專利名稱：用于降低或消除環(huán)境激素毒性的含熊去氧膽酸的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于降低或消除環(huán)境激素毒性的制劑，其中包含熊去氧膽酸(3α，7β-二羥-5β-膽烷酸；以下稱為UDCA)或其可藥用鹽或酯作為解毒劑。
背景技術(shù)：
UDCA(分子量392.58；分子式C24H40O4)在體內(nèi)具有多種藥理學(xué)作用。例如，可清潔膽小管從而消除其中的廢物以及毒性膽汁酸，可穩(wěn)定肝細胞膜和保護肝細胞。它也可增加肝臟中的血流量，抑制膽固醇的吸收和生物合成，溶解膽石并抑制其形成，以及使免疫應(yīng)答正常化。因此，目前UDCA被用于臨床治療膽石病、膽道疾病、慢性肝臟疾病、肝功能不全、腸切除術(shù)后消化不良和脂肪肝等。UDCA是動物膽汁的組成成分，但是在人膽汁中量非常低。取而代之UDCA的立體異構(gòu)體CDCA(鵝脫氧膽酸)通常以與甘氨酸或牛磺酸結(jié)合的形式存在于人膽汁中。
環(huán)境激素是能破壞內(nèi)分泌系統(tǒng)正常機能的化學(xué)物質(zhì)。它們可釋放到環(huán)境中，并被吸收到體內(nèi)，從而在體內(nèi)表現(xiàn)出激素樣作用。因此，往往將其稱為“內(nèi)分泌的破壞劑”。目前，在WWF(世界野生生物基金會)目錄中登記的環(huán)境激素包括67種化學(xué)物質(zhì)，而在日本衛(wèi)生和福利部中登記的有142種物質(zhì)，例如化工原料、藥品和食品添加劑等。在WWF目錄中登記的內(nèi)分泌破壞劑可分為6類有機氯化合物包括二噁英(dioxin)，44種殺蟲劑包括DDT，8種鄰苯二甲酸酯包括鄰苯二甲酸丁芐酯，3種重金屬包括鎘、雙酚A和苯并芘。
這些環(huán)境激素對生物體有多種影響，例如男性化和女性化、行為障礙和助長腫瘤等。最近，許多研究者發(fā)現(xiàn)它們對野生生態(tài)系統(tǒng)具有明顯的影響，而且對人也具有相似的作用。由于其雌激素樣活性(因此被稱為環(huán)境中的外源雌激素)，其中大多數(shù)內(nèi)分泌破壞劑甚至在非常低的水平即可在體內(nèi)表現(xiàn)出毒性。
在包括韓國的許多國家中，已從塑料、鋁罐的內(nèi)涂層材料、方便面容器、洗滌劑的降解產(chǎn)物、焚燒爐廢氣和殺蟲劑等中檢測出多種環(huán)境激素。盡管它們的排放量非常低，但是由于其高度的親脂性和在環(huán)境內(nèi)持續(xù)存在，它們可在介質(zhì)之間轉(zhuǎn)移，并通過食物鏈而得到生物學(xué)濃縮。因此，對生態(tài)系統(tǒng)有嚴重的不利影響。
在內(nèi)分泌破壞劑中，DDT和雙酚A是具有體內(nèi)雌激素樣活性的代表。雙酚A可用作聚氯乙烯(制造塑料的主要成分)的增溶劑，大量存在于廣泛使用的家用塑料器具中。因此，人類處于與其接觸的尤其高度危險中。已知DDT和雙酚A對雌性生殖器官有影響，例如可引起子宮肥大。在動物試驗中，這種子宮肥大可導(dǎo)致子宮重量增加。其已知的分子生物學(xué)機制是它們可與雌激素受體結(jié)合，從而表現(xiàn)出雌激素樣活性。因此，在卵巢結(jié)扎的動物體內(nèi)，DDT和雙酚A均表現(xiàn)出與雌激素相同的對子宮的重量和形狀的影響。尤其地，環(huán)境激素中最值得注意的物質(zhì)--鹵化芳烴化合物，例如多氯化苯化合物和二噁英(dioxin)，已知通過共同的反應(yīng)機制而表現(xiàn)出相似的毒性。
鹵化芳烴包括多氯化二苯并二噁英和多氯化氧芴，是燃燒化石燃料或焚化醫(yī)藥垃圾或漂白紙過程中排出的最典型的環(huán)境污染物。二噁英(其化學(xué)名為2，3，7，8-四氯二苯并-p-二噁烯，TCDD)，是多氯化芳烴中最具毒性的化合物，它也通過共同的反應(yīng)機制而表現(xiàn)出毒性。人類普遍地與已經(jīng)進入食物、飲用水、土壤、灰塵、煙霧或空氣中的這類化合物接觸。尤其是從事生產(chǎn)、使用或破壞這種物質(zhì)的勞動者，更可能連續(xù)地或間歇地與相對高濃度的多鹵化芳烴接觸，因此他們的健康受到極大威脅。這些化合物會生物學(xué)濃縮于魚體內(nèi)，然后漁民或嗜魚者就會經(jīng)口接觸這些物質(zhì)。焚化工廠附近的農(nóng)民也可能經(jīng)口接觸這些物質(zhì)。另外，生產(chǎn)事故和不恰當?shù)靥幹霉I(yè)廢料也可排放高濃度的這些化合物。焚燒爐中燃盡后留下的灰中所含的揮發(fā)性二噁英易吸收進肺部。二噁英以非常低的濃度存在于土壤、空氣和沉積物中，但是可借助于其持久的穩(wěn)定性和親脂性而通過食物鏈生物學(xué)濃縮。人類通常通過食品接觸二噁英。二噁英通過食品與人接觸的濃度被認為是約0.1-0.3pg/kg/天。
