本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01410514519.1，申請(qǐng)日為2014年9月29日，名稱(chēng)為“一種具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶組合突變體及其制備方法和應(yīng)用”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及基因工程和遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶組合突變體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

低聚半乳糖(gos)是一類(lèi)在人體胃腸道內(nèi)不能被消化吸收而直接進(jìn)入大腸被各種雙歧桿菌良好利用的具有特殊生物學(xué)功能的低聚糖。它能夠改善人體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，有利于雙歧桿菌和其它有益菌的增殖，提高人體免疫功能。同時(shí)，gos經(jīng)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸使腸內(nèi)ph值降低，抑制腸內(nèi)沙門(mén)氏菌和腐敗菌的生長(zhǎng)，減少有毒發(fā)酵產(chǎn)物及有害細(xì)菌酶的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)胃腸功能，減輕了肝臟分解毒素的負(fù)擔(dān)。由于低聚半乳糖有著比其他功能性低聚糖更優(yōu)良的性質(zhì)，從而使低聚半乳糖作為添加劑大規(guī)模應(yīng)用更方便易行，能夠適應(yīng)更多的食品種類(lèi)和更廣的消費(fèi)群體，有巨大的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)潛力。

gos制備方法通常有五種：從天然原料中提取、天然多糖的酸水解、化學(xué)法合成、發(fā)酵法及酶法合成。由于gos在自然界中含量低，無(wú)色不帶電荷故難以提取分離；天然多糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)品得率低，產(chǎn)物成分復(fù)雜，難以純化；化學(xué)法毒性大易殘留，對(duì)環(huán)境污染重；發(fā)酵法生產(chǎn)gos的研究很少，仍處于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，無(wú)法進(jìn)行大量生產(chǎn)。目前低聚半乳糖的工業(yè)化生產(chǎn)是通過(guò)β-半乳糖苷酶完成的。β-半乳糖苷酶(β-d-galactosidegalatohydrolase，ec3.2.1.23)又稱(chēng)乳糖酶(lactase)，具有水解和轉(zhuǎn)糖苷的雙重作用。早先對(duì)于β-半乳糖苷酶的研究主要集中在利用其水解功能生產(chǎn)低乳糖乳制品，來(lái)解除乳糖不耐受患者因食用乳制品而引起的腹瀉、腹脹等多種不良反應(yīng)。隨著低聚半乳糖特殊的保健功能的確定，利用β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷作用生產(chǎn)低聚半乳糖成為研究熱點(diǎn)。主要集中在以下三個(gè)方面：

1、篩選高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌

酵母、芽孢桿菌、曲霉、青霉、雙歧桿菌等多種微生物中都有具轉(zhuǎn)糖苷酶活性的β-半乳糖苷酶。研究表明，不同來(lái)源的β-半乳糖苷酶因其酶學(xué)性質(zhì)各異，合成低聚半乳糖時(shí)的反應(yīng)條件大不相同。β-半乳糖苷酶根據(jù)最適ph可分為酸性和中性?xún)煞N。通常霉菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶為酸性酶，其作用最適ph在ph2.5～5.5，最適反應(yīng)溫度較高(50～60℃)；酵母和細(xì)菌所產(chǎn)的β-半乳糖苷酶為中性酶，其最適ph介于ph6～7.5，最適反應(yīng)溫度較低(30～40℃)。不同來(lái)源的β-半乳糖苷酶作用的底物類(lèi)型也不盡相同，由此生成的低聚半乳糖中寡糖的種類(lèi)和比例也千差萬(wàn)別，這就使低聚半乳糖家族的新成員層出不窮。盡管如此，篩選到的天然β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷活性普遍較低，低聚半乳糖的最高產(chǎn)率通常只有5～30％，無(wú)法滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

2、優(yōu)化反應(yīng)條件、改進(jìn)生產(chǎn)工藝

有學(xué)者試圖通過(guò)優(yōu)化低聚半乳糖的生產(chǎn)條件和工藝來(lái)彌補(bǔ)其轉(zhuǎn)糖苷活性低的缺陷，提高低聚半乳糖的得率，已取得了一定的效果。主要的方法有：增加起始乳糖的濃度、用有機(jī)溶劑控制水活度以及采用固定化技術(shù)。由于β-半乳糖苷酶的水解和轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)是可逆的。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，水解產(chǎn)物半乳糖濃度較低，其對(duì)水解反應(yīng)的抑制作用較小，此時(shí)酶表現(xiàn)出水解活力較高，而轉(zhuǎn)糖苷活力較低，因此產(chǎn)物中單糖含量較高。當(dāng)乳糖濃度較高時(shí)，水解產(chǎn)物半乳糖濃度較高，當(dāng)其達(dá)到一定值就對(duì)水解酶活產(chǎn)生抑制作用。半乳糖是轉(zhuǎn)糖苷的底物，濃度高有利于半乳糖寡糖的合成，因此底物濃度較高時(shí)，產(chǎn)物中寡糖含量較高。使用有機(jī)溶劑有利于低聚糖的合成是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑能降低反應(yīng)體系中水的活度以影響酶的活性位點(diǎn)和反應(yīng)機(jī)制，引導(dǎo)水解酶催化逆向的轉(zhuǎn)半乳糖苷反應(yīng)，使反應(yīng)平衡由水解偏移向低聚糖合成。利用固定化技術(shù)則可大大增加游離酶的ph和熱穩(wěn)定性并可反復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本。mozaffar將β-半乳糖苷酶吸附于酚醛樹(shù)脂并用戊二醛交聯(lián)后，低聚糖的產(chǎn)率提高了20％；但也有研究發(fā)現(xiàn)，固定化酶作用于較高濃度的乳糖溶液時(shí)，產(chǎn)生的低聚糖比用游離酶還少。由此可見(jiàn)單純依靠?jī)?yōu)化條件始終無(wú)法從根本上解決問(wèn)題。

