本發(fā)明屬于分析化學領(lǐng)域，涉及一種利用高效液相色譜法拆分R/S-氯卡色林的方法。

背景技術(shù)：

氯卡色林是一種新型減肥藥，于2012年6月27日被美國食品藥品管理局(FDA)批準上市。其英文名是Lorcaserin，化學名為8-氯-1-甲基-2,3,4,5-四氫-1H-3-苯并氮雜卓(8-chloro-1-methyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepin)，分子式為C11H15Cl2N·0.5H2O，相對分子質(zhì)量為195.69，結(jié)構(gòu)式為：

氯卡色林一種能起到調(diào)節(jié)食欲和減少食物攝取作用的高選擇性的5-羥色胺2C受體激動劑，通過5-HT2C受體的刺激來增加CNS血清素活性,激活POMC系統(tǒng),釋放黑皮質(zhì)激素來調(diào)節(jié)熱量平衡，從而影響下行途徑，促進分解代謝和合成代謝抑制，有效控制體重。該藥獲準用于成人體質(zhì)指數(shù)(BMI)≥27的肥胖或超重者，并且患者至少有一項與體重相關(guān)的疾病(如高血壓、2型糖尿病或高脂血癥)。

手性藥物是指藥物分子結(jié)構(gòu)中引入手性中心后，得到的一對互為實物與鏡像的對映異構(gòu)體。這些對映異構(gòu)體的理化性質(zhì)基本相似，僅僅是旋光性有所差別，分別被命名為R-型(右旋)或S-型(左旋)、外消旋。絕大多數(shù)的藥物由手性分子構(gòu)成，兩種手性分子可能具有明顯不同的生物活性。藥物分子必須與受體(起反應(yīng)的物質(zhì))分子幾何結(jié)構(gòu)匹配，才能起到應(yīng)有的藥效，多數(shù)情況下只有一種藥物對映體有顯著的藥理活性，而另一種對映體活性較低或沒有活性，甚至具有毒副效應(yīng)。

8-氯-1-甲基-2，3，4，5-四氫-1H-3-苯并氮雜卓分子為R/S外消旋體混合物，需進一步拆分為具有生物活性的R構(gòu)型氯卡色林。在合成氯卡色林的過程中，S構(gòu)型可能會由于去除不完全，從而影響藥物純度和質(zhì)量。對于氯卡色林合成過程中引入的S構(gòu)型，在原料藥中是需要進行質(zhì)量控制的。在手性藥物對映體分離研究中，高效液相色譜法已成為使用最廣泛和有效的方法之一。

由于綠卡色林分子小，其S構(gòu)型和R構(gòu)型在空間構(gòu)象上的區(qū)分度不大，因此一般的手性柱很難拆分，需要找到一種剛好和其手性構(gòu)型匹配一致的色譜固定相才能將其有效分離。目前為止還沒有相關(guān)文獻發(fā)表過綠卡色林手性分離的方法。

因此，實現(xiàn)氯卡色林對映體的有效分離，在氯卡色林原料藥質(zhì)量控制方面具有重要的現(xiàn)實意義。實驗中我們主要對氯卡色林對映體的有效拆分的方法進行了研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用高效液相色譜法拆分R/S-氯卡色林的方法。該方法能夠高效、靈敏地實現(xiàn)氯卡色林對映體的檢測和分離，從而保證氯卡色林R構(gòu)型的純度，可用于其終產(chǎn)品原料藥的質(zhì)量控制。

本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種拆分R/S-氯卡色林對映體的方法，該方法采用高效液相色譜法，以直鏈淀粉類手性柱為色譜柱，以正已烷、醇和堿性添加劑為正相流動相。

所述的方法，其中色譜柱為Chiralpak IF手性柱，以直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)共價鍵合在硅膠表面為手性固定相。

所述的方法，其中流動相中正已烷、醇和堿性添加劑的體積百分比為49.6-98.9％：1-50％：0.1-0.4％。

所述的方法，其中正相流動相中醇為乙醇或異丙醇，堿性添加劑為二乙胺。

所述的方法，其中色譜柱為Chiralpak IF手性柱(Daicel，250mm×4.6mm，5μm)，以直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)共價鍵合在硅膠表面為手性固定相，正相流動相中正已烷、乙醇和二乙胺的體積百分比為49.6-98.9％：1-50％：0.1-0.4％，流動相流速為0.4～1.0mL/min，紫外檢測，檢測波長為260-290nm，色譜柱柱溫為5～40℃，進樣量為10μL。

