本發(fā)明屬于致病微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌感染和混合性細(xì)菌感染試劑盒。

背景技術(shù)：

多年來(lái)，神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌感染是一直神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)疾病。利用“cnsinfectionsbacteria”作為關(guān)鍵詞在pubmed進(jìn)行查詢，相關(guān)的報(bào)道有37000多個(gè)。尤其對(duì)于神經(jīng)外科來(lái)說(shuō)，細(xì)菌感染更是常見(jiàn)并發(fā)癥。常規(guī)開顱手術(shù)細(xì)菌性感染并發(fā)癥可達(dá)4.8％。腦外傷手術(shù)后顱內(nèi)感染的發(fā)生率約為9.39％。有報(bào)道在icu住院的784例患者,發(fā)生院內(nèi)感染患者162例,細(xì)菌性發(fā)病率為19.4％，肺部為感染好發(fā)部位，發(fā)生率61.7％，其余部位依次為泌尿道17.9％、上呼吸道6.2％、皮膚5.6％。

由于這些神經(jīng)系統(tǒng)感染的致病細(xì)菌難以自血液、痰液等體液中分離培養(yǎng)，尤其是腦脊液內(nèi)細(xì)菌的分離培養(yǎng)非常困難，導(dǎo)致診斷率非常低。例如，有報(bào)道自神經(jīng)外科病人共培養(yǎng)患者標(biāo)本1464份，其中痰標(biāo)本701份，血液標(biāo)222份，腦脊液標(biāo)本426份，其他標(biāo)本115份，共陽(yáng)性標(biāo)本檢出率為43.03％，(痰標(biāo)本74.46％，血液標(biāo)本18.47％，腦脊液標(biāo)本2.58％，其他標(biāo)本48.70％)。再如北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科重癥監(jiān)護(hù)病房自顱內(nèi)感染患者的痰(氣管插管吸取深部痰)、腦脊液及其他體液(血液、中心靜脈導(dǎo)管尖端分泌物、尿液、膽汁、腹水、胸水等)標(biāo)本中分離細(xì)菌5409株，其中痰標(biāo)本91.57％、腦脊液3.85％、其他4.58％。

由于神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌性感染的診斷率較低，直接導(dǎo)致抗生素應(yīng)用盲目、住院周期至幾個(gè)月以上和高致死率。有報(bào)道，對(duì)143例并發(fā)肺部感染的的腦外傷患者的臨床資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)病死率可達(dá)23.08％。

神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌感染的細(xì)菌種類的診斷率為何這樣低，主要由于目前的診斷技術(shù)(依據(jù)細(xì)菌生化特點(diǎn)進(jìn)行微生物診斷)的缺點(diǎn)決定的，包括：(1)需要自各種臨床體液、組織中分離培養(yǎng)細(xì)菌，而較高比例的微生物因無(wú)法培養(yǎng)出而導(dǎo)致漏診，尤其是腦脊液的分離培養(yǎng)更加困難；(2)由于這些生化診斷方法的代謝數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)法包括所有潛在感染的細(xì)菌數(shù)據(jù)而導(dǎo)致漏診某些細(xì)菌；(3)診斷依賴于細(xì)菌代謝特點(diǎn)，而基因表達(dá)代謝受環(huán)境影響較大導(dǎo)致誤診。其它缺點(diǎn)還有，生化診斷需要1-3日或更長(zhǎng)時(shí)間，導(dǎo)致延誤抗生素治療。

因此，需要研發(fā)出更精確的細(xì)菌診斷方法，對(duì)準(zhǔn)確指導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌性感染的抗生素應(yīng)用仍然是非常迫切的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌感染和混合性細(xì)菌感染試劑盒。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌感染和混合性細(xì)菌感染試劑盒，由第一克隆組件和第二克隆組件組成，第一克隆組件用來(lái)pcr擴(kuò)增來(lái)自病人體液的細(xì)菌的基因組中編碼16srrna的dna的序列，第二克隆組件針對(duì)混合性細(xì)菌感染，用來(lái)將第一克隆組件pcr擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到載體中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，進(jìn)而獲得目的序列以測(cè)序，并進(jìn)行菌種鑒定；

第一克隆組件包括：陽(yáng)性對(duì)照ecoli基因組dna100μl、正向引物16srrna-f10μl、反向引物16srrna-r、雙蒸水3ml和2xpcrmastermix2.5ml，其中：陽(yáng)性對(duì)照ecoli基因組dna的濃度為1ng/μl；正向引物16srrna-f如seqidno01所示，濃度為100μm；反向引物16srrna-r如seqidno02所示，濃度為100μm；

第二克隆組件包括：用于菌落pcr的正向引物pmd18-t-f10μl、用于菌落pcr的反向引物pmd18-t-r10μl、雙蒸水3ml、2xpcrmastermix2.5ml、lb液體培養(yǎng)基100ml、lb培養(yǎng)基瓊脂糖培養(yǎng)平板100個(gè)和pmd^tm18-tvectorcloningkit，其中：菌落pcr測(cè)序正向引物pmd18-t-f如seqidno03所示，濃度為100μm；菌落pcr測(cè)序反向引物pmd18-t-r如seqidno04所示，濃度為100μm；lb培養(yǎng)基瓊脂糖培養(yǎng)平板中含有含有x-gal、iptg和氨芐西林；

