專利名稱：細(xì)菌的保護(hù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種具有抗脅迫保護(hù)的細(xì)菌細(xì)胞，這些脅迫包括極端溫度改變和滲透休克的影響；一種含有受保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞的營養(yǎng)或藥物組合物；以及保護(hù)細(xì)菌抗脅迫的方法。
在這份說明書的上下文中，“含有”的意思是“除其他之外還包括”的意思。不應(yīng)被解釋為“僅由…組成”。另外，“脅迫”一詞可被與術(shù)語“逆境”互換使用。其包括但不限于溫度(熱休克、冷休克)，鹽(滲透休克)，pH(pH休克)，化學(xué)脅迫(抗生素，醇，雙氧水等)，營養(yǎng)脅迫，紫外脅迫，冷脅迫和氧濃度(氧化脅迫)的逆境。
本說明書使用IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)定義的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，RNA和DNA代碼。
眾所周知，細(xì)菌如乳酸細(xì)菌(LAB)在環(huán)境中是無所不在的，并且它們被大量地用于發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)。例如，在食品工業(yè)中，細(xì)菌被用于奶制品的發(fā)酵和曲引培養(yǎng)物的生產(chǎn)。在曲引培養(yǎng)物的生產(chǎn)、食品發(fā)酵、加工和儲(chǔ)藏過程中，被使用的細(xì)菌必需用不同種類的逆境處理，這些逆境通常有顯著地降低它們的生活力、穩(wěn)定性和活性的效果。這些逆境隨生產(chǎn)需要而變化，包括熱休克(冰凍-干燥或噴霧-干燥)、滲透休克(干燥)和pH休克(發(fā)酵)。人們認(rèn)識到，在細(xì)菌被大規(guī)模使用的條件下，細(xì)菌對這些脅迫的敏感性或無法應(yīng)付這些脅迫是一個(gè)問題。
在人類腸道主要是小腸和大腸中雙歧桿菌或乳桿菌的存在通常被公認(rèn)為是有益于健康的促進(jìn)因子。此外，認(rèn)為雙歧桿菌或乳桿菌在疾病包括胃腸感染的預(yù)防或治療中可能是有用的。據(jù)此，已經(jīng)有人建議在腸道中維持大量的雙歧桿菌或乳桿菌群體和服用包括這種細(xì)菌的產(chǎn)品。通常這些產(chǎn)品包括不同種的雙歧桿菌或乳桿菌。然而，產(chǎn)品加工和儲(chǔ)藏過程中雙歧桿菌和乳桿菌被暴露于其中的這些脅迫能顯著地降低它們的生活力和/或生理活性。
細(xì)菌培養(yǎng)物對亞致死溫度改變或其它亞致死脅迫(包括暴露于氧和滲透休克)的自然應(yīng)答包括一組叫做“應(yīng)激蛋白”的獨(dú)特多肽的快速表達(dá)。這些蛋白已被表明能使革蘭氏陽性細(xì)菌例如乳酸乳球菌，枯草芽孢桿菌，嗜酸乳桿菌，清酒乳桿菌，糞腸球菌和約氏乳桿菌適應(yīng)其它的限制生長的條件。
研究的最多的一種應(yīng)激蛋白是熱休克蛋白或伴侶蛋白。這些蛋白通常涉及到新合成蛋白的成熟，并且它們協(xié)助變性蛋白的重新折疊。在LAB中，許多的應(yīng)激基因已被描述，包括那些編碼涉及到新合成蛋白的正確折疊和那些變性蛋白復(fù)性的兩種主要伴侶機(jī)制(groES/groEL和hrcA/grpE/dnaK/danJ)的基因。
