專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)菌檢測(cè)器具、細(xì)菌檢測(cè)方法及細(xì)菌檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測(cè)器具、細(xì)菌檢測(cè)方法及細(xì)菌檢測(cè)試劑盒，具體涉及細(xì)菌的特異性寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具、使用該細(xì)菌檢測(cè)器具的極其準(zhǔn)確且操作性高的細(xì)菌檢測(cè)方法及細(xì)菌檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
例如麥芽酒精飲料中混入有害微生物時(shí)，會(huì)產(chǎn)生渾濁、風(fēng)味劣化等現(xiàn)象，從而成為質(zhì)量劣化的原因。更加具體地說(shuō)，如對(duì)于啤酒來(lái)說(shuō)，乳酸桿菌屬(LactcAacilIus)、片球菌屬(Pediococcus)、梳狀菌屬(Pectinatus)等是代表性的有害細(xì)菌。其中，短乳桿菌 (Lactobacillus brevis)、酸面團(tuán)乳桿菌(Lactobacillus lindneri)是有名的啤酒污染菌。作為檢測(cè)這些有害細(xì)菌的方法，現(xiàn)在最普通的方法是，用膜過(guò)濾器將對(duì)象啤酒過(guò)濾后， 在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，然后檢測(cè)生長(zhǎng)的菌落。作為判斷該菌落是否為上述有害細(xì)菌的方法，使用的方法是將從菌落中提取的 DNA作為模板，使用上述有害細(xì)菌特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)電泳來(lái)判斷是否能夠得到 PCR產(chǎn)物(如參照日本國(guó)特開(kāi)平7489295號(hào)公報(bào)(
公開(kāi)日平成7年11月7日))。但是， 因?yàn)樵谠摲椒ㄖ忻總€(gè)菌種都需要使用多數(shù)引物進(jìn)行多次PCR反應(yīng)，操作極其煩雜，在快速性方面存在問(wèn)題。此外，為了縮短時(shí)間，雖然可將多數(shù)引物混合并在1個(gè)試管內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，但可使用的引物數(shù)量有限，所以難于根據(jù)微量檢體進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。為了解決上述問(wèn)題點(diǎn)，使用了下述方法，即、設(shè)計(jì)含有各種菌種內(nèi)普遍存在的基因的種特異性序列的部分可擴(kuò)增的引物，擴(kuò)增后用識(shí)別種特異性序列的限制酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，以電泳得到的電泳帶的大小來(lái)特定其為何種菌種的基因。但是，能夠識(shí)別所有對(duì)象菌種的限制酶未必都存在，并且，需要用多種類(lèi)限制酶分別切割得到的擴(kuò)增產(chǎn)物提供給電泳這樣極其煩雜的操作，在快速性、簡(jiǎn)便性方面存在問(wèn)題。進(jìn)而，為了解決上述問(wèn)題，還實(shí)施了下述方法，S卩、用種特異性序列作探針，通過(guò)雜交來(lái)判斷被檢體中的DNA或RNA中是否存在與該序列互補(bǔ)的序列。但是，上述通過(guò)雜交進(jìn)行判斷的方法，對(duì)于非常近緣的DNA同源性高的菌種，也存在頻繁發(fā)生與別的菌種進(jìn)行錯(cuò)誤雜交的交叉雜交問(wèn)題，有時(shí)難于準(zhǔn)確鑒定菌種。特別是，在上述代表性的啤酒污染菌即屬于乳酸桿菌屬的種中近緣菌非常多，使用頻繁發(fā)生交叉雜交的方法，不能達(dá)到檢測(cè)、鑒定有害細(xì)菌的目的。鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供可以準(zhǔn)確判斷特定細(xì)菌是否存在的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具、使用該細(xì)菌檢測(cè)器具通過(guò)簡(jiǎn)便操作能夠進(jìn)行快速準(zhǔn)確判斷的細(xì)菌檢測(cè)方法及細(xì)菌檢測(cè)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者為了解決上述課題進(jìn)行了精心研究，其結(jié)果在麥芽酒精飲料的代表性污染細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中，發(fā)現(xiàn)了特定屬或特定種特異性序列；并且發(fā)現(xiàn)使用根據(jù)該堿基序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的器具，通過(guò)和來(lái)源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交，可快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)、鑒定目的細(xì)菌，完成了本發(fā)明。本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具，是用于檢測(cè)、鑒定被檢試料中的細(xì)菌的器具，其特征在于，對(duì)象細(xì)菌是從(1)屬于短乳桿菌(LactcAacillus brevis)的細(xì)菌、(2)屬于酸面團(tuán)乳桿菌(Lactobacillus lindneri)的細(xì)菌、(3)屬于片球菌屬(Pediococcus)的細(xì)菌、(4)屬于巨球形菌屬(Megasphaera)的細(xì)菌、(5)屬于梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌中選擇的至少2種或2種以上的細(xì)菌，根據(jù)對(duì)象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面，通過(guò)該寡核苷酸和來(lái)源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交，來(lái)檢測(cè)、鑒定被檢試料中的細(xì)菌。本發(fā)明的(1) (5)的細(xì)菌，例如短乳桿菌(LactcAacillus brevis)是序列號(hào) 7 9及序列號(hào)71所示的堿基序列全部包含在16S核糖體RNA基因中的細(xì)菌。酸面團(tuán)乳桿菌(LactcAacillus lindneri)是序列號(hào)22 M所示的堿基序列全部包含在16S核糖體 RNA基因中的細(xì)菌。屬于片球菌屬(Pediococcus)的細(xì)菌是序列號(hào)36 45所示的堿基序列中至少2個(gè)堿基序列包含在16S核糖體RNA基因中的細(xì)菌。屬于巨球形菌屬(Megasphaera) 的細(xì)菌是序列號(hào)50 55所示的堿基序列中至少2個(gè)堿基序列包含在16S核糖體RNA基因中的細(xì)菌。屬于梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌是序列號(hào)56 58所示的堿基序列中至少 2個(gè)堿基序列包含在16S核糖體RNA基因中的細(xì)菌。