專利名稱：細菌微量快速同步檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微量快速同步檢測細菌特別是病原菌的方法。
背景技術(shù)：
病原菌嚴重危害人們的身體健康和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。若要控制其所引起的病害，就應及時地診斷以采取相應的預防措施。近年來，PCR(聚合酶鏈反應)技術(shù)已應用于病原菌的檢測。這些檢測技術(shù)可分為兩大類，分別為特異性引物PCR和非特異性引物PCR。前者依目的菌不同而有不同的引物序列，而不同引物序列又可能需要不同的擴增條件，若待檢菌不明，則難以達到快速特異檢測的目的(Peng X X，Zhang J Y，Wang S Y，et al，Immuno-capture PCRfor Detection of Aeromonas hydrophila.J.Microbiol.Methods.2002；49(3)335-338)后者一般根據(jù)細菌16S rRNA(核糖體核糖核酸)基因的保守性合成通用引物，所擴增的產(chǎn)物往往需要配合RFLP(限制性片段多態(tài)性分析)、SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)或序列分析才能進行確定，如所擴增產(chǎn)物來自2種以上病原菌，則很難直接得到結(jié)果。基于上述情況，我們設計利用抗體特異性識別待檢菌，再采用細菌16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增(UPPCR)，建立了通用引物免疫捕捉法PCR技術(shù)，可以達到快速特異地檢測混合物中病原菌的目的(CN02101983.5，廈門大學，用于檢測細菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法)。由于病原菌的種類較多，有些病原菌還有較多的亞型和血清型。采用抗體捕捉法UPPCR進行檢測，則需要較多的材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種利用UPPCR-DGGE(通用引物PCR擴增-變性梯度凝膠電泳)微量快速同步檢測多種細菌的方法。其技術(shù)方案是首先利用16S rRNA基因通用引物進行擴增，得到待檢樣本中所有細菌的該基因片段，然后進行DGGE分析以確定該細菌。
本發(fā)明的具體步驟如下1)制備模板2)PCR擴增(UPPCR)擴增引物為細菌核糖體核糖核酸基因通用引物；3)變性梯度凝膠電泳(DGGE)取擴增產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳，與標準對照比較，確定混合細菌的種類。
制備模板可采用直接熱變性法或抗體捕捉后熱變性法，所說的直接熱變性法的步驟為取混合細菌培養(yǎng)物，加熱至裂解，離心取上清液。所說的抗體捕捉后熱變性法的步驟為取混合培養(yǎng)細菌液加入包被了針對2種以上的特異性抗體，加熱至裂解，取上清液。然后進行UPPCR。
本發(fā)明采用UPPCR技術(shù)擴增細菌的16S rRNA基因片段，從而獲得培養(yǎng)基中所有細菌相應基因片段序列的信息，再采用DGGE鑒定這些混合細菌的擴增產(chǎn)物，以確定檢測的細菌。從而建立了一種采用UPPCR和DGGE相結(jié)合的微量快速同步鑒定混合細菌的檢測技術(shù)。本發(fā)明的基本原理是細菌的16S rRNA基因具有高度的保守性，通用引物可擴增幾乎所有細菌，因此可以獲得待檢標本中的所有細菌的信息。再依據(jù)DGGE分離的敏感性將混合細菌產(chǎn)物逐一分開，最后將其與標準圖譜對照，則可以鑒定細菌，從而達到微量、快速、同步檢測混合細菌尤其是病原菌的目的。


