本發(fā)明屬于致病微生物檢測技術領域，具體涉及一種常見致病細菌感染檢測試劑盒。

背景技術：

目前，細菌感染依然在住院和門診病人中占有較大的比例。雖然幾十年以來抗生素研究的進展較為迅速，但是由于不能精確地診斷出致病微生物的屬種，導致抗生素運用盲目，細菌性感染導致的死亡率和致殘率未有明顯地改善，尤其針對手術后感染、免疫功能低下、高齡、新生兒病人的細菌性感染，轉變?yōu)樾菘?、急性或慢性器官衰竭、甚至死亡的比例依然較高。因此，準確、快速診斷致病細菌而正確指導抗生素應用，對細菌性感染的治療仍然是非常迫切的。

現(xiàn)階段，臨床實驗室主要依據(jù)細菌的生化特點進行微生物診斷，缺點包括：(1)需要自各種臨床體液、組織中分離培養(yǎng)細菌，而較高比例的微生物因無法培養(yǎng)出而導致漏診；(2)由于這些生化診斷方法的代謝數(shù)據(jù)庫無法包括所有潛在感染的細菌數(shù)據(jù)而導致漏診某些細菌；(3)診斷依賴于細菌代謝特點，而基因表達代謝受環(huán)境影響較大導致誤診；(4)因為細菌種屬間生化特征相似而導致無法精確診斷細菌至種；(5)生化診斷需要1-3日或更長時間，導致延誤抗生素治療。因此需要研發(fā)出更快、更精確的細菌診斷方法。

16srrna是細菌高度保守的序列，是細菌化石，可以用于細菌屬種的鑒定，尤其是對于實驗室無法分離培養(yǎng)的微生物，運用聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,pcr)能直接擴增菌落pcr而進行測序診斷。其非常明顯的缺點是，菌種間存在很高比例的16rrna序列相似，導致很高比例的細菌無法鑒定到種或結果不確定。當然，此方法還是比生化鑒定方法較為精確。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術缺陷，提供一種常見致病細菌感染檢測試劑盒。

本發(fā)明的具體技術方案如下：

一種常見致病細菌感染檢測試劑盒，包括用以進行pcr擴增的四組檢測引物、雙蒸水、2xpcrmastermix、陽性對照基因組dna，其中，四組檢測引物分別為第一檢測引物組、第二檢測引物組、第三檢測引物組和第四檢測引物組，每組引物均包括一正向引物 和一反向引物，各引物的濃度為100μm，第一檢測引物由v6-891f和v6-1033r組成，分別如seqidno01和seqidno02所示；第二檢測引物由v3-334f和v3-537r組成，分別如seqidno03和seqidno04所示；第三檢測引物由v6-961f和v6-1085r組成，分別如seqidno05和seqidno06所示；第四檢測引物由v3-334f和v6-1085r組成，分別如seqidno03和seqidno06所示；2xpcrmastermix的配方為：taq0.1u/μl，dntp各0.4mm，100mmkcl，3mmmgcl2，20mmtris-hcl，ph8.3；陽性對照基因組dna的濃度為1ng/μl。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述pcr擴增的反應體系的體積為50μl，具體如下：

進一步優(yōu)選的，所述pcr擴增的程序如下：95℃預變性5min；95℃變性30s，退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明能快速診斷細菌性感染的常見致病細菌，為此類病人致病菌的快速診斷提供了可能，有助于降低此類感染的致死率和致殘率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例3中pcr產(chǎn)物1(142bp)、2(203bp)、3(124bp)電泳圖。退火溫度50.5℃。

圖2為本發(fā)明實施例3中pcr產(chǎn)物4(751bp)電泳圖。選擇退火溫度45℃完成了所有測試。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結合附圖對本發(fā)明的技術方案進行進一步的說明和描述。

實施例1細菌基因組dna的提取

參照qiaampdnabloodminikit(51304,qiagen,germany)，按照對于革蘭氏陽 性菌和難裂解細菌的步驟進行。

(1)在將病人體液離心7500rpm，10min離心得到細菌沉渣。

(2)利用180μl溶液(20mg/ml溶菌酶(l1667-1g,sigma,usa)，20mmtris·hcl,ph8.0，2mmedta，1.2％triton)懸浮細菌沉渣。在37℃培養(yǎng)至少30min。

(3)加20μl蛋白酶k，加200μlbufferal混勻，旋渦振蕩,56℃水浴鍋中孵育，30min，然后95℃15min。

(4)離心幾秒，加入200μl乙醇(96-100％)至樣品，振蕩15s混勻后轉移至1.5ml離心管，去掉蓋子內部液體。注意樣品、bufferal的加樣順序，乙醇要充分混勻。加乙醇后可能會有白色沉淀，要將沉淀全部加入柱內。

(5)將混合液以及沉淀小心轉移到qiaampmini離心柱內(柱子放置于2ml收集管內)，不要弄濕管壁和膜外緣，關閉蓋子離心8000rpm，1min，轉移離心柱至2ml離心管，丟棄含有濾液的管。

