技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一個(gè)可參與黃酮類，聚酮類化合物合成后修飾的糖基化酶基因及其在生物轉(zhuǎn)化和合成生物學(xué)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：真菌生物轉(zhuǎn)化是利用細(xì)胞內(nèi)特定的酶對(duì)外源化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾與改造，從而獲得更有價(jià)值的代謝反應(yīng)。白僵菌屬真菌通過各種代謝方式轉(zhuǎn)化不同結(jié)構(gòu)類型的化合物，在要藥物研究領(lǐng)域占有重要地位。球孢白僵菌中含有大量的糖基轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素p450、脫氫酶、脫羧酶和酰基轉(zhuǎn)移酶等修飾酶基因，具有多種轉(zhuǎn)化功能，其中最獨(dú)特功能為糖基化作用，目前已經(jīng)被用于300多種不同底物的生物轉(zhuǎn)化。糖基轉(zhuǎn)移酶(gt)在生物體內(nèi)催化活化的糖連接到不同的受體分子，糖基化的產(chǎn)物具有很多生物學(xué)功能。在不同的gt家族中存在一類與抗生素生物合成相關(guān)的gt，它的功能是在抗生素等生物活性物質(zhì)的生物合成后期使其糖基化，通過糖的位置、類型和數(shù)量的改變對(duì)抗生素的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。目前，我們在實(shí)驗(yàn)室篩選的球孢白僵菌中發(fā)現(xiàn)了此家族中的葡糖基轉(zhuǎn)移酶，通過異源表達(dá)可修飾黃酮醇，黃烷醇、二氫黃酮、異黃酮類和查爾酮在內(nèi)的黃酮類及其衍生化合物、苯二酚內(nèi)酯等聚酮類化合物，表現(xiàn)出高效的催化效率以及廣泛的底物識(shí)別能力。這一點(diǎn)使其在組合生物合成中能得到靈活的應(yīng)用，為先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及藥物的定向轉(zhuǎn)化提供了新的研究方法與途徑。目前雖然已發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌對(duì)天然產(chǎn)物具有生物轉(zhuǎn)化的功能，但還未發(fā)現(xiàn)任何參與天然產(chǎn)物合成后修飾的相關(guān)基因，只能利用菌體進(jìn)行生物法轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率低，產(chǎn)物不單一，無法實(shí)現(xiàn)定向轉(zhuǎn)化。球孢白僵菌的生物轉(zhuǎn)化以糖基化為為主，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌中參與合成后修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶有利于拓展活性化合物的化學(xué)空間，提高化合物結(jié)構(gòu)的多樣性，為發(fā)現(xiàn)和改造新活性的天然產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：:本發(fā)明的目的是，獲得可參與化合物生物轉(zhuǎn)化的葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因，利用該基因?qū)崿F(xiàn)某些化合物體外的糖基化修飾，增強(qiáng)其活性。本發(fā)明通過人工合成，獲得了葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因，命名為bbugt86，核苷酸序列如seqidno.1所示。構(gòu)建了可在酵母bj5464中表達(dá)的重組質(zhì)粒，并在酵母中進(jìn)行異源表達(dá)轉(zhuǎn)化。將所得的蛋白產(chǎn)物分別與不同的聚酮類或黃酮類化合物進(jìn)行作用，得到了原化合物結(jié)構(gòu)中連接有葡萄糖基的糖基化產(chǎn)物。通過一系列的生理生化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些原先極性較低而不適于藥用的化合物在糖基化修飾之后較未修飾前水溶性增強(qiáng)，有利于改善其油水分配系數(shù)。具體如下：1、獲得bbugt86基因通過基因組測序和相關(guān)預(yù)測軟件對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，設(shè)計(jì)引物，由cdna擴(kuò)增獲得一種新的葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因bbugt86，核苷酸序列如seqidno.1所示。2、葡糖基轉(zhuǎn)移酶bbugt86酵母表達(dá)載體構(gòu)建與酵母轉(zhuǎn)化將含有完整的bbugt86的dna片段連接到prs425m載體上，構(gòu)建了組成型表達(dá)質(zhì)粒prs425m-bbugt86，轉(zhuǎn)入營養(yǎng)缺陷型酵母受體bj5464中進(jìn)行異源表達(dá)。3、重組子的篩選將表達(dá)載體prs425m-bbugt86轉(zhuǎn)入不能合成亮氨酸缺失的酵母菌中，利用亮氨酸營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記篩選重組子。4、聚酮類化合物飼喂轉(zhuǎn)化試驗(yàn)及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析在上述重組菌株培養(yǎng)過程中，添加化合物1進(jìn)行作用。