本發(fā)明涉及化學(xué)氧化和生物技術(shù)的綜合領(lǐng)域，具體涉及一種化學(xué)氧化和生物酶催化結(jié)合型氧化還原法制備熊去氧膽酸的方法，該方法基于NBS在丙酮中氧化鵝去氧膽酸生成7-羰基-石膽酸，再利用重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵產(chǎn)生的7β-羥基類固醇脫氫酶(7β-HSDH)，結(jié)合輔酶的作用，催化7-羰基-石膽酸轉(zhuǎn)化為熊去氧膽酸的方法。

背景技術(shù)：

熊去氧膽酸，英文名：ursodesoxycholic acid(UDCA)，是常用大宗藥材，《中國(guó)藥典》及美國(guó)等藥典收載品種，療效明確，毒副作用少且低，國(guó)內(nèi)外有著非常廣泛的用途，市場(chǎng)用量大。國(guó)內(nèi)主要用于治療膽結(jié)石、膽囊炎、膽管炎、膽汁性消化不良、黃疸及促進(jìn)肝移植等方面且有較好的治療效果；對(duì)膽汁反流性胃炎、酒精肝、膽汁性肝硬化及藥物誘發(fā)的肝炎，也有非常好的療效。美國(guó)等一些發(fā)達(dá)的西方國(guó)家，主要用來(lái)預(yù)防膽結(jié)石形成，這些國(guó)家飲食以肉類物質(zhì)為主要來(lái)源，能量及熱量高且密集、富于油脂等特點(diǎn)，患膽結(jié)石幾率較高，本著預(yù)防等目的，普通民眾食用熊去氧膽酸來(lái)預(yù)防膽結(jié)石形成。

傳統(tǒng)獲得熊去氧膽酸的方法需要采集大量牛、鵝膽汁提取鵝去氧膽酸(CDCA)，通過(guò)氧化還原法使7-OH發(fā)生構(gòu)型反轉(zhuǎn)，應(yīng)用系列化學(xué)氧化劑和還原劑將原料合成UDCA，最后還需進(jìn)行產(chǎn)品純化。傳統(tǒng)化學(xué)合成UDCA的方法存在反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜、低選擇性、反應(yīng)條件苛刻、能耗大、污染大等一系列問(wèn)題，因此UDCA的工業(yè)化進(jìn)程受到限制。

此外，基于組合酶催化技術(shù)制備熊去氧膽酸的方法目前也比較普遍，生物組合酶催化法克服了傳統(tǒng)化學(xué)方法的各種缺點(diǎn)，但是生物組合酶催化法催化鵝去氧膽酸生成熊去氧膽酸的方法成本較高，生物組合酶催化法生產(chǎn)的熊去氧膽酸的價(jià)格相對(duì)也較為昂貴，因此沒(méi)有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力?；趥鹘y(tǒng)的制備熊去氧膽酸的幾種方法，我們對(duì)熊去氧膽酸的制備方案進(jìn)行了改進(jìn)，克服了化學(xué)方法的危險(xiǎn)、能耗大、污染大、選擇性低的缺點(diǎn)，結(jié)合了生物催化法選擇性高的優(yōu)點(diǎn)，從而提出了效率高、成本低的制備熊去氧膽酸的新思路、新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本項(xiàng)目提出以鵝去氧膽酸為原料，利用NBS氧化丙酮溶解的鵝去氧膽酸生成7-羰基-石膽酸，再結(jié)合利用生物酶7β-HSDH將7-羰基-石膽酸(7k-LCA)催化合成UDCA的新思路，研究開發(fā)環(huán)保、綠色、高效的熊去氧膽酸的合成技術(shù)及工藝，并且熊去氧膽酸的生產(chǎn)成本大大降低。利用NBS氧化丙酮溶解的鵝去氧膽酸生成7-羰基-石膽酸的效率高，成本低的特點(diǎn)，結(jié)合使用重組大腸桿菌在特定溫度下進(jìn)行高密度發(fā)酵，產(chǎn)生高純度、高活性的催化酶(7β-HSDH)，催化酶可選擇性的催化7-羰基-石膽酸(7k-LCA)，生成純度較高的熊去氧膽酸(UDCA)，是環(huán)保、綠色、高效的熊去氧膽酸酶催化合成新技術(shù)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定：

