本發(fā)明是關(guān)于蝦廢棄物的重新再利用，具體為一種利用蝦廢料同時制取蝦青素、殼聚糖的方法，即利用微生物協(xié)同發(fā)酵技術(shù)從蝦廢棄物中同時提取活性物質(zhì)蝦青素、殼聚糖的方法。

背景技術(shù)：

我國對蝦產(chǎn)量很高并遠銷國外市場，對新鮮蝦的食用和加工過程中主要是棄去頭部和外殼，缺乏完全利用造成蝦殼和蝦頭中營養(yǎng)成分的極大浪費同時也增加了環(huán)境的負擔，蝦頭和蝦殼中含有豐富的殼聚糖、氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)和多種微量元素，目前世界上許多國家都著力開發(fā)這一資源。

在制備方法上，傳統(tǒng)水產(chǎn)品下腳料通常采用酸和酶來提取生物活性物質(zhì)，如公開號CN104938604A的發(fā)明專利，該申請公開了一種水產(chǎn)加工下腳料綜合利用方法，其分別公開了生產(chǎn)蝦青素、脂肪酸和水解蛋白產(chǎn)品：1將水產(chǎn)加工下腳料洗凈，在真空低溫冷凍式干燥機中40-60℃低溫干燥，至含水量達2-10%，冷凍粉碎至20-100目；2往步驟1處理后的原料中，加入原料干重的2-20倍水，調(diào)pH值6-10，加入脂肪酶和木瓜蛋白酶，其重量比為底物重量的0.1-0.5%和0.2-0.8%，水解2-20h，在水解1-3h后，再按底物干重比添加0.1-1.2%的風味酶，直至水解完成；3將步驟2的產(chǎn)物滅酶后，進入離心機，2000-8000rpm，10-50分鐘進行固液分離，得到固相和液相，并分別待用；4將步驟3得到的液體進行反滲透脫水，得到脂肪酸、蝦青素和水解蛋白混合物，然后加入包埋劑β-環(huán)狀糊精和麥芽糖糊精，加入按三者重量比，脂肪酸、蝦青素和水解蛋白混合物：β-環(huán)狀糊精：麥芽糖糊精=20-80：0.1-5：25-75，然后進行高壓均質(zhì)，使溶入脂肪酸的蝦青素與水溶性的水解蛋白完全均質(zhì)融合；5將步驟4的產(chǎn)物輸入真空低溫冷凍式干燥機，40-60℃干燥至含水量為2-10%為止，精制成粉，或按常規(guī)方法制粒、壓片即得含蝦青素、脂肪酸的水解蛋白片。由以上可知，該申請主要是利用酶來提取蝦青素。

生產(chǎn)甲殼素及其衍生物殼聚糖產(chǎn)品：將步驟3中分離的固體，加入原料干重的2-10%檸檬酸、蘋果酸和乳酸，三酸體積比2：2：1，料液比為1~10：5~20（kg/L），提取2-10h，然后由輸送泵打入離心機離心，2000-8000rpm，10-50分鐘，進行固液分離，液體和固體分別用于提取有機鈣和甲殼素及其衍生物殼聚糖，放入具有150-200目篩板的貯罐中，用水沖洗2-3次，即得白色甲殼素；2所得甲殼素，加原料干重的0.2-1.2%的纖維素酶,調(diào)pH值4-6，在40-60℃下，水解2-10h，降解脫甲殼素分子中的乙?；缓笸ㄟ^離心機2000-8000rpm離心10-50分鐘，進行固液分離；3將分離的液體40-60℃減壓濃縮至比重1.0-1.3后，輸入真空低溫冷凍式干燥機40-60℃干燥至含水量2-10%，即得殼聚糖。由以上可知，該申請主要是利用酸和酶來提取甲殼素。該專利的工藝中多次使用酶進行生產(chǎn)，而酶制劑的成本昂貴，不適合大工業(yè)化生產(chǎn)，微生物繁殖能力強，成本低，產(chǎn)率高，優(yōu)勢明顯。