二噁英以及有關(guān)物質(zhì)的親脂性可提高它們在母乳中的濃度，并增加其在哺乳期從乳房脂肪組織中釋放出來。因此，用母乳喂養(yǎng)的新生兒每日約接觸10-20倍更高濃度的二噁英。先前對二噁英的阻斷劑和解毒劑的研究發(fā)現(xiàn)，二噁英通過與芳烴受體結(jié)合而導(dǎo)致免疫抑制、內(nèi)分泌紊亂、致癌作用和缺血性心臟病。
據(jù)Casper R.F.等(Mol.Phar.Macol.1999年10月56(4)784-790)報道，從紅酒中提取的白藜蘆醇具有防止二噁英毒性的作用，它可與二噁英化合物競爭結(jié)合芳烴受體。先前的研究表明白藜蘆醇具有適當?shù)乃幚韺W(xué)作用，而且是一種無毒的物質(zhì)。在將來，經(jīng)許多臨床試驗后，它將被開發(fā)成用于預(yù)防二噁英毒性的藥物。然而，盡管這種化合物對已吸收到體內(nèi)的二噁英具有競爭性抑制活性，但是它并不能抑制二噁英本身的連續(xù)吸收，也不能增強其排泄。這樣，已吸收的二噁英會在組織尤其是肝臟或脂肪組織中蓄積。因此，它并不能完全地抑制二噁英毒性。
另外，蔗糖聚酯(olestra)(Lancet，1999年10月，9；354(9186)1266-1267)已知作為對二噁英具有潛在的吸附和促排泄活性的物質(zhì)，是一種多脂肪酸酯，其中的許多脂肪酸與蔗糖結(jié)合而使其不被胰酶降解。這種化合物對二噁英具有強烈的吸附活性，因此可有效地排泄經(jīng)胃腸循環(huán)再吸收的二噁英，并且能阻斷再吸收本身，因此在臨床上很有用。然而，它們對親脂性維生素例如維生素A、D、E、K和類胡蘿卜素也具有吸附活性，其缺點是妨礙了這些必需維生素的吸收。
另外，活性炭也可用作二噁英的吸附劑，但是由于其類似于蔗糖聚酯的較低的吸附選擇性，難于廣泛使用。
被稱作雌激素或類似活性物質(zhì)抑制劑的他莫昔芬和Faslodex(ICI182，780，AstraZeneca)，已經(jīng)被開發(fā)成乳腺癌的治療劑，目前正處于臨床試驗中。它們可能在臨床上用作二噁英的解毒。然而，目前用作乳腺癌治療劑的他莫昔芬也有副作用(例如向子宮活性)，因此其在人體中用作降低環(huán)境激素危險的藥物方面也有限制。在先前研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，降低乳腺癌治療劑他莫昔芬副作用的Faslodex表現(xiàn)出優(yōu)異的臨床效力。但是它的活性僅限于抗癌活性，并且其抗雌激素活性基本上僅限于對雌激素受體的競爭性抑制作用。因此，它與UDCA明顯不同，UDCA對體內(nèi)負荷的雌激素以及雌激素活性類似物均具有消除活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，UDCA可通過增加膽汁流量而促進有毒物質(zhì)的排泄，由此完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的是提供用于預(yù)防或改善可能因環(huán)境激素所致的體重下降、生長抑制、血糖調(diào)節(jié)降低、癌癥、免疫調(diào)節(jié)降低、生殖毒性和免疫毒性等的制劑。
本發(fā)明涉及用于降低或消除環(huán)境激素毒性的制劑，其中含有UDCA或其藥用鹽或酯作為活性成分。
UDCA可通過增加膽汁流量來促進有毒物質(zhì)的排泄。它還可通過有效地清除二噁英來保護正常的肝細胞，其中與其它任何器官相比，二噁英更易在肝臟中蓄積。同時，它不抑制必需親脂性物質(zhì)的吸收，這樣就可很有效地解毒有毒物質(zhì)而不引起任何嚴重的副作用。
按照本發(fā)明，可能由于與多種環(huán)境激素接觸而產(chǎn)生的任何毒性，均可通過使用UDCA或其等同物來改善或消除。在本發(fā)明中，UDCA的等同物包括在本領(lǐng)域中已知與UDCA具有相當?shù)乃幚韺W(xué)效力的其任何藥用鹽或酯。其代表性實例為UDCA鈉鹽和UDCA?；撬峤Y(jié)合物。
在此所用的術(shù)語“環(huán)境激素”包括鹵化芳烴例如PCB和二噁英化合物，和內(nèi)分泌破壞劑例如DDT、鄰苯二甲酸酯、烷基酚、雙酚A等。
本發(fā)明證實，通過向人為接觸二噁英的實驗動物施用UDCA，可使由二噁英所引起的多種毒性病癥例如死亡、體重下降、生長抑制、血糖調(diào)節(jié)喪失、睪丸重量下降等得到抑制或使其正?；?。另外，還發(fā)現(xiàn)通過施用UDCA可有效地抑制雌激素樣物質(zhì)所致的子宮肥大?；谏鲜鲅芯?，證實UDCA在體內(nèi)具有抗雌激素效力。
