本發(fā)明涉及克隆豆梨pcfro2（pyruscalleryanaferricreductionoxidase2）基因編碼區(qū)全序列的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：鐵作為一種重要的微量營(yíng)養(yǎng)元素，與果樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，在果樹(shù)光合、呼吸以及多種生理代謝中起重要作用。如果植物沒(méi)有主動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制獲得充足的鐵，在堿性或石灰性土壤條件下，大多數(shù)植物便會(huì)出現(xiàn)缺鐵癥狀，輕度缺鐵會(huì)引起新葉出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，光合效能降低，嚴(yán)重缺鐵則會(huì)導(dǎo)葉片焦黑枯死，光合作用停滯，生物產(chǎn)量大幅度減少。在應(yīng)對(duì)堿性或石灰性性土壤的過(guò)程中，不同的植物形成了多種適應(yīng)性的吸收鐵機(jī)制，其中豆梨吸收鐵的過(guò)程包括：（1）細(xì)胞膜上的h+-atpase分泌質(zhì)子酸化土壤，增加土壤中三價(jià)鐵離子的溶解性；（2）三價(jià)鐵離子螯合物還原酶把三價(jià)鐵離子轉(zhuǎn)變成二價(jià)鐵離子；（3）根系中的二價(jià)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白把二價(jià)鐵離子從土壤中轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。豆梨不能直接吸收利用三價(jià)鐵離子，必須先還原為二價(jià)鐵離子才能被吸收利用，三價(jià)鐵離子螯合物還原酶活性的提高是豆梨這類(lèi)植物最典型的特征。豆梨根系中分泌的三價(jià)鐵離子螯合物還原酶是由pcfro2基因編碼的，因此，pcfro2基因?qū)Χ估娓滴绽描F元素起著至關(guān)重要的作用。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚有一些關(guān)于梨黃葉病的研究，但絕大多數(shù)集中于黃葉病的矯治，如土壤施鐵，樹(shù)干注射，葉面噴施鐵等。至于對(duì)梨黃葉病缺鐵分子水平機(jī)理的探討尚少，尤其對(duì)編碼三價(jià)鐵離子螯合物還原酶基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)捷的獲取豆梨pcfro2基因的完整編碼區(qū)序列的方法，填補(bǔ)了此基因在該物種上克隆的空白，為深入挖掘豆梨pcfro2基因的功能及應(yīng)用尊定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種克隆豆梨pcfro2基因編碼區(qū)全序列的方法，包括下述步驟：a1、從豆梨嫩根根尖組織中提取總rna，隨后將總rna反轉(zhuǎn)錄成cdna；a2、以上述的cdna為模板，在起始密碼子上游區(qū)域設(shè)計(jì)正向引物f1，在終止密碼子下游區(qū)域設(shè)計(jì)反向引物f2，進(jìn)行pcr擴(kuò)增：正向引物f1：5'-ccgaaacgggaaggatta-3'；反向引物f2：5'-ccgaaacgggaaggatta-3'；通過(guò)梯度pcr得到擴(kuò)增pcfro2基因的優(yōu)化pcr反應(yīng)條件及反應(yīng)體系：反應(yīng)條件為：首先94℃預(yù)變性2min，然后40個(gè)循環(huán)（94℃，35s；57℃，30s；72℃，1min30s），最后72℃延伸7min；反應(yīng)體系采用20μl體系，其成分包含：10.0μl2×estaqmastermix，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，cdna模板1.0μl，ddh207.0μl；a3、pcr產(chǎn)物的回收和純化，采用膠純化回收試劑盒回收pcr產(chǎn)物，步驟按其說(shuō)明書(shū)操作；a4、克隆。上述方法中a1步驟具體操作如下：(1)總rna提取，根據(jù)tiangen的rnapreppureplantkit(目錄號(hào)：dp441)使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，優(yōu)化后操作步驟如下：a.取約150mg嫩根根尖組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μlsl和28μlβ-巰基乙醇，立即渦旋劇烈震蕩混勻，12,000rpm離心2min；b.將上清液轉(zhuǎn)移至過(guò)濾柱cs上，12,000rpm離心2min，小心吸取收集管中的上清液至新的rnase-free離心管中；c.緩慢加入180μl無(wú)水乙醇，混勻，將得到的溶液轉(zhuǎn)入吸附cr3中，12,000rpm離心15sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；d.向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm離心15sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；e.取10μldnasei儲(chǔ)存液放入新的rnase-free離心管中，加入70μlrdd溶液，輕柔混勻后加入吸附柱cr3中央，室溫放置15min；f.向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm離心15sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；g.向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，12,000rpm離心15sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中，重復(fù)一次；h.12,000rpm離心2min，將吸附柱cr3放入一個(gè)新的rnase-free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加40μlrnase-freeddh2o，室溫放置2min，12,000rpm離心1min，得到rna溶液；(2)cdna第一條鏈的合成，根據(jù)takara公司的primescript?1ststrandcdnasynthesiskit(codeno.6110a)的操作說(shuō)明進(jìn)行，優(yōu)化后的操作步驟如下：a.