專利名稱：具有共價結(jié)合酶的cm傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及電化學(xué)傳感器，它的制備方法以及利用該電化學(xué)傳感器確定流 體介質(zhì)中分析物的方法。
背景技術(shù)：
生化分析檢測系統(tǒng)是臨床相關(guān)分析方法的重要部分。這主要關(guān)心的是能夠 借助于酶直接或間接確定的分析物的檢測。生物傳感器，也就是配有生物組分 的測量系統(tǒng)，已經(jīng)被證明特別適合于分析物的測量，其允許對分析物進行連續(xù) 或間斷地重復(fù)測量并能運用于體外(ex vivo)及體內(nèi)(invivo)。體外生物傳感 器典型地用于流通池中，而體內(nèi)生物傳感器優(yōu)選植入皮下脂肪組織。人們就此 對經(jīng)皮植入和全植入(foil implant)進行區(qū)分，前者只在短時期引入組織并直接 和定位于皮膚上的測量設(shè)備接觸，后者利用外科手術(shù)連同觀懂設(shè)備一起插入組 織。
電化學(xué)生物傳感器允許通過兩個或更多電極對分析物進行測量，其中至少 一個電極表現(xiàn)為工作電極，需要被檢測的分析物在其上被轉(zhuǎn)換。含有酶作為生 物學(xué)組分的電化學(xué)生物傳感器將所述酶容納在工作電極上或工作電極內(nèi)，在這 種情況下，例如可以將分析物作為酶的底物，并且可以通過該酶使其發(fā)生物理 化學(xué)的改變(例如，氧化)。氧化還原介懶每分析物轉(zhuǎn)化期間釋放的電子遷移到 工作電極的導(dǎo)電組分上，并且由電子流動所產(chǎn)生的電測量信號與所測定分析物 的濃度相關(guān)。
天然產(chǎn)生的氧化還原對和合成的氧化還原對都考慮作為氧化還原介體。例 如那些Feldman等[Diabetes Technology & Therapeutics 5 (2003), 769-779]所描述
的合成的氧化還原介體，不太適合體內(nèi)應(yīng)用。這是因為如下事實當(dāng)生物傳感 器弓l入身體的時候，合成的氧化還原介體理論上來說總能弓胞身體的免疫反應(yīng)。
然而，至少必須考慮這些物質(zhì)的毒性，并且如果必要，對其進行檢査，因為氧 化還原介體必須一直能夠自由地擴散通過電極結(jié)構(gòu)，通過該方式它們也可以從 電極逃逸出并進入周圍的有機體。這點與體外應(yīng)用無關(guān)，如果確保不會因為分 析物的潛在回流而使其迎入身體的話。
因此，采用天然產(chǎn)生的氧化還原介體的電化學(xué)傳 #別適用于體內(nèi)應(yīng)用。 敦過氧化氫氧化還原對被證明在這點上有特殊的優(yōu)勢，因為最初成分(氧)一 直存在。在氧氣存在的情況下通過氧化酶而在分析物的酶轉(zhuǎn)化中產(chǎn)生的過氧化 氫被在電活性生物傳 的工作電極上重新氧化，于是通過釋放電子產(chǎn)生電信 號并且氧化還原介體也轉(zhuǎn)化回其氧化形式。這種酶反應(yīng)的動力學(xué)遵循所謂的乒
乓機制[Leskovac等，The International Journal of Biochemistry and Cell Biology 37 (2005), 731-750〗。
但是，在需要氧作為共底物的酶的幫助下對分析物進行檢觀附的一個重要 問題在于，在組織中會發(fā)生氧氣濃度與起始濃度相比暫時減小，這會影響傳統(tǒng) 的體內(nèi)生物學(xué)傳感器的功能。圖1顯示了在各種氧氣濃度下，利用葡萄糖氧化 酶把葡萄糖酶解氧化為葡萄糖酸-5-內(nèi)酯的反應(yīng)動力學(xué)。該圖表明一般而言在給 定氧氣濃度下所轉(zhuǎn)化的分析物的量隨著葡萄糖濃度的增加而減少，由此，盡管 葡萄糖氧化酶對葡萄糖有高結(jié)合常數(shù)(大約250mM)，在生理相關(guān)范圍中該曲 線處于非線性范圍內(nèi)。此外，圖1表示，在較高的分析物濃度下，直到氧濃度大約為ImM時才得 到近似線性曲線。但是，體內(nèi)水環(huán)壤特別是在皮下脂肪組織胞間液的溶解氧濃 度，是相當(dāng)?shù)氐?。然而，?7°C，水中氧濃度大約為0.21mM，皮下脂肪組織 的預(yù)期氧濃度僅為O.lmM或更少，這就是各種情況下所述曲線在生理性葡萄糖 濃度發(fā)生彎曲的原因。這種偏離線性路線導(dǎo)致了體內(nèi)生物傳感器中非期望的瞬 時功能特征。
因此，組織中氧氣的有限可獲得性是需要氧氣作為共底物的許多酶生物傳感 器中電化學(xué)傳感器的功能曲線的線性度柳艮制因素。功能曲線的線性度在原則 上能夠利用帶有蓋膜的工作電極來提高，所述蓋膜抑制分析物的擴散比抑制共 底物的擴散更強。其中，圖3尤其表示了帶有由促進氧氣擴散比皿葡萄糖擴
散強得多的聚亞安酯組成的蓋膜的酶生物傳感器的功能曲線(用正方形表示的 測量值)。這表明，通別頓合適的蓋膜，傳感器的測量信號育,基本保持線性 直至葡萄糖濃度約lOmM。在更高濃度下，曲線變得更為彎曲。
然而，電化學(xué)傳感器中蒯莫的運用與某些問題相關(guān)。因而，用來檢測不同分 析物的電化學(xué)傳感器通常也必須包含不同的蓋膜以便提供底物和共底物的不同 擴散。同時，其必須保證蓋膜在體內(nèi)應(yīng)用時具有高度生物相容性，這牽涉到相 當(dāng)量的技術(shù)要求并最終導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加。
為了降低電化學(xué)生物傳感器的工作電極相對于參考電極的極化電壓并且由 此減少干擾物質(zhì)對工作電極上測量信號的影響， 一些電化學(xué)生物傳感器額外利 用了促進電子從氧化還原介體到工作電極的導(dǎo)電部分上轉(zhuǎn)移的電催化劑。這種
電催化劑的例子就是酞菁鈷(cobalt phthalocyanine)，其催化過氧化氫氧化為氧 氣[Crouch等，Biosensors and Bioelectronics 21 (2005), 712-718〗。這個過程中，酞
菁鈷絡(luò)合物的鈷(n)陽離子最先被過氧化氫還原為鈷(i )，然后fflii在陽極 釋放電子轉(zhuǎn)化為原來的二價狀態(tài)。
另外來自文獻的電催化劑例子是軟錳礦形式的二氧化錳(manganese
dioxide) [Cui等，Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 1 (2005).