圖1為直接法獲取病原菌模板的UPPCR產(chǎn)物圖譜及產(chǎn)物的DGGE分析結(jié)果。在圖1中，A.UPPCR結(jié)果。M，分子量標準；1，熒光假單胞菌；2，鰻弧菌；3，河弧菌；4，嗜水氣單胞菌；5，雷氏普羅威登斯菌；6，溫和氣單胞菌；7，6種菌混合。B.DGGE結(jié)果；1，熒光假單胞菌；2，鰻弧菌；3，河弧菌；4，嗜水氣單胞菌；5，雷氏普羅威登斯菌；6，溫和氣單胞菌，7，6種菌混合。
圖2為抗體法獲取病原菌模板的UPPCR產(chǎn)物圖譜及產(chǎn)物的DGGE分析結(jié)果。在圖2中，A.UPPCR結(jié)果。M，分子量標準；1，志賀氏痢疾桿菌血清1型；2，鮑氏痢疾桿菌血清1型；3，福氏痢疾桿菌1a型；4，福氏痢疾桿菌3a型；5，4種菌混合。B.DGGE結(jié)果。1，志賀氏痢疾桿菌血清1型；2，鮑氏痢疾桿菌血清1型；3，福氏痢疾桿菌1a型；4，福氏痢疾桿菌3a型；5，4種菌混合。
具體實施例方式
以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1使用直接熱變性法制備模板，將細菌接種于LB培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)12～18h，作為種子菌，而后以1∶50(菌液∶培養(yǎng)基)比例接種于上述同種培養(yǎng)基，28～37℃搖床培養(yǎng)12～13h；取菌液0.5ml于無菌1.5ml離心管中，3,500轉(zhuǎn)/分離心20min，棄上清；沉淀用蒸餾水洗一遍，加入無菌雙蒸水0.8ml，混勻，于100℃水浴中煮10min；將水浴后的離心管置0℃冰浴中冷卻，再用12,000rpm離心10min，吸取15～30μl(25μl PCR反應體系取15μl，50μl PCR反應體系取30μl)上清液作為PCR反應模板。
按順序吸加2.5μl 10×緩沖液，0.5μl dNTP(核苷酸混合物，各10mM)，0.7μlMgCl2(25mM)，0.16μl引物混合液(引物15’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCACAAGCGGTGGAGCATGTG，其中在5’端加了40個核苷酸的GC clamp，為的是穩(wěn)定DGGE的分辨能力；引物25′-GCCCGGGAACGTATTCACCG)，0.2μl Taq酶(5u·μl-1)，及15μl模板，于各PCR管中，最后以無菌雙蒸水補足至體積為25μl，各試劑充分混勻并稍加離心后收集于管底；將加樣后的小離心管置于PCR擴增儀中，擴增程序為94℃ 10min，然后94℃ 1min，68℃min，72℃ 3min，此后每個循環(huán)退火溫度降0.5℃，直至58℃，再以退火溫度為58℃重復20個PCR循環(huán)，最后72℃ 10min；擴增后取PCR產(chǎn)物5μl，與適量加樣緩沖液(0.25％溴酚藍，40％蔗糖水溶液)混合，點樣于含0.5μg/mL溴化乙啶(EB)的2％瓊脂糖凝膠中，80V電泳30min，隨后觀察結(jié)果。
DGGE將7L1×TAE(三羥甲基氨基甲烷乙酸電泳)緩沖液(三羥甲基氨基甲烷48.4g，冰醋酸11.42ml，0.5M乙二胺四乙酸二鈉20ml pH8.0，加蒸餾水至200ml為50X緩沖液，高壓滅菌，室溫保存)倒入電泳槽中，把溫度控制器架在電泳槽上，連好電線，將溫度控制器上的開關(guān)、泵及加熱器依次打開；將溫度控制器設定到預定溫度為56℃，溫度變化率為200℃/h，以進行電泳液的預熱；用干凈的玻璃板、墊片組裝一套16cm×16cm平行梯度凝膠夾層，并將其鎖定在灌膠架上，使之保持水平；用兩個配套的注射器分別與軟管相連，在注射器上標“LO”與“HI”，分別用“LO”注射器和“HI”注射器吸入0％變性膠和70％變性膠(在70％變性膠中加入320μl變性梯度形成的指示液)；設定梯度混合器(cam wheel)的體積為14.5mL，將連有Y形管及16號針頭的一對注射器分別固定在梯度混合器的兩邊；轉(zhuǎn)動齒輪，將膠液灌到夾層中，插上干凈的梳子，待凝；凝后，拔去梳子，取下夾層；兩塊夾層分別固定于電泳槽中，在上槽中倒入350ml 