本發(fā)明涉及生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種amy2b信使rna的特異性擴(kuò)增引物，和包括該特異性擴(kuò)增引物的肝癌輔助診斷試劑盒。

背景技術(shù)：

肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是肝臟最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，在世界癌癥相關(guān)性死因中排第三位。目前公認(rèn)能治愈肝癌的手段只有手術(shù)，包括肝部分切除術(shù)及肝移植。而手術(shù)成功率及術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率與腫瘤的臨床分期密切相關(guān)，腫瘤體積的大小和生長(zhǎng)的部位是影響手術(shù)難度和風(fēng)險(xiǎn)的決定性因素。因此盡早發(fā)現(xiàn)肝癌是治療肝癌的關(guān)鍵。而目前臨床上發(fā)現(xiàn)早期肝癌是很困難的。一方面，早期肝癌癥狀不典型，當(dāng)出現(xiàn)疼痛、黃疸、肝功能不全等臨床表現(xiàn)時(shí)多已處于中晚期。另一方面，肝癌篩查手段匱乏。臨床上目前用于篩查肝癌的方法有影像學(xué)檢查(超聲波，ct，mri)及甲胎蛋白(afp)血液檢測(cè)。但是這些手段的敏感性及特異性都不能令人滿意。因此，發(fā)明一種敏感性高、特異性好且操作方便的檢查手段很有必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述臨床需求，提供一種amy2b信使rna的特異性擴(kuò)增引物以及包括該特異性擴(kuò)增引物的肝癌輔助診斷試劑盒。

本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)amy2b基因(cdna序列為seqidno：1)在晚期肝癌患者中顯著下調(diào)，用rt-pcr技術(shù)在早期肝癌病人標(biāo)本中驗(yàn)證得知，amy2b的表達(dá)量在肝癌早期中也有部分降低。進(jìn)一步分析肝 癌患者預(yù)后生存期發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)amy2b的患者生存期顯著縮短。

基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的第一方面是提供一種amy2b信使rna的特異性擴(kuò)增引物，該特異性擴(kuò)增引物包括：

正向引物：5’-atcaacctagccatccaacct-3’(seqidno：2)；

反向引物：5’-aaccgaattttcaattgttttcaca-3’(seqidno：3)。

本發(fā)明的第二方面是提供一種肝癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒包括：

(1)上述amy2b信使rna的特異性擴(kuò)增引物；

(2)pcr反應(yīng)用酶和試劑，和/或參照基因標(biāo)志物的信使rna的特異性引物。

所述參照基因標(biāo)志物優(yōu)選為hprt。參照基因的選擇基于國(guó)際腫瘤研究權(quán)威雜志journalofcancerresearchandclinicaloncology在2008年的研究文章：selectionofreferencegenesforreal-timepcrinhumanhepatocellularcarcinomatissues。該文章的作者為：gaoq1,wangxy,fanj,qiusj,zhouj,shiyh,xiaoys,xuy,huangxw,sunj。

參照基因hprt的信使rna的特異性引物可以為常規(guī)的用于驗(yàn)證hprt的特異性引物，優(yōu)選為：

正向引物：5’-cctggcgtcgtgattagtgat-3’(seqidno：4)；

反向引物：5’-agacgttcagtcctgtccataa-3’(seqidno：5)。

根據(jù)本發(fā)明，所述pcr反應(yīng)用酶和試劑優(yōu)選為用于pcr反應(yīng)的各種常規(guī)試劑，包括但不限于：taq酶、4×dntp混合液、mgcl2溶液和去離子水。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括：標(biāo)準(zhǔn)品amy2b基因序列。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括：對(duì)照品hprt基因序列。

通過(guò)分析肝癌患者組織樣品及正常組織的amy2b的信使rna的豐度，發(fā)現(xiàn)amy2b的豐度與肝癌的病理級(jí)別和預(yù)后生存高度關(guān)聯(lián)，并研制出可便于臨床應(yīng)用的肝癌輔助診斷試劑盒，為肝癌的診斷提供分子指標(biāo)的 支持，并為臨床用藥提供指導(dǎo)信息。

本發(fā)明的效果如下：

(1)利用qpcr進(jìn)行腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)具有非常高的敏感性和特異性，而且定量精確，有助于肝癌的輔助診斷，也為其他疾病的生物標(biāo)志物提供借鑒，同時(shí)amy2b的表達(dá)量為臨床上判斷患者病程提供信息支持。

(2)利用大樣本量的生物組織庫(kù)，驗(yàn)證了本發(fā)明試劑盒的有效性，并且對(duì)肝癌病人預(yù)后生存狀況進(jìn)行了分析，證明了本發(fā)明試劑盒能夠有效地預(yù)測(cè)病人的生存期長(zhǎng)短。為臨床檢測(cè)病人康復(fù)情況和制定個(gè)性化治療方案提供了幫助。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

通過(guò)結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明示例性實(shí)施方式進(jìn)行更詳細(xì)的描述。

圖1為人類amy2b的基因圖譜。

圖2顯示利用本發(fā)明的試劑盒對(duì)肝癌和正常肝臟樣本中amy2b信使rna的擴(kuò)增情況。

圖3顯示利用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)肝癌樣本中amy2b的表達(dá)量情況，并分析病人的病理進(jìn)程。其中，p表示差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，采用t檢驗(yàn)。