所述的方法，其中正相流動相中正已烷、乙醇和二乙胺的體積百分比為74.7％：25％：0.3％。

所述的方法，其中流動相流速為0.8mL/min。

所述的方法，其中色譜柱柱溫為35℃。

所述的方法，其中待測樣品采用甲醇溶液溶解，正己烷稀釋。

所述的方法，其中所用的高效液相色譜儀為：安捷倫1260高效液相色譜儀(Agilent LC 1260)。配置有G1311的1260Quat泵(G1311 1260Quat pump VL)、G1316A恒溫柱箱、G1329B自動液體進樣器進樣器(G1329B 1260ALS)、G4212B二極管陣列檢測器(G4212B 1260DAD)。

具體地說，該方法包括下列步驟：

(1)待測樣品預處理：取R-氯卡色林和氯卡色林消旋體各4mg，分別用1mL甲醇溶液溶解后，用正己烷稀釋10倍，配制成濃度為400μg/mL的溶液，再取0.4mLR-氯卡色林溶液和0.8mL氯卡色林消旋體溶液混合后得到樣品溶液，此時溶液中R-氯卡色林和S-氯卡色林的含量比為2:1，則R-氯卡色林和S-氯卡色林的色譜峰峰面積之比應(yīng)為2:1；

(2)利用高效液相色譜儀，以直鏈淀粉類手性柱為色譜柱，以正己烷、醇和堿性添加劑為正相流動相，其中所述的醇為乙醇或異丙醇，優(yōu)選乙醇；所述的堿性添加劑為二乙胺?？刂屏鲃酉嗔魉贋?.4～1.0mL/min，優(yōu)選0.8mL/min，檢測波長為260-290nm，優(yōu)選270nm，色譜柱柱溫箱溫度為5～40℃，優(yōu)選35℃，進樣量為10μL，將上述R/S-氯卡色林樣品溶液進行手性分離；

上述方法中，由正己烷、醇和堿性添加劑組成的正相流動相中，按體積百分比計算，即正己烷：醇：堿性添加劑為49.6-98.9％；1-50％；0.1-0.4％，合計100％。

上述方法中，所用的直鏈淀粉類手性柱為Chiralpak IF手性柱(Daicel，250mm×4.6mm，5μm)，以直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)共價鍵合在硅膠表面為手性固定相。

上述方法中，高效液相色譜儀的型號，無特別要求，本發(fā)明所用的高效液相色譜儀為：安捷倫1260高效液相色譜儀(Agilent LC1260)，采用其他高效液相色譜儀也可以。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的一種利用高效液相色譜法拆分R/S-氯卡色林的方法，使用Chiralpak IF手性色譜柱，并且使用正己烷、醇、堿性添加劑組成正相流動相，對R/S-氯卡色林分離度較好，達到完全的基線分離；采用的堿性添加劑二乙胺能夠有效的改善峰形，達到分好的分離效果，本發(fā)明解決了R/S-氯卡色林的檢測和分離問題，可用于氯卡色林原料藥的質(zhì)量控制。如果需要定量檢測可通過與標準品的HPLC圖對照即可算出。

附圖說明

圖1為實施例1時氯卡色林對映體HPLC圖，色譜條件為：色譜柱：Chiralpak IF手性柱(Daicel，250mm×4.6mm，5μm)；正己烷：乙醇：二乙胺＝74.7：25:0.3(v/v/v)；流速為0.8mL/min；檢測波長為270nm；色譜柱柱溫箱溫度為35℃；進樣量為10μL。

圖2A為實施例2時氯卡色林對映體HPLC圖，色譜條件為：色譜柱：Chiralpak IF手性柱(Daicel，250mm×4.6mm，5μm)；正己烷：乙醇：二乙胺＝74.7：25:0.3(v/v/v)；流速為0.8mL/min；檢測波長為270nm；色譜柱柱溫箱溫度為35℃；進樣量為10μL。

