一種紙制品細菌菌落檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種紙制品細菌菌落檢測方法，包括以下步驟：1）制備TGEA培養(yǎng)基或者LB培養(yǎng)基；2）滅菌；3）制備紙漿懸浮液；4）接種培養(yǎng)；5）CO2生成量的檢測并計算細菌菌落數(shù)量。本發(fā)明嚴格限定了培養(yǎng)基的種類和紙漿懸浮液的濃度，加速了CO2的生成速度和生成量，從而減少了檢測紙制品中細菌菌落數(shù)量所用的時間，提高了檢測效率。
【專利說明】一種紙制品細菌菌落檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種紙制品細菌檢測方法，尤其涉及一種用于衛(wèi)生紙的細菌檢測方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在紙產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)原料、工具設(shè)備、工藝流程、操作者的衛(wèi)生狀況以及生 產(chǎn)的消毒狀況等很多方面都會造成衛(wèi)生紙的細菌污染。受污染的衛(wèi)生紙會給人體健康帶來 極大的安全隱患，所以對衛(wèi)生紙中的細菌含量必須進行嚴格地控制?？焖?、準確、高效地檢 測衛(wèi)生紙中的細菌含量，對及時了解并保證產(chǎn)品使用的安全性具有重要的指導(dǎo)意義。
[0003] 目前，在用于檢測紙與紙板細菌含量的方法中，均采用經(jīng)典的平板菌落計數(shù)法。但 是由于該法在培養(yǎng)菌落的過程中，可受到如操作不熟練、培養(yǎng)基溫度過高損傷細胞及環(huán)境 衛(wèi)生條件不嚴格等的影響而引起污染，因此其測定結(jié)果誤差很大。另外，由于細菌在適宜的 固體培養(yǎng)基中形成菌落通常需要較長的時間(如24小時)才能在平板上進行計數(shù)，因此大大 影響了樣品中細菌含量的檢測效率。
[0004] 目前，國家衛(wèi)生機構(gòu)已將大腸菌群作為評價生活用紙衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標之一。 在衛(wèi)生紙以及衛(wèi)生紙原紙的國家標準及一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準中，大腸菌群檢測指 標均為不應(yīng)檢出（即：檢出為不合格)。隨著人們生活質(zhì)量的提高，生活用紙的需求量也越來 越大。因此，大腸菌群快速準確的檢測，對監(jiān)測生活用紙產(chǎn)品質(zhì)量進而保障消費者的生命健 康，具有重要的現(xiàn)實意義。
[0005] 早在1997年，Gardinia等人提出了采用頂空氣相色譜研究細菌生長規(guī)律的方法， 它通過檢測微生物代謝過程中二氧化碳（CO2)的釋放量來實現(xiàn)對微生物細胞活性和繁殖能 力的監(jiān)測。由于氣相色譜的熱導(dǎo)檢測器對CO 2較靈敏、方便，因此可以大大提高檢測的效率。 2008年，柴欣生等人采用一種多次頂空抽提氣相色譜技術(shù)，實現(xiàn)了對細菌生長規(guī)律的自動 化原位檢測，從而克服了取樣的不確定性并使樣品檢測的準確性顯著提高。然而，關(guān)于采用 頂空氣相色譜技術(shù)替代傳統(tǒng)的檢測批量產(chǎn)品細菌數(shù)量指標及大腸菌群指標的方法的研究 還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是根據(jù)上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種精確度高而又快 捷的檢測方法。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題本發(fā)明采取如下技術(shù)方案： 一種紙制品細菌菌落檢測方法，包括以下步驟： 1) 制備TGEA培養(yǎng)基或者LB培養(yǎng)基； 2) 將培養(yǎng)基、頂空瓶(包括墊片與鋁蓋)、壓蓋器、剪刀等器材置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅 菌，當(dāng)溫度降至l〇〇°C以下時，將其取出放于無菌室冷卻。