然后用有機(jī)溶劑提取，將提取物進(jìn)行hplc液相、二級(jí)質(zhì)譜和核磁共振分析，確證產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。所述化合物1是苯二酚內(nèi)酯類聚酮(desmethyl-lasiodiplodin)。hplc液相分析結(jié)果顯示，化合物1幾乎全部轉(zhuǎn)化，還出現(xiàn)了另外一個(gè)產(chǎn)物峰。分離該產(chǎn)物，并進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析，證明是與化合物1不同結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物聚酮類化合物2。經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振分析發(fā)現(xiàn)，化合物2與化合物1結(jié)構(gòu)的區(qū)別是5位碳原子的羥基上增加了一個(gè)葡萄糖基。證明了本發(fā)明所提供的葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因可用于對(duì)苯二酚內(nèi)酯類聚酮化合物的糖基化修飾，增加聚酮化合物庫的多樣性。重組菌株發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)見圖3和圖4。5、黃酮類化合物飼喂轉(zhuǎn)化試驗(yàn)及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析重組菌株培養(yǎng)過程中分別添加20種不同的黃酮類化合物，分別將得到的發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用有機(jī)溶劑提取，并進(jìn)行hplc液相分析，lc-ms分析產(chǎn)物轉(zhuǎn)化結(jié)果。通過分析證明了葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因可用于對(duì)黃酮類化合物的糖基化結(jié)構(gòu)修飾，增大黃酮類化合物的溶解。所實(shí)驗(yàn)的黃酮底物列表如表1所示。6.比較葡糖基轉(zhuǎn)移酶bbugt86在外源添加和導(dǎo)入質(zhì)粒轉(zhuǎn)化底物的效率將含有desmethyl-lasiodiplodin合成基因的重組質(zhì)粒pyx063-pxw06f-lass1和pyx064-pxk30f_lass2同含有完整的bbugt86基因片段的質(zhì)粒prs425m-bbugt86，轉(zhuǎn)入營養(yǎng)缺陷型酵母受體bj5464進(jìn)行異源表達(dá)。同時(shí)發(fā)酵在只含有質(zhì)粒prs425m-bbugt86的酵母，外源添加desmethyl-lasiodiplodin純品，同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用有機(jī)溶劑提取，并進(jìn)行hplc液相分析，比較兩種方法的轉(zhuǎn)化效率。通過hplc檢測的色譜圖比較分析發(fā)現(xiàn)，通過導(dǎo)入質(zhì)粒的方法進(jìn)行化合物轉(zhuǎn)化的效率要遠(yuǎn)高于外源添加底物的轉(zhuǎn)化效率。具體結(jié)果詳見色譜圖27和圖28。7.糖基化修飾產(chǎn)物化合物2與desmethyl-lasiodiplodin的溶解性比較分別稱取基化修飾產(chǎn)物化合物2與desmethyl-lasiodiplodin各1mg，分別置于25℃±2℃1ml的10種不同溶劑中，每隔5分鐘強(qiáng)力振搖30秒鐘；觀察30分鐘內(nèi)的溶解情況。通過觀察比較10種不同溶劑中的溶解結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在大部分溶劑中的溶解度均得到了或多或少的提高。說明糖基化產(chǎn)物的溶解性通過修飾得到了提升。序列表說明seqidno.1bbugt86的核苷酸序列；seqidno.2由seqidno.1推導(dǎo)出的bbugt86編碼的氨基酸序列。附圖說明圖1為bbugt86基因片段的擴(kuò)增結(jié)果；圖2為重組載體prs425m-bbugt86的物理圖譜；圖3為化合物1desmethyl-lasiodiplodin修飾前的液相色譜圖；圖4是化合物1修飾后，產(chǎn)生了多一個(gè)葡糖基的化合物2的hplc液相色譜圖；圖5-圖26為所實(shí)驗(yàn)的底物黃酮樣品及它們轉(zhuǎn)化后的糖基化產(chǎn)物的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果，其中：圖5是f-3化合物轉(zhuǎn)化前的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖6是f-3化合物轉(zhuǎn)化后的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖7是f-4化合物轉(zhuǎn)化前的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖8是f-4化合物轉(zhuǎn)化后的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖9是f-5化合物轉(zhuǎn)化前的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖10是f-5化合物轉(zhuǎn)化后的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖11是f-6化合物轉(zhuǎn)化前的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖12是f-6化合物轉(zhuǎn)化后的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖13是f-7化合物轉(zhuǎn)化前的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖14是f-7化合物轉(zhuǎn)化后的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖15是f-8化合物轉(zhuǎn)化前的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖16是f-8化合物轉(zhuǎn)化后的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖17是f-11化合物轉(zhuǎn)化前的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖18是f-11化合物轉(zhuǎn)化后的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖19是f-12化合物轉(zhuǎn)化前的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖20是f-12化合物轉(zhuǎn)化后的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖21是f-15化合物轉(zhuǎn)化前的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖22是f-15化合物轉(zhuǎn)化后的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖23是f-16化合物轉(zhuǎn)化前的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖24是f-16化合物轉(zhuǎn)化后的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖25是f-20化合物轉(zhuǎn)化前的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖26是f-20化合物轉(zhuǎn)化后的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果；圖27為導(dǎo)入質(zhì)粒轉(zhuǎn)化底物的色譜圖；圖28為外源添加底物轉(zhuǎn)化后的色譜圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)驗(yàn)中所用的實(shí)驗(yàn)材料說明及來源如下：以下菌株和載體均來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所，由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室自行保存：球孢白僵菌beauveriabassianaatcc7159、酵母菌s.cerevisiaebj5464-npga、酵母表達(dá)載體prs425m，pyx063-pxw06f-lass1和pyx064-pxk30f_lass2；酶與試劑盒：限制性內(nèi)切酶、t4dna連接酶購自neb公司；rna反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自takara公司；quick-fusioncloningkit購自biotool公司；dna聚合酶和dnamarker購自北京全式金生物公司；質(zhì)粒小提試劑盒、通用型dna純化膠回收試劑盒購自天根公司；冷凍酵母轉(zhuǎn)化試劑盒購自ymoresearch生物公司；大腸桿菌dh5α感受態(tài)購自康維世紀(jì)公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。培養(yǎng)基：大腸桿菌培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％nacl，ph7.0)。sc--leu/缺陷培養(yǎng)基(1％葡萄糖、6.7％difcotmyeastnitrogenbasew/oaminoacids、-leudosupplement)。ypd培養(yǎng)基(1％酵母膏，2％peptone蛋白胨，2％葡萄糖)。ypd低糖培養(yǎng)基(1％酵母膏，2％peptone蛋白胨，1％葡萄糖.)若制固體培養(yǎng)基，加入2％瓊脂粉。實(shí)施例中其它未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法進(jìn)行，分子克隆按(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)實(shí)驗(yàn)室手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1合成葡糖基轉(zhuǎn)移酶bbugt86，并構(gòu)建酵母表達(dá)載體獲得酵母轉(zhuǎn)化子對(duì)獲得的一株球孢白僵菌進(jìn)行基因組測序獲得了該菌株的基因組序列，通過相關(guān)生物信息學(xué)軟件分析糖基轉(zhuǎn)移酶的過程中，通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)udp-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，我們命名為葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因bbugt86。將bbugt86的核苷酸序列通過多種軟件預(yù)測分析去除掉內(nèi)含子拼接得到bbugt86的編碼區(qū)序列。提取球孢白僵菌的rna通過反轉(zhuǎn)錄獲得cdna，利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增bbugt86的編碼基因，回收目的片段交給測序公司測序比對(duì)，獲得seqidno.1所示的糖基轉(zhuǎn)移酶基因bbugt86。