在本發(fā)明中，對已施用了藥理學(xué)有效量UDCA的小鼠經(jīng)皮下注射TCDD，在給定期限后，通過測量死亡率的變化、血液學(xué)檢驗、摘取器官和免疫染色法，來評價UDCA對TCDD的解毒作用。然后，為了證實這種效力，將其與活性炭的結(jié)果比較，已知活性炭可通過抑制TCDD的體內(nèi)吸收來阻斷和清除通過腸肝循環(huán)連續(xù)表現(xiàn)出的TCDD毒性。
根據(jù)本發(fā)明，UDCA可使因不斷在體內(nèi)蓄積而顯示出毒性的高度親脂性物質(zhì)例如DDT、鄰苯二甲酸酯、烷基酚、雙酚A等在膽汁中增溶，從而有效地排泄和解毒這些物質(zhì)。因此，UDCA可使這些物質(zhì)在體內(nèi)的效力減至最小。
盡管本發(fā)明實驗是針對TCDD(一種代表性的鹵化芳烴)和雙酚A進行的，但是本發(fā)明的范圍不應(yīng)限于這些特定物質(zhì)，因為已知任何環(huán)境激素均通過共同的反應(yīng)機制而表現(xiàn)出相似毒性。因此，采用UDCA進行的臨床試驗適用于解毒、抑制和預(yù)防任何其它環(huán)境激素所致的毒性。因此，無論環(huán)境激素的種類或數(shù)量，本發(fā)明均可有效地防止或治療環(huán)境激素的毒性。
本發(fā)明制劑可包含本領(lǐng)域常規(guī)的可藥用載體，并可通過與所述藥用載體混合而制成片劑、散劑、顆粒劑、溶液劑、糖漿、膠囊等。另外，也可制成供肌肉或靜脈內(nèi)施用的可注射溶液劑?？山?jīng)任何藥學(xué)可接受的途徑施用UDCA。
按照本發(fā)明，以能抑制環(huán)境激素所致毒性的有效量施用UDCA，優(yōu)選每天以分劑量若干次施用10-2,000mg。
附圖簡述

圖1為施用溶劑對照組的細精管的光學(xué)顯微照片(×200)。
圖2為單獨施用27.5μg/kg TCDD劑量組的細精管的光學(xué)顯微照片(×200)。如該圖所示，可觀察到精子生成顯著降低。由于細胞質(zhì)的破裂，大多數(shù)細胞的形狀不清楚?；撞糠种械纳硟?nèi)皮細胞顯著溶解。在睪丸的細精管中，可見精原細胞從基底部分離。在基底部與腔部分之間存在較大空隙。在細精管中幾乎觀察不到正常的精子生成，同時可觀察到僅有支持細胞而沒有生殖細胞的細精管。
圖3是27.5μg/kg TCDD與0.5重量％UDCA聯(lián)用組的細精管的光學(xué)顯微照片(×200)。如該圖所示，可觀察到正常的細精管，同時在細精管中心觀察到一些受損的細精管和未成熟的精細胞。
圖4是施用溶劑對照組的支持細胞和生殖細胞的電子顯微鏡照片(×3,000)。支持細胞與生殖細胞緊密接觸，可觀察到緊密連接。
圖5為萊迪希氏細胞和細胞質(zhì)細胞器的電子顯微鏡照片(×2,500)。較好地保持了萊迪希氏細胞和細胞器的正常形狀。
圖6是單獨施用27.5μg/kg劑量TCDD組的萊迪希氏細胞的電子顯微鏡照片(×4,000)?？稍谌R迪希氏細胞的細胞質(zhì)中觀察到吞噬溶酶體。
圖7是單獨施用27.5μg/kg劑量TCDD組的支持細胞的電子顯微鏡照片(×4,000)?？稍谥С旨毎募毎|(zhì)中觀察到大的脂滴，還觀察到細胞質(zhì)空泡和吞噬溶酶體。
圖8是施用溶劑對照組的精子頭部的電子顯微鏡照片(×25,000)?？捎^察到正常發(fā)育的精子頭。
圖9是單獨施用27.5μg/kg劑量TCDD組的精子頭部的電子顯微鏡照片(×10,000)?？稍谥С旨毎募毎|(zhì)空泡中頻繁觀察到精子頭。
圖10是27.5μg/kg TCDD與0.5重量％UDCA聯(lián)用組的精子頭部的電子顯微鏡照片(×8,000)。保持了精子頭部的正常形狀。
實施本發(fā)明的最佳方式通過以下實施例可更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易理解在此描述的特定材料和結(jié)果僅僅是示例性的，不應(yīng)視為是對后附權(quán)利要求書中更為全面完整地定義的本發(fā)明范圍的限制。
實施例1UDCA對二噁英的解毒作用1.實驗動物購入雄性C57B1/6J小鼠(5周齡，平均體重為18-22g，在CRJ(日本Charles River)繁殖)，用作該實施例的實驗動物。使這些小鼠對恒定飼養(yǎng)條件(即溫度24±1℃、濕度60±10％和12小時的亮/暗周期)適應(yīng)1周，然后進行實驗。
