本發(fā)明涉及藻類生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，特別涉及一種通過誘導(dǎo)色綠藻高效合成蝦青素的方法。
背景技術(shù)：
：蝦青素(Astaxanthin)被稱為“超級抗氧化劑”，抗氧化能力是其它類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素、玉米黃素、葉黃素和角黃素等的10倍多，具有清除自由基、阻止脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)大能力，在預(yù)防動脈硬化、帕金森綜合癥、視網(wǎng)膜黃斑變性等年齡相關(guān)性疾病方面具有重要作用；對于維護(hù)眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)健康，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、強(qiáng)化肌體能量代謝、抗癌、抗感染等具有多重功效。目前蝦青素的生產(chǎn)方法主要有三種，分別為從蝦蟹殼內(nèi)提取、化學(xué)合成以及紅發(fā)夫酵母或雨生紅球藻等生物法生產(chǎn)。此外，還有采用轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)培養(yǎng)番茄積累蝦青素的報道。生物法，尤其是雨生紅球藻培養(yǎng)法生產(chǎn)蝦青素是目前天然蝦青素最主要的生產(chǎn)方法，從中得到的蝦青素均為3S,3’S構(gòu)型，抗氧化活性高，無毒副作用，被FDA(美國食品和藥物管理局)和EFSA(歐洲食品安全局)批準(zhǔn)作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，在保健食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域中有著廣泛的市場。但是，由于雨生紅球藻是自養(yǎng)培養(yǎng)，存在生長速率慢、培養(yǎng)周期長，面臨著成本高、生產(chǎn)效率低且不穩(wěn)定、易生物污染等技術(shù)瓶頸的制約。因此，僅僅依靠雨生紅球藻的培養(yǎng)來生產(chǎn)天然蝦青素，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國際市場需求。色綠藻(Chromochloriszofingiensis)是一種單細(xì)胞綠藻，被認(rèn)為是天然蝦青素的新來源。研究表明，雖然色綠藻和雨生紅球藻同屬于單細(xì)胞綠藻，但二者的細(xì)胞生理生化特性存在很大差別，蝦青素的合成機(jī)制也是截然不同的。因而，雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的工藝不能直接轉(zhuǎn)用于色綠藻，需根據(jù)色綠藻的細(xì)胞特性和蝦青素代謝調(diào)控機(jī)制進(jìn)行有針對性的研究開發(fā)，這也是利用色綠藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)蝦青素的首要任務(wù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)色綠藻高效合成蝦青素的方法。本發(fā)明為達(dá)到其目的，采用的技術(shù)方案如下：一種誘導(dǎo)色綠藻高效合成蝦青素的方法，包括如下步驟，S1，活化培養(yǎng)：將色綠藻細(xì)胞接種培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)以獲得種子液；具體的，可將色綠藻細(xì)胞活化培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)液作為種子液；S2，誘導(dǎo)培養(yǎng)：將S1獲得的種子液接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行光誘導(dǎo)培養(yǎng)，所用光源為白光或藍(lán)光，光源強(qiáng)度為60～330μmolm-2s-1，光暗周期為12:12(h)～24:0(h)，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括如下濃度的各組分：9～30g/L葡萄糖、0～0.75g/L硝酸鈉，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為6.0～7.0。優(yōu)選的，步驟S2中，將所述種子液接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基并使種子液稀釋至色綠藻細(xì)胞密度為2～3.5g/L。