3、利用基因工程手段提高β-半乳糖苷酶的表達(dá)和性質(zhì)改良

自然界中野生的β-半乳糖苷酶gos產(chǎn)量一般都維持在20～45％之間，產(chǎn)量較低，難以滿(mǎn)足生產(chǎn)需求，因此通過(guò)分子改造篩選轉(zhuǎn)糖苷性質(zhì)優(yōu)良的突變酶成為研究熱點(diǎn)。hanseno.(2001)等發(fā)現(xiàn)來(lái)源于雙歧桿菌中的β-半乳糖苷酶bif3，缺失掉c末端580個(gè)氨基酸后將酶蛋白變?yōu)橐粋€(gè)高效的轉(zhuǎn)糖苷酶，能夠利用幾乎90％乳糖生成gos，而水解成分占10％，而且在10％至40％的乳糖濃度下始終能夠保持9:1比率的轉(zhuǎn)糖苷活力和水解活力；placierg.于2009年對(duì)來(lái)源于嗜熱脂肪土芽孢桿菌kve39的β-半乳糖苷酶進(jìn)行定向進(jìn)化，將轉(zhuǎn)糖苷活力提高則水解活力降低作為篩選依據(jù)，成功篩選到三株突變體r109w，r109v，r109k，在18％(w/v)乳糖中低聚糖產(chǎn)量分別為23％，11.5％，21％，而野生酶只有2％；wuy.(2013)等對(duì)硫化葉菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶進(jìn)行分子改造，研究其最適gos生成條件，在各自最適條件下突變體f441ygos產(chǎn)量為61.7％，f359q為58.3％，而野生酶為50.9％。

繼而，有學(xué)者提出一種迭代組合突變的方法(jij,fank.etal,2012)，即將每一輪篩選結(jié)果里最高活力的突變體作為模板進(jìn)行下一輪組合突變，直至生成的突變體活力均無(wú)法超越出發(fā)模板時(shí)，迭代組合結(jié)束。通過(guò)該方法從四輪組合突變共24株突變體中篩選到11株活力提高的突變體，最終活力最高突變體(c155yy184hv275ic281y)比原始野生酶提高1874％，但該組合突變的方法尚未有報(bào)道應(yīng)用于β-半乳糖苷酶的分子改造中。

到目前為止，無(wú)論是天然酶的篩選分離、工藝優(yōu)化還是通過(guò)基因工程手段提高β-半乳糖苷酶的表達(dá)和性質(zhì)改良，都沒(méi)有改變?chǔ)?半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷活性低和產(chǎn)量低的現(xiàn)狀，從而也就造成低聚半乳糖合成產(chǎn)率低，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)成本太高，這嚴(yán)重制約了低聚半乳糖的廉價(jià)生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。

因此，創(chuàng)制高轉(zhuǎn)糖苷活性的新型β-半乳糖苷酶，并使其廉價(jià)生產(chǎn)是目前研究和生產(chǎn)中亟需解決的主要問(wèn)題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明一方面提供了一種具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶組合突變體，其是在亮白曲霉或米曲霉β-半乳糖苷酶的基礎(chǔ)上，通過(guò)雙位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變而獲得的，優(yōu)選是在序列2或序列4所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)雙位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變所獲得的，所述突變體在低聚糖生成量保持不變的情況下，轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)速率比野生型提高100％以上，優(yōu)選提高150％以上，更加優(yōu)選提高200％以上。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變位點(diǎn)分別為第219位和第785位的氨基酸。

在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變分別為用甘氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(s219g)和用纈氨酸殘基取代第785位的谷氨酸殘基(e785v)、用丙氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(s219a)和用纈氨酸殘基取代第785位的谷氨酸殘基(e785v)、用天冬酰胺殘基取代第219位的絲氨酸殘基(s219n)和用纈氨酸殘基取代第785位的谷氨酸殘基(e785v)、或用纈氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基(s219v)和用纈氨酸殘基取代第785位的谷氨酸殘基(e785v)。

本發(fā)明的另一方面提供了編碼上述組合突變體的dna分子。

本發(fā)明的再一方面提供了含有上述dna分子的重組表達(dá)載體，優(yōu)選為重組酵母表達(dá)載體。

本發(fā)明的再一方面提供了表達(dá)上述dna分子的宿主細(xì)胞，優(yōu)選糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬和甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株，甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株更加優(yōu)選為畢赤氏酵母屬菌株。

本發(fā)明的再一方面提供了一種制備具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶的方法，包括以下步驟：

1、用上述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得重組菌株；

2、培養(yǎng)上述重組菌株，誘導(dǎo)重組β-半乳糖苷酶的表達(dá)；

3、回收并純化所表達(dá)的高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶。

本發(fā)明的最后一方面提供了本發(fā)明所述的組合突變體、dna分子、重組表達(dá)載體以及宿主細(xì)胞在制備β-半乳糖苷酶中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用雙位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變技術(shù)對(duì)去除自身信號(hào)肽的亮白曲霉的β-半乳糖苷酶基因lacbˊ和去除自身信號(hào)肽的米曲霉的β-半乳糖苷酶基因lacoˊ進(jìn)行了定點(diǎn)飽和突變，獲得了具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶組合突變體，從而使其轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)速率比野生型提高了100％以上，甚至提高了200％以上，使制備高效率且高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶成為現(xiàn)實(shí)，為β-半乳糖苷酶的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1：亮白曲霉和米曲霉的β-半乳糖苷酶與底物的分子對(duì)接過(guò)程。