供給實驗動物Purina粉末飼料(購自Hae Eun Trade)，并隨意進水。在試驗期間，所有動物每周稱重2次。2.試驗物質(zhì)的配制和施用將2，3，7，8-四氯二苯并-p-二噁烯(TCDD，美國Chem.Services公司生產(chǎn))溶于甲苯(氣相色譜法分析純度為95％或更高)，經(jīng)氮氣揮發(fā)獲得粉末。將粉末溶于包含丙酮和玉米油(體積比1∶6)的混合溶劑中。將包含110、27.5和6.9μg/kg TCDD的所得溶液對小鼠進行皮下注射(5ml/體重)。將試驗物質(zhì)UDCA分別以0.5、0.25和0.125％(重量)的量摻入粉狀飼料中。從施用TCDD之前(施用前)10天至施用TCDD后(施用后)60天間，用上述飼料喂養(yǎng)小鼠。3.取樣和測試在完成上述60天的實驗后，實驗動物禁食24小時，并用乙醚麻醉。然后，切開腹部，由腹部腔靜脈收集血液。放血處死小鼠，摘取肝臟、腎、睪丸和附睪，并稱重。僅單獨保留睪丸并在光學(xué)和電子顯微鏡下觀察。用離心機從血液中分離血清，供生物化學(xué)試驗，分離的血清用自動血液生化分析儀Dimension(Dupont公司，美國)分析。將血液移至另一血液采集瓶中，然后用自動血細胞分析儀Celldyn(Abbott公司，美國)分析。4.對睪丸的光學(xué)顯微鏡檢將摘取的睪丸于10％中和的福爾馬林緩沖劑中固定24小時，并用流動水洗滌。接著用乙醇脫水并用二甲苯清理，然后用石蠟包埋。用切片機(microm HM 440E)切成厚度為2-3μm的切片，然后用蘇木精和曙紅雙重染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。5.對睪丸的電子顯微鏡檢將摘取的睪丸用pH7.3磷酸鹽緩沖液配制的預(yù)固定劑(2.5％戊二醛)浸透，并切成1mm3大小。于4℃，在預(yù)固定劑中預(yù)固定4小時，然后用相同的緩沖溶液洗滌。接著用1％四氧化鋨(pH7.3)固定2小時，并用相同緩沖液洗滌。用乙醇脫水，并用環(huán)氧丙烷置換，然后包埋于環(huán)氧類樹脂混合溶液中。使用超薄切片機(Reichert-Jung，Ultracut E)，將包埋的組織制成60-70nm厚的超薄切片，然后用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在透射電子顯微鏡(H-600，Hitachi公司，日本)下觀察。6.確定Johnsen評分為了評價精子發(fā)生的水平，于存在或缺乏按精子發(fā)生成熟排列的主細胞基礎(chǔ)上，確定Johnsen評分(從10到1)。睪丸中Johnsen評分的基礎(chǔ)如下10理想的精子發(fā)生，有許多精子，胚胎上皮細胞的組織具有恒定厚度，和開放的腔9盡管有許多精子，但胚胎上皮細胞與基底膜明顯分離并破裂，或失去腔8在切片中有5到小于10個精子7許多精細胞但沒有精子65到小于10個精細胞但無精子5幾個或許多精母細胞但沒有精子和精細胞4不到5個精母細胞沒有精子和精細胞3僅存在精原細胞為生殖細胞2僅存在支持細胞沒有任何生殖細胞1細精管切片中沒有細胞7.統(tǒng)計學(xué)所得結(jié)果用均值±標準偏差表示。采用單側(cè)方差分析(ANOVA)，對急性毒性試驗中體重、飼料和水攝取、生化數(shù)據(jù)、血液學(xué)數(shù)據(jù)和器官重量進行了統(tǒng)計分析(等分布)。若在ANOVA中表現(xiàn)出顯著性，則在p＜0.05和p＜0.01水平上進行學(xué)生t-檢驗。8.結(jié)果(1)對死亡率和死亡時間的影響表1.UDCA對單次皮下注射TCDD致小鼠死亡的影響

-施用6.9μg/kg劑量TCDD的組無論是否與UDCA接觸，沒有動物死亡。
-施用27.5μg/kg劑量TCDD的組未與UDCA接觸，死亡率是30％和死亡時間是55±5天，即動物大約在試驗結(jié)束時死亡。與之相比，與0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA接觸的動物，不論劑量多大都未出現(xiàn)死亡，-施用110μg/kg劑量TCDD的組未與UDCA接觸，所有動物在35±7天時死亡。與0.125％(重量)UDCA接觸，所有動物在33±4天時死亡。與0.25％(重量)UDCA接觸的動物中，有90％在34±5天時死亡。與0.5％(重量)UDCA接觸的動物中，有40％在51±8天時死亡。比較起來，與0.5％(重量)活性炭接觸的動物中，有70％在35±6天時死亡。(2)對體重變化的影響表2.UDCA對單次皮下注射TCDD致體重變化的影響

**與溶劑對照有顯著差異，p＜0.01#與單獨施用二噁英組有顯著差異，p＜0.05##與單獨施用二噁英組有顯著差異，p＜0.01-所有動物死亡-施用6.9μg/kg劑量TCDD的組未接觸UDCA組與溶劑對照組之間沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。但是，施用TCDD后59天體重顯著地降低。與之相比，通過與0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA接觸，可抑制這種統(tǒng)計學(xué)顯著意義的體重下降。
-施用27.5μg/kg劑量TCDD的組未接觸UDCA，與溶劑對照組相比較，從施用TCDD后12天起，該組的體重連續(xù)且顯著地降低。然而，通過與0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA接觸，可抑制這種統(tǒng)計學(xué)顯著意義的體重下降，并使體重保持在與溶劑對照組動物幾乎相同的水平。