本申請發(fā)明人在研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，采用優(yōu)選的起始密度，誘導(dǎo)后可以獲得較高的蝦青素產(chǎn)率；過高的細(xì)胞密度，會導(dǎo)致每個細(xì)胞受到的光輻射強(qiáng)度過低，影響色素合成；過低的細(xì)胞密度，會導(dǎo)致每個細(xì)胞受到的光輻射強(qiáng)度過高，抑制色素合成；采用該優(yōu)選的細(xì)胞密度，可以保證色綠藻細(xì)胞的光輻射強(qiáng)度適當(dāng)。優(yōu)選的，步驟S2中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，硝酸鈉的濃度為0～0.2g/L。優(yōu)選的，步驟S2中，所述光源強(qiáng)度為300±30μmolm-2s-1，光暗周期為24:0(h)(即連續(xù)光照)；進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟S2中，所述光源為白光。采用該優(yōu)選方案，有助于色綠藻胞內(nèi)蝦青素的誘導(dǎo)合成，蝦青素含量高、產(chǎn)量和產(chǎn)率高。在此基礎(chǔ)上更進(jìn)一步優(yōu)選的，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，氮源濃度為0～0.1g/L。優(yōu)選的，步驟S2中，將接種有種子液的誘導(dǎo)培養(yǎng)基分裝到透明微孔板或類似薄層培養(yǎng)容器(例如透明管道反應(yīng)器)中，并置于微孔板振蕩器上進(jìn)行光誘導(dǎo)培養(yǎng)。相比于傳統(tǒng)的三角瓶和發(fā)酵罐式光反應(yīng)器而言，透明微孔板或類似薄層培養(yǎng)容器具有透光性好、裝置簡易、操作簡便、運行成本低、節(jié)省空間和時間短等優(yōu)勢。該優(yōu)選方案，有利于色綠藻高效積累蝦青素，提高產(chǎn)量和產(chǎn)率。作為一種較為優(yōu)選的方案，步驟S2中，將所述種子液接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基并使種子液稀釋至色綠藻細(xì)胞密度為2～3.5g/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中硝酸鈉的濃度為0～0.1g/L，將接種有種子液的誘導(dǎo)培養(yǎng)基分裝至透明微孔板或類似薄層培養(yǎng)容器中，并置于微孔板振蕩器上進(jìn)行光誘導(dǎo)培養(yǎng)，光誘導(dǎo)培養(yǎng)所用光源為白光，光源強(qiáng)度為300±30μmolm-2s-1，光暗周期為24:0(h)。采用該優(yōu)選方案，有助于色綠藻胞內(nèi)蝦青素的誘導(dǎo)合成，蝦青素含量高、產(chǎn)量和產(chǎn)率高，且培養(yǎng)獲得的色綠藻細(xì)胞內(nèi)次級類胡蘿卜素特別是蝦青素的比例占總色素的比例較高。作為一種具體實施方式，步驟S1中，對色綠藻細(xì)胞進(jìn)行活化培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基選自Basal、Bristol、BG-11、BBM、Kuhl中的至少一種。作為一種具體實施方式，所述步驟S2中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還包括如下濃度的各組分：0.175g/L磷酸二氫鉀、0.075g/L磷酸氫二鉀、0.025g/L七水硫酸鎂、0.0025mg/L五水硫酸銅、5mg/L氯化鐵、0.025g/L二水氯化鈣、0.169mg/L一水硫酸錳、0.025g/L氯化鈉、0.287mg/L七水硫酸鋅、0.00124mg/L七水鉬酸銨、0.061mg/L硼酸。本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有如下有益效果：本發(fā)明方法與現(xiàn)有的色綠藻積累蝦青素的培養(yǎng)方式相比，可大大提高色綠藻胞內(nèi)蝦青素的產(chǎn)量和產(chǎn)率，方法簡便，能耗低，有效降低生產(chǎn)成本，在利用色綠藻進(jìn)行天然蝦青素的積累方面具有重要應(yīng)用價值。另外，采用本發(fā)明所提供的方法誘導(dǎo)色綠藻培養(yǎng)獲得的藻粉中，蝦青素與角黃素比例遠(yuǎn)高于2:1，食用安全，未來在食品和營養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用領(lǐng)域具有廣闊的市場前景。附圖說明圖1.