1×TAE緩沖液，按正確方向放上溫度控制儀，再打開電源開關(guān)、泵及加熱器，使系統(tǒng)達到設定的56℃；用5μl PCR擴增樣品與等量2×凝膠加樣染色液(0.25％溴酚藍，40％蔗糖水溶液)混合，加樣在清洗過的加樣孔中(為提高敏感性可以通過濃縮處理提高PCR產(chǎn)物的濃度)；調(diào)電壓為20V 20min，然后100電泳10～12h，同時打開溫度控制器，使系統(tǒng)維持在56℃；電泳完成后，關(guān)閉電源及加熱系統(tǒng)，取下夾層，取出膠塊；將膠放入裝有250ml 1×TAE緩沖液及25μl 0mg/ml溴化乙啶的染色盤中，染色5～10min；染色以后，將膠移到裝有250ml 1×TAE緩沖液的盤中，脫色5～20min；將染色后的膠放在多色凝膠成像系統(tǒng)中掃描，保存結(jié)果。
實施例2與實施例1類似，其不同在于采用抗體捕捉后熱變性法制備模板，將能與多種細菌反應的抗體(如型、群特異性抗體)用pH9.6，0.01mol/L碳酸緩沖液稀釋分別包被至96孔酶聯(lián)反應板各孔(1～10μg/ml)，每孔50μl，于4℃冰箱過夜；然后用pH7.4，0.01mol/L磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入50μl 10％小牛血清，36～38℃封閉1hr，甩干；每孔加入細菌液體培養(yǎng)液20～40μl(25μl PCR反應體系加20μl，50μl PCR反應體系加40μl)，于36～38℃溫育1～2h，用PBS-T洗液洗板5次，每次3～5min。每孔加入20～40μl(與所加細菌溶液體積一致)無菌雙蒸水，沸水浴加熱8～10min，吸取15～30μl(25μl PCR反應體系取15μl，50μL PCR反應體系取30μl)裂解液作為PCR反應模板。
實施例3細菌模板制備采用熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，鰻弧菌(Vibrioanguillarum)，河弧菌(Vibrio fluvialis)，嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri)，溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)，為本申請人保存菌種。將上述細菌分別和混合接種于LB培養(yǎng)基，共7管，28℃搖床培養(yǎng)12～18h，作為種子菌。而后以1∶50(菌液∶培養(yǎng)基)比例接種于上述同種培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)12～13h；取菌液0.5ml于新的無菌1.5ml小離心管中，3,500轉(zhuǎn)/分離心20min，棄上清；沉淀用蒸餾水洗一遍，加入無菌雙蒸水0.8ml，混勻，于100℃水浴中煮10min；將水浴后的小離心管置于0℃冰浴中冷卻，再用12,000rpm離心10min，吸取15μL上清液作為PCR反應模板。
UPPCR取無菌的新槍頭按順序吸加2.5μl 10×緩沖液，0.5μl dNTP(各10mM)，0.7μl MgCl2(25mM)，0.16μl引物混合液(引物15′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCACAAGCGGTGGAGCATGTG+引物25′-GCCCGGGAACGTATTCACCG)，0.2μl Taq酶(5u·μl-1)，及15μl模板，最后以無菌雙蒸水補足至終體積為25μl，各試劑充分混勻并稍加離心后收集于管底；將加樣后的小離心管置于PCR擴增儀中，設定程序為94℃ 10min，然后94℃ 1min，68℃min，72℃ 3min，此后每個循環(huán)退火溫度降0.5℃，直至58℃，再以退火溫度為58℃重復20個PCR循環(huán)，最后72℃ 10min；擴增完成后取下離心管。取PCR產(chǎn)物5μl，與適量加樣緩沖液混合，點樣于含0.5μg/mL溴化乙啶(EB)的2％瓊脂糖凝膠中，80V電泳30min，隨后觀察結(jié)果。