130-135; Luo等,Biosensors and Bioelectronics 19 (2004), 1295-1300]。雖然在二氧 化錳上過氧化氫的催化氧化機制尚未被詳細(xì)解釋，但是與沒有二氧化錳的工作 電極相比，以二氧化錳為電催化齊啲工作電極的電勢降低了數(shù)個勵mV。因此， 顯著減小了干擾物質(zhì)例如抗壞血鵬艦素對測量信號的影響。
禾,電催化齊啲另一個原因是由過量過氧化氫引起的酶的破壞。假如在工作 電極皿種物質(zhì)不充分ffi3Ii也懶牟，酶可能發(fā)生變性。為了解決這個問題，文 獻建議合自過氧化氫有抵抗力的酶，例如ffl)l突變[US 2004/0137547Al]。然 而，對酶進行這種修飾而不對酶的其他特性例如酶的特異性產(chǎn)生不利影響是非 常困難的。因此，由于電催化劑大大提高了過氧化氫的氧化效率并且按照這種 方式防止電極基質(zhì)或其環(huán)境中形成過量的過氧化物，在產(chǎn)生過氧化氫的轉(zhuǎn)化中 使用電催化劑似乎比上述方法要好得多。
在分析物的酶確定中與過氧化氫形成相關(guān)的附加問題是過氧化氫能作為分
析物或共底物氧氣的抑制劑。這種競爭性抑制依賴于過氧化氫的濃度并限制分
析物的轉(zhuǎn)化。最終促iS31氧化氫向氧的重新氧化的電催化劑的使用對于分析物
的轉(zhuǎn)化也具有積極的作用。
在設(shè)計電化學(xué)生物傳感器時需要考慮許多因素。因此，生物傳感器必須在工
作電極中有足夠量的酶以防止測量過程中酶的限制[Abd等,Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 7 (1999), 93-100]。此外，在用生物傳感器進行測量的旨 過程中，酶分子應(yīng)當(dāng)定位于工作電極的結(jié)構(gòu)中，也就是說所述酶不應(yīng)當(dāng)在測量 介質(zhì)到達的電極區(qū)域上發(fā)生分離或移位[Doretti等，Biosensors and Bioelectronics 11 (1996), 363-373]。最后，該酶也應(yīng)該在生物傳感器的工作電極里保持穩(wěn)定。 導(dǎo)致電化學(xué)生物傳感器中酶的熱失活的因素以及保持其穩(wěn)定的方法已經(jīng)被研究 了多次[Sarath Babu等,Biosensors and Bioelectronics 19 (2004), 1337-1341]。生物 傳感器制造后的酶P絲 最終導(dǎo)致了傳感器的有限的壽命。
為了考慮以上因素，嘗試M:將酶固定在工作電極的電極基質(zhì)上從而來穩(wěn)定 酶，但這需要大力尋找合適的固定方法來將酶固定在電化學(xué)生物傳感器上。吸 附和化學(xué)固定一樣都被用于實際應(yīng)用中。然而，由于各種原因吸附固定是不利 的。 一方面，它需要工作電極被不能被酶透過的膜包住，這增加了制造生物傳 感器的勞動并對膜有非常多的要求。另一方面，在吸附固定的情況下無法防止
—M在電極中的酶分子的位移，其導(dǎo)致傳感器功能的改變。US 5,368,707公開了 包含具有吸附結(jié)合酶的工作電極并適用于觀淀液體中微摩爾量的鉛離子的生物 傳感器。為了制造該生物傳感器，由導(dǎo)電材料構(gòu)成的工作電極的表面上覆有膠 體金，合適的酶吸附在 粒上，其進而能與氧化還原介體共價結(jié)合。
配有為支撐酶吸附固定的蓋膜的電極的另一缺點(這在體內(nèi)應(yīng)用時尤其不能 輕視)在于必須對蓋膜的完整性進行非侵入性檢查。由于即使是膜最小的瑕疵 也足以導(dǎo)致酶從電極流到環(huán)境中，因而必須進行大量的檢查，特別是在體內(nèi)生 物傳感器的情況下。因此考慮到吸附固定的缺點，從而存在通過電極基質(zhì)中的 或與之鍵合的共價健而將酶固定在電化學(xué)生物傳感器上的實際需求。
JP 10-68651描述了用來測定分析物例如葡萄糖的包含帶有共價結(jié)合酶的電 極的傳感器。為了達到這個目的，涂敷有作為導(dǎo)電物質(zhì)的Sn02的電極表面經(jīng)強
9
酸#^舌，用偶聯(lián)試劑功能化并最后與,觸。
EP0 247 850A1公開了用于分析物的電流檢測的生物傳繊。這些傳繊包 括帶有固定或吸附在導(dǎo)電支柱表面上的固定酶的電極，其中該支柱由樹脂結(jié)合 (resin-bound)碳或石墨顆粒的鍍鉑多孑L層構(gòu)成或包含這樣的層。為了這個目的， 先準(zhǔn)備好用鍍鉑石墨和聚合物粘合劑構(gòu)成的電極，隨后與,觸。在這種情況 下，該酶ffiil吸附到電極表面或利用合適試劑偶聯(lián)到聚合物粘合劑上而固定。
帶有包含固定或吸附在導(dǎo)電的、多孔電極材料上面或內(nèi)部的酶的電極的電流 生物傳感器在EP0 603 154A2中也有描述。為了制造酶電極，第四周期的過渡 金屬的氧化物或氫氧化物，例如二氧化錳，作為催化劑和石墨以及不導(dǎo)電的聚 和物粘合劑一起被制成糊，并且所述糊干后得到的多孔電極材料在第二步與酶 接觸。酶能夠利用戊二醛通過交聯(lián)而被固定在多孔電極材料上或多孔電極材料 內(nèi)。
JP10-68651 ， EP0 247 850 Al和EP0 603 154 A2中所述的電化學(xué)生物傳感 器的主要缺點是酶先被固定在預(yù)制的無酶電極上。結(jié)果，有個問題就是酶不能 通過可控制方法被偶聯(lián)到電極成分上。因此，當(dāng)戊二醛被用來作為交聯(lián)劑時， 酶不僅僅以不可控制的方式結(jié)合于電極材料的任何活性成分，也相互交聯(lián)。此 外，該過程用使用過的試劑污染了電極，由此，必須再次徹底地清潔電極，特 別是在用于體內(nèi)生物傳感器之前，這增加了生產(chǎn)的復(fù)雜性以及由此所導(dǎo)致的成 本。