起始細(xì)胞密度對色綠藻生物量濃度和蝦青素產(chǎn)量的影響；圖2.150μmolm-2s-1白光下硝酸鈉濃度對色綠藻生物量濃度和蝦青素產(chǎn)量的影響；圖3.150μmolm-2s-1藍(lán)色LED光下硝酸鈉濃度對色綠藻生物量濃度和蝦青素產(chǎn)量的影響；圖4.150μmolm-2s-1藍(lán)色LED光和白光下硝酸鈉濃度對色綠藻細(xì)胞內(nèi)色素百分含量的影響；圖5.300μmolm-2s-1藍(lán)色LED光和白光下色綠藻生物量濃度、比生長速率以及蝦青素含量、產(chǎn)量和產(chǎn)率；圖6.300μmolm-2s-1藍(lán)色LED光和白光對色綠藻細(xì)胞內(nèi)色素百分含量的影響。具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明：實施例1起始細(xì)胞密度對色綠藻生物量濃度和蝦青素產(chǎn)量的影響1.1菌種活化及種子液制備將實驗室中保存的色綠藻C.zofingiensis藻種轉(zhuǎn)接到裝有改良Bristol培養(yǎng)基的斜面上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26℃，光照為10μmolm-2s-1，并觀察色綠藻生長情況。用接種環(huán)將色綠藻藻苔接種到裝有改良Bristol液體培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，在溫度為26℃、光照為10μmolm-2s-1的恒溫振蕩搖床中，培養(yǎng)3～5天用作種子液。其中所述的改良Bristol培養(yǎng)基(pH6.5)成分如下表1所示(單位為mg/L)：組分含量(mg/L)組分含量(mg/L)組分含量(mg/L)葡萄糖9000NaNO3750KH2PO4175K2HPO475MgSO4·7H2O25CuSO4·5H2O0.0025FeCl35CaCl2·2H2O25MnSO4·H2O0.169NaCl25ZnSO4·7H2O0.287(NH4)6Mo7O24·7H2O0.00124H3BO30.061////1.2不同起始細(xì)胞密度下的誘導(dǎo)培養(yǎng)將培養(yǎng)好的色綠藻種子液在3800×g下離心2min，棄去上層培養(yǎng)基，并用無菌水重新懸浮后，再次離心去除上清液，將收集的色綠藻細(xì)胞采用改良的Bristol培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋重懸，控制色綠藻的細(xì)胞密度分別為0.5、1.0、1.9、2.9g/L，分裝到透明微孔板中，并置于微孔板振蕩器中，一起放置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)以積累蝦青素。誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用改良Bristol培養(yǎng)基，其和表1中的配方相比，不同僅在于：葡萄糖為30g/L，NaNO3為0.6g/L(碳氮比高于200)，pH為6.5。培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速為50～500r/m，溫度為26℃、光源采用藍(lán)色的LED硬燈條(光源的波長范圍為460±10nm)串聯(lián)并排放置，控制微孔板表面的光照強(qiáng)度為80±20μmolm-2s-1以上，分別培養(yǎng)12天。培養(yǎng)結(jié)束后，測定色綠藻培養(yǎng)液的生物量濃度；離心收集細(xì)胞，離心洗滌多次后收集藻泥，真空凍干獲得藻粉，分析藻粉內(nèi)色素含量。1.3起始細(xì)胞密度對色綠藻C.zofingiensis胞內(nèi)蝦青素產(chǎn)量的影響經(jīng)檢測，不同起始細(xì)胞密度的色綠藻，在藍(lán)光誘導(dǎo)條件下生物量和蝦青素產(chǎn)量參見圖1。不同起始密度下藍(lán)光誘導(dǎo)后胞內(nèi)蝦青素含量差異不大，基本保持在2.05mg/g以上。其中當(dāng)起始細(xì)胞密度為1.9～2.9g/L時，蝦青素含量均達(dá)2.38mg/g以上，產(chǎn)量基本在15.95～22.41mg/L之間。從圖1可知，色綠藻起始細(xì)胞密度對于蝦青素產(chǎn)率有較大影響，當(dāng)細(xì)胞密度在1.9～2.9g/L時，可以獲得較高的蝦青素產(chǎn)率，基本在1.3～1.8mg/L/d之間。實施例2～5白光誘導(dǎo)下氮源濃度對色綠藻C.zofingiensis積累蝦青素的誘導(dǎo)效果實施例2-5按照如下步驟操作：2.1、藻種活化及種子液制備將實驗室中保存的色綠藻C.zofingiensis藻種按1.1所述的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)3～5天用作種子液。