DGGE按實施例1的方法進行，每管點1個樣。
實施例4細菌模板制備采用志賀氏痢疾桿菌血清1型(S.dysenteriae serotypel)，鮑氏痢疾桿菌血清1型(S.boydii serotype 1)，福氏痢疾桿菌1a型(S.flexneri serotype 1a)，福氏痢疾桿菌3a型(S.flexneri serotype 3a)，均為本申請人保存菌種。將上述4種細菌分別和混合接種于LB培養(yǎng)基，共5管，37℃搖床培養(yǎng)12～18h，作為種子菌。而后以1∶50(菌液∶培養(yǎng)基)比例接種于上述同種培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)12～13h過夜取菌液20μl加入包被了痢疾桿菌抗體(此抗體對所有痢疾桿菌均可以發(fā)生特異結(jié)合)的酶標板中，于36～38℃溫育1h，用PBS-T洗液洗板5次，每次3～5min。每孔加入20μl無菌雙蒸水，沸水浴加熱8～10min，吸取15μl裂解液作為PCR反應模板。
UPPCR同實施例3。
DGGE同實施例3。
權(quán)利要求
1.細菌微量快速同步檢測方法，其特征在于步驟為1)制備模板；2)PCR擴增擴增引物為細菌核糖體核糖核酸基因通用引物；3)變性梯度凝膠電泳取擴增產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳，與標準對照比較，確定混合細菌的種類。
2.如權(quán)利要求1所述的細菌微量快速同步檢測方法，其特征在于所說的制備模板采用直接熱變性法或抗體捕捉后熱變性法，所說的直接熱變性法的步驟為取混合細菌培養(yǎng)物，加熱至裂解，離心取上清液；所說的抗體捕捉后熱變性法的步驟為取混合培養(yǎng)細菌液加入包被了針對2種以上的特異性抗體，加熱至裂解，取上清液，然后進行UPPCR。
3.如權(quán)利要求1所述的細菌微量快速同步檢測方法，其特征在于所說的擴增引物為5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCACAAGCGGTGGAGCATGTG和5′-GCCCGGGAACGTATTCACCG引物。
4.如權(quán)利要求2所述的細菌微量快速同步檢測方法，其特征在于所說的直接熱變性法為將細菌接種于LB培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)12～18h，作為種子菌，而后以1∶50(菌液∶培養(yǎng)基)比例接種于上述同種培養(yǎng)基28℃或37℃搖床培養(yǎng)12～13h；取菌液0.5ml于無菌1.5ml離心管中，3,500轉(zhuǎn)/分離心20min，棄上清；沉淀用蒸餾水洗一遍，加入無菌雙蒸水0.8ml，混勻，于100℃水浴中煮10min；將水浴后的離心管置0℃冰浴中冷卻，再用12,000rpm離心10min，吸取15～30μl上清液作為PCR反應模板。
5.如權(quán)利要求2所述的細菌微量快速同步檢測方法，其特征在于所說的抗體捕捉后熱變性法將能與多種細菌反應的抗體用pH9.6，0.01mol/L碳酸緩沖液稀釋分別包被至96孔酶聯(lián)反應板各孔1～10μg/ml，每孔50μl，于4℃冰箱過夜；然后用pH7.4，0.01mol/L磷酸鹽—吐溫緩沖液洗板3次，每次3～5min；每孔加入50μl 10％小牛血清，36～38℃封閉1hr，甩干；每孔加入細菌液體培養(yǎng)液20～40μl，于36～38℃溫育1h，用PBS-T洗液洗板5次，每次3～5min，每孔加入20～40μl無菌雙蒸水，沸水浴加熱8～10min，吸取15～30μl裂解液作為PCR反應模板。
