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一種共價(jià)交聯(lián)法固定纖維素酶酶解人參皂苷?Rb1制備人參皂苷?Rd的方法與流程

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一種共價(jià)交聯(lián)法固定纖維素酶酶解人參皂苷?Rb1制備人參皂苷?Rd的方法與流程

本發(fā)明屬于酶的固定化技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種共價(jià)交聯(lián)法固定纖維素酶及其酶解人參皂苷-Rb1制備人參皂苷-Rd的方法。



背景技術(shù):

人參皂苷-Rd屬于四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型中的原人參二醇型皂苷。研究表明,原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷,在體內(nèi)的主代謝途徑均是通過脫糖反應(yīng)生成藥理活性更好的次級(jí)苷和苷元,腸道酶把原人參二醇型人參皂苷-Rb1代謝為-Rd。因此,人參皂苷-Rd是原人參二醇型皂苷的代謝后被腸道吸收利用的重要形式之一。

人參皂苷-Rd具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)等作用。目前,制備次級(jí)皂苷主要有酸水解法、堿水解法、Smith降解和酶解法。前三種方法效率高,但是副產(chǎn)物較多,專一性差,環(huán)境污染嚴(yán)重,不易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn),而酶解法具有工藝條件溫和、選擇性高及無污染等特點(diǎn)。然而,游離酶(如游離蝸牛酶、橙皮苷酶等),存在穩(wěn)定性差、不可回收及生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。酶固定化后再進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí),酶具有易回收、易分離、反復(fù)多次使用等優(yōu)點(diǎn),可以彌補(bǔ)天然酶在催化反應(yīng)中的應(yīng)用缺陷。

酶的固定化技術(shù),是現(xiàn)代生物技術(shù)及其工業(yè)化環(huán)節(jié)中的一個(gè)核心技術(shù),固定化酶在工業(yè)、醫(yī)學(xué)、分析與分離技術(shù)以及化學(xué)合成等領(lǐng)域有著廣泛的用途。依據(jù)酶的性質(zhì)和用途,可通過包埋法、交聯(lián)法、吸附法和共價(jià)結(jié)合法來實(shí)現(xiàn)酶的固定化(羅貴民,酶工程,北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003,55-67.);張琪等人比較瓊脂法、包埋法、海藻酸鈉戊二醛包埋交聯(lián)法、交聯(lián)包埋法固定β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化人參皂苷-Rg1為人參皂苷-F1的轉(zhuǎn)化工藝(張琪,趙文倩,孟飛,等. 固定化β-葡萄糖苷酶制備人參皂苷F1的研究[J]. 中國抗生素雜志,2012,37(1):49-55.);于兆慧等采用交聯(lián)-包埋法利用多孔二氧化硅吸附固定化蝸牛酶,海藻酸制備成微球,考察固定化蝸牛酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備CK的工藝條件(于兆慧,劉其媛,崔莉,等. 微球固定化蝸牛酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備人參稀有皂苷Compound K研究[J]. 中草藥,2014,45(21):3092-3097.);專利CN101012473A采用海藻酸鈉固定化技術(shù)包埋轉(zhuǎn)化菌及酶,和聚乙烯氧化物為載體共價(jià)結(jié)合法以三醇型人參皂苷-Rg1制備生產(chǎn)人參皂苷-F1;專利CN101481725A采用殼聚糖吸附及戊二醛交聯(lián)轉(zhuǎn)化人參皂苷-Rb1制備-F2;專利CN 1899336A采用海藻酸鈉包埋β-葡聚糖苷酶、纖維素酶、纖維二糖酶轉(zhuǎn)化三七莖葉皂苷為CK。然而,上述的現(xiàn)有技術(shù)中僅應(yīng)用包埋法和交聯(lián)法,酶存在結(jié)合力弱,易失活且接觸表面積小的缺點(diǎn)。