作為本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具的檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌，優(yōu)選包括(6)屬于乳酸桿菌屬 (Lactobacillus)的細(xì)菌、(7)屬于鏈球菌屬(Streptococcus)的細(xì)菌、(8)屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌、(9)屬于發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的細(xì)菌、(10)屬于棒狀乳桿菌(Lactobacillus coryniformis)的細(xì)菌、(11)屬于彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的細(xì)菌、(12)屬于德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)的細(xì)菌、屬于發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillusfermentum)的細(xì)菌、(14)屬于壞發(fā)酵乳桿菌 (Lactobacillus malefermentans)的細(xì)菌、(15)屬于干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) Ii^ (Lactobacillus casei> Lactobacillus paracasein Lactobacillus zeae) ^tJ M "S、 (16)屬于鼠李糖乳桿菌(LactcAacillus rhamnosus)的細(xì)菌、(17)屬于布氏乳桿菌 (Lactobacillus buchneri)的細(xì)菌、(18)屬于而 久腸球菌(Enterococcus durans)的細(xì)菌、(19)屬于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的細(xì)菌。作為固定在基板表面的寡核苷酸，優(yōu)選為下述所示的寡核苷酸，本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具的特征是，至少1個(gè)或1個(gè)以上的所述寡核苷酸固定在基板表面。(A)其是根據(jù)屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)1所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)2所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)3所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)4所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)5所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)6所示的堿基序列的寡核苷酸。(B)其是根據(jù)短乳桿菌(LactcAacillus brevis)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)7所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)8所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)9所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)71所示的堿基序列的寡核苷酸。(C)其是根據(jù)棒狀乳桿菌(LactcAacillus coryniformis)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)10所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)11所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)12所示的堿基序列的寡核苷酸。(D)其是根據(jù)彎曲乳桿菌(LactcAacillus curvatus)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)13所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)14所示的堿基序列的寡核苷酸。(E)其是根據(jù)德氏乳桿菌(LactcAacillus delbrueckii)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)16所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)17所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)18所示的堿基序列的寡核苷酸。(F)其是根據(jù)發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)19所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)20所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)21所示的堿基序列的寡核苷酸。(G)其是根據(jù)酸面團(tuán)乳桿菌(LactcAacillus lindneri)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)22所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)23所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)M所示的堿基序列的寡核苷酸。(H)其是根據(jù)壞發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus malefermentans)的 16S 核糖體 RNA 基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)25所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)26所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)27 所示的堿基序列的寡核苷酸。(I)其是根據(jù)干酷乳桿菌(Lactobacillus casei)群(Lactobacillus casei、 Lactobacillus paracasei>Lactobacillus zeae) W 16SRNA SESIjfX^WMSj^ ^lJΦ WzFMEff^ (Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei) W^^ftj^^Ji^if 的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)28所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)四所示的堿基序列的寡核苷酸；以及是根據(jù)玉米乳桿菌(LactcAacillus zeae、且含有干酪乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株)特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)30所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)31所示的堿基序列的寡核苷酸。(J)其是根據(jù)鼠李糖乳桿菌(LactcAacillus rhamnosus)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)32所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)33所示的堿基序列的寡核苷酸。(K)其是根據(jù)布氏乳桿菌(LactcAacillus buchneri)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)34所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)35所示的堿基序列的寡核苷酸。