US4,938,860公幵了了合適的用于電化學(xué)傳感器的電極，其包含涂覆鉑的薄 膜狀陽極以及粘合在陽極上的酶層。優(yōu)選通過利用氨基硅烷和合適的交聯(lián)劑例 如戊二醛將酶層結(jié)合于鍍鄉(xiāng)日極上。然而，US4,938,860所描述電極的缺點為由 于陽極的薄膜狀結(jié)構(gòu)只有很小的表面用于分析物的酶轉(zhuǎn)化，并且用作催化劑的 鉑是相對昂貴的材料。

發(fā)明內(nèi)容
因而，本發(fā)明的目的在于提供用于確定分析物的酶電化學(xué)傳感器，其中至少 部分地消除了現(xiàn)有技術(shù)的缺點。特別地，該傳感器應(yīng)當(dāng)確保酶的特異性且持久
的固定，具有高效性并由此實現(xiàn)產(chǎn)生高信號產(chǎn)率。此外，應(yīng)該能夠以簡單和低 成本的方式制造所述傳感器。
根據(jù)本發(fā)明利用確定流體介質(zhì)中分析物的電化學(xué)傳感器實現(xiàn)了所述目標(biāo)，所 述傳感器至少包括一個工作電極和至少一個參考電極，其中至少工作電極在電 極基質(zhì)中包含電催化劑顆粒，且其中適合于確定分析物的酶共價結(jié)合于電催化 劑顆粒。
金屬氧化物^it用作至少存在于工作電極的電極基質(zhì)中的電催化劑。金屬氧 化物可以是任何能夠催化用于確定分析物的氧化還原介體的轉(zhuǎn)化的金屬氧化 物。在更{雌的實施方案中，所采用的電催化劑魏自如下物質(zhì)所構(gòu)成的組的
金屬氧化物Mn02， FeOOH， Fe304, Fe203 ， &203和^05，而癒02是特別 優(yōu)選的。此外，合意的是該電催化劑對氧有高親和力。
根據(jù)發(fā)明的電催化齊似顆粒形式提供，其中顆粒的尺寸可以因各自的需要而 改變。在本發(fā)明范圍中，90%的電催化齊噘茅爐常具有0.1拜到20網(wǎng)的直徑， 直徑為0.5拜到5拜被證明是特別 的。無論如何，電催化齊噘粒的大小應(yīng) 當(dāng)總是比工作電極的層厚度要小，工作電極的層厚度范圍為1,到50拜，優(yōu) 選的范圍是從5拜到20,。
il^粒尺寸來控制電催化劑有效表面的能力是至關(guān)重要的，特別是對于其 通過酶的功能化而言。由此，電催化劑較高有效的表面同樣增加了它的酶負(fù)載 量，并由此導(dǎo)致了較高的通常由工作電極里的電催化劑的數(shù)量、孔隙率以及面 積而確定的酶活性，酶活性以單7^/毫克電催化劑計。在本申請的使用范圍內(nèi)， 詞語"單元"代表的是標(biāo)準(zhǔn)狀況下每射中轉(zhuǎn)化l,ol底物需要的酶的量。用于本 發(fā)明目的的涂敷酶的電催化劑顆粒通常具有的酶活性大約為0.01U/mg至伏約 10U/mg，而酶活性大約0.1U/mg到大約10U/mg被證明是特別有利的。
根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器中，酶選擇性地與電催化劑顆粒共價結(jié)合，最優(yōu) 選的酶是與電極基質(zhì)的其它組分沒有共價結(jié)合。酶與電催化劑的共價結(jié)合，具 有氧化還原介體到電極催化活性部位的擴散途徑肖^多保持很小的優(yōu)點，這樣使 工作電極具有高效率，從而電化學(xué)傳 產(chǎn)生高的信號產(chǎn)率。
此外，電催化劑再生后，氧化還原介體也吸附結(jié)合在電催化劑上，作為這樣
的結(jié)果，例如在敦過氧化氫系統(tǒng)中的情況下，在電催化劑表面區(qū)域產(chǎn)生局部的 高氧活性，其朝著周圍測量介質(zhì)的方向減小。另一方面，酶共價結(jié)合到電催化 劑上導(dǎo)致了在酶上的再生的氧化還原介體的局部高活性，^M過所產(chǎn)生的與分 析物濃度相關(guān)的觀懂信號的較高統(tǒng)性和穩(wěn)定性來反映，例如圖3 (用三角表示的 測量值)所示。在這種情況下，即使環(huán)境中氧化還原介體的濃度瞬間降低，例 如由于組織的血液循環(huán)受限引起的，也不會導(dǎo)致測量信號的瞬間改變。
最后，因為在典型的測量條件下(生理電解濃度，生理PH值，體溫)可以 排除齢子的脫離，因此酶共價偶聯(lián)到電催化劑上保證了功能的穩(wěn)定性。由此， 根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器在一段長時間內(nèi)保持操作并且實際上不會漂移地進 行操作。
為了將酶共價結(jié)合到電催化劑顆粒上，本發(fā)明在優(yōu)選實施方案中設(shè)想電催 化齊噘粒具有功能化的表面，并且特別是具有用與酶結(jié)合的氨基基團南和羧基 基團功能化的表面。該表面例如通過用合適的試齊臉覆所述電催化齊噘粒以在 電催化劑顆粒表面形成官能團進行功能化，通過這種方式所述酶育^I多與電催化 顆粒共價結(jié)合。
在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的涂覆試劑是這樣的物質(zhì):其一方面M:例如電催化劑
的羥基與電催化劑共價結(jié)合，而在另一方面，其包含至少一個可用于與酶共價 結(jié)合的官能團。這意味著，涂覆試劑至少是雙官能的，也就是說，包含至少兩 個官能團。被用來與電催化齊哄價結(jié)合以及與酶共價結(jié)合的涂覆試齊啲官能團 可以是一樣的也可以是不一樣的，但是 是不一樣的。伏選的涂覆試劑是硅 烷，它攜帶有至少一個適合的官能團，酶通過蓋官能團共價結(jié)合到涂覆試劑上。 電催化齊噘粒表面更^^用氨基硅烷官能化，所述氨基硅烷結(jié)合到電催化 劑顆粒的表面上形成硅一氧鍵，而且同時為酶共價結(jié)合到電催化劑顆粒表面提