圖2：亮白曲霉和米曲霉的β-半乳糖苷酶中突變位點(diǎn)與乳糖分子空間位置關(guān)系。

圖3：含突變體β-半乳糖苷酶基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程。

圖4：s219位點(diǎn)典型突變體低聚半乳糖生成量。

圖5：f245位點(diǎn)突變體庫(kù)低聚半乳糖生成量趨勢(shì)。

圖6：f245位點(diǎn)典型突變體低聚半乳糖生成量。

圖7：e785位點(diǎn)突變體庫(kù)低聚半乳糖生成量趨勢(shì)。

圖8：s219/e785雙位點(diǎn)突變體低聚半乳糖生成量。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，旨在用于說(shuō)明本發(fā)明而非限定本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：β-半乳糖苷酶三級(jí)結(jié)構(gòu)及突變位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

去除自身信號(hào)肽的β-半乳糖苷酶基因lacbˊ，為本實(shí)驗(yàn)室從亮白曲霉(aspergilluscandidus)中克隆得到的，去除自身信號(hào)肽序列的基因由2958個(gè)核苷酸組成，具體序列如序列1所示，該基因編碼的蛋白質(zhì)由986個(gè)氨基酸組成，具體序列如序列2所示。

去除自身信號(hào)肽的β-半乳糖苷酶基因lacoˊ，為本實(shí)驗(yàn)室從米曲霉(aspergillusoryze)中克隆得到的，其也由2958個(gè)核苷酸組成，具體序列如序列3所示，該基因編碼的蛋白質(zhì)也由986個(gè)氨基酸組成，具體序列如序列4所示。其氨基酸序列與lacbˊ基因編碼的蛋白質(zhì)僅有三個(gè)氨基酸的差異：分別在第231位：lacbˊ(gly)，lacoˊ(ser)；第401位：lacbˊ(met)，lacoˊ(ile)；第970位：lacbˊ(asp)，lacoˊ(asn)。

以亮白曲霉和米曲霉的β-半乳糖苷酶為研究材料。以獲得晶體結(jié)構(gòu)的青霉屬β-半乳糖苷酶(pdb登錄號(hào)：1tg7)，米曲霉β-半乳糖苷酶(pdb登錄號(hào)：4iug)及里氏木霉β-半乳糖苷酶(pdb登錄號(hào)：3og2)的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)為同源模型，對(duì)β-半乳糖苷酶的3d結(jié)構(gòu)及與底物結(jié)合的區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報(bào)道的預(yù)測(cè)結(jié)果高度相似(參見(jiàn)thecrystalstructureofacidicβ-galactosidasefromaspergillusoryzae,mirkom.maksimainen,internationaljournalofbiologicalmacromolecules，2013,109-115)。酶蛋白由5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：結(jié)構(gòu)域1(1～394氨基酸)靠近n端，是該酶的活性中心所在，活性中心是tim桶型結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域2(395～573氨基酸)由16個(gè)反向平行的β-折疊片和1個(gè)α-螺旋組成，包含了一個(gè)類(lèi)似免疫球蛋白的亞結(jié)構(gòu)域；結(jié)構(gòu)域3(574～661氨基酸)由8個(gè)反向平行的β-折疊片組成一個(gè)“希臘鑰匙”的β-夾層和1個(gè)α-螺旋組成；結(jié)構(gòu)域4(662～857氨基酸)和結(jié)構(gòu)域5(858～1005氨基酸)主要由“春卷”型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)組成。對(duì)活性中心重點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，位于tim桶活性中心第4和第7條β-折疊片上的glu160、glu258可能是參與催化反應(yīng)必不可少的氨基酸，而asn140和tyr96可能用來(lái)固定乳糖分子。

根據(jù)得到的β-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)discoverystudio軟件進(jìn)行酶與底物的分子對(duì)接模擬(參見(jiàn)附圖1)，根據(jù)對(duì)接結(jié)果解析，可獲知與底物存在相互作用的氨基酸(參見(jiàn)附圖2)。使用計(jì)算生物學(xué)軟件逐個(gè)評(píng)估這些氨基酸的進(jìn)化熵，最終篩選確定了六個(gè)進(jìn)化熵變化較大的氨基酸位點(diǎn)s219，d239，s240，y241，f245和e785(參見(jiàn)表1)用于定點(diǎn)飽和突變。

表1β-半乳糖苷酶典型氨基酸的進(jìn)化熵

實(shí)施例2：畢赤酵母單點(diǎn)飽和突變體庫(kù)的構(gòu)建

1、材料與方法

(1)菌種與載體

野生型基因來(lái)源于去除自身信號(hào)肽的亮白曲霉的β-半乳糖苷酶基因lacbˊ，以及來(lái)源于米曲霉的β-半乳糖苷酶基因lacoˊ，為本實(shí)驗(yàn)室前期克隆得到，具體序列如序列1和序列3所示，連于ppic9表達(dá)載體上，并在畢赤酵母gs115中表達(dá)；escherichiacolitrans1-t1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于transgen公司；ppic9表達(dá)載體，畢赤酵母gs115購(gòu)于invitrogen公司。