(L)其是根據(jù)屬于片球菌屬(Pediococcus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)36所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)37所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)38所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)39所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)40所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)41所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)42所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)43所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)44所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)45所示的堿基序列的寡核苷酸。(M)其是根據(jù)屬于鏈球菌屬(Sti^ptococcus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)46所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)47所示的堿基序列的寡核苷酸。(N)其是根據(jù)屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)48所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)49所示的堿基序列的寡核苷酸。(0)其是根據(jù)屬于巨球形菌屬(Megasphaera)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)50所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)51所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)52所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)53所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)M所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)陽(yáng)所示的堿基序列的寡核苷酸。(P)其是根據(jù)屬于梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)56所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)57所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)58所示的堿基序列的寡核苷酸。(Q)其是根據(jù)屬于發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)59所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)60所示的堿基序列的寡核苷酸。(R)其是根據(jù)屬于耐久腸球菌(Enterococcus durans)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)61所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)62所示的堿基序列的寡核苷酸。(S)其是根據(jù)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，并且是含有序列號(hào)63所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)64所示的堿基序列的寡核苷酸。(T)其是含有屬于部分明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌及屬于部分乳酸桿菌屬 (Lactobacillus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列的共同的堿基序列中的序列號(hào)72所示的堿基序列的寡核苷酸。通過(guò)使用將上述(A) (T)所述的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，能夠全部檢測(cè)、鑒定食品中的污染菌、特別是麥芽酒精飲料中的污染菌。此外，本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具，優(yōu)選上述基板表面具有碳化二亞胺基或異氰酸酯基，且該碳化二亞胺基或異氰酸酯基與所述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的連接子進(jìn)行反應(yīng)形成共價(jià)鍵。
本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)方法，是用于檢測(cè)、鑒定被檢試料中的細(xì)菌的方法，其特征在于，包括制備被檢試料中的細(xì)菌的核酸的核酸制備步驟、以該核酸為模板制備標(biāo)記探針的探針制備步驟、將所述探針與固定在上述本發(fā)明細(xì)菌檢測(cè)器具的基板表面的寡核苷酸進(jìn)行雜交的雜交步驟、檢測(cè)雜交信號(hào)的信號(hào)檢測(cè)步驟。作為本發(fā)明細(xì)菌檢測(cè)方法的被檢試料，優(yōu)選食品，其中最優(yōu)選麥芽酒精飲料。本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)試劑盒，是用于實(shí)施上述本發(fā)明細(xì)菌檢測(cè)方法的試劑盒，包含上述本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具，并且優(yōu)選包含雜交步驟、信號(hào)檢測(cè)步驟、探針制備步驟、核酸制備步驟中使用的試劑。本發(fā)明的其他目的、特征及優(yōu)點(diǎn)通過(guò)下述內(nèi)容可以充分理解，并且本發(fā)明的利益通過(guò)下述參照附圖的說(shuō)明可以得以證明。


圖1(a)是表示實(shí)施例中使用的本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具的基板上固定的寡核苷酸的排列位置圖。圖1 (b)是表示使用在圖1 (a)所示的排列位置上固定寡核苷酸的細(xì)菌檢測(cè)器具檢測(cè) Lactobacillus brevis 的結(jié)果圖像。
具體實(shí)施例方式對(duì)本發(fā)明的一種實(shí)施方式進(jìn)行如下說(shuō)明，此外，本發(fā)明并不限于下述實(shí)施方式。(1)本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具用于檢測(cè)、鑒定被檢試料中的細(xì)菌，根據(jù)對(duì)象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面，通過(guò)該寡核苷酸和來(lái)源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交，來(lái)檢測(cè)、鑒定被檢試料中的細(xì)菌。[基板]本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具所使用的基板的材質(zhì)，只要能夠使寡核苷酸穩(wěn)定地固定即可。例如可以為聚碳酸酯或塑料等合成樹(shù)脂、玻璃等，但并不限于這些材質(zhì)?；宓男螒B(tài)沒(méi)有特別限定，但可優(yōu)選使用如板狀、薄膜狀等基板。[固定在基板表面的寡核苷酸]固定在本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具的基板表面的寡核苷酸，只要是根據(jù)檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸即可。通過(guò)該寡核苷酸和來(lái)源于被檢試料的核酸之間進(jìn)行雜交，可檢測(cè)出被檢試料中含有的屬于目的種或?qū)俚募?xì)菌。此外，對(duì)于根據(jù)上述檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌所屬種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，以下恰當(dāng)?shù)胤Q(chēng)之為“捕獲性寡核苷酸(capture olig) ”。