供了自由氨基基團。合適的氨基硿烷包括例如3-氨丙基三甲氧基硅烷和3-氨丙 基三乙氧基硅烷，3-氨丙基三乙氧基麟尤其fM。
可替換地，電催化劑顆粒的表面可以用羧基硅烷官能化，羧基硅烷結(jié)合到 電催化劑顆粒的表面形成硅-氧健，并且任選地在水解后為酶共價結(jié)合到電催化 劑顆粒提供自由的羧基基團。就此而言，可商業(yè)購買的稱為Geniosif GF20
(Wacker Company)的3-(三乙氧基甲硅烷基)-丙基琥珀酸酐被證明是特別合 適的硅烷。
所述酶可以通過直接或者交聯(lián)劑共價結(jié)合到電催化劑顆粒的官能化表面。 在優(yōu)選實施方案中，所述酶是直接結(jié)合到電催化齊噘粒的官能化表面上的。所 述酶可以以任何方式偶聯(lián)到電催化劑顆粒的官能化表面上，并且育的多包括在電 催化劑顆粒的官能化表面上的^和酶的官能團在先活化。例如，官能團可以通 過合適的活化試劑與官能化電催化劑或者酶進行反應(yīng)而被活化。優(yōu)選的活化試 劑包括碳二亞胺，例如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 二異丙基碳二亞胺或者1-乙基-3-(3-二甲氨基丙萄碳二亞胺(EDC)，以及碳二亞胺和琥珀酰亞胺的組合。 用于本發(fā)明目的的特別適合的活化試劑，包括l-乙基-3-(3-二甲氨基丙萄碳二亞 胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺的組合。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述酶通過交聯(lián)劑結(jié)合到電催化劑顆粒的官能化 表面上，所述交聯(lián)劑具有能夠與電催化齊噘粒官能化表面上的官能團以及酶的 官能團產(chǎn)生共價反應(yīng)的活性基團。存在特別優(yōu)選的活性基團，其肖^I多使酶和電 催化劑顆粒表面上的官能團發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。任何能夠滿足上述官能的試劑都可 以被考慮作為交聯(lián)劑，例如多官能醛，特別是二醛，例如戊二醛、苯醌、溴化 氰、肼類、琥珀酰亞胺類、2，4,6-三氯-1， 3， 5-三嗪或者它們的組合。4腿琥珀 酰亞胺，更優(yōu)選二琥珀酰亞胺(disuccinimide)，最優(yōu)選辛二酸二琥珀酰亞氨酯 (disuccinimidyl suberate) pSS)作為交聯(lián)劑。
通過將共價涂覆有酶的電催化劑顆粒與電極基質(zhì)的其它成分例如導(dǎo)電電極 材料混合，隨后將混合物干燥，可以得到工作電極的電極基質(zhì)，所述電極基質(zhì) 通常含有重量比大約為1%到大約50%的電催化劑， 的量是重量比大約5% 到大約20%。
在另一優(yōu)選實施方案中，電極基質(zhì)以多孔的形式存在。所述電極基質(zhì)的孔 隙率尤其能夠通過電催化劑和其它組分的顆粒尺寸進行調(diào)節(jié)，其中高孔隙率與 電極的更大有效表面相關(guān)，并因此與對測量介質(zhì)的更大接觸面積相關(guān)。肖^多例 如以糊的形式提供用于生產(chǎn)電極基質(zhì)的導(dǎo)電材料，包含導(dǎo)電固體顆粒，例如 石墨敏和富勒烯，與不導(dǎo)電的粘合劑，特別是不導(dǎo)電的聚和物粘合劑例如全氟
化聚合物如Nafion，的組合。
固定在電催化劑顆粒上的酶f，是氧化酶，特別是醇氧化酶(1丄3.13)、芳 醇氧化酶(EC 1丄3.7X兒茶,化酶(EC 1丄3.14)、膽固醇氧化酶(EC 1丄3.6)、 膽,化酶(l丄3.n)、半乳糖氧化酶(EC 1丄3.9)、葡萄糖氧化酶(EC 1丄3.4)、 甘油一3—磷酸酯氧化酶(EC 1丄3.2D、己糖氧化酶(EC 1丄3.5X蘋果酸鹽(酯) 氧化酶(EC 1.1.3.3)、吡喃糖氧化酶(EC 1.1.3.10)、吡眵醇4-氧化酶(EC 1丄3.12) 或者硫胺素氧化酶(EC1丄3.23)。所述酶特別優(yōu)選是葡萄糖氧化酶。
根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的參考電極用來調(diào)整工作電極的極化電位并且 能由適合于本發(fā)明目的的任何材料組成。ttiMOT傲氯化銀電極作為參考電極。
此外，本發(fā)明的電化學(xué)傳感器能夠除了所述至少一個工作電極和所述至少一 個參考電極以外還包含有至少一個反電極，所述反電極優(yōu)選是貴金屬電極形式 特別是金電極形式。貴金屬電極形式的反電極iM涂敷有適合的導(dǎo)電材料，例 如包含有導(dǎo)電性固體顆粒的糊，特別是碳糊。
根據(jù)本發(fā)明，電化學(xué)傳感器優(yōu)選包含兩個部分。能夠接觸到含有分析物的 流體介質(zhì)的第一個部分包括電極，即工作電極、參考電極和任選的反電極。這 個部分優(yōu)選具有生物相容涂層。所述生物相皿層允許分析物穿M入電極基 質(zhì)，但應(yīng)當(dāng)阻擋電極組分漏到周圍的介質(zhì)中。考慮到由于酶共價結(jié)合到電催化 劑所以所述酶不會從工作電極或者電化學(xué)傳感器漏出的事實，在很多應(yīng)用中生 物相容涂層并不是絕對必須的。從而，當(dāng)生物相，層不是到酶的障礙的時候， 根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器也能夠被特別應(yīng)用到體內(nèi)生物傳感器中。相反地， 能夠據(jù)此來挑選生物相，層，其提供與周圍組織或者血液或者血清最佳的相 互作用。