6.如權(quán)利要求1所述的細菌微量快速同步檢測方法，其特征在于所說的PCR擴增為按順序吸加2.5μl 10×緩沖液，0.5μl dNTP，0.7μl MgCl225mM，0.16μl引物混合液，引物15’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGG CGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCACAAGCGGTGGAGCATGTG，其中在5’端加了40個核苷酸的GC clamp，為的是穩(wěn)定DGGE的分辨能力；引物25′-GCCCGGGAACGTATTCACCG，0.2μl Taq酶，及15μl模板，于各PCR管中，最后以無菌雙蒸水補足至體積為25μl，各試劑充分混勻并稍加離心后收集于管底；將加樣后的小離心管置于PCR擴增儀中，擴增程序為94℃ 10min，然后94℃ 1min，68℃min，72℃ 3min，此后每個循環(huán)退火溫度降0.5℃，直至58℃，再以退火溫度為58℃重復20個PCR循環(huán)，最后72℃ 10min；擴增后取PCR產(chǎn)物5μl，與加樣緩沖液混合，點樣于含0.5μg/mL溴化乙啶的2％瓊脂糖凝膠中，80V電泳30min，隨后觀察結(jié)果。
7.如權(quán)利要求1所述的細菌微量快速同步檢測方法，其特征在于所說的DGGE為將7L1×三羥甲基氨基甲烷乙酸電泳緩沖液倒入電泳槽中，把溫度控制器架在電泳槽上，連好電線，將溫度控制器上的開關(guān)、泵及加熱器依次打開；將溫度控制器設定到預定溫度為56℃，溫度變化率為200℃/h，以進行電泳液的預熱；用干凈的玻璃板、墊片組裝一套16cm×16cm平行梯度凝膠夾層，并將其鎖定在灌膠架上，使之保持水平；用兩個配套的注射器分別與軟管相連，在注射器上標“LO”與“HI”，分別用“LO”注射器和“HI”注射器吸入0％變性膠和70％變性膠；設定梯度混合器的體積為14.5mL，將連有Y形管及16號針頭的一對注射器分別固定在梯度混合器的兩邊；轉(zhuǎn)動齒輪，將膠液灌到夾層中，插上干凈的梳子，待凝；凝后，拔去梳子，取下夾層；兩塊夾層分別固定于電泳槽中，在上槽中倒入350ml 1×TAE緩沖液，按正確方向放上溫度控制儀，再打開電源開關(guān)、泵及加熱器，使系統(tǒng)達到設定的56℃；用5μl PCR擴增樣品與等量2×凝膠加樣染色液混合，加樣在清洗過的加樣孔中；調(diào)電壓為20V 20min，然后100電泳10～12h，同時打開溫度控制器，使系統(tǒng)維持在56℃；電泳完成后，關(guān)閉電源及加熱系統(tǒng)，取下夾層，取出膠塊；將膠放入裝有250ml1×TAE緩沖液及25μl 0mg/ml溴化乙啶的染色盤中，染色5～10min；染色以后，將膠移到裝有250ml 1×TAE緩沖液的盤中，脫色5～20min；將染色后的膠放在多色凝膠成像系統(tǒng)中掃描，保存結(jié)果。
全文摘要
細菌微量快速同步檢測方法，涉及一種微量快速同步檢測細菌的方法。步驟為制備模板；PCR擴增擴增引物為細菌核糖體核糖核酸基因通用引物；變性梯度凝膠電泳取擴增產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳，確定種類。采用UPPCR技術(shù)擴增細菌的16S rRNA基因片段，獲得培養(yǎng)基中所有細菌相應基因片段序列的信息，再采用DGGE鑒定混合細菌的擴增產(chǎn)物，以確定檢測的細菌。建立采用UPPCR和DGGE相結(jié)合的微量快速同步鑒定混合細菌的檢測方法。達到微量、快速、同步檢測混合細菌尤其是病原菌的目的。
文檔編號C12Q1/68GK1699596SQ20041004543
公開日2005年11月23日 申請日期2004年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月19日
發(fā)明者彭宣憲, 紀念念, 彭博, 王三英 申請人:廈門大學