圖2B為實施例2時氯卡色林對映體HPLC圖，色譜條件除流速為0.6mL/min外與圖2A的條件相同。

圖2C為實施例2時氯卡色林對映體HPLC圖，色譜條件除流速為0.4mL/min外與圖2A的條件相同。

圖3為實施例3時氯卡色林對映體HPLC圖，色譜條件為：色譜柱：Chiralpak IF手性柱(Daicel，250mm×4.6mm，5μm)；正己烷：異丙醇：二乙胺＝84.7：15:0.3(v/v/v)；流速為0.8mL/min；檢測波長為270nm；色譜柱柱溫箱溫度為35℃；進樣量為10μL。

圖4為實施例3時氯卡色林對映體HPLC圖，色譜條件為：色譜柱：Chiralpak IF手性柱(Daicel，250mm×4.6mm，5μm)；正己烷：乙醇：二乙胺＝84.7：15:0.3(v/v/v)；流速為0.8mL/min；檢測波長為270nm；色譜柱柱溫箱溫度為35℃；進樣量為10μL。

圖5為采用OD-RH柱進行氯卡色林對映體分離的高效液相色譜圖。色譜條件：KPF₆(100mM)：CH₃OH＝60:40，流速為0.5mL，溫度為25℃，進樣為用乙腈配制的濃度為0.3mg/L的5μL的外消旋體。

圖6為采用OD-RH柱進行氯卡色林對映體分離的高效液相色譜圖。色譜條件：NH₄HCO₃(20mM，pH8.3)/ACN＝60/40，流速0.4ml/min，25℃，進樣為用乙腈配制的濃度為0.3mg/L的5uL的外消旋體。

圖7為采用OD-RH柱進行氯卡色林對映體分離的高效液相色譜圖。色譜條件：NH₄Ac(10mM，pH7.0)/ACN＝60/40，流速0.2ml/min，25℃，進樣為用乙腈配制的濃度為0.3mg/L的5μL的外消旋體。

圖8為采用ADH柱進行氯卡色林對映體分離的高效液相色譜圖。色譜條件：正己烷：異丙醇：二乙胺為80％:19.8％:0.2％。流速0.8mL/min，檢測波長為270nm，進樣為實施例4(1)中配制的旋光異構(gòu)體混合物，進樣量為10μL。

圖9為采用ASH柱進行氯卡色林對映體分離的高效液相色譜圖。色譜條件：正己烷：異丙醇：二乙胺為80％:19.8％:0.2％。流速0.8mL/min，檢測波長為270nm，進樣為實施例4(1)中配制的旋光異構(gòu)體混合物，進樣量為10μL。

圖10為采用ODH柱進行氯卡色林對映體分離的高效液相色譜圖。色譜條件：正己烷：異丙醇：二乙胺為80％:19.8％:0.2％。流速0.8mL/min，檢測波長為270nm，進樣為實施例4(1)中配制的旋光異構(gòu)體混合物，進樣量為10μL。

圖11為采用OJH柱進行氯卡色林對映體分離的高效液相色譜圖。色譜條件：正己烷：異丙醇：二乙胺為80％:19.8％:0.2％。流速0.8mL/min，檢測波長為270nm，進樣為實施例4(1)中配制的旋光異構(gòu)體混合物，進樣量為10μL。

圖12為采用IA-H柱進行氯卡色林對映體分離的高效液相色譜圖。色譜條件：正己烷：乙醇：二乙胺為80％:19.8％:0.2％。流速0.8mL/min，檢測波長為270nm，進樣為實施例4(1)中配制的旋光異構(gòu)體混合物，進樣量為10μL。

圖13為采用IB-H柱進行氯卡色林對映體分離的高效液相色譜圖。色譜條件：正己烷：乙醇：二乙胺為80％:19.8％:0.2％。流速0.8mL/min，檢測波長為270nm，進樣為實施例4(1)中配制的旋光異構(gòu)體混合物，進樣量為10μL。

圖14為采用IC-H柱進行氯卡色林對映體分離的高效液相色譜圖。色譜條件：正己烷：乙醇：二乙胺為80％:19.8％:0.2％。流速0.8mL/min，檢測波長為270nm，進樣為實施例4(1)中配制的旋光異構(gòu)體混合物，進樣量為10μL。