生物相容涂層能以各種方式產(chǎn)生。優(yōu)選的方法是采用施加于電化學(xué)傳感器 的預(yù)制膜。這種膜能夠通過多種技術(shù)固定在傳感器上，而膠粘或者激光焊接被 認(rèn)為是優(yōu)選的。就此而論，預(yù)制的透析膜被證明是有利的，并且由聚醚砜制成 的透析膜，例如那些在EP1710011 Al中所披露的可以通過商標(biāo)Ultrason 6020(BASF Company)商業(yè)購買得到的是特別優(yōu)選的。
可替換地，生物相容涂層能夠通過將合適的聚合物溶液施加到電化學(xué)傳感
器上并隨后對其進行"B喿而被原位生成。將聚合物施加到生物傳感器上優(yōu)選是 通過噴霧、浸涂或者分散該聚合物的稀釋液來實現(xiàn)，但并不僅僅局限于這些方 法。優(yōu)選使用有機溶劑作為溶劑，特別是沸點30(TC的有機溶劑，例如乙醇，
該溶劑含有大約從0.1%重量到約30%重量，，約0.5%到約15%重量的聚合
物。適合該目的的聚合物特別包括具有兩性離子結(jié)構(gòu)和模擬細(xì)胞表面的聚合物，
例如2-甲基丙烯酰氧基乙基一磷酰基膽堿-共-甲基丙烯酸正丁酯 (MPC-co-BMA)。所獲得的生物相繊層通常具有大約l拜到大約100拜的厚 度，雌是大約3,到大約25,的厚度。
電化學(xué)傳感器的第二部分存在于不能接觸到流體測量介質(zhì)的區(qū)域，并且優(yōu): 選包含用于記錄測量值的裝置。在另一優(yōu)選實施方案中，第二部分額外地包含 電壓源，例如電池或者蓄電池，和從無線數(shù)據(jù)傳輸體中以及顯示觀糧值的顯 示器趙隨的體?？商鎿Q地，第二部分能夠包含與電化學(xué)傳感器分離的用于測 量值記錄裝置的接口。
根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器優(yōu)選設(shè)計成用于多種測量，也就是說，傳感器
能夠?qū)Υ_定分析物進行重復(fù)測量。這在如下應(yīng)用中尤其是合意的其中，恒
定地，也即連續(xù)的或間斷地，控制分析物的存在南和量是在較長時間里例如一 天或者更長，特別是一周或者更長的發(fā)生，例如在透析病人的情況下。在優(yōu)選 實施方案中，本發(fā)明因此提供的電化學(xué)傳感器被設(shè)計作為含有分析物的流體流 過的流通池。可替換地，然而，本發(fā)明的電化學(xué)傳感器也能夠被設(shè)計成為全部 或者部分可植入的裝置，例如可以被植入到脂肪組織或者血管中。
根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器育^多被用來確定能夠來自任何來源的流體介質(zhì) 中的分析物。在優(yōu)選實施方案中，該電化學(xué)傳感器被用來確定體液中的分析物， 所述術(shù)夜包含但不限于全血、血漿、血清、淋巴液、膽汁、腦脊液、細(xì)胞外組 織液、尿液以及腺體分泌物，比如唾液或汗液，其中全血、血漿、血清以及細(xì)
胞外組織液被看作是特別雌的。分析所需的樣本量通常從大約0.01^1至伏約 IOOmJ，，是從大約0.1^d到大約2nl。
待定性魴和定量確定的分析物可以是任何育,氧化還原反應(yīng)的方式被測
定的生物或化學(xué)物質(zhì)。分析物^^從下歹,質(zhì)所組成的組中選擇蘋果酸、醇、
銨、抗壞血酸、膽固醇、半胱氨酸、葡萄糖、谷胱甘肽、甘油、尿素、3-羥基丁 酸酯、乳酸、5-核苷酸酶、肽、丙酮酸鹽(酯)、水楊酸鹽(酯)和甘油三酸脂。 在特別優(yōu)選的實施方案中，待用本發(fā)明所述電化學(xué)傳感器確定的分析物是葡萄糖。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明所述電化學(xué)傳感器的方法，包括步驟:
(a) 提供電催化劑顆粒，
(b) 用酶涂敷電催化劑顆粒，其中，所述酶共價結(jié)合到電催化劑顆粒上，
(c) 將從步驟(b)得到的共價涂敷了酶的電催化劑顆粒與導(dǎo)電電極材料
以及任選的另外的物質(zhì)相混合，
(d) 將步驟(c)中得到的混合物加工制作成電極，并且
(e)將步驟(d)中得到的電極與至少一個其它電極進行組合。 為了制備本發(fā)明所述的電化學(xué)傳感器，上面所定義的電催化劑顆粒優(yōu)選首 先和涂敷試劑反應(yīng)，該電催化齊噘粒表面通過這種方式被官能化。通過官能化 的電催化劑顆粒連續(xù)與交聯(lián)劑及酶反應(yīng)，從而獲得了共價涂敷有酶的電催化劑 顆粒，其能夠通過與上述的其它成分進行混合來加工形成電極基質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法實際上確實被證明是特別有利的，這是因為制造涂 敷酶的電催化齊脂巨夠和電極的制備分開執(zhí)行。而且，共價涂敷有酶的電催化劑 為電極糊的制備提供了所定義的起始材料，這種起始材料能在弓l入電極糊之前 謝B屯化，從而避免對完成的電極進行后續(xù)清洗。
在另一方面，本發(fā)明涉及觀啶流體介質(zhì)中分析物的方法，包括步驟
(a) 所述流體介質(zhì)與根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳 接觸，禾口
(b) 通過測fijlf述電化學(xué)傳麟產(chǎn)生的信號來確定流體介質(zhì)中分析物的存在敏和量。