殼聚糖具有獨特的理化性質(zhì)和生物活性功能，易于被人體吸收。其化學結(jié)構(gòu)為帶陽離子的高分子堿性多糖聚合物，可經(jīng)甲殼素脫乙酰基制得。不僅具有減肥調(diào)脂、美容護膚得功效，還可以升高血液pH值，增強免疫活性細胞質(zhì)量和數(shù)量，抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞的生長；活化修復(fù)干細胞，強化肝臟功能；促使胰島素分泌，防治高血壓；促進腸道有益菌得繁殖，吸附排除體內(nèi)重金屬等作用。以往傳統(tǒng)方法生產(chǎn)甲殼素一般使用高濃度的酸堿處理原料，脫除其中的礦物質(zhì)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再經(jīng)過脫色而成，導致甲殼素的結(jié)構(gòu)被酸堿破壞，并產(chǎn)生大量的廢水污染環(huán)境?，F(xiàn)有技術(shù)中加入蛋白酶進行水解雖然避免了強酸堿的使用，但是商品化酶制劑增加了運營成本，而發(fā)酵法利用微生物繁殖過程中產(chǎn)酸去除礦物質(zhì)，產(chǎn)蛋白酶去除蛋白質(zhì)，發(fā)酵過程中不會水解甲殼素，提高了提取率。

蝦青素是一種類胡蘿卜素，是單線態(tài)氧的淬滅劑，也是人類發(fā)現(xiàn)自然界最強的抗氧化劑，其抗氧化能力超過現(xiàn)有的抗氧化劑，在體內(nèi)可與蛋白質(zhì)結(jié)合呈現(xiàn)青、藍色，對人體有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、預(yù)防動脈硬化和心腦血管疾病等作用。蝦青素的化學合成困難，采用有毒溶劑進行提取安全性不可知并且動物體對天然蝦青素的吸收比化學合成要強，因此，利用自然界的微生物進行天然蝦青素的提取成為研究的熱點，利用已經(jīng)除去蛋白質(zhì)的甲殼素上清液進行提取簡化了工序，對殼聚糖和蝦青素的綜合提取利用具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵蝦廢料同時制備蝦青素、殼聚糖的方法，發(fā)酵生產(chǎn)的活性物質(zhì)可安全用于食品、保健品等多領(lǐng)域。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是：

S1：新鮮蝦殼和蝦頭經(jīng)清洗、粉碎后加水制成漿液并水煮滅菌；

S2：加入10%葡萄糖，均質(zhì)處理3-5min，將擴大培養(yǎng)的微生物菌液接種到S1制備的漿液中進行發(fā)酵；

S3：滅菌后將發(fā)酵液分離得上清液和殘渣，殘渣中含有甲殼素；

S4：將S3中得到的殘渣水洗，干燥，加入1%醋酸溶液按1:4固液比配置成甲殼素溶液，調(diào)節(jié)pH4-5，加入脫乙酰酶；滅酶活后固液分離取沉淀水洗、干燥得到殼聚糖；

S5：上清液用鄰單胞桿菌（plesiomonas）處理，滅菌、過濾、噴霧干燥后得到蝦青素，具體步驟為：37℃下，活化31-35h；以10%-20%的接種量，接入上清液中，發(fā)酵條件為：35-40℃、150-180rpm下震蕩36-50h。

進一步地，所述S2中微生物菌包括枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)。要求枯草芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌依次加入，經(jīng)過72h發(fā)酵后再加入嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌共生體系發(fā)酵一周。進一步地，所述S3中發(fā)酵液采用2000-5000r/min離心機離心5-15min分離成發(fā)酵液和殘渣。

進一步地，所述S4中滅酶活的條件優(yōu)選為90-100℃，處理3-5min。

進一步地，所述S4中所述的干燥方式包括真空冷凍干燥或者噴霧干燥。

進一步地，所述S5中 所述的嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌的活化條件：37℃下，活化25-33h，以5%-20%的接種量，接入到滅好菌的蝦漿中；發(fā)酵條件為：30-40℃、170-200rpm下震蕩一周。

