一種用高效液相色譜儀檢測?；切苋パ跄懰嶂须s質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物質(zhì)量測定方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用高效液相色譜儀檢測牛 磺熊去氧膽酸中雜質(zhì)的方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 牛磺熊去氧膽酸(Tauroursodeoxycholic Acid)化學(xué)名稱為3α，7β二羥基膽燒酰-Ν-?；撬?，是由熊去氧膽酸(UDCA)的梭基與牛磺酸的氨基之間縮水而成的結(jié)合型膽汁酸， 為白色或類白色粉末。在乙醇、甲醇易溶，冰醋酸中溶解，水中略溶，乙腈、乙酸乙酯、丙酮、 四氫呋喃中不溶。可增加膽汁酸的分泌，導(dǎo)致膽汁酸成分的變化，使其在膽汁中的含量增 加。?；切苋パ跄懰徇€可抑制肝臟膽固醇的合成，降低膽汁中膽固醇及膽固醇酯的量和膽 固醇的飽和指數(shù)，從而有利于膽汁中膽固醇逐漸溶解。
[0004] 牛磺熊去氧膽酸有這么多的功效，被大量使用。但在制備過程不免會(huì)有各樣雜質(zhì) 沒有去除，使產(chǎn)品達(dá)不到規(guī)定，或給療效上帶來新的問題。
[0005] 在各樣雜質(zhì)中，熊去氧膽酸雜質(zhì)、中間體、牛磺鵝去氧膽酸雜質(zhì)、牛磺海貍鼠膽酸 和對(duì)硝基苯酚雜質(zhì)為主要雜質(zhì)，需要對(duì)它們進(jìn)行檢測，并去除。
[0006] 目前有人用高效液相色譜法監(jiān)控雜質(zhì)，高效液相色譜法又稱〃高壓液相色譜〃、〃高 速液相色譜〃、〃高分離度液相色譜〃、〃近代柱色譜〃等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要 分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合 溶劑、緩沖液等流動(dòng)相栗入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行 檢測，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。
[0007] 比如中國專利CN201010552339.4說明書中，提到的雜質(zhì)分析方法為國家標(biāo)準(zhǔn)的色 譜方法，但運(yùn)用此方法不能夠?qū)⑾嚓P(guān)雜質(zhì)全部進(jìn)行分離開。中國專利201010577534.2說明 書中，也提供了一種超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法，但也存 在著只能檢測出單一的雜質(zhì)。還有相關(guān)文獻(xiàn)中提到"RP-HPLC法測定熊去氧膽酸中的有關(guān)物 質(zhì)"，此方法同樣無法將需要監(jiān)控的雜質(zhì)全部分離開；國內(nèi)外法定藥典均沒有收載此產(chǎn)品的 雜質(zhì)色譜條件;而國家標(biāo)準(zhǔn)提供的現(xiàn)有色譜條件僅能夠監(jiān)控?；蛆Z去氧膽酸雜質(zhì)，其他需 要監(jiān)控的雜質(zhì)無法在此色譜條件下進(jìn)行監(jiān)控，而是采用了非定量的薄層色譜法(TLC)進(jìn)行 補(bǔ)充，比如?；撬?、熊去氧膽酸、其他未知雜質(zhì)等。但因這些色譜條件的技術(shù)缺陷，無法滿足 對(duì)產(chǎn)品的高品質(zhì)的要求，而且多個(gè)雜質(zhì)監(jiān)控方法使質(zhì)量監(jiān)控人員工作量增加，不能夠及時(shí) 的監(jiān)控產(chǎn)品中的全部雜質(zhì)，與生產(chǎn)監(jiān)控要求的及時(shí)性、準(zhǔn)確性等相差甚遠(yuǎn)。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用高效液相色譜儀檢測?；切苋パ跄懰?中雜質(zhì)的方法，能夠在同樣的色譜條件下，全面檢測牛磺熊去氧膽酸中雜質(zhì)，保障產(chǎn)品的品 質(zhì);操作簡單，時(shí)間快，精確度高，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，成本降低。