為了確定分析物，電化學(xué)傳感器能以允許所述電化學(xué)傳感器與流體介質(zhì)接 觸的任何方式進行設(shè)計。由此，傳感器例如能被設(shè)計成允許含有分析物的介質(zhì) 從中流過的流通池。另一方面，該傳感器也能夠被設(shè)計成擴散傳感器，其中傳 感器和介質(zhì)的接觸通過擴散而發(fā)生。同樣地，該電化學(xué)傳感器能被設(shè)計成旨在 完全或者部分植入病人體內(nèi)的裝置，在這種情況下其或者植入到血管中或植入
組織中，特別是植入皮下脂肪組織中。
根據(jù)分析物的存在*和量由傳感器產(chǎn)生可測量信號。該信號優(yōu)選是電信號， 比如例如是電流、電壓、電阻等等，其通過適當(dāng)?shù)姆椒ū辉u估或者讀取。電化 學(xué)傳lt^，是電流傳感器。
將ffiil下面的附圖和實施例對本發(fā)明作進一步闡述。


圖1顯示當(dāng)使用葡萄糖氧化酶作為酶以及敦過氧化氫作為氧化還原反應(yīng)介
體時，葡萄糖轉(zhuǎn)化相對于葡萄糖濃度[mM]曲線圖，其作為氧濃度的函數(shù)。Km^ 和VH^^f^的是根據(jù)Michaelis-Menten動力學(xué)得出的葡萄糖的酶動力學(xué)常數(shù)。 圖2顯示了在對測試溶液中的葡萄糖濃度進行的7天測量過程中根據(jù)本發(fā) 明的電化學(xué)傳感器的觀糧到的信號[nA]相對于時間[秒]的曲線圖，其中葡萄糖濃 度從0到26mM之間周期性變化。沒有蓋膜的電極作為工作電極，所述電極含 有涂敷了葡萄糖氧化酶作為電催化齊啲二氧化錳，根據(jù)本申請實施例6制備得 到。
圖3顯示的是具有固定酶的兩個電化學(xué)傳感器的須糧信號[nA]相對于測試 溶液中葡萄糖濃度[mM]的關(guān)系圖。用三角形表示的測量值顯示了本發(fā)明所述的 電化學(xué)傳感器的功能曲線，其中葡萄糖氧化酶共價結(jié)合到工作電極的電催化劑 上并且沒有使用蓋膜。正方形所表示的測量值形成了相同尺寸的傳感器的功能 曲線，其中所述酶利用由聚氨酯組成的蓋膜固定在工作電極中并且不通過共價 結(jié)合方式與電催化劑相結(jié)合。
具體實施方式
實施例
實施例l:羧基官能化的二氧化錳的制備
1.6g二氧化錳(TechnipurCompany)在256ml甲苯中懸浮，將84gGeniosif GF20 (WackerCompany)力口到所得的懸液中里，在氮氣氛圍中、5(TC以及520 rpm下將反應(yīng)混合物攪拌24小時以制備羧基官能化的二氧化錳。在冷卻并沉淀
二氧化錳后，潷析出甲苯，將殘留物洗滌兩次，每次用250ml的甲苯，之后用 250ml的丙酮洗滌一次。在按照此方式獲得的官能化二氧化錳中添加250 ml水 并在室溫下攪拌24小時。接著，水被離心分離，殘留物置于CaCl2上5(TC真空 千燥，得到大約1.5mg的羧基官能化二氧化錳。
實施例2:將葡萄糖氧化酶耦連到羧基一官能化的二氧化錳上
500mg的l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、 400mg的N-羥 基琥珀酰亞胺和70mg的葡萄糖氧化酶加入到100mg的來自實施例1的干的、 羧基官能化的二氧化錳中，室溫下在水溶液里攪拌24小時。當(dāng)固鵬淀后，除 去上清液，用pH 7.4的磷酸鉀緩沖液洗滌所述固體四次。得到的固體在空氣中 千燥后，得到大約85mg的涂敷酶的電催化劑，其具有的酶活性為0.06U/mg。
實施例3:制備氮基官能化的二氧化錳
將8ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷(Sigma Company)加到經(jīng)充分?jǐn)嚢璧膽?浮液中，所述懸浮液是在加熱到6(TC的32ml甲苯中的200mg 二氧化錳 (Technipur Company),所述混合物在6(TC進一步攪拌16小時。當(dāng)固,淀后， 潷析出上清液，固微滌3次，每次用32ml甲苯。乘除的固i枯空氣中干燥， 從而得到大約182mg的氨基官能化的二氧化錳。
^!M^用戊二,乍為交聯(lián)齊鵬葡萄糖氧化酶偶聯(lián)至嵐基官肖巨化的二氧化錳上 由實施例3得到的千燥固體用32ml 50mMpH7.4的磷酸鉀緩沖液洗滌一次， 隨后置于16ml 50mMpH7.4的磷酸鉀緩沖液中。往該懸浮液中添加16ml的10% 的戊二醛溶液(Sigma Company)并同時攪拌。在25。C 1.5小時后終止該反應(yīng)。 沉淀的固體洗滌3次(每次用32ml 50mM pH7.4的磷酸鉀緩沖液)，懸浮到16ml 的相同緩沖液中并同時攪拌，并與0.5mg/ml葡萄糖氧化酶(Roche Company) 在50mM pH7.4磷,緩沖液中的16 ml溶液混合。將所述混合物在25。C攪拌3 小時。當(dāng)固體沉淀后，洗滌4次，每次用16ml的50mM的pH7.4的磷,緩沖 液洗。凍干后，得到大約200mg的酶活性為0.12U/mg的涂敷酶的電催化劑。^Mii:用辛二酸二琥珀酰亞胺作為交聯(lián)齊i將葡萄糖氧化酶偶聯(lián)至i嵐基官能化
的二氧化錳上
把在20m1 二氧雜環(huán)己烷中的0.02mg辛二酸二琥珀酰亞胺以及在2ml 0.1 m pH8.5的磷酸鉀緩沖液中的0.008mg葡萄糖氧化酶加入到從實施例3中得到的 20mg干的氨基官能化的二氧化錳中，并在室溫攪拌4小時。將所述固體離心后， 所述固佩滌2次，每次用5mJ 0.1MpH8.5的磷,緩沖液，隨后置于5ml 0.1M pH8.5的磷酸鉀緩沖液中。凍干后，得到大約18.8mg的酶活性為0.1U/mg的涂 敷酶的電催化劑。
實施例6:制備電流傳感器