具體實施方式：

以下通過實施形式，對本發(fā)明涉及的氯卡色林對映體的分離檢測方法作進一步的詳細說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實施例中采用的儀器及試劑：

直鏈淀粉類手性柱采用250mm×4.6mm I.D.粒度5μm，Chiralpak IF柱(大賽璐藥物手性技術(shù)(上海)Daicel Chiral Technologies China,Shanghai)，其硅膠表面共價鍵合有直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)。

正己烷、異丙醇、乙醇均為色譜純試劑(TEDIA，美國天地高純?nèi)軇?。

二乙胺為分析純試劑(上海凌峰化學試劑有限公司)。

安捷倫1260高效液相色譜儀，配置有G1311的1260Quat泵、G1316A恒溫柱箱、G1329B自動液體進樣器進樣器、G4212B二極管陣列檢測器。

實施例1：二乙胺對分離效果的影響

(1)取R-氯卡色林和氯卡色林消旋體各4mg，分別用1mL甲醇溶液溶解后，用正己烷稀釋10倍，配制成濃度為400μg/mL的溶液，再取0.4mLR-氯卡色林溶液和0.8mL氯卡色林消旋體溶液混合后得到樣品溶液，此時溶液中R-氯卡色林和S-氯卡色林的含量比為2:1，則R-氯卡色林和S-氯卡色林的色譜峰峰面積之比應(yīng)為2:1；

(2)采用安捷倫1260高效液相色譜儀，以直鏈淀粉類手性柱為色譜柱，以正己烷、乙醇和二乙胺為正相流動相?？刂屏鲃酉嗔魉贋?.8mL/min，檢測波長為270nm，色譜柱柱溫箱溫度為35℃，進樣量為10μL，調(diào)節(jié)二乙胺在正相流動相中的比例，對上述R/S-氯卡色林樣品溶液進行手性分離；

調(diào)節(jié)二乙胺在正相流動相中的比例，考察二乙胺對分離效果的影響，分為以下幾組，按體積百分比計算，即正己烷：乙醇：二乙胺為75％：25％：0％，74.9％:25％:0.1％，74.8％:25％:0.2％，74.7％:25％:0.3％，74.6％:25％:0.4％。

所用的直鏈淀粉類手性柱為Chiralpak IF手性柱(Daicel，250mm×4.6mm，5μm)，以直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)共價鍵合在硅膠表面為手性固定相。

上述的色譜分離結(jié)果如下表：

表中t₁和對稱因子1分別為S-氯卡色林的保留時間和色譜峰對稱因子，t₂和對稱因子2分別為R-氯卡色林的保留時間和色譜峰對稱因子，Rs為分離度。

由上表的結(jié)構(gòu)可以看出，本實施例中二乙胺的添加量對色譜峰分離度和對稱因子均有影響，流動相中不含二乙胺時，30min內(nèi)未見出峰，加入少量二乙胺峰形能夠得到很大改善，當二乙胺含量從0.3％提高至0.4％，柱效及峰形沒有太大改善，結(jié)合分離度Rs，故最后所選取的二乙胺最優(yōu)添加量為0.3％。

當二乙胺的添加量為0.3％時，R/S-氯卡色林的拆分結(jié)果見附圖1，從圖1中可以看出，保留時間為7.69min的為S-氯卡色林，保留時間為9.28min的為R-氯卡色林，兩者的分離度Rs為6.36，此時，色譜峰形得到很大改善，兩色譜峰達到完全的基線分離。二乙胺主要通過兩個方面來減少拖尾，改善峰形，提高分離的選擇性，一方面是抑制胺基離子化，另一方面是屏蔽CSP的殘余硅烷醇基團。

實施例2：流動相流速對分離效果的影響

(1)取R-氯卡色林和氯卡色林消旋體各4mg，分別用1mL甲醇溶液溶解后，用正己烷稀釋10倍，配制成濃度為400μg/mL的溶液，再取0.4mL R-氯卡色林溶液和0.8mL氯卡色林消旋體溶液混合后得到樣品溶液，此時溶液中R-氯卡色林和S-氯卡色林的含量比為2:1，則R-氯卡色林和S-氯卡色林的色譜峰峰面積之比應(yīng)為2:1；

