾樣本的測定均值－對照樣本的測定均值)/對照樣本的測定均值×100％；

由圖4可以看出，實施例1試劑在總膽紅素≤30mg/dL、甘油三酯≤3000mg/dL、血紅蛋白≤800mg/dL、抗壞血酸≤220mg/dL時對測試結(jié)果沒有明顯干擾，而對照組試劑在上述濃度干擾物質(zhì)存在時，受到明顯干擾，這說明通過優(yōu)化反應(yīng)緩沖體系、膽紅素氧化酶和抗壞血酸氧化酶，及新型非離子表面活性劑烷基糖苷(APG)后，實施例1試劑的抗干擾性能顯著提高，遠遠優(yōu)于對比試劑。

實施例3

相關(guān)性實驗：利用實施例1配方配制試劑，與市場常見的國家食品藥品監(jiān)督管理局認可的某公司的腺苷脫氨酶（ADA）試劑盒進行對照檢測，同時檢測了20個臨床血清樣本，檢測結(jié)果如圖5所示，并獲得了兩種試劑的相關(guān)性曲線（如圖1所示），通過檢測結(jié)果顯示，兩個試劑盒的相關(guān)系數(shù)為0.9996，說明了兩者有極大的相關(guān)性。

實施例4

試劑的穩(wěn)定性對比試驗：對實施例1中的試劑，均勻分裝13組，每組的試劑量R1為20mL，R2為10mL；并且取13組市場常見的國家食品藥品監(jiān)督管理局認可的某公司的腺苷脫氨酶（ADA）試劑盒作對照；放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一組試劑檢測ADA質(zhì)控品（靶值為35.7U/L），檢測結(jié)果如圖2所示，實施例1試劑在2-8℃儲存條件下比市場常見的腺苷脫氨酶（ADA）測定試劑盒更加穩(wěn)定；

通過驗證，本試劑與同類檢測試劑對比相關(guān)性好，臨床檢測樣本結(jié)果一致，能夠達到市場對產(chǎn)品的應(yīng)用要求，并且抗干擾性能好，是一種更加穩(wěn)定、良好的腺苷脫氨酶（ADA）檢測試劑。