進一步地，所述S1、S3、S5中滅菌方式采用蒸汽滅菌條件為120℃，25-30min或者巴氏殺菌。

本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌協(xié)同作用加以葡萄糖來發(fā)酵蝦皮和蝦頭進行脫鹽和脫蛋白質(zhì)，然后利用嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌共生體系發(fā)酵一周進行脫鈣和脫色，利用甲殼素脫乙酰酶處理甲殼素得殼聚糖，用革蘭氏陰性菌類志賀鄰單胞菌處理得蝦青素。在發(fā)酵的過程中無需大量的酸堿加入，減少了環(huán)境污染，并且微生物發(fā)酵比采用酶發(fā)酵節(jié)約成本，得到的活性成分含量更高，實現(xiàn)了對原料有效成分的完全利用，經(jīng)濟可行。

附圖說明

圖1：本發(fā)明的流程示意圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）菌種編號：CGMCC1.934、氧化葡糖桿菌（Gluconobacteroxydans）菌種編號：CGMCC1.110、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)菌種編號：CGMCC1.3996、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)菌種編號：CGMCC1.3342等微生物均可購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)菌種編號：ACCC10638，購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。類志賀鄰單胞菌（Plesiomonasshigelloides）菌種編號：CICC10380可購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。也可以是從其它途徑獲得，具有相同或類似代謝功能的菌株。

實施例1：

制備勻漿：取新鮮蝦頭、蝦殼20g粗粉后加60g水溶解，并在120℃條件下滅菌25min。

加葡萄糖：收集勻漿加入160g10%的葡萄糖溶液均質(zhì)處理3min。

接入菌種：（1）將已經(jīng)冷藏保存的枯草芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌依次進行活化?；罨椒ǎ航臃N于種子培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱中振蕩培養(yǎng)28h。先將枯草桿菌以8%的接種量接種到培養(yǎng)基中，38℃培養(yǎng)48h后按照同樣方法接種氧化葡糖桿菌38℃繼續(xù)培養(yǎng)24h。測定工藝中的脫鹽率為：93.52%，脫蛋白率95.32%。

（2）發(fā)酵完全后進行滅菌，再加入嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌共生體系，37℃下，活化30h，以15%的接種量接種于培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件為：37℃、180rpm下震蕩培養(yǎng)一周。測定工藝中的脫鈣率：91.33%，脫色率達35.23%。

分離：滅菌后所得的菌液于4000r條件下離心10min，可以分離出上清液以及發(fā)酵殘渣。

殘渣處理得殼聚糖：加入醋酸溶液調(diào)節(jié)殘渣pH值4.5，溫度50℃，甲殼素脫乙酰酶40mg/L處理24h，滅酶活后固液分離取沉淀水洗、干燥后得到殼聚糖2.53g。

上清液處理得蝦青素：上清液用類志賀鄰單胞菌處理，活化溫度為37℃，活化時間32h，10%的接種量，35℃，180rpm下震蕩50h培養(yǎng)，滅菌、過濾、噴霧干燥得到蝦青素2mg。

實施例2：

其他同實施例1，只不過枯草芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌的接種量分別為5%，測定工藝中的脫鹽率91.32%，脫蛋白率90.63%。

實施例3：

其他同實施例1，只不過枯草芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌的接種量分別為6%，測定工藝中的脫鹽率92.65%，脫蛋白率91.25%。

實施例4：

其他同實施例1，只不過嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌共生體系接種量為20%，測定工藝中的脫鈣率91.13%，脫色率34.35%。

實施例5：

其他同實施例1，只不過嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌共生體系接種量為10%，測定工藝中的脫鈣率90.28%，脫色率34.55%。

實施例6：

其他同實施例1，只不過類志賀鄰單胞菌活化32h，以15%的接種量最終得到蝦青素1.8mg。

實施例7：

其他同實施例1，只不過類志賀鄰單胞菌活化32h，以20%的接種量最終得到蝦青素1.7mg。

上述結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌依次加入的最佳接種量分別為8%時脫鹽率和脫蛋白質(zhì)率最高。嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌共生體系的接種量在15%時，脫鈣和脫色率最高。處理蝦青素的類志賀鄰單胞菌活化32h，接種10%的量時可得到噴霧干燥蝦青素2mg。