專利名稱：一種檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及奇異變形桿菌的檢測，具體的說是一種檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列及其應用。
背景技術：
奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)屬于變形桿菌屬(Proteus)，廣泛存在于泥土、水和糞便等受到污染的環(huán)境。奇異變形桿菌是環(huán)境中的一種條件致病菌，是一種常見的能夠感染人類并引起人體病變的病原菌。近年來，臨床上由奇異變形桿菌引起的食物中毒發(fā)生率顯著提高，嚴重威脅到人們的健康。但是，有關奇異變形桿菌的檢測方法還比較落后，國內(nèi)外專門開展該菌檢測方法研究的報道也較少。目前對奇異變形桿菌的檢測多采用傳統(tǒng)方法，主要以實驗室分離和生理生化鑒定為主，此類方法繁瑣費時，一般需要4到5天，檢測周期比較長，且主觀性強，容易造成漏檢和誤檢，因此出現(xiàn)假陽性和假陰性的現(xiàn)象。16SrDNA鑒定亦需要3到5天的時間，而且大多數(shù)情況下需要結(jié)合生理生化鑒定才能確定細菌為哪一個種群。利用基于特異的核酸標識序列進行PCR檢測細菌的技術目前已經(jīng)得到認同，并且正在推廣，該技術相對傳統(tǒng)的細菌檢測方法具有高通量、檢測速度快、特異性強和靈敏度高等優(yōu)點。利用PCR等分子方法進行奇異變形桿菌的檢測具有檢測過程快速和靈敏度高等優(yōu)點。PCR的擴增過程僅需要2個小時， 大大縮減了檢驗檢疫所需要的時間，提高了工作效率。而且利用實時熒光定量PCR能夠較快和較為準確地對環(huán)境中的細菌，尤其是病原菌，進行定量檢測。但是目前能夠用于PCR檢測奇異變形桿菌的特異核酸標識序列發(fā)現(xiàn)的還比較少，目前已知的奇異變形桿菌的核酸標識序列主要有16S序列，16S-23S間區(qū)序列，ureC序列和一段功能未知的核酸片段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列及其應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為一種檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列ureRFl :5，-GGTGAGATTTGTATTAATGG-3，ureRRl :5’ -ATAATCTGGAAGATGACGAG-3，。檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列的應用所述奇異變形桿菌特異的核酸標識序列應用于檢測環(huán)境中的奇異變形桿菌。采用普通PCR定性檢測奇異變形桿菌，具體過程為(1)以核酸標識序列ureRFl和ureRRl為正向引物和反向引物進行PCR, 15μ 1的 PCR的反應體系，PCR體系的反應條件為94°C變性％iin，然后94°C變性40seC，58°C退火 lmin，72°C延伸30sec，30個循環(huán)，最后72°C繼續(xù)延伸IOmin ；(2)所得PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)中進行分析，檢測PCR產(chǎn)物的有無和大小。
所述PCR的反應體系為15 μ 1的PCR反應體系分別加入以下體積的物質(zhì)，1.5μ 1 的10XPCR緩沖液，0. 5μ 1的ΙΟμ οΙ Γ1正向引物，0. 5 μ 1的10 μ mol Γ1反向引物， 1. 5 μ 1的dNTP混合物，1 μ 1的模板，0. 25 μ 1的Taq DNA聚合酶，9. 75 μ 1的滅菌雙蒸水。所述10XPCR 緩沖液為 200mmol F1Tris HCl (pH 8. 4)，200mmol F1KCl, 15mmol ” MgCl2。所述步驟(2)瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)的DNA片段即為，檢測樣品中含有奇異變形桿菌。檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列的應用采用實時熒光定量 (real-time, RT) PCR定量檢測奇異變形桿菌，具體過程為(1)將奇異變形桿菌按10倍的濃度梯度分別稀釋，將稀釋液10，OOOrpm離心5min 收集菌體，提取細菌的基因組DNA，作為實時熒光定量PCR模板；(2)分別以核酸標識序列ureRFl和ureRRl為正向引物和反向引物進行實時熒光定量PCR，20 μ 1的實時熒光定量PCR反應體系，實時熒光定量PCR的反應條件為94°C變性30sec，然后94°C變性5sec，58°C變性和延伸20sec，循環(huán)40個循環(huán)，最后94°C熱變性 15sec，58°C變性和延伸 lmin，94°C熱變性 15sec ；(3)數(shù)據(jù)分析以細菌的濃度(CFU πιΓ1)為橫坐標，以達到熒光閾值所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)為縱坐標，繪制散點曲線，即可定性地檢測樣品中的奇異變形桿菌的數(shù)量。所述步驟(1)將奇異變形桿菌按10倍的濃度梯度分別稀釋至終濃度為1. OX 108， 1. OXlO7,1. OXlO6,1. OXlO5,1. OXlO4,1. OXlO3,1. OXlO2 禾口 1. OX IO1CFU mr1,收集 Iml 不同濃度梯度的奇異變形桿菌稀釋液，提取基因組DNA，待用。所述步驟O)中的實時熒光定量PCR反應體系，PCR的反應體系分別加入以下體積的物質(zhì)，10μ 1 的 STOR Premix，0. 5μ 1 的 ΙΟμπιοΙ Γ1 正向引物，0. 5 μ 1 的 10 μ mol Γ1 反向引物，0. 4 μ 1的ROX校正液和1 μ 1的模板DNA，7. 6 μ 1的雙蒸水。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明利用奇異變形桿菌特異的核酸標識序列對其進行特異地定性、定量的檢測。特別是本發(fā)明的核酸標識序列可在海水、淡水和尿液等不同水環(huán)境中進行奇異變形桿菌的定性和定量PCR檢測。該發(fā)明的檢測過程所需要的時間短，檢測方法靈敏度和特異性
尚ο本發(fā)明的反應原理根據(jù)奇異變形桿菌所特有的ureR基因的序列，設計了 ureRFl和ureRRl —對核苷酸序列作為PCR反應的正反向引物。奇異變形桿菌中含有ureR基因，因此用奇異變形桿菌的DNA或是菌液作為PCR反應的模板就能夠得到ureR基因的部分序列，因此在凝膠電泳分析中就能夠看到225bp的DNA片段，在實時熒光定量PCR反應中能夠看到熒光的增強；而在測定的其他種細菌中均不含有ureR基因，因此用其他種細菌的DNA或是菌液作為PCR反應的模板就不能夠得到ureR基因的部分序列，因此在凝膠電泳分析中就不能夠看到225bp的 DNA片段，在實時熒光定量PCR反應中亦不能夠看到熒光的增強。


圖1為本發(fā)明實施例提供的核酸標識序列進行檢測各種菌種的電泳圖譜，其中泳道1和2為霍氏腸桿菌Pd9和陰溝腸桿菌V2 ；泳道3和4，不動桿菌HS51和醋酸鈣不動桿菌T32 ；泳道5和6，克雷伯菌Pd2和肺炎克萊伯菌Pd8 ；泳道7-10,弧菌V134，哈維氏弧菌 T4，副溶血弧菌BL，魚腸道弧菌BX ；泳道11，遲緩愛德華氏菌T2 ；泳道12-16，假單胞菌屬 J61和DX7，變形假單胞菌DJ3，綠膿假單胞菌I和惡臭假單胞菌SPl ；泳道17，斯氏普羅威登斯菌；泳道18-20，埃希氏桿菌屬HS21，埃希氏大腸桿菌ToplO和HSll ；泳道21，奇異變形桿菌V7 ；泳道22，DNA分子量標準。圖2為本發(fā)明實施例提供的分別以奇異變形桿菌特異的核酸標識序列ureRFl和ureRRl為正反向引物，奇異變形桿菌V7的培養(yǎng)液作為模板，PCR 得到的DNA片段的核酸序列圖譜。圖3為本發(fā)明實施例提供的普通PCR方法檢測奇異變形桿菌的凝膠電泳圖譜。其中泳道1，DNA分子量標準；奇異變形桿菌的濃度分別為泳道2，LOXIO0CFU πιΓ1 ；泳道3， 1. OXIOiCFU InrlAIdt^LOXlO2CFU HirlAldtsa-OXiO3CFU mi—jldtea.oxio^FU πιΓ1 ；泳道 7，1.0X IO5CFUmr1 ；泳道 8，1. OX IO6CFU πιΓ1 ；泳道9，1. 0 X IO7CFU πιΓ1 ；泳道 10， 1. OXlO8CFU πιΓ1,,圖4為本發(fā)明實施例提供的采用PCR方法檢測淡水、海水和尿液中的奇異變形桿菌的凝膠電泳圖譜，其中泳道1，DNA分子量標準；奇異變形桿菌的濃度分別為泳道 2，1.0Χ IO1CFU ml—1(尿液)；泳道 3，1. 0X IO2CFU ml—1 (尿液)；泳道 4，1. 0X IO3CFU πιΓ1 (尿液)；泳道 5，1.0X IO4CFU πιΓ1 (尿液)；泳道 6，1. 