圖4顯示利用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)肝癌樣本中amy2b的表達(dá)量情況，并以此為依據(jù)分析病人的預(yù)后以及生存期限。其中，橫軸表示病人生存時(shí)間(天)，p表示差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，采用logrank檢驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的肝癌輔助診斷試劑盒的研制過(guò)程包括：(1)系統(tǒng)收集病人肝癌組織和臨床資料，并長(zhǎng)時(shí)間跟蹤病人預(yù)后情況；(2)研究肝癌組織中amy2b信使rna的豐度與臨床指標(biāo)和病人預(yù)后生存之間的關(guān)聯(lián)；(3)建 立數(shù)學(xué)模型，驗(yàn)證amy2b信使rna的豐度用于臨床診斷的可重復(fù)性；(4)研制基于amy2b的肝癌輔助診斷試劑盒。

在上述步驟(3)中，amy2b信使rna的豐度采用qpcr進(jìn)行檢測(cè)，具體的操作步驟為：

(1)分離純化肝癌組織樣品中的總rna；

(2)將步驟(1)的總rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna；

(3)在熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀上將amy2b和參照基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)；

amy2b信使rna的特異性擴(kuò)增引物為：

正向引物：5’-atcaacctagccatccaacct-3’(seqidno：2)；

反向引物：5’-aaccgaattttcaattgttttcaca-3’(seqidno：3)。

參照基因hprt的信使rna的特異性引物為：

正向引物：5’-cctggcgtcgtgattagtgat-3’(seqidno：4)；

反向引物：5’-agacgttcagtcctgtccataa-3’(seqidno：5)。

上述步驟均可以為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟。

例如，步驟(1)的具體操作步驟包括：

a.組織勻漿：在液氮浴中把組織標(biāo)本研磨為粉狀，加入適量trizol試劑，轉(zhuǎn)移至1.5mleppendorf管中，放置室溫下5分鐘。

b.每ml組織研磨液中加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15秒，室溫下靜置3分鐘，之后放入離心機(jī)，12000g離心15分鐘。

c.小心移取上清至新管，加入相同體積的異丙醇，顛倒混勻。4℃下靜置15分鐘，之后7500g離心15分鐘。

d.移棄上清，加入1ml75％乙醇，7500g離心5分鐘。

e.空氣干燥rna沉淀10分鐘，用20μldepc水溶解沉淀。

f.用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)od260和od280的值。

步驟(2)的具體操作包括：

將步驟(1)提取的1μg總rna溶解于14μldepc水中，加入2μl10×緩沖液、2μl10mmdntp混合液、1μloligo(dt)18引物(0.5μg/ul)和1μl逆轉(zhuǎn)錄酶，輕微震蕩。42℃孵育60分鐘，置于95℃3分鐘。冰上冷卻之后短暫離心，加入380μl去離子水，備用。

步驟(3)的具體操作包括：

采用12μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)管，以保證結(jié)果的可靠性。sybrgreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系6μl，正反向引物各1μl，步驟(2)的反應(yīng)產(chǎn)物4μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，5分鐘，(94℃，15秒；60℃，60秒)×40個(gè)循環(huán)。在熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀上進(jìn)行pcr反應(yīng)。

圖2顯示了利用本發(fā)明的試劑盒對(duì)肝癌和正常肝臟樣本中amy2b信使rna的擴(kuò)增情況。驗(yàn)證了本發(fā)明的試劑盒對(duì)肝癌樣品檢測(cè)的有效性。從結(jié)果可以看出，本發(fā)明的試劑盒可以有效檢測(cè)肝癌組織樣品中amy2b信使rna的豐度，依據(jù)擴(kuò)增曲線可以計(jì)算出amy2b信使rna的相對(duì)量。

為了繼續(xù)評(píng)估本發(fā)明在肝癌臨床輔助診斷中的價(jià)值，發(fā)明人運(yùn)用本試劑盒對(duì)臨床收集的369例肝癌樣品和50例癌旁正常組織樣品進(jìn)行了檢測(cè)。其中，50例癌旁組織樣品作為對(duì)照組。

首先比對(duì)了本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果和肝癌臨床病理分級(jí)的結(jié)果。如圖3所示，在肝癌早期病人中，amy2b信使rna的豐度略有下調(diào)但不明顯；而在肝癌晚期病人中，amy2b信使rna的豐度降低了一倍以上，并在統(tǒng)計(jì)學(xué)上表現(xiàn)出極高的顯著性。這一結(jié)果提示，監(jiān)測(cè)amy2b信使rna的豐度可以用來(lái)輔助判斷肝癌病人的疾病發(fā)展?fàn)顩r，對(duì)于出現(xiàn)amy2b信使rna的豐度下降的病人要予以密切關(guān)注和積極治療。

發(fā)明人還比較了本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果和肝癌病人的預(yù)后評(píng)估。如圖4所示，依據(jù)369例肝癌病人的監(jiān)測(cè)結(jié)果將病人分為amy2b信使rna高水平組和低水平組。我們發(fā)現(xiàn)，amy2b信使rna高水平組的生存預(yù)期顯著優(yōu)于低水平組，前者的5年生存率是后者的1.6倍，前者的中位生存時(shí)間是 后者的2倍以上。該結(jié)果顯示，用本發(fā)明的試劑盒對(duì)肝癌病人的預(yù)后生存評(píng)估具有十分重要的參考價(jià)值，可以提示病人的生存預(yù)期。

以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實(shí)施例，上述說(shuō)明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實(shí)施例。在不偏離所說(shuō)明的各實(shí)施例的范圍和精神的情況下，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)許多修改和變更都是顯而易見的。