2.2在白光和不同氮源濃度下積累蝦青素的誘導(dǎo)培養(yǎng)將培養(yǎng)好的色綠藻種子液按1.2所述的方法，收集色綠藻細(xì)胞。采用含有不同氮源濃度的改良Bristol培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋、重懸，并控制細(xì)胞密度為3g/L左右，其中實施例2～5分別依次采用氮源濃度為0、0.1、0.2、0.3g/L的改良Bristol培養(yǎng)基，葡萄糖均為10g/L，其他組分與表1中相同。將接種后含有不同氮源濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分裝到透明微孔板中，置于微孔板振蕩器中，一起放置于光照培養(yǎng)箱中，進(jìn)行色綠藻C.zofingiensis培養(yǎng)積累蝦青素。培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速為50–500r/m，溫度為26℃、采用白色熒光燈并排放置作為光源，控制微孔板表面的光照強(qiáng)度為150±30μmolm-2s-1以上，分別培養(yǎng)12天。對實施例2-5中色綠藻的生物量和胞內(nèi)色素含量進(jìn)行檢測分析：培養(yǎng)結(jié)束后，將色綠藻培養(yǎng)液離心收集藻泥，凍干獲得干藻粉并分析胞內(nèi)色素含量。2.3實驗結(jié)果結(jié)果可參見圖2。由圖2可知，實施例4，在氮源濃度為0.2g/L條件下，蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率均較高，分別為29.56mg/L、2.60mg/L/d。實施例2，在完全無氮培養(yǎng)時，色綠藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量較高，為4.75mg/g。實施例2～5的結(jié)果表明，白光條件下，氮源的增加有助于生物量的增加，而色綠藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素的含量隨著氮源濃度的增加卻有極顯著降低(p＜0.01)，蝦青素的產(chǎn)量和產(chǎn)率也不會因氮源濃度增加而持續(xù)增加。因此，在白光下，低濃度氮源(0-0.2g/L)不僅可以保證胞內(nèi)蝦青素含量不會明顯降低，同時可獲得較高的蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率。實施例6～9藍(lán)光條件下不同氮源濃度誘導(dǎo)色綠藻C.zofingiensis積累蝦青素實施例2-5按照如下步驟操作：3.1菌種活化及種子液制備將實驗室中保存的色綠藻C.zofingiensis菌種按1.1所述的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)3～5天用作種子液。3.2在藍(lán)光和不同氮源濃度下積累蝦青素的誘導(dǎo)培養(yǎng)將培養(yǎng)好的色綠藻種子液按1.2所述的方法，收集色綠藻細(xì)胞。采用含有不同氮源濃度的改良Bristol培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋、重懸，并控制細(xì)胞密度為3g/L左右，其中實施例6～9分別依次采用氮源濃度為0、0.1、0.2、0.3g/L的改良Bristol培養(yǎng)基，葡萄糖均為10g/L，其他組分與表1中相同。將接種色綠藻細(xì)胞的含有不同氮源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分裝到不同的透明微孔板中，并置于微孔板振蕩器中，一起放置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行色綠藻C.zofingiensis培養(yǎng)積累蝦青素。培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速為50–500r/m，溫度為26℃、采用藍(lán)色LED硬燈條作為光源，控制微孔板表面的光照強(qiáng)度為150±30μmolm-2s-1以上，分別培養(yǎng)12天。對實施例6-9色綠藻的生物量和胞內(nèi)色素含量進(jìn)行檢測分析：培養(yǎng)結(jié)束后，色綠藻培養(yǎng)液離心收集藻泥，凍干獲得干藻粉并進(jìn)行色綠藻胞內(nèi)色素含量分析。3.3實驗結(jié)果結(jié)果可參見圖3。由圖3可知，實施例6在完全無氮培養(yǎng)時，色綠藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量、蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率均較高，分別為5.53mg/g、27.97mg/L和2.33mg/L/d。