為了制備具有三個電極(工作電極、參考電極和反電極)的允許用來測定 血液中或者皮下脂肪組織中的葡萄糖的電化學(xué)傳感器，在第一步驟中制備沒有 蓋膜的工作電極。為了這個目的，將根據(jù)實施例5的用葡萄糖氧化酶官能化的 二氧化錳與碳聚合物糊PE401 (Acheson Company)以及二甘醇單丁醚混合，用 分配技術(shù)將得到的混合物施加到由聚酯制成的傳繊條的金表面上，并在25°C 真空干燥。以此方式得到的工作電極與作為參考電極的傲氯化銀電極、作為反 電極的金電極結(jié)合。所述導(dǎo)電路徑是絕緣的。
實施例7:檢測電流傳感器的觀糧信號的穩(wěn)定性禾喊性
根據(jù)實施例6所得到的電化學(xué)傳 浸入到位于流通室中的葡萄糖溶液 里，檢測7天，期間葡萄糖溶液濃度在0到26mM之間持續(xù)變化。圖2和3顯 示了該測量結(jié)果。
權(quán)利要求
1. 用于確定流體介質(zhì)中分析物的電化學(xué)傳感器，包含至少一個工作電極和至少一個參考電極，其中，至少所述工作電極包含在電極基質(zhì)中的電催化劑顆粒，其特征在于適于確定所述分析物的酶被選擇性地共價結(jié)合在所述電催化劑顆粒上。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述電催化劑為金屬 氧化物，特別是從由Mn02、 FeOOH、 Fe304、 Fe203、 0203和￥205所組成的組 中選出來的金屬氧化物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述電催化劑為MnO^
4. 根據(jù)權(quán)禾頓求1-3中任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于90%的電催 化劑顆粒的直徑為0.1拜一20拜，特別為0.5拜一5拜。
5. 根據(jù)權(quán)利要求M中任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述電催化 劑顆粒具有的酶活性為大約0.01U/mg—約10U/mg，特別為約0.1U/mg—約 10U/mg。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述電催化劑 顆粒具有結(jié)合所述酶的官能化表面。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述電催化劑顆粒的 表面用氨基基團^/和羧基基團官能化。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的電化學(xué)傳繊，其特征在于所述電催化齊噘 粒的表面用氨基硅烷特別是用3-氨丙基三乙氧基硅烷官能化。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6或者7的電化學(xué)傳自，其特征在于電催化劑顆粒的表 面用羧基硅烷特別是3-(三乙氧基甲g基)丙基琥珀酸酐官能化。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述酶直接結(jié) 合至U所述電催化齊噘粒的所述官能化表面上。
11. 根據(jù)權(quán)利要求6到9任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述酶ffi31 交聯(lián)劑結(jié)合到所述電催化劑顆粒的所述官能化表面上。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述交聯(lián)劑是琥珀酰 亞胺并特別是辛二酸二琥珀酰亞胺。
13. 根據(jù)權(quán)禾腰求l-12任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述電極基質(zhì) 含有大約為lwtM—大約50wt%，特別是大約5wt。/。一大約20wt"y。的電催化劑。
14. 根據(jù)權(quán)禾腰求1-13任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述電極基質(zhì) 為多孔形式。
15. 根據(jù)權(quán)利要求l-14任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述電極基質(zhì) 另外包括導(dǎo)電電極材料。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-15任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述酶是氧化酶。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-16任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述酶是葡萄 糖氧化酶。