綜上所述,研究一種新型的、能夠提高酶活性的酶固化技術(shù),顯得尤為重要。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題,本發(fā)明提供一種共價(jià)交聯(lián)法固定纖維素酶酶解人參皂苷-Rb1制備人參皂苷-Rd的方法。采用共價(jià)交聯(lián)法,確定纖維素酶的最佳固定工藝,然后以固定化酶轉(zhuǎn)化西洋參二醇組皂苷,得到較高產(chǎn)率的人參皂苷-Rd。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供共價(jià)交聯(lián)法固定纖維素酶酶解人參皂苷-Rb1制備人參皂苷-Rd的方法,包括以下步驟。

步驟1、卡拉膠的胺化:取適量的濃度為10-40 mg/ml的卡拉膠水溶液,溫度為65℃的條件下,攪拌,得卡拉膠混懸液;取4℃的濃度為2% KCl水溶液(重量比),置于燒杯中,放在磁力攪拌器上攪拌,并吸取卡拉膠混懸液緩慢滴入其中,形成透明半球狀凝膠珠,靜置,制成卡拉膠凝膠珠;稱取適量的卡拉膠凝膠珠,加入濃度為0.05-3%的聚乙烯亞胺溶液,滴加堿溶液,調(diào)節(jié)pH為7.0-12.0,胺化時(shí)間為0.25-4 h,放在滾軸混合器上混合,蒸餾水洗,洗凈殘余聚乙烯亞胺,備用。

步驟2、交聯(lián)反應(yīng):取適量的步驟1得到的胺化的卡拉膠凝膠珠,加入濃度為0.1-4%戊二醛溶液,交聯(lián)時(shí)間為0.5-5.0 h,放在滾軸混合器上混合,用蒸餾水清洗,洗凈殘余戊二醛,加入纖維素酶溶液,放在滾軸混合器上混合,完成酶的固定化,即得固定纖維素酶,并測(cè)定固定化酶的活力。

步驟3、西洋參二醇組皂苷的制備:西洋參干燥根及根莖粗粉用水煎提取,水液減壓濃縮,然后上D 101大孔吸附樹脂分離,吸附12 h,水洗后用乙醇溶液洗脫,收集洗脫液,減壓蒸除溶劑,制得西洋參二醇組皂苷干燥粉末。

步驟4、酶解反應(yīng):取適量的步驟3制備的西洋參二醇組皂苷粉末,配置成濃度為0.5-5 mg/ml的西洋參二醇組皂苷溶液,加入步驟2得到的固定纖維素酶,用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH值為3.0-9.0,反應(yīng)溫度為30-70℃,反應(yīng)時(shí)間為12-24 h;利用高效液相法測(cè)定人參皂苷-Rb1轉(zhuǎn)化情況。

所述的卡拉膠混懸液的滴距為6 cm,滴速為70-80滴/min。

所述的堿溶液為氫氧化鈉溶液。

所述的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH值優(yōu)選為5.0。

本發(fā)明的有益效果。

本發(fā)明中,提供了一種新的采用固定化酶轉(zhuǎn)化人參皂苷-Rb1制備人參皂苷-Rd的方法,直接以西洋參二醇組皂苷為底物,所應(yīng)用的酶為固定化纖維素酶。固定化酶由卡拉膠經(jīng)聚乙烯亞胺胺化,戊二醛交聯(lián),酶的固定化三步制得;其中,聚乙烯亞胺胺化時(shí),卡拉膠控制滴加速度70-80滴/min??ɡz凝膠珠上表面的羥基與聚乙烯亞胺(PEI)上的氨基結(jié)合,使得凝膠珠表面孔隙變小,阻止游離酶在凝膠珠內(nèi)部的進(jìn)出;戊二醛交聯(lián)時(shí),胺化后的卡拉膠凝膠珠與戊二醛上的一個(gè)醛基交聯(lián)完成活化,戊二醛的另一個(gè)醛基與酶蛋白上的氨基發(fā)生Schiff反應(yīng),使酶牢固地結(jié)合在凝膠珠載體上。經(jīng)聚乙烯亞胺及戊二醛活化后的凝膠珠質(zhì)地緊密牢固,不易被破壞,且酶與凝膠珠通過共價(jià)鍵結(jié)合,結(jié)合緊密,不易斷裂。