(2)培養(yǎng)基及相關(guān)溶液的配制

畢赤酵母轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及篩選常規(guī)培養(yǎng)基及試劑參照invitrogen公司的說(shuō)明書(shū)。

ptm微量鹽：0.6％cuso4，0.008％nai2，0.3％mnso4，0.02％na2moo4，0.002％h3bo3，0.05％cocl2，2％zncl2，6.5％feso4，0.5％硫酸(v/v)。

酵母發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(fbsm)：0.5％kh2po4，5％nh4h2po4，1.485％mgso4，1.82％k2so4，0.093％caso4，0.15％koh，0.00011％biotin，0.44％ptm微量鹽，2％葡萄糖。

酵母發(fā)酵基礎(chǔ)鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(fbim)：0.5％kh2po4，5％nh4h2po4，1.485％mgso4，1.82％k2so4，0.093％caso4，0.15％koh，0.00011％biotin，0.44％ptm微量鹽，0.5％甲醇。

na2hpo4-檸檬酸緩沖液(0.1mol/lph5.2)：0.2mol/l磷酸氫二鈉536ml，0.1mol/l檸檬酸464ml，混勻后調(diào)ph至5.2。

(3)寡核苷酸引物

基因突變中所采用的具體引物序列如表2所示。

表2基因突變中所用引物表

2、重疊pcr擴(kuò)增突變位點(diǎn)

采用重疊pcr(overlappcr)的方法對(duì)基因的單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變。即兩個(gè)片段分別經(jīng)pcr擴(kuò)增，然后通過(guò)重疊延伸進(jìn)行融合。設(shè)計(jì)一對(duì)兼并引物，使其在靶位點(diǎn)附近有一定程度的重疊(參見(jiàn)附圖3中的b、c引物)，分別與基因5′和3′端引物(參見(jiàn)附圖3中的a、d引物)組合，擴(kuò)增含突變靶位點(diǎn)的上游片段和下游片段，由于這些引物是互補(bǔ)的，因而產(chǎn)生的pcr產(chǎn)物鏈將相互重疊，將上下游片段在靶位點(diǎn)處交錯(cuò)，互為模板重疊延伸成全長(zhǎng)基因。取1μlppic9-lacb′質(zhì)粒為模板，分別用引物對(duì)a和c以及b和d，使用transstartfastpfudna聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增將pcr產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，回收大小正確的片段(方法參照天根生化試劑(北京)公司，瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒)。

3、體外同源重組構(gòu)建表達(dá)載體

將帶有同源臂的兩段pcr片段，等摩爾量混合，加入同源重組酶進(jìn)行體外重組。將混合物在25℃反應(yīng)30min，之后冰上放置5min。可立即轉(zhuǎn)化或者-20℃保存。將同源重組產(chǎn)物分別取10ul利用化學(xué)法轉(zhuǎn)入100ul大腸桿菌trans1-t1感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含有amp的lb平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

lb平板上長(zhǎng)出3～5倍于理論突變子數(shù)量(突變密碼子為mnn，變體庫(kù)的理論值為4×4×2＝32，單點(diǎn)飽和突變挑選32個(gè)克隆子即可覆蓋全部突變)就可以覆蓋所有突變位點(diǎn)。隨機(jī)從每個(gè)突變體庫(kù)的lb平板上挑取6～8個(gè)單克隆進(jìn)行dna序列測(cè)定，測(cè)序工作委托北京邁奧德恩生物科技有限公司完成。將每個(gè)突變體庫(kù)按突變位點(diǎn)不同，依次命名為s219庫(kù)、d239庫(kù)、s240庫(kù)、y241庫(kù)、f245庫(kù)和e785庫(kù)。

4、β-半乳糖苷酶突變體在畢赤酵母中的表達(dá)與高轉(zhuǎn)糖苷活性菌株的篩選方法

(1)重組質(zhì)粒在畢赤酵母中的表達(dá)

從各個(gè)突變體庫(kù)的大腸桿菌中提取混合質(zhì)粒(約200-230μg)，用足量bglii酶進(jìn)行完全酶切消化后，異丙醇沉淀，70％乙醇洗滌后溶于去離子水中轉(zhuǎn)化畢赤酵母。將轉(zhuǎn)化酵母涂布到含有x-gal的mm平板上，在mm平板上變藍(lán)的菌株為有β-半乳糖苷酶活性的陽(yáng)性克隆，將其對(duì)應(yīng)的md平板上的菌落挑到48孔培養(yǎng)板中，不同突變體在48孔板中先經(jīng)fbsm培養(yǎng)基培養(yǎng)使其快速生長(zhǎng)48h后，再經(jīng)fbim培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后取上清測(cè)定陽(yáng)性突變株的β-半乳糖苷酶活性。

(2)β-半乳糖苷酶以onpg底物的活性測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取onpg底物0.1g，溶于40mlna2hpo4-檸檬酸緩沖液(ph5.2，0.1mol/l)，即為濃度為0.25％(w/v)的onpg溶液。待測(cè)粗酶液使用ph5.2，0.1mol/l的na2hpo4-檸檬酸稀釋至合適倍數(shù)，取吸800μl的底物溶液加入試管中于60℃水浴鍋中預(yù)熱2min，加入200μl稀釋后酶液混勻，反應(yīng)15min后依次加入1ml10％tca終止，2ml1mol/lna2co3顯色，測(cè)定420nm處的光吸收值(od420)。以加入na2hpo4-檸檬酸緩沖液(濃度為0.1mol/l，ph5.2)作為空白對(duì)照，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算反應(yīng)生成的onp的量，進(jìn)而計(jì)算出β-半乳糖苷酶的酶活力。酶活力單位定義：一個(gè)單位(1u)的β-半乳糖苷酶活性指在60℃，ph5.2條件下，每分鐘催化底物鄰硝基苯酚-β-d-吡喃半乳糖苷(onpg)生成1μmol鄰硝基酚(onp)所需的酶量。