18. 根據(jù)權(quán)禾腰求1-17任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于其另外包括反 電極。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-18任--所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述反電極涂 敷有導(dǎo)電材料。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1-19任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于它包含至少 兩個部分，其中第一部分包括所述電極，提供有生物相容性涂層并且能夠與含 有所述分析物的所述流體介質(zhì)接觸，而其中第二部分處于不能到達所述流體介 質(zhì)的區(qū)域中。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的電化學(xué)傳自，其特征在于所述生物相容性涂層 是fflil把預(yù)制的膜施加在所述傳麟上形成。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的電化學(xué)傳lifl，其特征在于所述生物相容性涂層M:把聚合物溶液施加在所述傳感器上并隨后干燥形成的。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述聚合物是 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷翻旦堿-掩甲基丙烯酸正丁酯。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20-23任-所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于所述生物相 容性涂層的厚度為約lMm-約100,， j，約25miti。
25. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的電化學(xué)傳 ，其特征在于所述第二部分包括用于記錄測量值的裝置。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的電化學(xué)傳 ，其特征在于所述第二部分另外包 括電壓電源、和選自無線數(shù)據(jù)傳輸裝置和用于顯示測量值的顯示器的元件。
27. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的電化學(xué)傳lf^，其特征在于所述第二部分包括用 于記錄測量值的裝置的接口 ，所述記錄測量值的裝置與電化學(xué)傳感器分離。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1-27任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于該傳 被設(shè) 計為用于多次測量。
29. 根據(jù)權(quán)利要求l-28任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于該傳/i^被設(shè) 計成為可全部或部分植入的設(shè)備。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1-28任一所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于該傳 被設(shè) 計為流通池形式。
31. 根據(jù)權(quán)利要求1-30任一所述的電化學(xué)傳感器，其用于測定 中的分析 物，特別是在全血、血漿、血清或細(xì)胞外組織液中的分析物。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1-31任一所述的電化學(xué)傳感器，其用于確定從如下物質(zhì)所 構(gòu)成的組中選擇的分析物蘋果酸，醇，銨，抗壞血酸，膽固醇，半胱氨酸， 葡萄糖，谷胱甘肽，甘油，尿素，3-羥基丁酸酯，乳酸，5'-核苷酸酶，肽，丙 酮酸鹽，水楊酸鹽和甘油三酸脂，特別是葡萄糖。
33. 根據(jù)權(quán)利要求1-32任一所述的電化學(xué)傳感器的制造方法，包括步驟(a) 提供電催化劑顆粒，(b) 用酶涂敷電催化劑顆粒，其中，所述酶通過共價結(jié)合到所述電催化劑 顆粒上，(c) 把由步驟(b)得到的被 價涂敷的所述電催化齊噘粒與導(dǎo)電電極材 料以及任選的其它物質(zhì)進行混合，(d) 對由步驟(c)所得到的混合物進行加工以形成電極，以及(e) 把由步驟(d)所得到的電極與至少一個其它電極進行組合。
34. 根據(jù)禾又利要求33所述的方法，其特征在于在步驟(b)中，所述電催化 齊噘粒首先與涂敷試齊阪應(yīng)，隨后與交聯(lián)劑反應(yīng)，最后與酶反應(yīng)。
35.確定流體介質(zhì)中分析物的方法，其包括步驟(a) 4妙萬述流體介質(zhì)與權(quán)禾腰求1-32任一所述的電化學(xué)傳# 觸，以及(b) 通過測量由所述電化學(xué)傳感器產(chǎn)生的信號確定所述流體介質(zhì)中分析物 的存在敏和量。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有共價結(jié)合酶的CM傳感器，尤其涉及電化學(xué)傳感器、其制造方法以及利用該電化學(xué)傳感器確定流體介質(zhì)中的分析物的方法。所述電化學(xué)傳感器包含至少一個工作電極和至少一個參考電極，并且至少所述工作電極包含在電極基質(zhì)中的電催化劑顆粒，其特征在于適于確定所述分析物的酶被選擇性地共價結(jié)合在所述電催化劑顆粒上。
文檔編號G01N27/327GK101393159SQ20081021543
公開日2009年3月25日 申請日期2008年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月19日
發(fā)明者A·斯泰布, H·佩謝爾, M·漢塞克, R·米施勒, T·邁耶 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司