本發(fā)明提供的酶固定化方法,易于與反應(yīng)體系分離;具有一定的機(jī)械強(qiáng)度,便于酶催化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)化操作;重復(fù)利用9次后,固定化酶對(duì)人參皂苷-Rb1的轉(zhuǎn)化相對(duì)活力依然保持45%以上,極大節(jié)約生產(chǎn)成本。與單純使用游離酶相比,本方法具有可回收利用、選擇性高和無污染等優(yōu)點(diǎn),與其他酶固定化方法相比,本方法具有結(jié)合牢固、操作穩(wěn)定、可多次反復(fù)利用等諸多優(yōu)點(diǎn),更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2西洋參二醇組皂苷HPLC圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1。

纖維素酶的共價(jià)固定工藝。

稱取0.25g卡拉膠(采購于北京索萊寶公司)加入到25ml蒸餾水中,溫度為65℃條件下,用磁力攪拌器攪拌1h,轉(zhuǎn)速為300rpm,得卡拉膠混懸液;取4℃的2%的KCl溶液50ml置于燒杯中,放在磁力攪拌器上攪拌,轉(zhuǎn)速為300rpm,并用5ml注射器吸取卡拉膠混懸液,緩慢滴入其中(滴入過程中固定滴距為6 cm,滴速為80滴/min),瞬時(shí)形成透明半球狀凝膠珠,并在2%KCl溶液中放置3h,制成濃度為1%卡拉膠凝膠珠;取1g卡拉膠凝膠珠,加入10ml濃度為1%聚乙烯亞胺溶液,滴加10%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為10,放在滾軸混合器上混合胺化1h,轉(zhuǎn)速為50rpm,蒸餾水洗3遍,洗凈殘余聚乙烯亞胺;再加入到的10 ml 0.5%戊二醛中,放在滾軸混合器上混合進(jìn)行交聯(lián)2h,轉(zhuǎn)速為50rpm,蒸餾水洗3遍,洗凈殘余戊二醛;加入4ml濃度為2.5U/ml纖維素酶溶液(10U)(采購于北京索萊寶公司,批號(hào)923C021),放在滾軸混合器上混合16h,轉(zhuǎn)速為50rpm,完成酶的固定化。

實(shí)施例2。

纖維素酶的共價(jià)固定工藝。

稱取0.5g卡拉膠加入到25ml蒸餾水中,溫度為65℃條件下,用磁力攪拌器攪拌,轉(zhuǎn)速為300rpm,得卡拉膠混懸液;取4℃的2% 的KCl溶液50ml置于燒杯中,放在磁力攪拌器上攪拌,轉(zhuǎn)速為300rpm,并用5ml注射器吸取卡拉膠混懸液,緩慢滴入其中(滴入過程中固定滴距為6 cm,滴速為80滴/min),瞬時(shí)形成透明半球狀凝膠珠,并在2%KCl溶液中放置3h,制成濃度為1%卡拉膠凝膠珠;取1 g卡拉膠凝膠珠,加入10 ml濃度為0.5%聚乙烯亞胺溶液,滴加10%的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值為8,放在滾軸混合器上混合胺化3h,蒸餾水洗3遍,洗凈殘余聚乙烯亞胺;再加入到10 ml 3%戊二醛中,放在滾軸混合器上混合進(jìn)行交聯(lián)2h,轉(zhuǎn)速為50rpm,蒸餾水洗3遍,洗凈殘余戊二醛;加入4ml(10U)濃度為2.5U/ml纖維素酶溶液,放在滾軸混合器上混合16h,轉(zhuǎn)速為50rpm,完成酶的固定化。