0 X IO5CFU πιΓ1 (尿液)；泳道 7， 1. OXlO6CFU πιΓ1 (尿液)；泳道 8，1. 0 X IO7CFU ml—1 (尿液)；泳道 9，1. 0 X IO1CFU πιΓ1 (海水)；泳道 10，1. OX IO2CFU πιΓ1 (海水)；泳道 11，1. OXlO3CFU πιΓ1 (海水)；泳道 12， 1. OXlO4CFU πιΓ1 (海水)；泳道 13，1. 0 X IO5CFU πιΓ1 (海水)；泳道 14，1. 0 X IO6CFU ι Γ1 (海水)；泳道 15，1.0Χ IO7CFU πιΓ1 (海水)；泳道 16，1. 0X IO1CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 17， 1. OXlO2CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 18，1. 0 X IO3CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 19，1. 0 X IO4CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 20，1. 0 X IO5CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 21，1. 0 X IO6CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 22， 1. OXlO7CFU πιΓ1 (淡水)。圖5為本發(fā)明實施例提供的實時熒光定量PCR檢測奇異變形桿菌的基因組DNA 圖，其中橫坐標是模板DNA的含量(fg)，縱坐標是Ct值。圖6為本發(fā)明實施例提供的實時熒光定量PCR對奇異變形桿菌進行定量檢測圖， 其中橫坐標是奇異變形桿菌的菌液濃度(CFU πιΓ1)，縱坐標是Ct值。
具體實施例方式本發(fā)明利用特異性引物定性檢測奇異變形桿菌的普通PCR方法，其具體步驟為(1)以核酸標識序列ureRFl和ureRRl分別為正向引物和反向引物，15 μ 1 的PCR的反應體系，分別加入以下體積的物質(zhì)1.5μ1的10XPCR緩沖液OOOmmol F1Tris-HCKpH 8. 4) ,200mmol F1KCl, 15mmol F1MgCl2)，0· 5 μ 1 的 10 μ mo 1 Γ1 正向引物， 0. 5 μ 1 的 10 μ mol Γ1 反向引物，1. 5 μ 1 的 dNTP 混合物(dATP、dGTP、dCTP、dTTP 的濃度分別為2. 5匪ο11_1)，1μ 1的模板，0. 25μ 1的Taq DNA聚合酶，9. 75 μ 1的滅菌雙蒸水。PCR 體系的反應條件為94°C變性％iin，然后94°C變性40sec，58°C退火lmin，72°C延伸30sec， 30個循環(huán)。然后最后72°C繼續(xù)延伸IOmin。(2)5μ1的PCR產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)中進行分析，檢測PCR產(chǎn)物的有無和大小。本發(fā)明利用特異性引物定量檢測奇異變形桿菌的實時熒光定量PCR檢測的方法， 其具體步驟為(1)將奇異變形桿菌按10倍的濃度梯度分別稀釋到至終濃度為1.0X108， 1. OX IO7, 1. OX IO6, 1. OX IO5, 1. OX IO4, 1. OX IO3, 1. OX IO2 和 Loxio1CFU mr1， 10，OOOrpm離心5min收集菌體。用使用基因組提取試劑盒(購自天根公司)并參照試劑盒說明書提取細菌的基因組DNA，吸取提取的1 μ 1基因組DNA作為模板進行實時熒光定量 PCR。(2) 20 μ 1的實時熒光定量PCR的反應體系中分別加入以下體積的物質(zhì)為10μ 1 的 SYBR Premix(Takara)，0· 5μ 1 的 10μ mo 1 Γ1 正向引物，0· 5 μ 1 的 10 μ mol Γ1 反向引物，0. 4 μ 1的ROX校正液(Takara)和1 μ 1的模板DNA，7. 6 μ 1的雙蒸水。實時熒光定量 PCR的反應條件為94°C變性30sec，然后94°C變性kec，58°C變性和延伸20sec，循環(huán)40個循環(huán)，最后94°C熱變性15sec，58°C變性和延伸lmin，94C熱變性15sec。