-施用110μg/kg劑量TCDD的組未與UDCA接觸，與溶劑對照組相比較，該組的體重從施用TCDD后12天起連續(xù)且顯著地降低。此外，同未接觸UDCA的組一樣，與0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA接觸組的體重連續(xù)降低。(3)飼料和水的攝取表3.UDCA對單次皮下注射TCDD的小鼠飼料攝取的影響


**與溶劑對照有顯著差異，p＜0.01##與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.01-所有動物死亡如以上表3所示，動物對飼料的攝取隨著接觸TCDD濃度的提高而顯著降低。
-施用6.9μg/kg劑量TCDD的組接觸UDCA組與未接觸UDCA組之間沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。
-施用27.5μg/kg劑量TCDD的組從施用TCDD后30天起，未接觸UDCA組與接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA組之間可觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著差異。即通過施用UDCA而抑制了飼料攝取的降低。
-施用110μg/kg劑量TCDD的組接觸UDCA組與未接觸UDCA組之間的飼料攝取沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。
表4.UDCA對單次皮下注射TCDD的小鼠水攝取的影響


*與溶劑對照有顯著差異，p＜0.05**與溶劑對照有顯著差異，p＜0.01##與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.01-所有動物死亡如以上表4所示，動物的水攝取隨著接觸TCDD濃度的提高而顯著降低。
-施用6.9μg/kg劑量TCDD的組接觸UDCA組與未接觸UDCA組之間沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。
-施用27.5μg/kg劑量TCDD組從施用TCDD后30天起，未接觸UDCA組與接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA組之間可觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著差異。即通過施用UDCA而抑制了水攝取的降低。
-施用110μg/kg劑量TCDD組未接觸UDCA組與接觸UDCA組之間水攝取沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。(4)生化研究為了獲得血清中的生化數(shù)據(jù)，測定了血清中葡萄糖(GLU)、GOT、GPT、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)和堿性磷酸酶(ALP)的水平，結(jié)果如下所示。
表5.UDCA對單次皮下注射TCDD的小鼠血液生化變化的影響

*與溶劑對照有顯著差異，p＜0.05**與溶劑對照有顯著差異，p＜0.01#與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.05##與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.01GLU的顯著降低與TCDD施用劑量正比例。在每一TCDD施用劑量下，與0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA接觸均可顯著抑制血清中葡萄糖水平的降低。與溶劑對照組比較，在施用27.5μg/kg劑量TCDD的組中，GOT顯著增加，而接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA可顯著抑制這種增加。然而，與溶劑對照組相比，施用6.9μg/kg劑量TCDD組的GOT未顯著增加。與溶劑對照組比較，施用27.5μg/kg劑量TCDD組的GPT顯著地增加，而接觸0.25和0.5％(重量)UDCA可顯著地抑制這種增加。HDL-C的顯著降低與TCDD施用劑量成比例，而接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA可顯著地抑制這種降低。