根據(jù)β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的結(jié)果，酶活力計(jì)算公式為：

酶活性(u/ml)＝5*n*(0.9472x+0.0046)/15

x：420nm處光吸收值；n：酶液的稀釋倍數(shù)；15：反應(yīng)15min；5：將200μl稀釋酶液中的酶活折算為1ml的酶活性。

(3)突變株轉(zhuǎn)糖苷活力測(cè)定基本反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

將各突變體的粗酶液經(jīng)ph5.2，0.1mol/l的na2hpo4-檸檬酸緩沖液稀釋至等蛋白濃度，即每60μl酶液中含有5μg蛋白(濃度約0.08mg/ml)。吸取60μl稀釋后酶液置于ep管中，加入440μl30％(w/v)的乳糖底物，底物與酶液混合盡量快速，保證每個(gè)樣品起始反應(yīng)時(shí)間間隔最小。將各反應(yīng)物置于50℃，200rpm恒溫?fù)u床中反應(yīng)不同時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后12000rpm離心10min，置于100℃水浴中煮沸10min終止反應(yīng)。

反應(yīng)產(chǎn)物使用超純水稀釋16倍后12000rpm離心10min，取700μl進(jìn)行hplc檢測(cè)。

高效液相色譜儀(hplc)檢測(cè)條件：

hplc定量檢測(cè)前繪制葡萄糖、半乳糖、乳糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。葡萄糖、半乳糖、乳糖的檢測(cè)區(qū)間均為0–25.6mg/ml，檢測(cè)條件為：waterse2695separationsmoule，流動(dòng)相：50mmedta鈣鈉鹽；柱溫：85℃；流速，時(shí)間：0.5ml/min，12min/sample。

低聚糖gos產(chǎn)量(mg/ml)＝起始乳糖量(mg/ml)-剩余乳糖量(mg/ml)-葡萄糖量(mg/ml)-半乳糖量(mg/ml)(jorgensenfetal,2001)；

gos轉(zhuǎn)化率＝低聚糖量(mg/ml)/起始乳糖量(mg/ml)；

消耗乳糖轉(zhuǎn)化為gos的得率＝低聚糖量(mg/ml)/[起始乳糖量(mg/ml)-剩余乳糖量(mg/ml)]。

實(shí)施例3：s219飽和突變體庫(kù)的篩選及低聚糖的合成

選取s219突變體庫(kù)的200個(gè)畢赤酵母陽(yáng)性克隆測(cè)定其轉(zhuǎn)糖苷活性(低聚糖生產(chǎn)量)，并測(cè)定核苷酸序列。測(cè)序表明，這些突變體分別突變?yōu)?種不同的氨基酸均可提高突變酶的轉(zhuǎn)糖苷活性(參見(jiàn)表3)，尤其以帶有較小側(cè)鏈的氨基酸如gly、ala、val及帶負(fù)電荷的極性氨基酸glu較突出，其中突變?yōu)間ly最為明顯(參見(jiàn)附圖4)，低聚糖生成量可提高26.6％。突變?yōu)樾?cè)鏈且?guī)ж?fù)電的glu后低聚糖生成量提高25.7％，當(dāng)s219突變?yōu)閍la、val后低聚糖生成量分別提高15.0％和15.5％，突變?yōu)閍sp、arg、leu低聚糖生成量分別提高10.4％，7.9％和8.2％，突變?yōu)榇髠?cè)鏈芳香族氨基酸phe其轉(zhuǎn)糖苷也有大幅提升，提高16.4％。而突變?yōu)閜ro和trp其轉(zhuǎn)糖苷能力明顯下降，分別下降16.7％和28.7％。由此可見(jiàn)，s219突變?yōu)槠渌被岷筠D(zhuǎn)糖苷能力呈現(xiàn)有高有低的態(tài)勢(shì)，表明該位點(diǎn)是一個(gè)與β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷能力相關(guān)的重要位點(diǎn)。該位點(diǎn)在空間上位于β-半乳糖苷酶活性中心-tim桶內(nèi)，通過(guò)電荷和極性作用與乳糖底物產(chǎn)生一定作用且是該活性中心內(nèi)的非保守氨基酸。

表3s219不同氨基酸突變體低聚糖生成情況

注：wt代表野生酶。

實(shí)施例4：f245飽和突變體庫(kù)的篩選及低聚糖的合成

從f245庫(kù)中篩選了200個(gè)陽(yáng)性突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)糖苷活性的測(cè)定。結(jié)合轉(zhuǎn)糖苷活性測(cè)定結(jié)果和測(cè)序結(jié)果表明，所有突變體在低聚糖生成量上呈現(xiàn)有高有低的態(tài)勢(shì)(參見(jiàn)附圖5)，部分突變體低聚糖生成量比野生酶下降很多，部分突變體低聚糖生成量比野生酶高出30％左右。由此可見(jiàn)，f245位點(diǎn)也是一個(gè)與β-半乳糖苷酶低聚糖生成相關(guān)的重要位點(diǎn)。