(2)采用安捷倫1260高效液相色譜儀，以直鏈淀粉類手性柱為色譜柱，以正己烷、乙醇和二乙胺為正相流動相，按體積百分比計算，即正己烷：乙醇：二乙胺為74.7％：25％：0.3％。檢測波長為270nm，色譜柱柱溫箱溫度為35℃，進樣量為10μL，調(diào)節(jié)流動相流速，對上述R/S-氯卡色林樣品溶液進行手性分離；

控制流動相流速，考察流動相流速對分離效果的影響，分為以下幾組，即流動相流速分別為0.4mL/min，0.6mL/min，0.8mL/min。

所用的直鏈淀粉類手性柱為Chiralpak IF手性柱(Daicel，250mm×4.6mm，5μm)，以直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)共價鍵合在硅膠表面為手性固定相。

上述的色譜分離結(jié)果如下表：

表中t₁為S-氯卡色林的保留時間，t₂為R-氯卡色林的保留時間，Rs為分離度

由上表的結(jié)果可以看出，當流速從0.8mL/min減小至0.4mL/min時，Rs只是稍有改變，并未有明顯變化。但若繼續(xù)降低流速，雖可進一步提高分離度，但分析時間也同時增加，峰形也會隨之變寬，故最后選取的最優(yōu)流速為0.8mL/min。此時，兩色譜峰分離度較高，出峰時間合適，成本更低。

當控制流速為0.4mL/min，0.6mL/min，0.8mL/min時，R/S-氯卡色林的拆分結(jié)果見附圖2A、圖2B、圖2C。圖2A的色譜圖為當流速為0.8mL/min時R/S-氯卡色林的拆分結(jié)果，圖2B的色譜圖為當流速為0.6mL/min時R/S-氯卡色林的拆分結(jié)果，圖2C的色譜圖為當流速為0.4mL/min時R/S-氯卡色林的拆分結(jié)果。

實施例3：正相流動相中醇的種類和比例對分離效果的影響

(1)取R-氯卡色林和氯卡色林消旋體各4mg，分別用1mL甲醇溶液溶解后，用正己烷稀釋10倍，配制成濃度為400μg/mL的溶液，再取0.4mLR-氯卡色林溶液和0.8mL氯卡色林消旋體溶液混合后得到樣品溶液，此時溶液中R-氯卡色林和S-氯卡色林的含量比為2:1，則R-氯卡色林和S-氯卡色林的色譜峰峰面積之比應(yīng)為2:1；

(2)采用安捷倫1260高效液相色譜儀，以直鏈淀粉類手性柱為色譜柱，以正己烷、醇和二乙胺為正相流動相，所述的醇為乙醇或異丙醇；控制流動相流速為0.8mL/min，檢測波長為270nm，色譜柱柱溫箱溫度為35℃，進樣量為10μL，調(diào)節(jié)正相流動相中醇的種類和比例，對上述R/S-氯卡色林樣品溶液進行手性分離；

為考慮正相流動相中醇的種類和比例對分離效果的影響，分為以下幾組：

上述方法中，正相流動相中的醇為乙醇時，調(diào)節(jié)乙醇的比例，按體積百分比計算，即正己烷：乙醇：二乙胺為94.7％:5％:0.3％，89.7％:10％:0.3％，84.7％:15％:0.3％，74.7％:25％:0.3％，64.7％:35％:0.3％，54.7％:45％:0.3％；

上述方法中，由正己烷、醇和堿性添加劑組成的正相流動相中，醇為異丙醇時，控制流動相比例，按體積百分比計算，即正己烷：異丙醇：二乙胺為94.7％:5％:0.3％，89.7％:10％:0.3％，84.7％:15％:0.3％，79.7％:20％:0.3％，69.7％:30％:0.3％；59.7％:40％:0.3％。

所用的直鏈淀粉類手性柱為Chiralpak IF手性柱(Daicel，250mm×4.6mm，5μm)，以直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)共價鍵合在硅膠表面為手性固定相。