與溶劑對照組比較，施用27.5μg/kg劑量TCDD組的LDL-C未顯著地降低，而接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA可引起顯著差異。與溶劑對照組相比，施用6.9μg/kg劑量TCDD組的LDLC顯著地下降，而接觸0.125％(重量)UDCA可引起顯著差異。TG和ALP沒有顯著變化。(5)血液學(xué)研究為了進行血液學(xué)研究，測定了白細胞(WBC)、嗜中性粒細胞(NEU)、淋巴細胞(LYM)、單核細胞(MONO)、嗜酸性粒細胞(EOS)、嗜堿性粒細胞(BASO)和紅血球(RBC)計數(shù)，和血紅蛋白濃度(HGB)、血細胞比容(HCT)、平均細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞分布寬度(RDW)和血小板計數(shù)(PLT)，結(jié)果如下。
表6.UDCA對單次皮下注射TCDD的小鼠血液學(xué)變化的影響


*與溶劑對照有顯著差異，p＜0.05**與溶劑對照有顯著差異，p＜0.01##與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.01施用TCDD后，WBC、MON0、EOS、BASO、RBC和RDW沒有顯著變化。與溶劑對照組相比，施用27.5μg/kg劑量TCDD組的NEU顯著地增加，而接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA可顯著地抑制這種增加。與溶劑對照組相比，施用27.5μg/kg劑量TCDD組的LYM顯著地降低，而接觸0.25和0.5％(重量)UDCA可顯著地抑制這種降低。與溶劑對照組相比較，施用27.5μg/kg劑量TCDD組的HGB顯著地降低，而接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA可顯著地抑制這種降低。與溶劑對照組相比較，施用27.5μg/kg劑量TCDD組的HCT顯著地降低，而接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA可顯著地抑制這種降低。與溶劑對照組相比，施用27.5μg/kg劑量TCDD組的MCV顯著地降低，而接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA可顯著地抑制這種降低。與溶劑對照組相比，MCH顯著降低，而接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA可顯著地抑制這種降低。與溶劑對照組相比，施用27.5μg/kg劑量TCDD組的MCHC顯著地降低，但是接觸UDCA不能抑制這種降低。與溶劑對照組相比，施用27.5μg/kg劑量TCDD組的PLT顯著地增加，而接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA可顯著地抑制這種增加。與溶劑對照組相比，施用6.9μg/kg劑量TCDD組的PLT沒有顯著變化。(6)測量器官重量對器官即肝臟、腎、睪丸和附睪進行稱重，結(jié)果如下所示。
表7.UDCA對單次皮下注射TCDD的小鼠體重和肝臟重量以及肝臟相對重量變化的影響

*與溶劑對照有顯著差異，p＜0.05**與溶劑對照有顯著差異，p＜0.01##與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.01與溶劑對照組相比，施用27.5μg/kg劑量TCDD組的肝臟重量顯著地降低，其相對重量顯著地增加。接觸0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA可顯著地抑制這種重量的下降，但是不能抑制相對重量的增加。與溶劑對照組相比，施用6.9μg/kg劑量TCDD組中僅相對重量顯著地增加。接觸UDCA不能抑制這種增加。
表8.UDCA對單次皮下注射TCDD的小鼠腎重量以及腎相對重量變化的影響

**與溶劑對照有顯著差異，p＜0.01##與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.01與溶劑對照組相比，施用27.5μg/kg TCDD組的腎重量顯著地降低，其相對重量顯著地增加。接觸UDCA不能抑制這種變化。與溶劑對照組相比，施用6.9μg/kg TCDD組沒有觀察顯著變化。
表9.UDCA對單次皮下注射TCDD的小鼠睪丸重量以及其相對重量變化的影響