按下表配置反應(yīng)液oligodtprimer(50μm)1μldntpmixture(10mmeach)1μltemplaterna4μlrnasefreedh2o4μltotal10μlb.65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻；c.按下表配制20μl體系的反應(yīng)液上述變性后反應(yīng)液10μl5×primescriptbuffer4μlrnaseinhibitor(40u/μl)0.5μlprimescriptrtase(200u/μl)1μlrnasefreedh2o4.5μltotal20μld.緩慢混勻，然后42℃孵育45min，最后95℃保溫5min，使酶失活，反應(yīng)產(chǎn)物于-20℃下保存?zhèn)溆茫簧鲜龇椒ㄖ胁襟Ea3具體操作如下：(1)pcr產(chǎn)物的檢測(cè)：pcr反應(yīng)結(jié)束后取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，以dl5000dnamarker為參照，在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓130v，電泳25min。電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并分析擴(kuò)增片段的大小及亮度。(2)目的片段的回收與純化，根據(jù)takara公司的takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0(codeno.9762)的操作說(shuō)明進(jìn)行，優(yōu)化后的操作步驟如下：a.將40μlpcr產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外線下切出含有目的dna的瓊脂糖凝膠，放入1.5ml離心管(膠塊總質(zhì)量不應(yīng)大于300mg)；b.向膠塊中加入380μl膠塊溶解液buffergm，均勻混合后室溫15-25℃溶解膠塊；c.凝膠完全溶解后，轉(zhuǎn)移至spincolumn中，12,000rpm離心1min，棄濾液；d.將700μl的bufferwb加入spincolumn中，室溫12,000rpm離心30sec，棄濾液；e.重復(fù)操作步驟d；f.將spincolumn安置于collectiontube上，室溫12,000rpm離心1min；g.將spincolumn安置于新的1.5ml的離心管上，在spincolumn膜的中央處加入35μlelutionbuffer，室溫靜置1min；h.室溫12,000rpm離心1min洗脫dna；上述方法中步驟a4具體操作如下：(1)目的片段與pmd19-t載體連接：將回收的目的片段與pmd19-tvector連接，反應(yīng)體系如下：pmd19-tvector(50ng·μl-1)0.5μl目的dna2μlsolutionⅰ2.5μltotal5μl以上成分添加完畢后，混勻，短暫離心至離心管底部，16℃連接10h；(2)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化步驟如下：a.將置于-80℃的dh5α感受態(tài)細(xì)胞取出50μl，放入無(wú)菌環(huán)境中，冰上融化，5μl的連接產(chǎn)物加入其中，混勻，冰浴45min；b.42℃熱激90s，然后快速轉(zhuǎn)移到冰上，冰浴3min；c.向離心管中加入500μl無(wú)抗生素的lb液體培養(yǎng)基，混勻，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)45min，使細(xì)菌復(fù)蘇；d.在含amp(50mg·ml-1)的lb固體培養(yǎng)基上均勻涂布上x(chóng)-gal(20mg·ml-1)40μl和iptg(200mg·ml-1)4μl的混合液；e.在上述含amp/x-gal/iptg的lb固體瓊脂培養(yǎng)基上均勻涂布100μl已轉(zhuǎn)化的菌液，倒置平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，直到出現(xiàn)明顯的單菌落；(3)陽(yáng)性克隆的篩選和鑒定：將上述平板置于4℃或室溫放置數(shù)小時(shí)，使藍(lán)白斑顏色分明，挑取單克隆白斑置于含有1.5mllb液體培養(yǎng)基（50mg·ml-1amp）的離心管（容積為2ml）中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)4h；(4)陽(yáng)性克隆的篩選和鑒定：采用菌液pcr鑒定篩選陽(yáng)性克隆，選取帶有陽(yáng)性克隆基因的菌液送上海生工測(cè)序。附圖說(shuō)明序列表seqidno:1，豆梨pcfro2基因序列。圖1是豆梨pcfro2基因的pcr產(chǎn)物電泳圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡明。豆梨pcfro2基因的克隆具體實(shí)施步驟：a.提取rna并反轉(zhuǎn)錄cdna取水培豆梨嫩根根尖組織，用蒸餾水迅速?zèng)_洗干凈，并將吸附的蒸餾水用濾紙吸干，液氮中研磨提取組織中的總rna，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)rna的完整性，最后將其反轉(zhuǎn)錄成cdna。b.基因的克隆參考近緣蘋(píng)果屬mxfro2基因序列與梨基因組blastp，選取同源性最高的蛋白為模板，設(shè)計(jì)編碼區(qū)全長(zhǎng)上游引物f1和下游引物f2；然后以cdna為模板，用上述引物進(jìn)行pcr反應(yīng)，然后對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，再連接到pmd19-t載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α，最后用通用引物m13-47（cgccagggttttcccagtcacgac）和rv-m（gagcggataacaatttcacacagg）進(jìn)行測(cè)序。