實(shí)施例1

利用化學(xué)氧化法氧化鵝去氧膽酸生成中間體7-羰基-石膽酸的方法，具體包括以下步驟：

(1)取鵝去氧膽酸6g溶于10倍體積的丙酮水溶液中，丙酮-水的體積比為2.7：1，待完全溶解，加入NBS4g，30℃攪拌1.5h。待反應(yīng)完全后，加入40％的NaHSO₃，用500ml水稀釋，使產(chǎn)物析出。

(2)過(guò)濾反應(yīng)液Ⅰ，烘干產(chǎn)物，干燥，得到白色疏松的7-羰基-石膽酸粉末Ⅰ。

實(shí)施例2

原料CDCA的含量分析

取粉末Ⅰ約0.1g于50ml容量瓶中，加入甲醇適量，超聲(功率300W，頻率25kHz)5min使之溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取濾液，10l，通過(guò)高效液相色譜儀，采用蒸汽發(fā)光散射檢測(cè)器，記錄色譜圖1，對(duì)色譜圖進(jìn)行分析，CDCA的百分比含量為98％。對(duì)照品CDCA來(lái)自于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

實(shí)施例3

反應(yīng)液Ⅰ處理完后的粉末Ⅰ中的7K-LCA的含量分析

取粉末Ⅰ約0.1g于50ml容量瓶中，加入甲醇適量，超聲(功率300W，頻率25kHz)5min使之溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取濾液，10l，通過(guò)高效液相色譜儀，采用蒸汽發(fā)光散射檢測(cè)器，記錄色譜圖2，對(duì)色譜圖進(jìn)行分析，7K-LCA的百分比含量為99％。對(duì)照品7K-LCA來(lái)自于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

實(shí)施例4

7β-羥基類固醇脫氫酶(7β-HSDH)的表達(dá)

大腸桿菌：BL21(DE3)菌株，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(Solarbio Life Science)。

表達(dá)載體pGEX-6p-1：購(gòu)自生工生物(上海)股份有限公司。

用于發(fā)酵催化酶的7β-羥基類固醇脫氫酶的基因序列由生工生物(上海)股份有限公司進(jìn)行全基因合成，基因合成后與表達(dá)載體pGEX-6p-1連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)，用氨芐抗性的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化成功的表達(dá)菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)，將重組菌株按5％的添加量加入LB液體培養(yǎng)基中，220rmp、37℃培養(yǎng)。待OD₆₀₀為0.5時(shí)，25℃IPTG誘導(dǎo)16小時(shí)，大腸桿菌表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的7β-HSDH融合蛋白。將誘導(dǎo)完成的大腸桿菌培養(yǎng)液10000rmp離心10min，收集菌體，棄培養(yǎng)液，加入10倍體積的PBS溶液，超聲破碎菌液20min，至菌液澄清；4℃10000rmp離心20分鐘，收集上清液；上清液與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B(Glutathione Sepharose 4B medium，購(gòu)自BBI Life Science公司)4℃結(jié)合4h，使GST融合蛋白結(jié)合于谷胱甘肽標(biāo)簽分離樹脂(GST-Sefinose^TM Resin，購(gòu)自BBI Life Science公司)，分離融合蛋白，用五倍體積的PBS(100mM)沖洗三次。利用切GST標(biāo)簽的切割酶(Recombinant PreScission Protease,Low Endotoxin，購(gòu)自BBI Life Science公司)，4℃或室溫條件下切割16h，離心得到目的蛋白。嚴(yán)格按照BBI Life Science公司純化融合蛋白和酶切融合蛋白的步驟進(jìn)行操作。