具體的，f245位點(diǎn)突變?yōu)閍rg后低聚糖生成量提高最多，約35％，其次是lys和gly，分別提高約30％和24.7％。突變?yōu)槠渌被崛鐂er、glu、ala、thr和met等后，低聚糖產(chǎn)量也都有大幅提升(參見(jiàn)附圖6)。

實(shí)施例5：e785飽和突變體庫(kù)的篩選及低聚糖的合成

與野生型相比，e785飽和突變體庫(kù)中，僅有少量突變體的低聚糖合成量提高，且提高幅度不大于20％(參見(jiàn)附圖7)。e785突變體庫(kù)低聚糖生成量提高的突變體中，glu突變?yōu)関al后提高15％，其余大部分突變體低聚糖產(chǎn)量低于野生型或與野生酶差異不大。

實(shí)施例6組合突變體庫(kù)的構(gòu)建和篩選

1、材料與方法

(1)菌種與載體

起始突變體為亮白曲霉的β-半乳糖苷酶基因lacbˊ的突變體e785v，連接于ppic9表達(dá)載體上，并在畢赤酵母gs115中表達(dá)；escherichiacolitrans1-t1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于transgen公司；ppic9表達(dá)載體和畢赤酵母gs115購(gòu)于invitrogen公司。

(2)培養(yǎng)基及相關(guān)溶液的配制

畢赤酵母轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及篩選常規(guī)培養(yǎng)基及試劑參照invitrogen公司的說(shuō)明書(shū)。

ptm微量鹽：0.6％cuso4，0.008％nai2，0.3％mnso4，0.02％na2moo4，0.002％h3bo3，0.05％cocl2，2％zncl2，6.5％feso4，0.5％硫酸(v/v)。

酵母發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(fbsm)：0.5％kh2po4，5％nh4h2po4，1.485％mgso4，1.82％k2so4，0.093％caso4，0.15％koh，0.00011％biotin，0.44％ptm微量鹽，2％葡萄糖。

酵母發(fā)酵基礎(chǔ)鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(fbim)：0.5％kh2po4，5％nh4h2po4，1.485％mgso4，1.82％k2so4，0.093％caso4，0.15％koh，0.00011％biotin，0.44％ptm微量鹽，0.5％甲醇。

na2hpo4-檸檬酸緩沖液(0.1mol/lph5.2)：0.2mol/l磷酸氫二鈉536ml，0.1mol/l檸檬酸464ml，混勻后調(diào)ph至5.2。

(3)突變用寡核苷酸引物

組合突變中所采用的具體引物序列如表4所示。

表4組合突變中所用引物表

注：加粗字體為突變堿基。

2、組合突變體庫(kù)的構(gòu)建

基于上述對(duì)不同位點(diǎn)飽和突變體庫(kù)的分析，選擇s219以及e785兩個(gè)位點(diǎn)作為組合突變的位點(diǎn)，并根據(jù)對(duì)每個(gè)位點(diǎn)正突變體的測(cè)序結(jié)果確定每個(gè)位點(diǎn)的目的突變氨基酸。。確定突變位點(diǎn)以及目的突變氨基酸后設(shè)計(jì)引物，組合突變體庫(kù)的構(gòu)建采用分次突變的方法，即先構(gòu)建其中一個(gè)位點(diǎn)的突變質(zhì)粒，在此基礎(chǔ)上再對(duì)另一位點(diǎn)進(jìn)行突變，直至完成目的突變。對(duì)于s219/e785雙點(diǎn)組合突變而言，采用先突變e785單點(diǎn)，再利用e785單點(diǎn)突變質(zhì)粒進(jìn)行s219位點(diǎn)的突變。

組合突變重組質(zhì)粒的構(gòu)建則建立在上述單點(diǎn)突變的基礎(chǔ)上，即以單點(diǎn)突變的混合質(zhì)粒為模板繼續(xù)通過(guò)上述的pcr擴(kuò)增和重組技術(shù)獲得雙點(diǎn)突變體。

將組合突變重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母gs115中，在畢赤酵母gs115中進(jìn)行表達(dá)，并測(cè)定陽(yáng)性突變株的β-半乳糖苷酶活性。

3、組合突變體庫(kù)的篩選

從s219/e785雙點(diǎn)突變體庫(kù)中隨機(jī)挑取500個(gè)突變體，測(cè)定其β-半乳糖苷酶活性。如圖8所示，s219/e785雙點(diǎn)突變體庫(kù)中大部分突變體的低聚糖生成量都高于野生酶。更重要的是，部分組合突變體的gos生成速率較野生型大大加快，達(dá)到最高gos產(chǎn)量所需的時(shí)間也大大縮短，不同突變體轉(zhuǎn)糖苷的性質(zhì)分別列于表5中。

表5不同突變體的轉(zhuǎn)糖苷性質(zhì)