(3)以細菌的濃度為橫坐標，以達到熒光閾值所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)為縱坐標， 繪制散點曲線。實施例11.奇異變形桿菌的篩選和基因組DNA的提取在煙臺海岸帶附近不同的海域取樣，收集不同區(qū)域的海水。將海水樣品取100 μ 1涂布到LB培養(yǎng)基(成分胰蛋白胨，IOg Γ1，酵母浸膏，5g Γ1，氯化鈉，IOg Γ1，瓊脂糖，12g Γ1)，將固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)的能夠快速移動的菌落進行16S rDNA測序，在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST的結(jié)果為奇異變形桿菌，命名為V7。 該菌株已經(jīng)在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)登記保藏；地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期為2010年11月06日；編號為CGMCC No. 4312 ； 奇異變形桿菌ftOteus mirabilis。V7在LB培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)，并將培養(yǎng)液中加入50% 的甘油保存在_80°C超低溫冰箱中。在使用時，首先將甘油中保存的菌株劃線接種于LB固體平板，培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，將其接種于5ml的LB液體中，待細菌生長至對數(shù)期時， 測定菌液的0D_，離心收集菌體，使用基因組提取試劑盒(購自天根公司)并參照試劑盒說明書提取菌體的基因組DNA，將提取的基因組DNA溶解在50 μ 1的無菌水中，使用NanoDrop 核酸蛋白測定儀測定提取的奇異變形桿菌基因組DNA的濃度。2.奇異變形桿菌特異的核酸標識序列的設計與驗證(1)根據(jù)奇異變形桿菌ureR的核酸序列，設計引物ureRFl 5，-GGTGAGATTTGTATTAATGG-3，和 ureRRl :5，-ATAATCTGGAAGATGACGAG-3，。分別利用此核酸標識序列ureRFl和ureRRl作為PCR反應的正反向引物，利用分離到的奇異變形桿菌 V7(CGMCC No. 4312)和含有ureR同源基因的斯氏普羅威登斯菌，埃希氏桿菌，埃希氏大腸桿菌，以及一些環(huán)境中常見的病原菌(菌株包括弧菌、愛德華氏菌、克雷伯氏菌和假單胞菌等菌株)為模板PCR，確定利用PCR進行奇異變形桿菌檢測的特異性。(2) 15 μ 1的PCR的反應體系分別加入以下體積的物質(zhì)1. 5 μ 1的10 X PCR緩沖液 (200mmol F1Tris-HCl (pH 8. 4), 200mmol F1KCl, 15mmol廣MgCl2)，0· 5 μ 1 的 10 μ mol Γ1 正向引物，0. 5μ 1 的 10 μ mol Γ1 反向引物，1. 5μ 1 的 dNTP 混合物(dATP、dGTP、dCTP、dTTP的濃度分別為2. 5mmol γ1)，1 μ 1的模板，0. 25 μ 1的taq dna聚合酶，9. 75 μ 1的滅菌雙蒸水。pcr體系的反應條件為94°c變性％iin，然后94°c變性40sec，58°c退火lmin，72°c延伸 30sec，30個循環(huán)。然后最后72°c繼續(xù)延伸lomin。(3)5μ 1的pcr產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)中進行分析，檢測pcr產(chǎn)物的有無和大小。實驗結(jié)果如圖1所示，只有奇異變形桿菌v7能夠pcr得到大小為22^ρ的dna條帶，而其他菌株經(jīng)過pcr無相應大小的dna條帶。將pcr得到的奇異變形桿菌v7的核酸片段進行測序，得到的核酸序列如圖2所示，于美國國家生物技術信息中心(ncbi)數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，發(fā)現(xiàn)來自于奇異變形桿菌v7的urer序列和奇異變形桿菌hi4320的序列 am942759和z18752具有100%的同源性。此結(jié)果表明，本發(fā)明專利中的針對奇異變形桿菌的特異核酸標示序列能夠用來進行奇異變形桿菌的檢測。3.