上述特異性堿基序列，只要從檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌的基因組堿基序列中選取屬或種特異性堿基序列即可，優(yōu)選從檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌的核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中選取。其中， 已知道細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中具有很多屬或種特異性堿基序列， 特別優(yōu)選從16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的DNA序列中選取屬或種特異性堿基序列。核糖體 RNA基因的堿基序列，可以從GenBank、EMBL、DDBJ等的數(shù)據(jù)庫(kù)等中得到。根據(jù)上述屬或種特異性堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)捕獲性寡核苷酸即可。因此，其可以為上述屬或種特異性堿基序列自身，只要能夠與從檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌中制備的核酸進(jìn)行特異性雜交，也可包含變異，變異的位置沒(méi)有特別限定。捕獲性寡核苷酸的長(zhǎng)度(堿基數(shù))沒(méi)有特別限定，如果太短難于對(duì)雜交進(jìn)行檢測(cè)， 如果太長(zhǎng)會(huì)發(fā)生非特異性雜交。本發(fā)明者對(duì)捕獲性寡核苷酸的最適合長(zhǎng)度進(jìn)行反復(fù)研究， 確定標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度為12 對(duì)個(gè)堿基。更優(yōu)選13 22個(gè)堿基，但并不限于此。本發(fā)明者確認(rèn)， 堿基長(zhǎng)度主要取決于序列特性(特定的堿基含有率、同一堿基的重復(fù))，結(jié)合性良好的序列即使鏈短，也可進(jìn)行特異性雜交。當(dāng)捕獲性寡核苷酸具有妨礙其與來(lái)源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、環(huán)狀結(jié)構(gòu)或除此之外的立體結(jié)構(gòu)時(shí)，通過(guò)將構(gòu)成捕獲性寡核苷酸的1個(gè)或1個(gè)以上的核苷酸置換為與肌苷或任何核苷酸不聯(lián)會(huì)的核酸，可以解除其立體結(jié)構(gòu)。捕獲性寡核苷酸的合成方法沒(méi)有特別限定，根據(jù)公知的方法(如Maniatis，Τ. et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)所述方法)合成即可。一般可以用市售的DNA合成機(jī)進(jìn)行化學(xué)合成。本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具，不僅將根據(jù)上述檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面，而且優(yōu)選在此基礎(chǔ)上將所謂的對(duì)照捕獲性寡核苷酸也固定在基板表面。對(duì)照捕獲性寡核苷酸包括陽(yáng)性對(duì)照捕獲性寡核苷酸及陰性對(duì)照捕獲性寡核苷酸。陽(yáng)性對(duì)照捕獲性寡核苷酸用于判斷下述探針制備步驟中的擴(kuò)增反應(yīng)是否順利進(jìn)行。陰性對(duì)照捕獲性寡核苷酸用于確認(rèn)未發(fā)生非特異性雜交，即未發(fā)生假陽(yáng)性雜交。本發(fā)明也包含這些陽(yáng)性對(duì)照捕獲性寡核苷酸及陰性對(duì)照捕獲性寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具。陽(yáng)性對(duì)照捕獲性寡核苷酸只要根據(jù)從檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌中制備的探針中所包含的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)即可。此外，使用同一細(xì)菌檢測(cè)器具同時(shí)檢測(cè)多數(shù)檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌時(shí)，可以對(duì)各檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照捕獲性寡核苷酸，或者也可以根據(jù)從多數(shù)檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌中制備的探針中的相同堿基序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。從所有檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌中制備的探針中沒(méi)有相同堿基序列時(shí)，也可分為數(shù)組分別設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照捕獲性寡核苷酸?；蛘咭部梢栽O(shè)計(jì)引物序列部分相同、 與對(duì)象細(xì)菌序列不同的人工序列，使該序列的一部分成為陽(yáng)性對(duì)照捕獲性寡核苷酸。以上述人工序列作模板制備探針(在本說(shuō)明書(shū)中稱(chēng)這種探針為對(duì)照探針)，通過(guò)添加到從被檢試料中制備的探針上，可以驗(yàn)證雜交的特異性。此外，在下面將對(duì)上述探針進(jìn)行說(shuō)明。陰性對(duì)照捕獲性寡核苷酸，優(yōu)選以下述方式設(shè)計(jì)，S卩、在陽(yáng)性對(duì)照捕獲性寡核苷酸的堿基序列中，在1個(gè)或1個(gè)以上的堿基且小于該序列具有的堿基數(shù)的未滿(mǎn)20%的范圍內(nèi)具有包含人工置換堿基的堿基序列。進(jìn)行堿基置換的堿基數(shù)，取決于與雜交條件之間的關(guān)系，可選擇來(lái)源于檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌的探針不發(fā)生雜交的堿基數(shù)。檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌沒(méi)有特別限定，可適當(dāng)選擇要從目的被檢試料中檢測(cè)的細(xì)菌。例如可以為混入食品中可能污染該食品的細(xì)菌。其中優(yōu)選可能混入、污染麥芽酒精飲料的細(xì)菌為檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌。食品中混入有害細(xì)菌已成為公共衛(wèi)生方面的非常大的問(wèn)題。此外，對(duì)于啤酒、發(fā)泡酒等所代表的麥芽酒精飲料，有害細(xì)菌混入時(shí)成為渾濁、風(fēng)味劣化等質(zhì)量劣化的原因，因此，特別期望開(kāi)發(fā)出快速且準(zhǔn)確檢測(cè)、鑒定這些有害細(xì)菌的方法。作為污染麥芽酒精飲料的細(xì)菌，可以為屬于乳酸桿菌屬(LactcAacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、巨球形菌屬(Megasphaera)以及梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌。并且屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的菌種，可以為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、棒狀乳桿菌(Lactobacillus coryniformis)、彎曲乳桿 M (Lactobacillus curvatus)、德氏季Llf (Lactobacillus delbrueckii)、 (Lactobacillus fermentum)、酸面團(tuán)乳桿菌(Lactobacillus lindneri)、壞發(fā)酵乳桿菌 (Lactobacillus malefermentans) λzFSS^LIf ^ (Lactobacillus casein Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、玉米乳桿菌(含有 Lactobacillus zeae、Lactobacillus casei 的標(biāo)準(zhǔn)株)。 