上述2xpcrmastermix的配方為：taq0.1u/μl，dntp各0.4mm，100mmkcl，3mmmgcl2，20mmtris-hcl，ph8.3。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一克隆組件的pcr反應(yīng)體系的體積為50μl，具體如下：

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述第一克隆組件的pcr擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；共進(jìn)行兩輪pcr。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述菌落pcr的反應(yīng)體系的體積為50μl，具體如下：

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述菌落pcr的pcr擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性2min；95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸100s，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明運(yùn)用測(cè)序編碼16srrna的dna來(lái)建立了一種簡(jiǎn)單、快速、精確的細(xì)菌性感染的致病微生物診斷方法。16srrna是細(xì)菌高度保守的序列，是細(xì)菌化石，可以用于細(xì)菌屬種的鑒定，尤其是對(duì)于實(shí)驗(yàn)室無(wú)法分離培養(yǎng)的微生物，直接自各種體液提取基因組dna、尤其是腦脊液，之后運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,pcr)擴(kuò)增編碼16srrna的dna，而后進(jìn)行測(cè)序診斷致病微生物。

2、本發(fā)明對(duì)于混合性細(xì)菌感染的診斷也有顯著效果，一旦發(fā)現(xiàn)混合性細(xì)菌感染問(wèn)題，即進(jìn)行克?。簩⒒旌细腥镜募?xì)菌基因組中編碼16srrna的dna序列pcr擴(kuò)增后克隆到質(zhì)粒pmd18-t中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)dh5α(大腸桿菌(ecoli))擴(kuò)增形成藍(lán)白斑單菌落，隨機(jī)選取10-15個(gè)無(wú)色單菌落,直接利用特異性引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行測(cè)序，即可診斷出混合性感染的致病細(xì)菌。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中13例顱內(nèi)感染病人的腦脊液細(xì)菌dna中編碼16srrna的dna的pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。左側(cè)為第一輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，其顯示，只有顱內(nèi)感染病人1、2、11、12的腦脊液細(xì)菌dna可以觀測(cè)到編碼16srrna的dna的pcr產(chǎn)物，右側(cè)為第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，其顯示，所有13例顱內(nèi)感染病人的腦脊液細(xì)菌dna都可以觀測(cè)到編碼16srrna的dna的pcr產(chǎn)物，說(shuō)明二輪pcr可大大提高診斷的敏感性。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例4中克隆成功的白色菌落，pcr擴(kuò)增片段連接到pmd18-tvector中并成功轉(zhuǎn)化到dh5α感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)過(guò)x-gal、iptg、氨芐西林篩選，顯示出很多的白色菌落和較少的藍(lán)色菌落。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中白色菌落載體中插入片段的pcr驗(yàn)證，挑取的所有10個(gè)菌落都含有插入的目的片段，說(shuō)明克隆的成功率非常高。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明和描述。

下述實(shí)施例取13例顱內(nèi)感染病人的腦脊液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例1.腦脊液細(xì)菌基因組dna的提取

參照qiaampdnabloodminikit(51304,qiagen,germany)，按照對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌和難裂解細(xì)菌的步驟進(jìn)行。

(1)取新鮮或陳舊腦脊液500μl，6000xg，離心10min，調(diào)整移液器至162μl抽取沉渣和上清,加18ul的10x溶菌酶溶液(200mg/ml溶菌酶，200mmtris·hcl，ph8.0；20mmedta；12％tritonx100)混合，37℃水浴30min。

(2)加proteinasek(dnamini51304配套的為>600mau/ml，工作濃度>60mau/ml，即稀釋10倍；若用roche公司的proteinasek工作濃度為2mg/ml)20ul混合，56℃水浴1h，然后95℃15min加速裂解細(xì)菌，封口膜密封蓋，防止高溫崩開。

(3)加rnasea4μl(需要高濃度100mg/ml，工作濃度為2mg/ml，來(lái)自qiafilterplasmidmaxikit12262,qiagen,germany；或北京索萊寶科技有限公司r1030，儲(chǔ)存濃度10mg/ml))混懸,常溫放置5-10min或更久。

(4)加bufferal200ul混合，56℃水浴30min或70℃水浴10min，封口膜密封蓋，防止高溫崩開。

(5)加carrierrna(1μg/μl天根生物科技有限公司tp316)混懸，加100％無(wú)水乙醇200μl混合，轉(zhuǎn)移至qiaampminispincolumn,6000xg離心1min，去除收集管內(nèi)濾過(guò)液。

(6)加bufferaw1500μl至qiaampminispincolumn,6000xg離心1min，去除收集管內(nèi)濾過(guò)液。

(7)加bufferaw2500μl至qiaampminispincolumn,20000xg離心3min,去除收集管內(nèi)濾過(guò)液，20000xg再次離心2min,去除收集管內(nèi)濾過(guò)液；