由表5的數(shù)據(jù)可知，篩選出的高轉(zhuǎn)糖苷突變酶在相同乳糖底物中低聚糖的生成速率明顯加快，也即意味著轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)速率加快，以s219g/e785v突變體最為明顯。s219g/e785v在反應(yīng)2h時(shí)低聚糖的產(chǎn)量就極高，大部分突變體在5–6h左右就達(dá)到了低聚糖合成最大量，即水解和轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)速度相平衡階段，只有e785v突變體在36h左右才達(dá)到最大低聚糖生成量，而野生酶在48h左右才達(dá)到轉(zhuǎn)糖苷和水解的平衡階段，反應(yīng)周期很長(zhǎng)。大部分突變體在加快反應(yīng)速率的同時(shí)增加了gos得率，最高的如s219v/e785v轉(zhuǎn)化率由23.3％到27.1％提高了16％。以反應(yīng)2h低聚糖的產(chǎn)量來(lái)計(jì)算每個(gè)突變體低聚糖的生成速率可見(jiàn)，除e785v突變體比野生酶提高了22％左右，其余突變體提高量都在100％以上，其中反應(yīng)速率最快的s219g/e785v突變體提高量在211％左右，是野生酶的3倍多。

序列表

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所

<120>一種具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶組合突變體及其制備方法和應(yīng)用

<160>24

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2958

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tccatcaagcatcgtctcaatggcttcacgatcctggaacatccggatccggcgaaaaga60