[0010] 解決以上技術(shù)問題的本發(fā)明中的一種用高效液相色譜儀檢測?；切苋パ跄懰嶂?雜質(zhì)的方法，其特征在于:包括以下步驟： (1) 試樣溶液準(zhǔn)備： 雜質(zhì)貯備液:稱取熊去氧膽酸l〇mg、?；蛆Z去氧膽酸10mg、中間體10mg、?；呛Ｘ偸竽?酸1 Omg、對(duì)硝基苯酚1 Omg，分別置50mg量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，作為貯備液； 主成分溶液:?；切苋パ跄懰岷鸵译嫒芤?； 稀釋溶劑:體積百分比為5%的乙腈水溶液5-lOOml; 流動(dòng)相A:磷酸緩沖鹽； 流動(dòng)相B:乙腈； (2) 制備供試品溶液： 取牛磺熊去氧膽酸50mg置5ml量瓶中，加5%乙腈溶解并稀釋至刻度； (3) 制備對(duì)照品溶液： 精密量取熊去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、中間體、牛磺海貍鼠膽酸、對(duì)硝基苯酚雜質(zhì)貯 備液各5ml置100ml量瓶中，用5%乙腈溶液稀釋至刻度。
[0011] (4)雜質(zhì)分離及限度要求： 用高效液相色譜儀對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜定位，各雜質(zhì)之間的分離度> 1.5;在同一色 譜系統(tǒng)洗脫出來記錄的色譜圖中每個(gè)雜質(zhì)與雜質(zhì)之間的分離度要大于1.5;主成分峰理論 塔板數(shù)不得低于2000;主成分峰拖尾因子不得過2.0,主成分峰的保留時(shí)間應(yīng)在8-12min內(nèi)。 [0012]檢測結(jié)果中，若熊去氧膽酸雜質(zhì)< 0.1%;牛磺鵝去氧膽酸< 0.1%，?；呛Ｘ偸竽懰?< 0.1%、對(duì)硝基苯酚< 0.1%，中間體< 0.1%，則為合格質(zhì)量的產(chǎn)品。
[0013] 本發(fā)明中以下幾個(gè)條件需要同時(shí)滿足： 本發(fā)明中雜質(zhì)的含量確定是采用色譜方法中的"加校正因子的主成分自身對(duì)照法"來 確定。
[0014] 所述磷酸緩沖鹽為0.02mol/L磷酸二氫鉀，用磷酸調(diào)pH至3.0。
[0015] 所述乙腈為分析純乙腈。
[0016] 本發(fā)明中用梯度洗脫法來設(shè)計(jì)色譜條件，使在同一個(gè)色譜條件下分離這些雜質(zhì)。
[0017] 所述高效液相色譜儀色譜條件為：色譜柱:C18柱，柱溫25-35°C，流速0.8-1.2ml/ 111；[11，檢測波長21011111。
[0018]優(yōu)化方案中所述高效液相色譜儀色譜條件為:色譜柱:C18柱，柱溫30°C，流速lml/ 111；[11，檢測波長21011111。
[0019] 本發(fā)明中色譜條件是根據(jù)牛磺熊去氧膽酸主成分性質(zhì)及各雜質(zhì)在色譜洗脫條件 下，主成分中雜質(zhì)色譜分離情況來確定。確定的色譜條件可以全面監(jiān)控牛磺熊去氧膽酸雜 質(zhì)的殘留情況，給合成車間工業(yè)化化生產(chǎn)監(jiān)控產(chǎn)品品質(zhì)提供可行的檢測條件。