*與溶劑對照有顯著差異，p＜0.05**與溶劑對照有顯著差異，p＜0.01#與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.05##與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.01與溶劑對照組相比，施用27.5μg/kg劑量TCDD組的睪丸重量顯著地降低，其相對重量顯著地增加。接觸UDCA可抑制這種變化，但抑制程度取決于UDCA濃度。與對照組相比，施用6.9μg/kg TCDD組僅重量顯著地降低。與0.125和0.5％(重量)UDCA接觸可抑制這種降低。
表10.UDCA對單次皮下注射TCDD的小鼠附睪重量以及其相對重量變化的影響

*與溶劑對照有顯著差異，p＜0.05**與溶劑對照組有顯著差異，p＜0.01#與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.05##與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.01與溶劑對照組相比，施用27.5μg/kg TCDD組的附睪重量顯著地降低，其相對重量顯著地增加。接觸UDCA可抑制這種變化，但抑制程度取決于UDCA濃度。與溶劑對照組相比，施用6.9μg/kg TCDD組中僅左附睪的重量顯著地降低，接觸UDCA可抑制這種降低。與單獨施用TCDD的組相比，其相對重量顯著地增加。(7)光學(xué)顯微鏡下的組織病理學(xué)研究在單獨施用TCDD的組中，包括精原細胞在內(nèi)的大多數(shù)生殖細胞表現(xiàn)出分化降低。由于生殖上皮細胞的溶解，可觀察到基底膜周圍的精原細胞分離，和相鄰細胞之間的空隙擴大。還發(fā)現(xiàn)基底部分與腔之間的空隙(鄰近部分的內(nèi)部空間)擴大。此外，還觀察到精母細胞和精細胞的生長停滯。在某些組中，可觀察到壞死病變區(qū)域以及僅有支持細胞的細精管。上述結(jié)果表明TCDD可引起非常嚴重的變化。與之相比，在接觸UDCA的組中，細精管的形狀與溶劑對照組相似，有時候精子發(fā)生還反而增加(參見附圖1、2和3)。(8)電子顯微鏡下細胞微觀結(jié)構(gòu)的變化在單獨施用TCDD的組中，可觀察到萊迪希氏細胞中細胞質(zhì)空泡的形成、線粒體的腫脹和變性、以及平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的減少和變形。還觀察到吞噬溶酶體和脂粒的增加以及核凝聚。在細精管中，特征性發(fā)現(xiàn)基底膜與生殖細胞分離，還觀察到生殖細胞中不規(guī)則形狀的核以及染色質(zhì)凝聚。此外，還發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)細胞器的破裂和丟失。與之相比，在施用UDCA的組中，幾乎所有情況下均保留了與溶劑對照組相似的細胞形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)，有時候還可觀察到發(fā)育良好的細胞微觀結(jié)構(gòu)(參見附圖4-10)。(9)測定Johnsen評分以定量組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)結(jié)果表11.睪丸組織的Johnsen評分

**與溶劑對照有顯著差異，p＜0.01##與單獨施用TCDD組有顯著差異，p＜0.01如以上表11所示，與溶劑對照組相比，在單獨施用6.9μg/kg TCDD和27.5μg/kg TCDD的各組中，可觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著差異(p＜0.01)。在單獨施用6.9μg/kg TCDD組與分別聯(lián)用0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA和6.9μg/kg TCDD的組之間，可觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著差異(p＜0.01)。另外，在單獨施用27.5μg/kg TCDD組與分別聯(lián)用0.125、0.25和0.5％(重量)UDCA和27.5μg/kg TCDD的組之間，可觀察統(tǒng)計學(xué)顯著差異(p＜0.01)。因此，UDCA對TCDD毒性的阻斷效應(yīng)得到了證實。此外，對于施用6.9μg/kg和27.5μg/kg TCDD的兩組，這種效應(yīng)均是劑量依賴性增加的。
實施例2雙酚A對子宮增生的影響1.實驗動物和給藥方案購入切除卵巢的雌性B6C3F1小鼠(5周齡，平均體重為18-22g，在CRJ繁殖)。使這些小鼠對恒定飼養(yǎng)條件(即恒溫24±1℃、濕度60±10％和12小時的亮/暗周期)適應(yīng)1周，然后進行實驗。供給動物購自Purina的固體飼料，隨意進水。適應(yīng)期后，將溶于玉米油中的試驗物質(zhì)經(jīng)皮下注射一天一次(共4天)。用乙醇配制在此所用試驗物質(zhì)雙酚A和UDCA的貯備液。將溶于0.2ml玉米油中的2mg雙酚A單獨或與UDCA聯(lián)合給予小鼠(每天一次)。UDCA的施用劑量是0.2或2.0mg，以玉米油作為溶劑對照。2.測量子宮重量每天一次觀察實驗動物的臨床毒性表現(xiàn)，在完成實驗后摘取子宮并稱重。3.統(tǒng)計分析結(jié)果用均值±標準偏差表示。進行AVOVA，以評價給藥組的平均值分布。若在ANOVA中有顯著性，則在p＜0.05和p＜0.01水平上進行學(xué)生t-檢驗。4.結(jié)果表12.UDCA對雙酚A所致子宮重量變化的影響