在藍(lán)光條件下，在低氮源濃度或無氮條件下(0-0.2g/L)具有較佳的蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率。對實施例2-9中誘導(dǎo)培養(yǎng)所得色綠藻細(xì)胞內(nèi)色素組成進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。圖4中“W”代表白光條件下的色素組成，“B”代表藍(lán)光條件下的色素組成。由圖4可知，在實施例2-9中，色綠藻胞內(nèi)次級類胡蘿卜素均占到所有色素的81.88～94.09％之間。實施例2-9的蝦青素/角黃素比值均大于2：1，但，相對于白光而言，藍(lán)光條件下培養(yǎng)，蝦青素/角黃素比值較高，可達(dá)7.5，表明采用藍(lán)光可更有效調(diào)控色綠藻胞內(nèi)色素的組分及其比例。實施例10-13在高光強(qiáng)度下白光和藍(lán)光誘導(dǎo)色綠藻積累蝦青素實施例10-13按照如下步驟進(jìn)行：4.1菌種活化及種子液制備將實驗室中保存的色綠藻C.zofingiensis菌種按1.1所述的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)3～5天用作種子液。4.2在白光和藍(lán)色LED高光強(qiáng)照射下積累蝦青素的誘導(dǎo)培養(yǎng)將培養(yǎng)好的色綠藻種子液按1.2所述的方法，收集色綠藻細(xì)胞。采用含有不同氮源濃度的改良Bristol培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋、重懸，并控制細(xì)胞密度為3g/L左右，其中實施例10-13分別采用氮源濃度為0、0.1、0、0.1g/L的改良Bristol培養(yǎng)基，葡萄糖均為10g/L，其他組分與表1中相同。將接種色綠藻細(xì)胞的含有不同氮源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基分裝到不同的透明微孔板中，并置于微孔板振蕩器中，一起放置于光照培養(yǎng)箱中，進(jìn)行色綠藻C.zofingiensis培養(yǎng)積累蝦青素。培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速為50–500r/m，溫度為26℃，實施例10-11(對應(yīng)于圖5、圖6中“藍(lán)光/無氮”、“藍(lán)光/低氮”)采用藍(lán)色的LED硬燈條作為光源，實施例12-13(對應(yīng)于圖5、圖6中“白光/無氮”、“白光/低氮”)采用白色熒光燈管作為光源，控制微孔板表面的光照強(qiáng)度均為300±30μmolm-2s-1以上，分別培養(yǎng)12天。對色綠藻的生物量和胞內(nèi)色素含量進(jìn)行檢測分析：培養(yǎng)結(jié)束后，將色綠藻培養(yǎng)液離心收集藻泥，凍干獲得干藻粉并進(jìn)行色綠藻胞內(nèi)色素含量分析。4.3實驗結(jié)果通過檢測高光誘導(dǎo)條件下細(xì)胞生物量和蝦青素產(chǎn)量的變化規(guī)律，結(jié)果可參見圖5。由色綠藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素積累量可知，高強(qiáng)度白光相對于高強(qiáng)度藍(lán)光而言，更有利于色綠藻胞內(nèi)蝦青素的誘導(dǎo)合成。在無氮條件下，高強(qiáng)度白光可以高效誘導(dǎo)合成蝦青素，獲得較高的蝦青素含量為7.11mg/g，其占色綠藻胞內(nèi)色素的質(zhì)量百分比可達(dá)到69.1％，這是目前已知的色綠藻胞內(nèi)蝦青素的最高含量；在低氮條件下(0.1g/L氮源)，蝦青素含量略有降低，為6.51mg/g，但是由于生物量相對較高，因而在此條件下培養(yǎng)色綠藻，可以獲得較高的蝦青素產(chǎn)量和產(chǎn)率，分別為38.9mg/L和3.2mg/L/d。相對于之前的色綠藻生產(chǎn)蝦青素的水平而言，采用本實施例的方法，色綠藻胞內(nèi)蝦青素的生產(chǎn)效率有顯著提升，這也是目前已知的野生型色綠藻生產(chǎn)蝦青素的最高水平。綜合以上結(jié)果表明，采用過高強(qiáng)度的藍(lán)光，會在一定程度上抑制蝦青素的合成，但是高強(qiáng)度的白光脅迫誘導(dǎo)，則可以進(jìn)一步提高色綠藻胞內(nèi)蝦青素的積累量。參見圖6，實施例12可以將次級類胡蘿卜素占總色素的比例提高到最高96.33％，同時蝦青素比例也從最高65.83％提高到69.11％。