[0020] 所述高效液相色譜儀色譜檢測中采用梯度法，其梯度表如下： T(min) 0 10-15 30-40 40-50 55 60 A相（％):80 30-55 30-55 30-55 20 80 B相（％):20 45-60 60-70 60-70 20 20 進(jìn)一步優(yōu)化方案中梯度法程序的梯度表如下： T(min) Ο 15 30 50 55 60 流動(dòng)性A相（％) :80 40 30 30 20 80 流動(dòng)性B相(％) :20 60 70 70 20 20 ?；切苋パ跄懰嶂鞒煞肿贤馕蛰^弱，都是紫外末端吸收，而且極性較大，若采用高效 液相等度色譜一般方法中的條件無法將眾多的雜質(zhì)進(jìn)行分離和準(zhǔn)確定量，一般方法是用需 要采用其他監(jiān)控手段比如TLC技術(shù)來進(jìn)行補(bǔ)充監(jiān)控。補(bǔ)充監(jiān)控的加入，可以一定范圍內(nèi)檢測 準(zhǔn)確，但依然存在對(duì)產(chǎn)品的雜質(zhì)漏檢，而且無法精確定量分析，導(dǎo)致合成工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，無 法全面監(jiān)控雜質(zhì)，給產(chǎn)品品質(zhì)帶來隱患。
[0021] 梯度法具體操作就是按已設(shè)計(jì)好的梯度運(yùn)行時(shí)間表，在高液設(shè)備自帶的梯度洗脫 設(shè)置軟件上輸入運(yùn)行時(shí)間，高液根據(jù)時(shí)間運(yùn)行要求自行切換流動(dòng)性的洗脫比例，達(dá)到將不 同極性的雜質(zhì)在同一根色譜柱中依次洗脫出來，而且時(shí)間短，雜質(zhì)監(jiān)控全面，除了能夠監(jiān)控 這些已知雜質(zhì)外，梯度洗脫程序還可以洗脫出其他未知的雜質(zhì)，達(dá)到全面控制產(chǎn)品品質(zhì)的 目的。
[0022] 本發(fā)明中的檢測方法能夠在同樣的色譜條件下，全面檢測?；切苋パ跄懰嶂须s 質(zhì)，保障產(chǎn)品的品質(zhì)；同時(shí)此色譜條件的運(yùn)用，可以監(jiān)控制劑產(chǎn)品中的雜質(zhì)降解情況，給產(chǎn) 品的生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸、臨床使用提供了科學(xué)的監(jiān)控質(zhì)量色譜體系。
[0023]
【具體實(shí)施方式】
[0024] 以下通過實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明： 其中，本品化學(xué)名稱為2-[[(3α, 5β, 7β)_3, 7_二羥基_24_氧代膽留燒_24_基]氛基] 乙烷磺酸二水合物。
[0025] 所用儀器或設(shè)備、相應(yīng)的劑型： 高液色譜設(shè)備:Agilent 1200 四元栗(G1311A)，Agilent 1200DAD 檢測器(G1315A)， Agilent 1200真空脫氣機(jī)，（G1322A)Agilent 1200自動(dòng)進(jìn)樣器（G1367A)，D〇-chrom(DT-230A)柱溫箱 色譜柱:Ci8(型號(hào)：Sapphire，長:250mm，內(nèi)徑:4 · 6mm，填料粒徑:5??m ) 試劑：乙腈(天津科密化學(xué)試劑有限公司，1298156,色譜級(jí)），磷酸二氫鉀(成都科龍化 學(xué)試劑有限公司，120011，AR級(jí)），磷酸(成都科龍化學(xué)試劑有限公司，128011，AR級(jí)） 天平：METTLER TOLEDO XS105 實(shí)施例1 用高效液相色譜儀檢測?；切苋パ跄懰嶂须s質(zhì)的方法，包括以下步驟： (1)試樣溶液準(zhǔn)備： 雜質(zhì)貯備液:稱取熊去氧膽酸l〇mg、?；蛆Z去氧膽酸10mg、中間體10mg、?；呛Ｘ偸竽?酸1 Omg、對(duì)硝基苯酚1 Omg，分別置50mg量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，作為貯備液； 主成分溶液:牛磺熊去氧膽酸和乙腈溶液； 稀釋溶劑:體積百分比為5%的乙腈水溶液5-100ml; 流動(dòng)相A:磷酸緩沖鹽，具體為0.02mo