[0008] 3)在無菌操作條件下，稱取一定量紙樣，剪成碎片，加入裝有滅菌培養(yǎng)基的打散 杯中打散，或者加入裝有滅菌培養(yǎng)基和玻璃珠的錐形瓶中，充分搖勻，制成濃度為0. 5? 5g/100ml的紙漿懸浮液； 4) 用移液槍移取IOmL的紙漿懸浮液置于頂空瓶中并壓蓋密封，將頂空瓶放于培養(yǎng)箱 培養(yǎng)8小時后迅速用注射器向頂空瓶中注入ImL濃度為2mol/L的硫酸； 5) 將培養(yǎng)后的頂空瓶置于頂空氣相色譜儀器檢測CO2含量，記錄下檢測器測得的CO2氣 相色譜峰的面積并計算出細菌菌落總數(shù)。
[0009] 使用上述方法只需8小時即可檢測出細菌菌落數(shù)量，較現(xiàn)有技術(shù)中的24小時，大 大縮短了檢測時間，另外，本發(fā)明加入硫酸，也進一步加快了二氧化碳的釋放，避免對二氧 化碳的吸收，提1? 了檢測精度。
[0010] 所述TGEA培養(yǎng)基制備方法為：準確稱取牛肉浸膏3 g、胰蛋白胨5 g、D-葡萄糖1 g、吐溫-80 0.02mL溶于IL蒸餾水中，混合均勻，用lmol/L的NaOH中和至pH為7.0±0.2 ; 所述LB培養(yǎng)基的制備方法為：準確稱取酵母浸膏2.5 g、胰蛋白胨5 g、D-葡萄糖I g、吐 溫-80 0. 02mL溶于IL的蒸餾水中，混合均勻，用lmol/L的NaOH中和至pH為7. 0±0. 2。 本申請選用特定培養(yǎng)基，加速了 CO2的生產(chǎn)兩，縮短了檢測時間，提高了檢測精度。
[0011] 本方法步驟2)所述高壓蒸汽滅菌溫度為121°C，滅菌時間為20min。
[0012] 進一步的，本方法步驟3)中，稱取I. 5g紙樣，剪成IcmX2cm的碎片并加入裝有 300mL滅菌培養(yǎng)基的打散杯中打散lmin，制成質(zhì)量濃度為0. 5g/100ml的紙漿懸浮液；或者 稱取15g紙樣，剪成IOmmX IOmm的碎片并加入裝有300mL滅菌培養(yǎng)基和玻璃珠的錐形瓶 中，充分搖勻，制成質(zhì)量濃度為5g/100ml的紙漿懸浮液。
[0013] 進一步的，步驟4)中的紙漿懸浮液在培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，如不能立即去頂空氣相色譜 儀檢測CO 2含量，需要將頂空瓶放入-4°C的冰箱中冷凍，檢測前再解凍。
[0014] 更進一步的，步驟5)所述頂空氣相色譜檢測條件為：平衡溫度60°C，平衡時間 20min，色譜柱溫度45°C，檢測時間3min。
[0015] 本發(fā)明嚴格限定了培養(yǎng)基的種類和紙漿懸浮液的濃度，加速了 CO2的生成速度和 生成量，從而減少了檢測紙制品中細菌菌落數(shù)量所用的時間，提高了檢測效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是不同濃度紙漿懸浮液與C02生成量和生產(chǎn)時間曲線圖； 圖2是不同濃度紙漿懸浮液與C02生成量的關(guān)系曲線圖； 圖3是紙漿懸浮液的纖維分散效果圖：其中，（a)為通過加玻璃珠搖勻下的纖維分散效 果圖；（b)為通過打散杯打散下的纖維分散效果圖； 圖4是紙漿懸浮液制備方式對檢測結(jié)果的影響效果圖。

【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0018] 實施例1 本實施例以衛(wèi)生紙為例，按如下步驟對衛(wèi)生紙中細菌菌落總數(shù)進行檢測： 1)制備TGEA培養(yǎng)基 準確稱取牛肉浸膏3 g、胰蛋白胨5 g、D-葡萄糖I g、吐溫-80 0.02mL溶于IL的蒸餾 水中，混合均勻，用lmol/L的NaOH中和至pH為7. O±0. 2,分裝待用。
[0019] 2)滅菌 將培養(yǎng)基、以及本方法所涉及的頂空瓶(包括墊片與鋁蓋)、壓蓋器、剪刀等器材置于高 壓蒸汽滅菌鍋中在121°C條件下滅菌20min，當(dāng)溫度降至KKTC以下時，將其取出放于無菌 室冷卻。
[0020] 3)紙漿懸浮液的制備 在無菌操作條件下，在超凈工作臺上稱量被測紙樣I. 5g，剪成IcmX2cm的碎片并加入 裝有300mL滅菌培養(yǎng)基的打散杯中打散lmin，制成質(zhì)量濃度為0. 5%的紙漿懸浮液。
[0021] 4)接種培養(yǎng) 用移液槍移取IOmL的紙漿懸浮液置于頂空瓶中壓蓋密封，將頂空瓶放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 小時后立即用注射器向頂空瓶中注入ImL濃度為2mol/L的硫酸。