利用pcr檢測奇異變形桿菌的靈敏度(1)將生長至od6tltl約為1. o的奇異變形桿菌培養(yǎng)液，按10倍的濃度梯度稀釋到終濃度分別 % 1. ox io8,1.0x io7,1.0x io6,1.0x io5,1.0x io4,1.0x io3,1.0x io2, 1.0x101和loxio0cfu ml—1，分別取1 μ 1作為pcr反應的模板。(2) 15 μ 1的pcr的反應體系，中分別加入以下體積的物質(zhì)1. 5 μ 1的ioxpcr緩沖液 ooommol f1tris-hckph 8. 4), 200mmol f1kcl, 15mmol f1mgcl2), 0. 5 μ i^loymol γ1 正向引物，0. 5μ 1 的 ιομπιοιγ1 反向引物，1. 5μ 1 的 dntp 混合物(datp、dgtp、dctp、 dttp的濃度分別為2. 5mmol γ1)，1 μ 1的模板，0. 25 μ 1的i1aq dna聚合酶，9. 75 μ 1的滅菌雙蒸水。pcr體系的反應條件為94°c變性％iin，然后94°c變性40sec，58°c退火lmin，72°c 延伸30sec，30個循環(huán)。然后最后72°c繼續(xù)延伸lomin。(3)5μ 1的pcr產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)中進行分析，檢測pcr產(chǎn)物的有無和大小。結(jié)果如圖3所示，從1. ox io8到1. ox io3cfu ml—1的奇異變形桿菌稀釋液，經(jīng)過如上的pcr反應后能夠得到強陽性的結(jié)果；1. ox io2cfu πιγ1的奇異變形桿菌稀釋液經(jīng)過 pcr后有的時候能夠得到弱的陽性結(jié)果，而有的時候得不到相應的pcr產(chǎn)物，在凝膠電泳分析中呈現(xiàn)的陽性結(jié)果不夠穩(wěn)定。4.利用pcr方法檢測淡水、海水和尿液中的奇異變形桿菌(1)分別取1 μ 1的尿液、海水和淡水作為模板，進行pcr。(2) 15 μ 1的pcr的反應體系，中分別加入以下體積的物質(zhì)1. 5 μ 1的ioxpcr緩沖液 ooommol f1tris-hckph 8. 4), 200mmol f1kcl, 15mmol f1mgcl2), 0. 5 μ i^loymol γ1 正向引物，0. 5μ 1 的 ιομπιοιγ1 反向引物，1. 5μ 1 的 dntp 混合物(datp、dgtp、dctp、 dttp的濃度分別為2. 5mmol γ1)，1 μ 1的模板，0. 25 μ 1的i1aq dna聚合酶，9. 75 μ 1的滅菌雙蒸水。pcr體系的反應條件為94°c變性％iin，然后94°c變性40sec，58°c退火lmin，72°c 延伸30sec，30個循環(huán)。然后最后72°c繼續(xù)延伸lomin。(3)5μ 1的pcr產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)中進行分析，檢測pcr產(chǎn)物的有無和大小。實驗結(jié)果表明，在采集的尿液、海水和淡水中均無奇異變形桿菌。(4)將不同濃度梯度的奇異變形桿菌分別加入到采集到的尿液、海水和淡水中，使奇異變形桿菌在不同的液體環(huán)境中的終濃度分別為1.0x107，1.0x io6,1.0x io5, 1. oxlo4,1. oxlo3,1. oxlo2 禾口 1. ox io1cfu IIir1O5)取1 μ 1上述菌液作為pcr的模板，15 μ 1的pcr的反應體系，分別加入以下體積的物質(zhì)1. 5μ 1 的 10xpcr緩沖液 ooommol f1tris-hckph 8. 4) ,200mmol f1kcl, 15mmol f1mgcl2),0. 5μ 1 的 ιομπιοιγ1 正向引物，0. 5μ 1 的 ioymol γ1 反向引物，1.5μ 1 wdntp 混合物(datp、dgtp、dctp、dttp 的濃度分別為 2. 5mmol γ1)，1 μ 1 的模板，0. 25 μ 1 的 taq dna聚合酶，9. 75 μ 1的滅菌雙蒸水。pcr體系的反應條件為94°c變性^iin，然后94°c變性 40sec，58°c退火lmin，72°c延伸30sec，30個循環(huán)。然后最后72°c繼續(xù)延伸lomin。(6)5μ 1的pcr產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)中進行分析，檢測pcr產(chǎn)物的有無和大小。結(jié)果如圖4所示。