對(duì)實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的固化纖維素酶進(jìn)行固定化酶酶活力測(cè)定方法:分別取0.5 ml不同濃度的10、20、40、80、160、320μmol/L的對(duì)硝基苯酚溶液,50℃水浴加熱15 min,加入2 mol/LNa2CO3溶液1 ml,停止反應(yīng),冷卻至室溫。采用紫外分光光度計(jì)讀取400 nm處的吸光度值,見表1;以對(duì)硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),制作對(duì)硝基苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。分別稱取實(shí)施例1和實(shí)施例2固定化纖維素酶0.1g,分別加入10mM醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制的pNPG(對(duì)硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷)0.5 ml,50℃水浴加熱15 min,加入2 mol/LNa2CO3溶液1 ml,停止反應(yīng),冷卻至室溫。采用紫外分光光度計(jì),讀取400 nm處的吸光度值,以對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中對(duì)硝基苯酚的濃度,根據(jù)其濃度得出固定化酶酶活力。酶活力單位的定義是:1 g固定化酶在1 min內(nèi)催化pNPG產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚所消耗的酶量定義為一個(gè)酶活單位(1 U)。采用上述固定化酶酶活力測(cè)定方法,測(cè)得實(shí)施例1的吸光度值為0.478,固定化酶酶活力單位為0.03 U;測(cè)得實(shí)施例2的吸光度值為0.594,固定化酶酶活力單位為0.04 U。

表1 不同濃度對(duì)硝基苯酚吸光度值。

實(shí)施例3

固定化酶轉(zhuǎn)化西洋參二醇組皂苷中人參皂苷-Rb1。

一、西洋參二醇組皂苷樣品制備。

西洋參干燥根及根莖粗粉用水煎提取,濾去殘?jiān)?,水液減壓濃縮至西洋參投料量的濃縮液,然后上D 101大孔吸附樹脂分離,大孔吸附樹脂用量為1.5倍濃縮液,于55℃吸附12 h,先用水洗至無甜味,然后用30%和65%乙醇溶液依次解吸,收集65%的洗脫液,減壓旋干溶劑,進(jìn)一步減壓干燥,制得西洋參二醇組皂苷干燥粉末。

西洋參二醇組皂苷中人參皂苷-Rb1和-Rd的含量測(cè)定。

采用高效液相色譜法測(cè)定西洋參二醇組皂苷中人參皂苷-Rb1和-Rd的含量。具體方法如下。

1.提取物檢測(cè)樣品的制備:稱取干燥西洋參二醇組皂苷粉末,加甲醇,配制成濃度為2 mg/ml的溶液,0.45μm微孔濾膜濾過,備用。

2.對(duì)照品溶液配制:人參皂苷-Rb1(批號(hào):110704-201424)和-Rd (111818-201302)購于中國食品藥品檢定研究院,以甲醇配成濃度為1.15 mg/ml和0.50 mg/ml樣品。

3.高效液相色譜法條件如下。

Agilent1260液相條件:安捷倫ZORBAX SB-C18(250 mm ×4.6 mm,5μm)柱,二極管陣列檢測(cè)器(DAD),以乙腈(A)-磷酸水溶液(B 0.1%)為流動(dòng)相梯度洗脫,流速1.0 mL?min-1,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)203nm,洗脫條件見表2。液相色譜圖,見圖2。

表2 人參皂苷梯度洗脫條件。

人參皂苷-Rb1和-Rd的含量計(jì)算,均采用外標(biāo)法計(jì)算,Cx=Cr*Ax/Ar(Cx為樣品濃度,Cr為對(duì)照品濃度,Ax為樣品峰面積,Ar為對(duì)照峰面積),然后根據(jù)溶液濃度折算實(shí)際含量。