c.序列的拼接和比對(duì)參照測(cè)序圖譜將測(cè)序的結(jié)果使用dnaman進(jìn)行拼接校正，然后使用orffinder尋找該基因的起始密碼子和終止密碼子，從而得到pcfro2基因完整的編碼區(qū)序列（即包含起始密碼子和終止密碼子）；用blastp在線軟件比對(duì)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果表明該序列與其他近緣物種編碼三價(jià)鐵離子螯合物還原酶基因序列高度保守，表明該方法能達(dá)到獲得豆梨fcfro2基因完整編碼區(qū)序列的目的。綜上所述，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、快捷的獲取了豆梨pcfro2基因編碼區(qū)全序列的方法，填補(bǔ)了該基因在豆梨上的空白，為深入挖掘豆梨pcfro2基因的功能及應(yīng)用尊定了基礎(chǔ)。sequencelisting<110>河北農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種克隆豆梨pcfro2基因編碼區(qū)全序列的方法<130>2016<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>2166<212>dna<213>豆梨<400>1atggtttccacttcaagtccagcagaggtgaaagaacaagaaaccagtccttctggtgaa60ggaatgaggaccgttcgatcaatcatgaggctgcttctgatggtggtgtttgttgggtac120atgatgatctggatcatcatgcccaccaacacttactatctgaaatggttccctcatatt180cataaaaaaactgatcccacgtattttggccaagaaggtgcagacatacttatttacaca240ttccccatcctatttacagcaaccatgggctgcttattgctccacatgggaaacaaaaat300gttgacattaacaaccaaagggcgaaaaaatcataccggggatcatggaatcggcctgcg360ctggtgaaaggtcctttaggaattgtttcttggatagagctttctttcctggtgatgttc420attggcttacttgtctggtctatcccttcttacttacacgacatgtttgcatatgccacc480ctggaggctgcagccaagaaagagcatgtgtgggaaaataagttgggaagtgtagcacta540acactagggatagttgggagcattggcctagcctttctcttcttccctgtgagcagatgc600tcttccattctgcagatcattggcctcacatcagaggcaagcatcaagtaccatatctgg660ctagggcatcttgtcatgactctcttcacggctcacggtttatgttacgtagtctattgg720gggagcactaatcaaatttcagagatgttgaaatggaacaaggtaggtgtttcgaatgtg780gcaggagaagttgctctgcttgcaggactagccatgtgggctatgagcatccctcgcatc840aggcgcaagaccttcgagctcttcttatacactcaccatctctacattgtcttccttgtc900ttctttgtgtttcacgtggggttctcctatgcgtgcatcatgctcccgggcttttacctc960ttcctgattgacaggttcttacgtttcttgcaatctcagcgtagaattcgcctggtttca1020gcccgtgttcttccctgtgaggcggttgagctgaacttctccaagagtacaggactgaat1080tattctccaacaagcatggtgtttgtaaatgtgcctggtatttcaaagctgcaatggcat1140ccttttggtgttacttctagcagcaaattcgatcttgacaagctgagtgttgtcatcaaa1200agcgaaggaaattggtctcagaagttgtatcaggaactgtcatcctctcagcccgcagac1260cgccgacaagtctcggtggaaggaccgtatggacctgtctcaagcaacatgctaaggcac1320gacacaatagtgatggtgagcggaggaagcggtattactccgttaatctccgtcatccgt1380gagctcctcttcgaagccaataacttaggcggcaaggctccaaaaattctactcatatct1440gttttcaggaaaacactagacctcaccatgttggacctaatccttcccgtttcgggcaca1500aacctcgacatttctcgcttgcaattgcaaatcgaagcttatgtgacaagagagaaagaa1560cccatgtcagaatcctacaaacccctccaaacaatttggttcaagccgaacccttcagac1620gcgccggtttctgcaattctaggccaaaatagctggctctggcttggaatgatcatatcg1680tcgtctttcgtcatctttcttgtgctgatgggcatcctcacaagatattacatctaccca1740attgaccacaactccagcatgatatgttctgactcagctagatctgccttaaacatgtta1800tttttatgcgtatctatagccacaactgcaacagcagttttcttatggaacaagaaacag1860accctcaaggagatggggcagattcaagtcctggacacaccaacaccgacaactgcttcg1920ccgagcgggcgctttgccgttgctgagcaagaactcgaaagccttccccaccggtctttc1980gtcgagtcaacaaccgtgcactatgatagaagaccagatcttaagaggatactatctgag2040cgtgaaggttcgagcattggggttcttgttagtggcccaagaaagatgaggcaagaagtg2100gctgcaatttgctcatctggcttggccaacaaccttcattaccattccctgagcttcagt2160tggtaa2166當(dāng)前第1頁(yè)12