合成時(shí)引入酶切位點(diǎn)。在啟動(dòng)子前加入ndei酶切位點(diǎn)，在終止子后加入pmei酶切位點(diǎn)，片段長度為535bp和901bp。bbugt86擴(kuò)增片段見圖1。用ndei和pmeⅰ雙酶切穿梭載體prs425m并回收7555bp大小的片段。利用無縫連接克隆試劑盒將兩片段連接。熱激法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)dh5α。ampr抗性篩選，提取質(zhì)粒，ecorv和salⅰ酶切鑒定。重組質(zhì)粒prs425m-bbugt86圖譜見圖2將釀酒酵母s.cerevisiaebj5464-npga接種至ypd培養(yǎng)基中，30℃、200r/min-1培養(yǎng)至o.d.值0.8-1.0，按照zymo公司提供的說明書制備釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。將含有葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的prs425m-bbugt86重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入釀酒酵母中，涂布于亮氨酸缺失的sc固體缺陷培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3天左右。獲得的酵母轉(zhuǎn)化子，劃線培養(yǎng)至新的sc--leu缺陷培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天左右；實(shí)施例2應(yīng)用葡糖基轉(zhuǎn)移酶重組載體prs425m-bbugt86實(shí)現(xiàn)對(duì)聚酮類化合物desmethyl-lasiodiplodin(化合物1)的修飾1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^hplc高效液相分離得到葡糖基轉(zhuǎn)移酶修飾后的代謝產(chǎn)物并分析其分子結(jié)構(gòu)。2.實(shí)驗(yàn)方法：1)發(fā)酵培養(yǎng)采取二步法發(fā)酵技術(shù)，首先將適量的酵母轉(zhuǎn)化子菌體接種至相應(yīng)的25ml-leu液體缺陷培養(yǎng)基中，30℃、200r·min-1培養(yǎng)16h左右，再加入ypd低糖培養(yǎng)基25ml，同時(shí)分別加入5mgdesmethyl-lasiodiplodin純品繼續(xù)培養(yǎng)48h；用乙酸乙酯提取發(fā)酵產(chǎn)物，乙酸乙酯與發(fā)酵液的比例為1:1，即用50ml的乙酸乙酯提取發(fā)酵產(chǎn)物；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯干燥萃取物，1ml甲醇復(fù)溶萃取物。2)高效液相(hplc)色譜檢測：將上述所得發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)高速離心后用高效液相色譜檢測。hplc檢測條件如下：色譜柱kromasil100-5-c18，采用乙腈-h2o為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；梯度洗脫條件:0～5min,乙腈10％；5～15min,乙腈從10％→95％；15～25min,乙腈為95％；25～28min,乙腈從95％→10％；28～31min,乙腈為10％。流速0.8ml/min-1；檢測波長為300nm。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：通過hplc分析發(fā)現(xiàn)，除了天然產(chǎn)物化合物1(desmethyl-lasiodiplodin)的峰外，得到了另外一個(gè)峰，說明天然產(chǎn)物化合物1(desmethyl-lasiodiplodin)大部分被轉(zhuǎn)化。分離產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜及核磁共振分析證明大部分化合物1通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶的修飾作用轉(zhuǎn)化為了化合物2，得到了與天然產(chǎn)物化合物1不同結(jié)構(gòu)的聚酮類化合物。經(jīng)質(zhì)譜分析及核磁共振的c譜及h譜結(jié)果分別得到了化合物1、2的大致結(jié)構(gòu)式，通過比較兩種化合物的相對(duì)分子質(zhì)量發(fā)現(xiàn)化合物2比化合物1的相對(duì)分子質(zhì)量大，結(jié)合分子結(jié)構(gòu)可確定化合物2分子上多出了一個(gè)葡萄糖分子。通過軟件進(jìn)一步分析c譜及h譜發(fā)現(xiàn)化合物2是在原產(chǎn)物化合物1的位碳原子的羥基上加上了一個(gè)葡萄糖。證明了葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因可用于對(duì)苯二酚內(nèi)酯其類似物的聚酮化合物的結(jié)構(gòu)修飾，很適合對(duì)各種活性化合物進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)修飾，增加聚酮化合物庫的多樣性。重組菌株發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)見圖3和圖4?；衔?和2nmr的c譜及h譜如表2所示。