在尿液中的奇異變形桿菌，濃度為從1. oxlo7到LOXIO4CFu ml—1的稀釋液為陽性結(jié)果；在海水中的奇異變形桿菌，濃度為從1.0x107到LOXIO3CFu ml—1的稀釋液為陽性結(jié)果；在淡水中的奇異變形桿菌，濃度為從1.0x107到LOXIO3CFu πιΓ1的稀釋液為陽性結(jié)果。5.利用實時定量pcr對環(huán)境中的奇異變形桿菌進行定量。(1)將提取的奇異變形桿菌的基因組dna進行紫外定量，然后進行10倍稀釋。取 1 μ 1稀釋后的dna作為實時熒光定量pcr的模板，進行實時熒光定量pcr。(2)20μ 1的實時熒光定量pcr的反應體系為10μ 1的storpremix，0. 5μ 1的 ioymol γ1正向引物，0.5μ 1的ioymol γ1反向引物，0.4μ 1的rox校正液和1 μ 1的模板dna，7. 6μ 1的雙蒸水。實時熒光定量pcr的反應條件為94°c變性30sec，然后94°c變性5sec，58°c變性和延伸20sec，循環(huán)40個循環(huán)，最后94°c熱變性15sec，58°c變性和延伸 lmin，94°c 熱變性 15sec。(3)以細菌的濃度為橫坐標，以ct值為縱坐標，繪制散點曲線。實驗結(jié)果如圖5所示，dna濃度在85fg μ γ1到85ng μ γ1之間，dna的濃度與ct 值成嚴格的負相關關系，實時熒光定量pcr可以檢測到85fg μ γ1的奇異變形桿菌dna。(4)將0d600約為1. o的奇異變形桿菌培養(yǎng)液按10倍的濃度梯度稀釋到終濃度分別為 1. oxlo8,1. oxlo7,1. oxlo6,1. oxlo5,1. oxlo4,1. oxlo3,1. oxlo2 禾口 1. ox io1cfu mr1，13，ooorpm離心5min收集菌體，使用基因組提取試劑盒(購自天根公司)并參照試劑盒說明書提取菌體的基因組dna，將提取的1 μ 1基因組dna作為模板進行實時熒光定量 pcr。(5)20μ 1的實時熒光定量pcr的反應體系為10μ 1的storpremix，0. 5 μ 1的 ioymol γ1正向引物，0.5μ 1的ioymol γ1反向引物，0.4μ 1的rox校正液和1 μ 1的模板dna，7. 6μ 1的雙蒸水。實時熒光定量pcr的反應條件為94°c變性30sec，然后94°c變性kec，58°c變性和延伸20sec，循環(huán)40個循環(huán)，最后94°c熱變性15sec，58°c變性和延伸 lmin，94°c 熱變性 15sec。(6)以細菌的濃度為橫坐標，以ct值為縱坐標，繪制散點曲線。實驗結(jié)果如圖6所示，(a)實時熒光定量pcr可以檢測到iocfu ml—1的奇異變形桿菌，細菌濃度在1. ox io8到1. ox io1cfu ml-1的濃度之間和ct值成較好的負相關關系， r2 = 0. 94。(b)細菌的濃度在1. oxlo8到1. ox io4cfu πιγ1之間和ct值成嚴格的負相關關系，R2 = 0. 99。即在細菌濃度稍高時，定量檢測的準確度也越高。
權(quán)利要求
1.一種檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列，其特征在于ureRFl :5’ -GGTGAGATTTGTATTAATGG-3’ureRRl :5’ -ATAATCTGGAAGATGACGAG-3，。
2.—種權(quán)利要求1所述的檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列的應用，其特征在于所述奇異變形桿菌特異的核酸標識序列應用于檢測環(huán)境中的奇異變形桿菌。
3.按權(quán)利要求2所述的檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列的應用，其特征在于采用普通PCR定性檢測奇異變形桿菌，具體過程為(1)以核酸標識序列ureRFl和ureRRl為正向引物和反向引物進行PCR,15 μ 1的PCR 的反應體系，PCR體系的反應條件為94°C變性％iin，然后94°C變性40seC，58°C退火lmin， 72°C延伸30sec，30個循環(huán)，最后72°C繼續(xù)延伸IOmin ；(2)所得PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)中進行分析，檢測PCR產(chǎn)物的有無和大小。