實(shí)施例5

利用7β-HSDH酶催化7K-LCA制備熊去氧膽酸

利用大腸桿菌的高密度發(fā)酵產(chǎn)生的催化酶，催化7-羰基-石膽酸，制備熊去氧膽酸的方法，具體包括以下幾個(gè)步驟：

取2g7K-LCA粉末，溶于100mlpH8.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)；超聲5min，待完全溶解，加入0.02g的NADPH，加入5ml的7β-HSDH(酶總量為800g)；30℃反應(yīng)0.5h。

實(shí)施例6

反應(yīng)產(chǎn)物后處理

將實(shí)施例5中的轉(zhuǎn)化液調(diào)至pH為酸性，使7β-HSDH變性和產(chǎn)物結(jié)晶，采用高速離心機(jī)離心，10000rmp離心20min，除去蛋白和溶液，蒸餾除去剩余溶劑液，得到熊去氧膽酸粗品；將得到的熊去氧膽酸粗品和乙酸乙酯加入反應(yīng)容器中，升溫并回流1小時(shí)，降溫至常溫，過(guò)濾得到純度大于99％熊去氧膽酸。

實(shí)施例7

高效液相質(zhì)譜檢測(cè)前的樣品處理

對(duì)于實(shí)施例6處理完的產(chǎn)物，取1g，加50％的甲醇水溶液定容至50ml。

實(shí)施例8

液相質(zhì)譜(HPLC-MS)檢測(cè)樣品的方法

取實(shí)施例7所處理的溶液10l，過(guò)濾，加入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，采用的霧化器溫度為80℃，N₂流量3.0ml/min，C₁₈色譜柱。質(zhì)譜條件采用40℃柱溫，1.0ml/min流速；流動(dòng)相A:0.1％乙腈，流動(dòng)相B:0.1％甲酸。50％A和50％B等度洗脫25min。記錄質(zhì)譜曲線圖，如圖3。

實(shí)施例9

高效液相色譜蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)檢測(cè)前的樣品處理

對(duì)于實(shí)施例6處理完的產(chǎn)物，取0.5g的樣品，加入20ml的50％的甲醇水溶液中。

實(shí)施例10

高效液相色譜蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)檢測(cè)樣品的方法

取實(shí)施例9所處理的溶液10l，過(guò)濾，加入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，采用的霧化器溫度為80℃，N₂流量3.0ml/min，C₁₈色譜柱。色譜條件采用40℃柱溫，1.0ml/min流速；記錄色譜曲線圖，如圖4，計(jì)算結(jié)果分析得：熊去氧膽酸含量為99％以上。

上述實(shí)施例說(shuō)明通過(guò)化學(xué)氧化和生物酶催化聯(lián)用的兩步法制備熊去氧膽酸的方法是非常有效的，7位的羥基發(fā)生構(gòu)型反轉(zhuǎn)，且該反應(yīng)僅對(duì)7位的羥基發(fā)生了作用?；瘜W(xué)氧化高效且成本較低，生物酶催化還原的專一性，使用化學(xué)氧化和生物酶催化還原法聯(lián)用制備熊去氧膽酸，克服了化學(xué)方法的危險(xiǎn)、能耗大、污染大、選擇性低的缺點(diǎn)，結(jié)合了生物催化法選擇性高的優(yōu)點(diǎn)，使得熊去氧膽酸的制備效率大大提高、成本大大降低。

附圖說(shuō)明

圖1 HPLC-ELSD檢測(cè)原料中鵝去氧膽酸的含量，檢測(cè)結(jié)果顯示鵝去氧膽酸的含量為98％。

圖2 HPLC-ELSD檢測(cè)化學(xué)氧化的轉(zhuǎn)化液處理后的7k-LCA的含量，檢測(cè)結(jié)果顯示7k-LCA的含量為99％。

圖3質(zhì)譜檢測(cè)酶催化還原7k-LCA生成UDCA，檢測(cè)結(jié)果顯示該反應(yīng)有很明顯的熊去氧膽酸生成，熊去氧膽酸的含量明顯多于原料7k-LCA的含量，并且原料7k-LCA幾乎沒(méi)有殘留。

圖4 HPLC-ELSD檢測(cè)得到熊去氧膽酸的含量，檢測(cè)結(jié)果顯示熊去氧膽酸的含量為99％。

最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以輕松理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。