**與對照組(給予玉米油)有顯著差異，p＜0.01##與施用2mg/天劑量雙酚A組有顯著差異，p＜0.01如以上表12所示，每天施用一次2 mg雙酚A可使子宮重量增加約2倍。與0.2mg UDCA聯(lián)用沒有產(chǎn)生任何顯著變化，但是聯(lián)用2.0mg的UDCA將施用雙酚A所增加的子宮重量降低至施用玉米油的對照水平。
總之，證實了外源性雌激素--雙酚A在體內(nèi)具有與雌激素相同的生理活性，其代表性的例證是引起子宮增生(可導(dǎo)致子宮重量增加)。UDCA對這種效應(yīng)表現(xiàn)出了拮抗活性。
制劑1顆粒劑
UDCA10wt％乳糖65wt％淀粉19wt％羥丙纖維素 5wt％硬脂酸鎂1wt％混合上述成分，將整個混合物用30wt％乙醇為粘合劑捏和。然后，采用常規(guī)方法對捏和后的混合物制粒，然后干燥。按1g/包的量將顆粒劑填充到包裝中，得到各含100mg干燥UDCA的顆粒劑。
制劑2片劑采用常規(guī)方法，將上述制劑1中配制的顆粒劑壓制成片劑(500mg/片)，得到每片包含50mg UDCA的片劑。
制劑3糖漿劑UDCA0.6wt％蔗糖50wt％羧甲基纖維素鈉 0.05wt％羥苯甲酸甲酯0.08wt％香料0.1wt％純凈水 適量將羧甲基纖維素鈉加到49.17重量份的純凈水中，然后溶脹。將蔗糖和羥苯甲酸甲酯加到所得混合物中，并加溫溶解。向所得溶液中加入UDCA，然后攪拌得均勻溶液。加入香料混合。將所得溶液調(diào)至最終體積100m1，然后過濾。按33ml/瓶的量將濾液填入瓶中，得到各含200mg UDCA的糖漿。
制劑4注射劑UDCA2wt％
乙醇2wt％聚乙二醇0.5wt％氯化鈉 適量加入2M氫氧化鈉溶液，將上述成分調(diào)至pH6.5。然后，加入注射用蒸餾水，使總體積為100ml。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，UDCA具有優(yōu)異的抑制環(huán)境激素所致毒性的效力，因而可用來預(yù)防或治療因與環(huán)境激素接觸所致的任何疾病，例如體重下降、生長抑制、低血糖、免疫抑制、生殖毒性、免疫毒性等。
此外，UDCA可通過對具有雌激素樣活性的外源物質(zhì)的拮抗活性而抑制內(nèi)分泌破壞劑。
權(quán)利要求
1.用于降低或消除環(huán)境激素毒性的制劑，其中含有熊去氧膽酸或其藥用鹽或酯作為活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中環(huán)境激素是選自多氯化苯化合物和二噁英的鹵化芳烴，或選自DDT、鄰苯二甲酸酯、烷基酚和雙酚A的內(nèi)分泌破壞劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的制劑，其中環(huán)境激素是二噁英或雙酚A。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項的制劑，用于預(yù)防或治療體重下降、生長抑制、血糖調(diào)節(jié)降低、癌癥、免疫應(yīng)答降低或生殖力降低。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項的制劑，還含有藥用載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的制劑，適于經(jīng)口服或注射施用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的制劑，適于經(jīng)肌肉或靜脈內(nèi)注射。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于降低或消除環(huán)境激素毒性的制劑，其中含有熊去氧膽酸或其藥用鹽或酯作為解毒劑。
文檔編號C07J9/00GK1468103SQ01816891
公開日2004年1月14日 申請日期2001年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月4日
發(fā)明者延濟德, 白慶業(yè), 鄭奎奕, 樸勝國 申請人:株式會社大熊制藥