表2化合物1和2nmr的c譜及h譜實(shí)施例3應(yīng)用葡糖基轉(zhuǎn)移酶重組載體prs425m-bbugt86實(shí)現(xiàn)對(duì)黃酮類化合物的修飾1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^hplc高效液相分離得到葡糖基轉(zhuǎn)移酶修飾黃酮類化合物后所得的代謝產(chǎn)物并分析其分子結(jié)構(gòu)。2.實(shí)驗(yàn)方法：1)發(fā)酵培養(yǎng)采取二步法發(fā)酵技術(shù)，首先將適量的酵母轉(zhuǎn)化子菌體接種至相應(yīng)的25ml-ura液體缺陷培養(yǎng)基中，30℃、200r·min-1培養(yǎng)16h左右，再加入ypd低糖培養(yǎng)基25ml，同時(shí)分別加入5mg不同黃酮純品繼續(xù)培養(yǎng)48h，所用黃酮類樣品共20種；用乙酸乙酯提取發(fā)酵產(chǎn)物，乙酸乙酯與發(fā)酵液的比例為1:1，即用50ml的乙酸乙酯提取發(fā)酵產(chǎn)物；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯干燥萃取物，1ml甲醇復(fù)溶萃取物。2)高效液相(hplc)色譜檢測：將上述所得發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)高速離心后用高效液相色譜檢測。hplc檢測條件如下：色譜柱kromasil100-5-c18，采用乙腈-h2o為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；梯度洗脫條件:0～5min,乙腈10％；5～15min,乙腈從10％→95％；15～25min,乙腈為95％；25～28min,乙腈從95％→10％；28～31min,乙腈為10％。流速0.8ml·min-1；檢測波長為300nm。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：通過hplc分析發(fā)現(xiàn)，在分別添加的20中底物中共有11種樣品發(fā)生了轉(zhuǎn)化，分別為編號(hào)f-3,f-4,f-5,f-6,f-7,f-8，f-11,f-12,f-15,f-16,f-20。轉(zhuǎn)化樣品的發(fā)酵產(chǎn)物的色譜圖中除了添加的起始底物的峰，還得到了另一個(gè)極性增強(qiáng)的化合物峰，確定添加的起始黃酮類化合物均發(fā)生了轉(zhuǎn)化。可發(fā)生轉(zhuǎn)化的黃酮底物的hplc檢測色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果見圖5，圖7，圖9，圖11，圖13，圖15，圖17，圖19，圖21，圖23，圖25。經(jīng)質(zhì)譜分析結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶的修飾作用成功將添加的底物黃酮類化合物進(jìn)行了糖基化修飾，通過比較分子量的大小確定是在底物上加了一個(gè)葡萄糖分子。重組菌株發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖見圖6，圖8,圖10,圖12,圖14,圖16，圖18,圖20,圖22,圖24，圖26。轉(zhuǎn)化后化合物的化學(xué)式及相對(duì)分子量見表3。表3轉(zhuǎn)化后的黃酮類化合物的化學(xué)式及相對(duì)分子量實(shí)施例4比較葡糖基轉(zhuǎn)移酶bbugt86在外源添加和導(dǎo)入質(zhì)粒轉(zhuǎn)化底物的效率1.實(shí)驗(yàn)方法：將含有天然聚酮類產(chǎn)物(化合物1)合成基因的重組質(zhì)粒pyx063-pxw06f-lass1和pyx064-pxk30f_lass2同含有完整的葡糖基轉(zhuǎn)移酶bbugt86基因片段的重組質(zhì)粒prs425m-bbugt86轉(zhuǎn)化入釀酒酵母bj5464的感受態(tài)中，涂布于亮氨酸，色氨酸，尿嘧啶缺失的sc固體缺陷培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3天左右。獲得的酵母轉(zhuǎn)化子，劃線培養(yǎng)至新的sc--leu/-trp/-ura的缺陷培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天左右；采取二步法發(fā)酵技術(shù)，首先將適量的酵母轉(zhuǎn)化子菌體接種至相應(yīng)的25ml-leu液體缺陷培養(yǎng)基中，30℃、200r·min-1培養(yǎng)16h左右，再加入ypd低糖培養(yǎng)基25ml，繼續(xù)培養(yǎng)48h；用乙酸乙酯提取發(fā)酵產(chǎn)物，乙酸乙酯與發(fā)酵液的比例為1:1，即用50ml的乙酸乙酯提取發(fā)酵產(chǎn)物；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯干燥萃取物，1ml甲醇復(fù)溶萃取物。同時(shí)采取二步法發(fā)酵技術(shù)，發(fā)酵在只含有質(zhì)粒prs425m-bbugt86的酵母，在培養(yǎng)過程中外源添加5mgdesmethyl-lasiodiplodin純品轉(zhuǎn)化48h，乙酸乙酯提取發(fā)酵產(chǎn)物，乙酸乙酯與發(fā)酵液的比例為1:1，即用50ml的乙酸乙酯提取發(fā)酵產(chǎn)物；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯干燥萃取物，1ml甲醇復(fù)溶萃取物。將上述所得發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)高速離心后用高效液相色譜檢測。hplc檢測條件如下：色譜柱kromasil100-5-c18，采用乙腈-h2o為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫條件:梯度洗脫條件:0～5min,乙腈10％；5～15min,乙腈從10％→95％；15～25min,乙腈為95％；25～28min,乙腈從95％→10％；28～31min,乙腈為10％。