4.按權(quán)利要求3所述的檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列的應用，其特征在于所述PCR的反應體系為15μ 1的PCR反應體系分別加入以下體積的物質(zhì)，1.5μ 1的 10XPCR 緩沖液，0. 5μ 1 的 IOymol Γ1 正向引物，0. 5μ 1 的 IOymol Γ1 反向引物，1. 5μ 1 的dNTP混合物，1 μ 1的模板，0. 25 μ 1的Taq DNA聚合酶，9. 75 μ 1的滅菌雙蒸水。
5.按權(quán)利要求4所述的檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列的應用，其特征在于所述 10XPCR 緩沖液為 200mmol F1Tris HCl (pH 8. 4)，200mmol F1KCl, 15mmol ” MgCl2。
6.按權(quán)利要求3所述的檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列的應用，其特征在于所述步驟(2)瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)225bp的DNA片段即為，檢測樣品中含有奇異變形桿菌。
7.按權(quán)利要求2所述的檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列的應用，其特征在于采用實時熒光定量(real-time，RT) PCR定量檢測奇異變形桿菌，具體過程為(1)將奇異變形桿菌按10倍的濃度梯度分別稀釋，將稀釋液10，OOOrpm離心5min收集菌體，提取細菌的基因組DNA，作為實時熒光定量PCR模板；(2)分別以核酸標識序列ureRFl和ureRRl為正向引物和反向引物進行實時熒光定量PCR，20y 1的實時熒光定量PCR反應體系，實時熒光定量PCR的反應條件為94°C變性30sec，然后94°C變性5sec，58°C變性和延伸20sec，循環(huán)40個循環(huán)，最后94°C熱變性 15sec，58°C變性和延伸 lmin，94°C熱變性 15sec ；(3)數(shù)據(jù)分析以細菌的濃度(CFUπιΓ1)為橫坐標，以達到熒光閾值所需要的循環(huán)數(shù) (Ct值)為縱坐標，繪制散點曲線，即可定性地檢測樣品中的奇異變形桿菌的數(shù)量。
8.按權(quán)利要求2所述的檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列的應用，其特征在于所述步驟(1)將奇異變形桿菌按10倍的濃度梯度分別稀釋至終濃度為1.0X108， 1. OXlO7,1. OXlO6,1. OXlO5,1. OXlO4,1. OXlO3,1. OXlO2 禾口 1. OX IO1CFU mr1,收集 Iml 不同濃度梯度的奇異變形桿菌稀釋液，提取基因組DNA，待用。
9.按權(quán)利要求2所述的檢測奇異變形桿菌的特異的核酸標識序列的應用，其特征在于所述步驟O)中的實時熒光定量PCR反應體系，PCR的反應體系分別加入以下體積的物質(zhì)，10 μ 1 的 SYBR Premix, 0. 5 μ 1 的 IOymol Γ1 正向引物，0. 5 μ 1 的 IOymol Γ1 反向引物，0. 4 μ 1的ROX校正液和1 μ 1的模板DNA，7. 6 μ 1的雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明涉及奇異變形桿菌的檢測，具體的說是一種檢測奇異變形桿菌特異的核酸標識序列及其應用。檢測奇異變形桿菌特異的核酸標識序列為ureRF15’-GGTGAGATTTGTATTAATGG-3’；ureRR15’-ATAATCTGGAAGATGACGAG-3’。所述奇異變形桿菌特異的核酸標識序列應用于檢測環(huán)境中的奇異變形桿菌。利用本發(fā)明方法對不同環(huán)境中的奇異變形桿菌進行檢測，具有簡便、快速、特異性和靈敏度高等優(yōu)點。該方法可用于環(huán)境和臨床樣品的奇異變形桿菌的檢測和流行病學調(diào)查，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/11GK102559863SQ201110290460
公開日2012年7月11日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者張衛(wèi)衛(wèi), 殷堃, 牛宗亮, 陳令新 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所