gacttgctgcaagacattgttacatgggatgacaaatctctgttcatcaatggagagagg120

attatgttattcagcggagaagtgcatcctttcagattgccagtaccttcgctttggctt180

gatatcttccacaagatcagagctcttggtttcaactgtgtatctttctatattgattgg240

gctcttctggagggaaagcctggcgactacagagcagaaggcatctttgctctggaaccc300

ttcttcgatgcagccaaggaagcaggcatttatctgatcgcccgccccggttcgtacatc360

aatgccgaggtctcaggcggtggcttccctggatggttgcagagggtcaatggcactctt420

cgctcgtctgatgagccattccttaaagctactgataactatatcgccaatgccgctgct480

gccgtggcgaaggctcaaatcacgaatggagggccagtaattctctaccagcccgaaaac540

gaatacagcggtggctgctgcggtgtcaaataccccgatgcagactacatgcagtatgtt600

atggatcaggcccggaaggctgacattgttgtacctttcatcagcaacgatgcctcacct660

tctgggcacaatgctcctggaagtggaacgggcgctgttgatatttatggtcacgatagc720

tatccccttggctttgattgcgcaaacccatccgtatggcccgagggtaaactgcccgac780

aacttccgcacgctccatcttgagcagagcccatcaactccgtattcacttcttgagttc840

caagcgggtgctttcgacccatggggtggacccggctttgaaaaatgctatgccctcgtt900

aaccacgaattctcgagagttttctataggaacgacttgagtttcggagtttctaccttt960

aacttatacatgactttcggcggaacaaactggggtaacctcggacatcccggtggatat1020

acatcctacgactacggctcgcctataactgaaacgcgaaacgttacacgggagaagtac1080

agcgacataaagctccttgccaactttgtcaaagcatcgccatcctatctcaccgctact1140

cccagaaacctgactactggtgtttacacagacacatctgacctggctgtcaccccgtta1200

atgggtgatagtccaggctcattcttcgtggtcagacatacggactattccagccaagag1260

tcaacctcgtacaaacttaagcttcctaccagtgctggtaacctgactattccccagctg1320

gagggcactctaagtctcaacggacgtgactcaaaaattcatgttgttgattataatgtg1380

tctggaacgaacattatctattcgacagctgaagtcttcacctggaagaagtttgacggt1440

aacaaggtcctggtgttatacggcggaccgaaggaacaccatgaattggccattgcctcc1500

aagtcaaatgtgaccatcatcgaaggttcggactctggaattgtctcaacgaggaagggc1560

agctctgttatcattggctgggatgtctcttctactcgtcgcatcgttcaagtcggtgac1620

ttgagagtgttcctgcttgatagaaactctgcttacaactactgggtccccgaactcccc1680

acagaaggtacttctcccgggttcagcacttcgaagacgaccgcctcctccattattgtg1740

aaggccggctacctcctccgaggggctcacctggatggtgctgatcttcatcttactgct1800

gatttcaatgccaccaccccgattgaagtgatcggtgctccaacaggcgccaagaatctg1860

ttcgtgaatggtgaaaaggctagccacacagtcgacaaaaacggcatctggagtagtgag1920

gtcaagtacgcggctccagagatcaagctccccggtttgaaggatttggactggaagtat1980

ctggacacgcttcccgaaattaagtcttcctatgatgactcggcctgggtttcggcagac2040

cttccaaagacaaagaacactcaccgtcctcttgacacaccaacatcgctatactcctct2100

gactatggcttccacactggctacctgatctacaggggtcacttcgttgccaacggcaag2160

gaaagcgaattttttattcgcacacaaggcggtagcgcattcggaagttccgtatggctg2220

aacgagacgtatctgggctcttggactggtgccgattatgcgatggacggtaactctacc2280

tacaagctatctcagctggagtcgggcaagaattacgtcatcactgtggttattgataac2340

ctgggtctcgacgagaattggacggtcggcgaggaaaccatgaagaatcctcgtggtatt2400

cttagctacaagctgagcggacaagacgccagcgcaatcacctggaagctcactggtaac2460

ctcggaggagaagactaccaggataaggttagaggacctctcaacgaaggtggactgtac2520

gcagagcgccagggcttccatcagcctcagcctccaagcgaatcctgggagtcgggcagt2580

ccccttgaaggcctgtcgaagccgggtatcggattctacactgcccagttcgaccttgac2640

ctcccgaagggctgggatgtgccgctgtacttcaactttggcaacaacacccaggcggct2700

cgggcccagctctacgtcaacggttaccagtatggcaagttcactggaaacgttgggcca2760

cagaccagcttccctgttcccgaagggatcctgaactaccgcggaaccaactatgtggca2820

ctgagtctttgggcattggagtcggacggtgctaagctgggtagcttcgaactgtcctac2880

accaccccagtgctgaccggatacggggatgttgagtcacctgagcagcccaagtatgag2940

cagcggaagggagcatac2958

<210>2

<211>986

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

serilelyshisargleuasnglyphethrileleugluhisproasp

151015

proalalysargaspleuleuglnaspilevalthrtrpaspasplys

202530

serleupheileasnglygluargilemetleupheserglygluval

354045

hispropheargleuprovalproserleutrpleuaspilephehis

505560

lysileargalaleuglypheasncysvalserphetyrileasptrp

65707580

alaleuleugluglylysproglyasptyrargalagluglyilephe

859095

alaleugluprophepheaspalaalalysglualaglyiletyrleu

100105110

ilealaargproglysertyrileasnalagluvalserglyglygly

115120125

pheproglytrpleuglnargvalasnglythrleuargserserasp

130135140

glupropheleulysalathraspasntyrilealaasnalaalaala

145150155160

alavalalalysalaglnilethrasnglyglyprovalileleutyr

165170175

glnprogluasnglutyrserglyglycyscysglyvallystyrpro

180185190

aspalaasptyrmetglntyrvalmetaspglnalaarglysalaasp

195200205

ilevalvalpropheileserasnaspalaserproserglyhisasn

210215220

alaproglyserglythrglyalavalaspiletyrglyhisaspser

225230235240

tyrproleuglypheaspcysalaasnproservaltrpproglugly

245250255

lysleuproaspasnpheargthrleuhisleugluglnserproser

260265270

thrprotyrserleuleuglupheglnalaglyalapheaspprotrp

275280285

glyglyproglypheglulyscystyralaleuvalasnhisgluphe

290295300

serargvalphetyrargasnaspleuserpheglyvalserthrphe

305310315320

asnleutyrmetthrpheglyglythrasntrpglyasnleuglyhis

325330335

proglyglytyrthrsertyrasptyrglyserproilethrgluthr

340345350

argasnvalthrargglulystyrseraspilelysleuleualaasn

355360365

phevallysalaserprosertyrleuthralathrproargasnleu

370375380

thrthrglyvaltyrthraspthrseraspleualavalthrproleu

385390395400

metglyaspserproglyserphephevalvalarghisthrasptyr

405410415

serserglngluserthrsertyrlysleulysleuprothrserala

420425430

glyasnleuthrileproglnleugluglythrleuserleuasngly

435440445

argaspserlysilehisvalvalasptyrasnvalserglythrasn

450455460

ileiletyrserthralagluvalphethrtrplyslyspheaspgly

465470475480

asnlysvalleuvalleutyrglyglyprolysgluhishisgluleu

485490495

alailealaserlysserasnvalthrileilegluglyseraspser

500505510

glyilevalserthrarglysglyserservalileileglytrpasp

515520525

valserserthrargargilevalglnvalglyaspleuargvalphe

530535540

leuleuaspargasnseralatyrasntyrtrpvalprogluleupro

545550555560

thrgluglythrserproglypheserthrserlysthrthralaser

565570575

serileilevallysalaglytyrleuleuargglyalahisleuasp

580585590

glyalaaspleuhisleuthralaasppheasnalathrthrproile

595600605

gluvalileglyalaprothrglyalalysasnleuphevalasngly

610615620

glulysalaserhisthrvalasplysasnglyiletrpserserglu

625630635640

vallystyralaalaprogluilelysleuproglyleulysaspleu

645650655

asptrplystyrleuaspthrleuprogluilelyssersertyrasp

660665670

aspseralatrpvalseralaaspleuprolysthrlysasnthrhis

675680685

argproleuaspthrprothrserleutyrserserasptyrglyphe

690695700

histhrglytyrleuiletyrargglyhisphevalalaasnglylys

705710715720

glusergluphepheileargthrglnglyglyseralapheglyser

725730735

servaltrpleuasngluthrtyrleuglysertrpthrglyalaasp

740745750

tyralametaspglyasnserthrtyrlysleuserglnleugluser

755760765

glylysasntyrvalilethrvalvalileaspasnleuglyleuasp

770775780

gluasntrpthrvalglyglugluthrmetlysasnproargglyile

785790795800

leusertyrlysleuserglyglnaspalaseralailethrtrplys

805810815

leuthrglyasnleuglyglygluasptyrglnasplysvalarggly

820825830

proleuasngluglyglyleutyralagluargglnglyphehisgln

835840845

proglnproproserglusertrpgluserglyserproleuglugly

850855860

leuserlysproglyileglyphetyrthralaglnpheaspleuasp

865870875880

leuprolysglytrpaspvalproleutyrpheasnpheglyasnasn

885890895

thrglnalaalaargalaglnleutyrvalasnglytyrglntyrgly

900905910

lysphethrglyasnvalglyproglnthrserpheprovalproglu

915920925

glyileleuasntyrargglythrasntyrvalalaleuserleutrp

930935940

alaleugluseraspglyalalysleuglyserphegluleusertyr

945950955960

thrthrprovalleuthrglytyrglyaspvalgluserproglugln

965970975

prolystyrgluglnarglysglyalatyr

980985

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<212>dna

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245250255

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asnlysvalleuvalleutyrglyglyprolysgluhishisgluleu

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