(8)更換收集管，加入bufferae50μl靜置5min,6000xg離心1min，收集的dna于-20℃凍存。

實(shí)施例2.血液、血清、血漿、血沉棕黃色層(白細(xì)胞層)、痰液、尿液等其它體液內(nèi)細(xì)菌基因組dna的提取

(1)在1.5ml離心管加200ul血液、血清、血漿、血沉棕黃色層(白細(xì)胞層)、痰液、尿液等其它體液，不足200μl用pbs補(bǔ)齊

(2)加18ul的10x溶菌酶溶液(200mg/ml溶菌酶，200mmtrishcl，ph8.0；20mmedta；12％tritonx100)混合，37℃水浴30min；之后，按照實(shí)施例1的第(2)步開始執(zhí)行。

實(shí)施例3.致病細(xì)菌編碼16srrna的dna的pcr擴(kuò)增、測(cè)序

(1)致病細(xì)菌編碼16srrna的dna的pcr擴(kuò)增和測(cè)序引物針對(duì)細(xì)菌保守16srrna設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增編碼16srrna的dna引物，其5’引物來(lái)自pmd18-tvector(codeno6011，takara)，見(jiàn)表1：

表1.致病細(xì)菌編碼16srrna的dna的pcr擴(kuò)增、測(cè)序、克隆引物

seqidno01中包含seqidno03和擴(kuò)增編碼16srrna的dna的特異性引物；seqidno02中包含seqidno04和擴(kuò)增編碼16srrna的dna的特異性引物；seqidno03、04用于病人腦脊液等體液中細(xì)菌內(nèi)編碼16srrna的dna的pcr產(chǎn)物的測(cè)序(用來(lái)鑒定感染的細(xì)菌的屬種)和菌落pcr產(chǎn)物的測(cè)序(用來(lái)鑒定混合感染的細(xì)菌的屬種)。

(2)pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件

表2.pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系

表3.pcr擴(kuò)增程序

由于腦脊液中細(xì)菌的dna含量可能極低，一輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物不能在瓊脂糖凝膠電泳觀測(cè)到，將這些產(chǎn)物再進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增以提高診斷的靈敏性和診斷率，見(jiàn)圖1。

(3)pcr產(chǎn)物純化

將第二輪pcr產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳后，利用磁珠法(gel_100，長(zhǎng)春市志昂生物科技有限公司)進(jìn)行純化，按照推薦步驟進(jìn)行。

(4)測(cè)序反應(yīng)條件

利用abibigdyeterminator試劑盒v3.1進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)(20μl反應(yīng)體系，96孔板)。

(5)測(cè)序產(chǎn)物純化：采用酒精/edta/naac法。

(6)上機(jī)測(cè)序：利用abi3500或外送3730基因分析儀測(cè)序。

(7)編碼16srrna的dna序列拼接和分析：

利用chromas2.4.1查看、標(biāo)記、去除測(cè)序起始和終末部分的不確定序列；利用lasergeneseqman軟件(dnastar,usa)提取并拼接序列。

將序列利用blast軟件與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定致病微生物的屬種：2號(hào)病人確定為鮑曼不動(dòng)桿菌，11、12號(hào)病人為蠟樣芽胞桿菌，與臨床實(shí)驗(yàn)室利用細(xì)菌生化鑒定所獲得的結(jié)果一致。其他病人測(cè)序?yàn)殡p峰，疑為混合性細(xì)菌感染，采取克隆、測(cè)序的方法解決。

實(shí)施例4.致病細(xì)菌編碼16srrna的dna的克隆測(cè)試

采用pmd^tm18-tvectorcloningkit(codeno.6011，takara)，步驟如下：

(1)利用qbit測(cè)定實(shí)施例3中第(3)步驟經(jīng)純化獲得的病人2的pcr產(chǎn)物濃度(15ng/μl)，用作insertdna,作為陽(yáng)性的克隆測(cè)試對(duì)象。

(2)在微量離心管中配制下列組分。

表4.pcr擴(kuò)增產(chǎn)物連接反應(yīng)體系

在進(jìn)行克隆時(shí)，pmd18-tvectordna和insertdna的摩爾比一般為：1：2-10

(3)16℃反應(yīng)30min。

(4)全量(10μl)加入至100μldh5α感受態(tài)細(xì)胞(cb101-02，天根生化科技有限公司)中，冰中放置30min。

(5)42℃加熱45s后，再在冰中放置1分鐘。

(6)加入890μllb培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60min。

(7)在含有x-gal、iptg、氨芐西林的lb-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計(jì)數(shù)白色、藍(lán)色菌落，見(jiàn)圖2。

(8)挑選10個(gè)白色菌落，使用pcr(表5、6)擴(kuò)增載體中插入片段，10個(gè)菌落都擴(kuò)增到目的片段，見(jiàn)圖3。

表5.菌落pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系

表6.菌落pcr擴(kuò)增程序

(9)按照實(shí)施例3中(3)-(7)步驟，對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，再次證明2號(hào)病人感染的為鮑曼不動(dòng)桿菌，并可在48h內(nèi)完成。這說(shuō)明本技術(shù)可以快速應(yīng)用到混合性細(xì)菌感染病人的致病細(xì)菌的診斷。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說(shuō)明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。