經(jīng)上述高效液相法測(cè)得主要人參皂苷-Rb1和-Rd的含量分別為350mg/g、70mg/g,主要計(jì)算數(shù)據(jù)見表3。

表3西洋參二醇組皂苷中人參皂苷-Rb1及-Rd的峰面積及含量。

二、固定化酶轉(zhuǎn)化西洋參二醇組皂苷中人參皂苷-Rb1。

(1)酶解反應(yīng):取配制的濃度為2 mg/ml的西洋參二醇組皂苷溶液5 ml,加到0.5g實(shí)施例1制備的固定化纖維素酶中,用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為4.0,在50℃恒溫振蕩器下反應(yīng)24h,得到轉(zhuǎn)化液;取轉(zhuǎn)化液1 ml,加入等體積正丁醇,萃取3次,揮干溶劑,用甲醇溶解,轉(zhuǎn)移到1 ml量瓶中,加甲醇至刻度,用0.45μm微孔濾膜濾過,待分析。按照上述高校液相色譜法檢測(cè),分析結(jié)果為:人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化率為95.8%,人參皂苷-Rd的增加率為87.1%。

(2)酶解反應(yīng):取配制的濃度為2 mg/ml的西洋參二醇組皂苷溶液5 ml,加到0.5g實(shí)施例2制備的固定化纖維素酶中,用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為5.0,在60℃恒溫振蕩器下反應(yīng)24 h,得到轉(zhuǎn)化液;取轉(zhuǎn)化液1 ml,加入等體積正丁醇,萃取3次,揮干溶劑,用甲醇溶解,轉(zhuǎn)移到1 ml量瓶中,加甲醇至刻度,用0.45μm微孔濾膜濾過,待分析。按照上述高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果:人參皂苷-Rb1轉(zhuǎn)化率為97.5%,人參皂苷-Rd的增加率89.9%。

(3)酶解反應(yīng)耐用性實(shí)驗(yàn):取配制的濃度為2 mg/ml的西洋參二醇組皂苷溶液5 ml,加到0.5g實(shí)施例2制備的固定化纖維素酶中,用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為5.0,在60℃恒溫振蕩器下反應(yīng)24h,取出,分離固定化纖維素酶和反應(yīng)液,醋酸-醋酸鈉緩沖溶液洗3遍,洗凈殘余反應(yīng)液,繼續(xù)采用西洋參二醇組皂苷溶液進(jìn)行第2次酶解反應(yīng),如此重復(fù)操作上述過程,共進(jìn)行9次。每次酶解反應(yīng)結(jié)束后,取轉(zhuǎn)化液1 ml,加入等體積正丁醇,萃取3次,揮干溶劑,用甲醇溶解,轉(zhuǎn)移到1 ml量瓶中,加甲醇至刻度,用0.45μm微孔濾膜濾過,待分析。按照上述高效液相色譜法對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行檢測(cè)分析。轉(zhuǎn)化9次之后,固定化酶對(duì)人參皂苷-Rb1的轉(zhuǎn)化相對(duì)活力依然保持在45%以上(人參皂苷-Rb1轉(zhuǎn)化率%=(C空白-C轉(zhuǎn)化后)/C空白%),以第一次反應(yīng)測(cè)得的轉(zhuǎn)化率為1,其他則為第一次轉(zhuǎn)化率的相對(duì)值),具體數(shù)據(jù)見表4。證明酶與載體間的吸附作用較穩(wěn)定,一直保持在穩(wěn)定的水平,固定化酶可以連續(xù)轉(zhuǎn)化人參皂苷-Rb1為-Rd,具有較高重復(fù)耐用性,用于工業(yè)化生產(chǎn)可以節(jié)約成本。

表4酶解反應(yīng)耐用性實(shí)驗(yàn)人參皂苷-Rb1的相對(duì)轉(zhuǎn)化率。

本發(fā)明提供的纖維素酶的新固定化方法,并采用固定化的纖維素酶轉(zhuǎn)化西洋參二醇組皂苷中Rb1為-Rd,方法重復(fù)性好,固定化酶可反復(fù)利用,適合工業(yè)化生產(chǎn),為人參皂苷-Rd的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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