[0022] 5) CO2生成量的檢測 將培養(yǎng)后的頂空瓶置于頂空氣相色譜儀器檢測CO2含量，記錄下檢測器測得的CO2氣相 色譜峰的面積。
[0023] 頂空氣相色譜主要檢測條件如下：平衡溫度60°C，平衡時間20min，色譜柱溫度 45°C，檢測時間3min。
[0024] 如步驟4)中經(jīng)過培養(yǎng)箱培養(yǎng)后的紙漿懸浮液不能立即去頂空氣相色譜儀檢測CO2 含量，則需要將頂空瓶放入-4°C的冰箱中冷凍，檢測前再解凍。
[0025] 6)細菌菌落總數(shù)的計算 由于C02的釋放量與頂空氣相色譜信號峰面積之間的關(guān)系為線性關(guān)系，因此，衛(wèi)生紙 中細菌菌落總數(shù)按照以下公式進行計算：

【權(quán)利要求】
1. 一種紙制品細菌菌落檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 制備TGEA培養(yǎng)基或者LB培養(yǎng)基； 2) 將培養(yǎng)基、頂空瓶(包括墊片與鋁蓋)、壓蓋器、剪刀等器材置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅 菌，當(dāng)溫度降至l〇〇°C以下時，將其取出放于無菌室冷卻； 3) 在無菌操作條件下，稱取一定量紙樣，剪成碎片，加入裝有滅菌培養(yǎng)基的打散杯中打 散，或者加入裝有滅菌培養(yǎng)基和玻璃珠的錐形瓶中，充分搖勻，制成濃度為〇. 5?5g/100ml 的紙漿懸浮液； 4) 用移液槍移取10mL的紙漿懸浮液置于頂空瓶中并壓蓋密封，將頂空瓶放于培養(yǎng)箱 培養(yǎng)8小時后迅速用注射器向頂空瓶中注入lmL濃度為2mol/L的硫酸； 5) 將培養(yǎng)后的頂空瓶置于頂空氣相色譜儀器檢測C02含量，記錄下檢測器測得的C02氣 相色譜峰的面積，并計算出細菌菌落總數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述紙制品細菌菌落檢測方法，其特征在于，所述TGEA培養(yǎng)基制備 方法為：準確稱取牛肉浸膏3 g、胰蛋白胨5 g、D-葡萄糖1 g、吐溫-80 0.02mL溶于1L蒸 餾水中，混合均勻，用lmol/L的NaOH中和至pH為7. 0±0. 2 ; 所述LB培養(yǎng)基的制備方法為：準確稱取酵母浸膏2.5 g、胰蛋白胨5 g、D-葡萄糖1 g、 吐溫-80 0. 02mL溶于1L的蒸餾水中，混合均勻，用lmol/L的NaOH中和至pH為7. 0 ±0. 2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述紙制品細菌菌落檢測方法，其特征在于，步驟2)所述高壓蒸汽 滅菌溫度為121°C，滅菌時間為20min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述紙制品細菌菌落檢測方法，其特征在于，步驟3)中，稱取1. 5g 紙樣，剪成lcmX2cm的碎片并加入裝有300mL滅菌培養(yǎng)基的打散杯中打散lmin，制成 0. 5g/100ml的紙漿懸浮液；或者 稱取15g紙樣，剪成10mmX 10mm的碎片并加入裝有300mL滅菌培養(yǎng)基和玻璃珠的錐形 瓶中，充分搖勻，制成5g/100ml的紙楽懸浮液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述紙制品細菌菌落檢測方法，其特征在于，步驟4)中的紙漿懸浮 液在培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，如不能立即去頂空氣相色譜儀檢測C02含量，需要將頂空瓶放入-4°C的 冰箱中冷凍，檢測前再解凍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述紙制品細菌檢測方法，其特征在于，步驟5)所述頂空氣相色譜 檢測條件為：平衡溫度60°C，平衡時間20min，色譜柱溫度45°C，檢測時間3min。
【文檔編號】C12Q1/06GK104419745SQ201310411622
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】柴欣生, 陳春霞, 彭云云, 陳潤權(quán), 王玉峰 申請人:廣東省東莞市質(zhì)量監(jiān)督檢測中心