上述的色譜分離結(jié)果如下表：

表中t₁為S-氯卡色林的保留時間，t₂為R-氯卡色林的保留時間，Rs為分離度

由上表的結(jié)果可以看出，當流動相組成為正己烷、乙醇和二乙胺時，流動相比例，按體積百分比計算，即正己烷：乙醇：二乙胺為94.7:5:0.3，84.7:15:0.3，74.7:25:0.3，64.7:35:0.3，54.7:45:0.3(v,v％)變化時，分離度Rs分別為9.00，7.41，6.51，5.80，5.41逐漸減??；同樣當流動相組成為正己烷、異丙醇和二乙胺時，按體積百分比計算，即正己烷：異丙醇：二乙胺為94.7:5:0.3，89.7:10:0.3，84.7:15:0.3，79.7:20:0.3，69.7:30:0.3；59.7:40:0.3(v,v％)時，分離度也逐漸減小。且當流動相中的醇分別采用乙醇和異丙醇時，兩者雖均可以使R/S-氯卡色林分離，但當流動相組成為正己烷、乙醇和二乙胺時的分離度明顯高于當流動相組成為正己烷、異丙醇和二乙胺時，故最后選取的最優(yōu)流動相組成為正己烷，乙醇和二乙胺。

當流動相組成為正己烷，異丙醇和二乙胺時，流動相比例，按體積百分比計算，即正己烷：異丙醇：二乙胺為84.7:15:0.3(v,v％)時，R/S-氯卡色林的拆分結(jié)果見附圖3，從圖3可以看出S-氯卡色林的保留時間為7.700min，R-氯卡色林的保留時間為8.378min。

當流動相組成為正己烷，乙醇和二乙胺時，流動相比例，按體積百分比計算，以正己烷：乙醇：二乙胺為84.7:15:0.3(v,v％)時的例子，R/S-氯卡色林的拆分結(jié)果見附圖4，從圖4可以看出S-氯卡色林的保留時間為9.090min，R-氯卡色林的保留時間為11.295min。

當乙醇采用25％時，保留時間較短，分離度較好。

實施例4：色譜柱柱溫對分離效果的影響

(1)取R-氯卡色林和氯卡色林消旋體各4mg，用1mL甲醇溶液溶解后，用正己烷稀釋10倍，配制成濃度為400μg/mL的溶液，再取0.4mLR-氯卡色林溶液和0.8mL氯卡色林消旋體溶液混合后得到樣品溶液，此時溶液中R-氯卡色林和S-氯卡色林的含量比為2:1，則R-氯卡色林和S-氯卡色林的色譜峰峰面積之比應(yīng)為2:1；

(2)采用安捷倫1260高效液相色譜儀，以直鏈淀粉類手性柱為色譜柱，以正己烷、乙醇和二乙胺為正相流動相，控制流動相比例，按體積百分比計算，即正己烷：乙醇：二乙胺為79.7％:25％:0.3％?？刂屏鲃酉嗔魉贋?.8mL/min，檢測波長為270nm，進樣量為10μL，調(diào)節(jié)色譜柱柱溫，將上述R/S-氯卡色林樣品溶液進行手性分離；

為考慮柱溫對分離效果的影響，色譜柱柱溫箱溫度分為5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃幾組。

所用的直鏈淀粉類手性柱為Chiralpak IF手性柱(Daicel，250mm×4.6mm，5μm)，以直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)共價鍵合在硅膠表面為手性固定相。

上述的色譜分離結(jié)果如下表：

表中t₁為S-氯卡色林的保留時間，t₂為R-氯卡色林的保留時間，Rs為分離度

由上表的結(jié)果可以看出，本實施例中不同色譜柱溫度對色譜峰分離度有影響，隨著色譜柱柱溫箱溫度的升高，分離度呈下降的趨勢，但都能滿足完全分離，考慮到分析效率，選擇的較短的保留時間，39℃雖然保留時間最短，但對柱子壽命有些影響，因此最后選擇的最優(yōu)色譜柱柱溫箱溫度為35℃。

最佳色譜柱柱溫箱溫度為25℃時，R/S-氯卡色林的拆分結(jié)果見附圖1，從圖1可以看出，保留時間為7.69min的為S-氯卡色林，保留時間為9.28min的為R-氯卡色林。

實施例5：不同色譜柱對分離效果的影響

采用不同色譜柱(均為Daicel公司產(chǎn)品)及色譜條件進行分離比較，結(jié)果見下表：

經(jīng)過發(fā)明人大量實驗，發(fā)現(xiàn)色譜柱采用Chiralpak IF手性柱才能將R/S-氯卡色林較好地分離。