(6)小心打開離心柱，加入500μlbufferaw1，不要弄濕管壁，關閉蓋子，8000rpm，離心1min，將柱子換到干凈的2ml收集管，棄掉收集管和廢液。

(7)小心打開離心柱，加入500μlbufferaw2，不要弄濕管壁。關閉蓋子，14000rpm，離心3min，將離心柱轉移到新的2ml收集管，棄掉原來的管和廢液，全速離心1min，有助于消除bufferaw2滯留的機會。

(8)將離心管移至干凈的1.5ml微量離心管，棄掉管和廢液。小心打開離心柱，加入200μlbufferae或蒸餾水，室溫下放置1-5min，8000rpm下離心1min。

(9)收集洗脫液，加200μlbufferae第2次洗脫會提高產(chǎn)率15％。dna置于-20℃儲存。

實施例2常見致病菌的引物

首先總結了醫(yī)院內各種細菌性感染的常見致病菌，并針對16srrna報收系列設計引物，見表1：

表1.常見致病菌的引物

實施例3各pcr反應條件測試

(1)pcr擴增反應體系，見表2：

表2.pcr擴增反應體系

(2)pcr擴增反應程序，見表3：

表3.pcr擴增程序

(3)電泳驗證，見圖1、2。

(4)pcr產(chǎn)物純化

將pcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，利用磁珠法(gel_100長春市志昂生物科技有限公司)進行純化，步驟如下：

①切好的膠塊樣品(膠塊不宜大于0.3g)直接轉入96孔板，每孔加入500μl吸附液u，用硅膠密封墊封住96孔板后55℃溫浴15min，期間旋渦振蕩混勻3次，使膠塊徹底融化。

②將96孔板瞬時離心，揭開硅膠密封墊，每孔加入混勻的磁珠10μl，用硅膠密封墊封住96孔板，旋渦振蕩混勻，室溫吸附10min，期間振蕩混勻2～3次。

③吸附結束后旋渦振蕩混勻，將96孔板瞬時離心，然后置于磁力架上磁吸5min。揭開硅膠密封墊，連同磁力架一起將96孔板倒置，倒出所有液體，注意動作輕柔不要倒出磁珠，保持96孔板倒置的狀態(tài)置于吸水紙上，將吸水紙、96孔板連同磁力架一起倒置放入平板離心機，開始離心，離心機加速到600rpm后立即停止離心，取出96孔板。

④連同磁力架一起將96孔板翻轉至開口向上，并將96孔板從磁力架上取下。每孔 樣品中加入200μl洗滌液，用硅膠密封墊封住96孔板，充分旋渦振蕩混勻，將96孔板瞬時離心，放回磁力架磁吸2min，揭開硅膠密封墊，連同磁力架一起將96孔板倒置，倒出所有液體，注意動作輕柔不要倒出磁珠，保持96孔板倒置的狀態(tài)，將96孔板置于吸水紙上。按壓幾次，吸盡孔周圍液體。

⑤按照照步驟④的方法用80％乙醇洗滌一次。

⑥保持96孔板倒置狀態(tài)置于吸水紙上，將吸水紙、96孔板連同磁力架一起倒置放入平板離心機，開始離心，離心機加速到600rpm后立即停止離心，取出96孔板。連同磁力架一起將96孔板翻轉至開口向上，并將96孔板從磁力架上取下，室溫干燥2min。

⑦加入20-50μl于75℃預熱的去離子雙蒸餾水，旋渦振蕩混勻后室溫洗脫5min，期間振蕩混勻1次。

⑧旋渦振蕩混勻后將96孔板置于磁力架上磁吸1min，取出純化后的dna溶液。

實施例4測序反應條件

(1)測序反應條件

利用abibigdyeterminator試劑盒v3.1進行測序反應。以下為測序pcr熱循環(huán)條件(20μl反應體系，96孔板)，見表4，5。

表4.測序pcr熱循環(huán)體系

表5.測序pcr熱循環(huán)條件

(2)測序產(chǎn)物純化：酒精/edta/naac法

①每管加入2μl125mmedta到管底，每管加入2μl3mnaac到管底。

②每管加入50μl100％酒精，鋁箔封嚴密，震蕩混勻4次，室溫放置15min。

③1400-2000xg離心45min或者2000-3000xg離心30min，馬上倒置96孔板，離心至185xg停止離心(從離心機啟動到達到185xg停止離心總共1min時間)。

④每管加入70μl70％酒精，1650xg4℃離心15min；馬上倒置96孔板，離心至185xg停止離心(從離心機啟動到達到185xg停止離心總共1min時間)。

⑤重復第4步1次。

⑥室溫揮發(fā)凈酒精，加入10μlhi-diformamide溶解dna；或者鋁箔密封后于4℃保存。

⑦溶解后的樣品需要在95℃變性4min，迅速置冰中冷卻4min后。

⑧上機測序，利用abi3500基因分析儀進行測序。

實施例516srrna序列拼接和分析

利用chromas2.4.1查看、標記、去除測序起始和終末部分的不確定序列；利用lasergeneseqman軟件(dnastar,usa)提取并拼接序列。將序列利用blast軟件與ncbi數(shù)據(jù)庫進行比對，確定致病微生物的屬種。

實施例616srrna測序成功率驗證

將所有pcr產(chǎn)物外送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序驗證和比對,具體準確性為96％以上。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依 本發(fā)明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內。