流速0.8ml·min-1，檢測波長為300nm，通過峰高比較兩種方法的轉(zhuǎn)化效率高低。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論：通過hplc檢測的色譜圖比較分析發(fā)現(xiàn)，通過導(dǎo)入質(zhì)粒的方法進(jìn)行化合物轉(zhuǎn)化的效率要遠(yuǎn)高于外源添加底物的轉(zhuǎn)化效率，雖然外源添加底物可實(shí)現(xiàn)大部分化合物的轉(zhuǎn)化，但導(dǎo)入質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行合成和轉(zhuǎn)化幾乎和實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的完全轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化利用率大大提升。兩種轉(zhuǎn)化方法的酵母發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖見圖27和圖28。實(shí)施例5天然聚酮類產(chǎn)物(化合物1)及其糖基化修飾產(chǎn)物(化合物2)的溶解性比較實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定糖基化對(duì)化合物天然聚酮類產(chǎn)物在不同溶劑中的溶解度影響。1.實(shí)驗(yàn)方法：分別稱取化合物2與化合物1各1mg，置于25℃±2℃1ml的不同溶劑中，每隔5分鐘強(qiáng)力振搖30秒鐘；觀察30分鐘內(nèi)的溶解情況，如看不見溶質(zhì)顆?；蛞旱螘r(shí)，即視為完全溶解。所選取溶劑有蒸餾水，甲醇，乙醇，n-甲基吡絡(luò)烷酮，。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：天然聚酮類產(chǎn)物(化合物1)及其糖基化修飾產(chǎn)物(化合物2)在不同溶劑中的溶解性如表4所示。表4化合物2與化合物1在不同溶劑中的溶解性注：不溶-；微溶-+；部分溶解+；大部分溶解++；完全溶解+++實(shí)施例6比較黃酮類化合物修飾前后的極性變化1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^hplc檢測，根據(jù)出峰時(shí)間，比較黃酮類化合物修飾前后的保留時(shí)間，確定糖基化修飾對(duì)不同黃酮類化合物極性的影響。2.實(shí)驗(yàn)方法：將可參與轉(zhuǎn)化的黃酮類化合物及其糖基化產(chǎn)物溶解于色譜甲醇中，用高效液相色譜檢測。hplc檢測條件如下：色譜柱agilenteclipseplusc18rrhdcolumn(50mmx2.1mmid,1.8μmparticlesize)采用乙腈-h2o為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫:梯度洗脫條件:0～4min,乙腈從10％增為50％；4～8min,乙腈從50％→95％；8～14min,乙腈為95％；14～15min,乙腈從95％→10％。流速0.5ml·min-1；檢測波長為300nm。比較底物及修飾后產(chǎn)物的色譜峰保留時(shí)間。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：黃酮類底物及其糖基化產(chǎn)物的色譜峰保留時(shí)間如表5所示：表5黃酮類底物及其糖基化產(chǎn)物的色譜峰保留時(shí)間編號(hào)名稱原產(chǎn)物保留時(shí)間糖基化產(chǎn)物保留時(shí)間f-3山奈酚3.2761.958f-4橙皮素3.3312.264f-5柚皮素3.1772.076f-6木犀草素2.7411.957f-7大豆苷元2.5421.591f-8大黃素5.0163.047f-11香葉木素3.2902.239f-12染料木素3.1991.981f-15芹菜素3.1862.052f-16刺芒柄花素3.6672.316f-20槲皮素2.7791.728通過比較色譜峰的保留時(shí)間可以發(fā)現(xiàn)，糖基化產(chǎn)物的出峰時(shí)間提前，出峰時(shí)有機(jī)相的比例減小，極性增大，說明其糖基化產(chǎn)物的溶解性在水相中可能有所增強(qiáng)。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>可參與生物合成轉(zhuǎn)化后修飾的葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因<130><160>1<170>patentinversion3.1<210>1<211>1386<212>dna<213>球孢白僵菌(beauveriabassiana)<400>1atgtctccgtcacgcagcgagccacttattgataatttagttgaccgttccaatctcaag60attgtagcgcttgcgtcgcccgctgatggtcacacctttccacttctacgtatcgttgag120gagctagtcctccgtggctacgatgtgacgttcctcgcaagtgaggactacagagcccgc180acagctgccgtgggagcatactttgtccccgttccgccttatgacgatattcaaagaatt240actaccgagctatctgtcatagcggacccaggtgaacgtatgaatgccgctatgatcgag300ctcttcattaagcccaccgccggccgcatggcgacgctgtacgcggcgctcgaggacgtc360aaacgggaaaagcctttacacaaagttgtgcttttgaccgaatcatttttcctcggtgac420catccactattccttggtgcgccgcttccaaagggcttcactagacggcctcgcgccatc480aacattcatgcttgcagctacgggctcagtagcgtcgatagcgcacccttcggcctgacc540atcataccagatggaacagcagaaagccgtgaaaagtacaggaaactgcacagcgatatg600ctgacagggtctcttgcagagtctgtggctctgcaaaagaaggtcttgactgaacttggt660gcgacaaacatggacgaagtggaaggccgcaacccattggatgtcatcgccaccacggcc720gacgtaacgctgcaaatgtgtcctccgagtctagagtatcgtcgatccgatatccacccc780aaggtgcgttttattggtgccttgccgcctcgtgctcccccaaagacgttttccgcgcca840ccgttttggaacaccgtcatcaacggtagcaagcgggtcgtggtagtgtcacagggcaca900gtcgcggtgcgctacgaccaacttcttgtccctgcgatgcatgcgctcgcagacagagat960gacattgttgtggtggcaattctaggccaaaaaggtgctgaattacccggtgaagttgcg1020ataccatcgaatgcctacactgtggactacttgtcatacgacgccatgctaccctatgct1080tcggtgtttgttttgaacgctggctatggcggctttatgcacggcattgtgaatggtgta1140ccgatggtgttggcgggcggaagtgaggacaagcccgaagttgcaaatcgaggcgagttt1200gccggcgtgggaatcaatttgaggacaggaacgccgtcgcagagacagatccgacagggg1260gttgatgaaattttgtcaaatccaaagtataagcggcgcgtcaaggagattcaacttgag1320aatgaaaagatgaaagcaatggattcagtggagaaggagattctcaagtgggcggctatg1380gattga1386<210>2<211>461<212>prt<213>球孢白僵菌(beauveriabassiana)<400>2metserproserargsergluproleuileaspasnleuvalasparg151015serasnleulysilevalalaleualaserproalaaspglyhisthr202530pheproleuleuargilevalglugluleuvalleuargglytyrasp354045valthrpheleualasergluasptyrargalaargthralaalaval505560glyalatyrphevalprovalproprotyraspaspileglnargile65707580thrthrgluleuservalilealaaspproglygluargmetasnala859095alametilegluleupheilelysprothralaglyargmetalathr100105110leutyralaalaleugluaspvallysargglulysproleuhislys115120125valvalleuleuthrgluserphepheleuglyasphisproleuphe130135140leuglyalaproleuprolysglyphethrargargproargalaile145150155160asnilehisalacyssertyrglyleuserservalaspseralapro165170175pheglyleuthrileileproaspglythralagluserargglulys180185190tyrarglysleuhisseraspmetleuthrglyserleualagluser195200205valalaleuglnlyslysvalleuthrgluleuglyalathrasnmet210215220aspgluvalgluglyargasnproleuaspvalilealathrthrala225230235240aspvalthrleuglnmetcysproproserleuglutyrargargser245250255aspilehisprolysvalargpheileglyalaleuproproargala260265270proprolysthrpheseralaproprophetrpasnthrvalileasn275280285glyserlysargvalvalvalvalserglnglythrvalalavalarg290295300tyraspglnleuleuvalproalamethisalaleualaaspargasp305310315320aspilevalvalvalalaileleuglyglnlysglyalagluleupro325330335glygluvalalaileproserasnalatyrthrvalasptyrleuser340345350tyraspalametleuprotyralaservalphevalleuasnalagly355360365tyrglyglyphemethisglyilevalasnglyvalprometvalleu370375380alaglyglysergluasplysprogluvalalaasnargglygluphe385390395400alaglyvalglyileasnleuargthrglythrproserglnarggln405410415ileargglnglyvalaspgluileleuserasnprolystyrlysarg420425430argvallysgluileglnleugluasnglulysmetlysalametasp435440445servalglulysgluileleulystrpalaalametasp450455460當(dāng)前第1頁12