實施例12～13，角黃素的比例基本維持在11.1～11.6％之間，相應(yīng)的蝦青素/角黃素比值在5.97～6.13之間。實施例10～11的高強(qiáng)度藍(lán)光條件下，蝦青素/角黃素比值在7.3～8.1之間。由于人類日常飲食中的三文魚等魚類體內(nèi)含有角黃素，過量攝入角黃素具有潛在的眼部病變和皮膚著色等可能風(fēng)險。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)提出，對于角黃素每日攝入量需控制在0.03mg/kgbw/day(毫克/公斤體重/天)。蝦青素的每日攝入量為0.06mg/kgbw/day(毫克/公斤體重/天)，因此控制蝦青素和角黃素比值在2：1以上是口服安全的。本發(fā)明所提供的方法，采用色綠藻培養(yǎng)獲得的藻粉中蝦青素與角黃素比例遠(yuǎn)高于該值，食用安全，未來在食品和營養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用領(lǐng)域具有廣闊的市場前景。實施例10～11的高強(qiáng)度藍(lán)光條件下，蝦青素的產(chǎn)量和產(chǎn)率不如實施例12-13的高強(qiáng)度白光誘導(dǎo)，但是蝦青素/角黃素比值卻高于實施例12-13，高達(dá)7.3～8.1之間；而在實施例2-9中，藍(lán)光條件下，蝦青素/角黃素比值也高于白光條件下的誘導(dǎo)結(jié)果，說明可以利用藍(lán)光培養(yǎng)來調(diào)控色綠藻胞內(nèi)角黃素含量以及蝦青素/角黃素比值。本發(fā)明實施例中采用的檢測方法可參照如下說明進(jìn)行：(一)色綠藻胞內(nèi)蝦青素的HPLC檢測方法1)色綠藻藻粉中蝦青素的提取：準(zhǔn)確稱取凍干藻粉10mg，置于裝有陶瓷珠的凍存管中，加入含有0.1％(w/v)BHT的二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中，該混合溶劑中二氯甲烷：甲醇的體積比為3:1，高速振蕩1分鐘，然后置于液氮中迅速冷卻，離心收集上清液；沉淀再次加入含有0.1％(w/v)BHT的二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中，振蕩，置于液氮中冷卻，離心收集上清液，重復(fù)該步驟直至藻泥呈無色為止。合并所有上清液，用氮氣吹干后，用色譜純的甲醇和MTBE的混合溶劑(二者的體積比為1:1)溶劑定容到1mL，用于HPLC法測定色綠藻胞內(nèi)色素含量。2)HPLC法測定蝦青素含量采用配備PDA檢測器和YMCTMC30色譜柱(4.6mm×150mm,3μm)的液相色譜儀進(jìn)行分析，洗脫液為色譜級甲醇(流動相A)、甲基叔丁基醚MTBE(流動相B)和水(流動相C)。梯度洗脫程序為：0-6min，95％→80％A、5％→20％B、0％C；6-12min,80％→60％A、20％→38％B、0→2％C；12-28min，60％→50％A、38％→48％B、2％C；28-33min，50％A、48％B、2％C；33-35min，50％→95％A、48％→5％B、2％→0％C；35-38min，95％A、5％B、0％C。柱溫箱溫度為30℃，洗脫液流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量為20μL，PDA檢測器波長設(shè)置在300-700nm進(jìn)行全波長掃描以測定色素吸收光譜圖，同時在480nm波長下測定胞內(nèi)色素的含量。色素的定性分析采用色素標(biāo)準(zhǔn)品(蝦青素、葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、角黃素、玉米黃質(zhì))的保留時間和特征吸收光譜圖進(jìn)行分析，定量分析采用色素標(biāo)準(zhǔn)品制作的外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算，對于酮基葉黃素和胡蘿卜素類色素則采用類似的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。(二)色綠藻生物量濃度的測定方法色綠藻培養(yǎng)過程中的生物量濃度測定方法采用干重法進(jìn)行測定。將取樣獲得的藻液，量取一定體積置于事前稱重的離心管中，在6000r/m轉(zhuǎn)速下離心1min收集藻細(xì)胞沉淀，然后加入純水振蕩懸浮后，重復(fù)離心洗滌2次，除去上清液，將含有藻泥的離心管置于60℃烘箱中烘干至恒重，測定藻粉的差重，并換算獲得色綠藻培養(yǎng)液中的生物量濃度。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，故凡未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3