此外，作為污染食品的細(xì)菌，除上述之外還可以為屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)及發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的細(xì)菌，以及耐久腸球菌(Enterococcus durans)和乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)。但檢測(cè)對(duì)象細(xì)菌并不限于上述細(xì)菌。用于檢測(cè)、鑒定上述所示細(xì)菌的捕獲性寡核苷酸，可以為根據(jù)屬于下述菌屬的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的各屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，所述菌屬為乳酸桿菌屬(LactcAacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬 (Streptococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、巨球形菌屬(Megasphaera)、梳狀菌屬 (Pectinatus)及發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)；以及可以為由下述菌種的16S核糖體RNA 基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的各細(xì)菌的種特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，所述菌種為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、棒狀乳桿菌(Lactobacillus coryniformis)、彎曲乳桿 lif (Lactobacillus curvatus)lif (Lactobacillus delbrueckii)lif (Lactobacillus fermentum)、酸面團(tuán)乳桿菌(Lactobacillus lindneri)、壞發(fā)酵乳桿菌 (Lactobacillus malefermentans) >zFSS-^LIf 1 (Lactobacillus casei> Lactobacillus paracasei) > IE ^H If lif (Lactobacillus rhamnosus) > 1 If lif (Lactobacillus buchneri)、玉米乳桿菌(含有 Lactobacillus zeae>LactobaciIlus casei 的標(biāo)準(zhǔn)株)、耐久腸球菌(Enterococcus durans)以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。具體來(lái)說(shuō),可以為含有序列號(hào)1 64、71及72所示的任何堿基序列的寡核苷酸，但并不限于這些寡核苷酸。表1例舉了通過(guò)根據(jù)乳酸桿菌屬(Lactobacillus)特異性堿基序列設(shè)計(jì)的捕獲性寡核苷酸(序列號(hào)1 6)、以及根據(jù)部分乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和部分明串珠菌屬 (Leuconostoc)所對(duì)應(yīng)的堿基序列設(shè)計(jì)的捕獲性寡核苷酸(序列號(hào)72)，可以檢測(cè)出的乳酸桿菌屬的細(xì)菌。但通過(guò)具有序列號(hào)1 6及72所示的任何堿基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測(cè)出的細(xì)菌，并不限于這些。[表 1]
權(quán)利要求
1.細(xì)菌檢測(cè)器具，用于檢測(cè)、鑒定被檢試料中的細(xì)菌，其特征在于，對(duì)象細(xì)菌是從下述 ⑴ (5)中所述的細(xì)菌中選擇的至少2種或2種以上的細(xì)菌，根據(jù)對(duì)象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面，通過(guò)該寡核苷酸和來(lái)源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交，來(lái)檢測(cè)、鑒定被檢試料中的細(xì)菌，(1)屬于短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)的細(xì)菌(2)屬于酸面團(tuán)乳桿菌(LactcAacilluslindneri)的細(xì)菌(3)屬于片球菌屬(Pediococcus)的細(xì)菌(4)屬于巨球形菌屬(Megasphaera)的細(xì)菌(5)屬于梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，所述對(duì)象細(xì)菌還包括下述(6) (19)中所述的細(xì)菌，(6)屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌(7)屬于鏈球菌屬(Streptococcus)的細(xì)菌(8)屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌(9)屬于發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的細(xì)菌(10)屬于棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)的細(xì)菌(11)屬于彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)的細(xì)菌(12)屬于德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)的細(xì)菌(13)屬于發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)的細(xì)菌(14)屬于壞發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusmalefermentans)的細(xì)菌(15)屬于干酪乳桿菌(LactcAacilluscasei)群的細(xì)菌(16)屬于鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)的細(xì)菌(17)屬于布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)的細(xì)菌(18)屬于耐久腸球菌(Enterococcusdurans)的細(xì)菌(19)屬于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的細(xì)菌。
3.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌的163核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1 種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)1所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)2所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)3所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)4所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)5所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào) 6所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
4.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)短乳桿菌(LactcAacillus brevis)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)7所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)8所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)9所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)71所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
5.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)棒狀乳桿菌(LactcAacilluscoryniformis)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)10所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)11所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)12所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
6.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)彎曲乳桿菌(LactcAacillus curvatus)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)13所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)14所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
7.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)16所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)17所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)18所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
8.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillus fermentum)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)19所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)20所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)21所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
9.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)酸面團(tuán)乳桿菌(LactcAacillus lindneri)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)22所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)23所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)M所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
10.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)壞發(fā)酵乳桿菌(LactcAacillus malefermentans)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)25所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)26所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)27所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
11.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)干酪乳桿菌(LactcAacilluscasei) 群的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1 種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)觀所示的堿基序列的寡核苷酸、 含有序列號(hào)四所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)30所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)31所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
12.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)鼠李糖乳桿菌(LactcAacillus rhamnosus)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)32所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)33所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
13.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)布氏乳桿菌(LactcAacillus buchneri)的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)34所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)35所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
14.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)屬于片球菌屬(Pediococcus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1 種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)36所示的堿基序列的寡核苷酸、 含有序列號(hào)37所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)38所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)39所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)40所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)41所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)42所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)43所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)44所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)45所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
15.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)屬于鏈球菌屬(Streptococcus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1 種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)46所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)47所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
16.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1 種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)48所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)49所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
17.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)屬于巨球形菌屬(Megasphaera) 的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)50所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)51所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)52所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)53所示的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)M所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)55所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
18.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)屬于梳狀菌屬(Pectinatus)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1 種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)56所示的堿基序列的寡核苷酸、 含有序列號(hào)57所示的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)58所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
19.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)屬于發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的細(xì)菌的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同屬的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1 種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)59所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)60所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
20.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)耐久腸球菌(Enterococcusdurans) 的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)61所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)62所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
21.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其為根據(jù)乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) 的16S核糖體RNA基因所對(duì)應(yīng)的堿基序列中的同種的特異性序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號(hào)63所示的堿基序列的寡核苷酸及含有序列號(hào)64所示的堿基序列的寡核苷酸組成。
22.如權(quán)利要求1 21中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)器具，其特征在于，所述基板表面具有碳化二亞胺基或異氰酸酯基，并且該碳化二亞胺基或異氰酸酯基與所述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的連接子進(jìn)行反應(yīng)形成共價(jià)鍵。
23.細(xì)菌檢測(cè)器具，用于檢測(cè)、鑒定被檢試料中的細(xì)菌，其特征在于，含有屬于明串珠菌屬(Leuconostoc)的細(xì)菌及/或?qū)儆谌樗釛U菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌的16S核糖體 RNA基因所對(duì)應(yīng)的序列中的序列號(hào)72所示的堿基序列的寡核苷酸固定在基板表面，通過(guò)該寡核苷酸和來(lái)源于被檢試料的核酸進(jìn)行雜交，來(lái)檢測(cè)、鑒定被檢試料中的細(xì)菌。
24.細(xì)菌檢測(cè)方法，其為檢測(cè)、鑒定被檢試料中的細(xì)菌的方法，其特征在于，包括制備被檢試料中細(xì)菌的核酸的核酸制備步驟、以該核酸為模板制備標(biāo)記探針的探針制備步驟、使所述探針和權(quán)利要求1 23中任一項(xiàng)所述的在細(xì)菌檢測(cè)器具的基板表面固定的寡核苷酸進(jìn)行雜交的雜交步驟、檢測(cè)雜交信號(hào)的信號(hào)檢測(cè)步驟。
25.如權(quán)利要求M所述的細(xì)菌檢測(cè)方法，其特征在于，所述被檢試料是食品。
26.如權(quán)利要求25所述的細(xì)菌檢測(cè)方法，其特征在于，所述食品是麥芽酒精飲料。
27.細(xì)菌檢測(cè)試劑盒，其用于實(shí)施權(quán)利要求M 沈中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)方法。
28.細(xì)菌檢測(cè)試劑盒，其為用于實(shí)施權(quán)利要求M 沈中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)方法的試劑盒，其特征在于，包含所述雜交步驟及/或信號(hào)檢測(cè)步驟使用的試劑。
29.如權(quán)利要求觀所述的細(xì)菌檢測(cè)試劑盒，其還包含所述探針制備步驟及/或所述核酸制備步驟使用的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供用簡(jiǎn)便操作可快速準(zhǔn)確地判斷混入被檢試料中的細(xì)菌的細(xì)菌檢測(cè)器具、細(xì)菌檢測(cè)方法及細(xì)菌檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)器具是微陣列型器具，其中根據(jù)對(duì)象細(xì)菌所屬的種或?qū)偬禺愋詨A基序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸固定在基板表面。根據(jù)從被檢試料中制備的探針和固定在上述基板表面的寡核苷酸是否發(fā)生雜交，可簡(jiǎn)便、快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)、鑒定被檢試料中的細(xì)菌。
文檔編號(hào)C12R1/46GK102337209SQ20111029078
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2005年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者中川浩子, 兒玉由紀(jì)子, 守屋彰悟, 小佐野薰, 田中幸一, 畑中一成 申請(qǐng)人:三得利控股株式會(huì)社