引人注目地是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌包括雙歧桿菌或乳桿菌能被保護(hù)，抵抗在非保護(hù)細(xì)菌中是致死的脅迫水平。令人驚訝地是，其可通過使細(xì)菌經(jīng)受一種亞致死水平的脅迫處理而實(shí)現(xiàn)。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在這種初始的脅迫處理后要對細(xì)菌有不利影響需要更高的脅迫水平。這是出乎意料的，因?yàn)橐话阏J(rèn)為被脅迫損害的細(xì)胞應(yīng)付進(jìn)一步的脅迫的可能性更小。事實(shí)上，相反的情況已被發(fā)現(xiàn)，預(yù)脅迫的細(xì)胞比未經(jīng)預(yù)脅迫的對照細(xì)胞能忍受更高水平的脅迫。
通過用不相關(guān)的脅迫方式處理獲得的抵抗一種脅迫的保護(hù)作用被稱作為“交叉保護(hù)作用”。這是出乎意料的，因?yàn)橐话阏J(rèn)為經(jīng)受過一種脅迫處理損害的細(xì)胞對其它的亞致死或致死脅迫更為敏感。
因此，第一方面，本發(fā)明提供一種細(xì)菌細(xì)胞，其具有抵抗對于非保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞是致死的條件的保護(hù)作用，其中，這種被保護(hù)的細(xì)胞是通過使細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)受亞致死水平的脅迫處理而獲得。
第二方面，本發(fā)明提供一種營養(yǎng)組合物，該組合物含有具有抵抗對于非保護(hù)細(xì)菌是致死的條件的保護(hù)作用的細(xì)菌，其中，這種受保護(hù)的細(xì)菌是通過使細(xì)菌經(jīng)受亞致死水平的脅迫處理并使其恢復(fù)而獲得的。
再一方面，本發(fā)明提供一種保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞抗脅迫的方法，該方法包括，用選自熱休克、滲透休克、pH休克、氧化脅迫、化學(xué)脅迫、營養(yǎng)脅迫、紫外脅迫、冷脅迫的亞致死水平脅迫處理細(xì)菌細(xì)胞的步驟。
優(yōu)選，該方法包括允許該細(xì)胞恢復(fù)的步驟。
優(yōu)選，化學(xué)脅迫通過用抗生素、醇、或雙氧水處理提供。
優(yōu)選，該細(xì)菌細(xì)胞選自雙歧桿菌、乳酸細(xì)菌、腸球菌、鏈霉菌和桿菌。
更優(yōu)選，該細(xì)菌是長雙歧桿菌，青春雙歧桿菌，短雙歧桿菌或約氏乳桿菌。這些細(xì)菌所提供的優(yōu)勢是它們有能力快速地酸化它們的底物，從而生產(chǎn)微生物學(xué)上安全的產(chǎn)品。此外，它們有益于人類和動(dòng)物的健康。而且，它們顯示出了抗腸道病原物攻擊的保護(hù)作用，并被與抗致癌物質(zhì)、抗誘變和抗致腫瘤的活性相關(guān)聯(lián)。若不囿于理論，最近的報(bào)道顯示它們可以在腸道中通過抗微生物活性直接地起作用，通過經(jīng)由腸道細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)或通過改變土著微生物菌系而間接地起作用。
優(yōu)選細(xì)菌，更優(yōu)選雙歧桿菌和乳桿菌，被亞致死濃度的鹽處理以保護(hù)它們抗致死的鹽濃度，或細(xì)胞被亞致死的熱脅迫處理保護(hù)它們抗致死的溫度。此外，結(jié)果表明鹽處理(如NaCl)能保護(hù)這些細(xì)菌抗致死的熱脅迫或抗致死的反復(fù)凍融。據(jù)此，本發(fā)明也包括用鹽處理細(xì)胞以保護(hù)抗熱脅迫或用不利的溫度條件處理以保護(hù)抗鹽脅迫的步驟。
優(yōu)選該細(xì)菌細(xì)胞選自長雙歧桿菌，青春雙歧桿菌或約氏乳桿菌。更優(yōu)選該細(xì)菌選自長雙歧桿菌，NCC481，青春雙歧桿菌NCC251或約氏乳桿菌Lal。
優(yōu)選，抗致死鹽濃度(如0.1％～0.4％)的保護(hù)作用通過用大約0.01～0.1％的鹽處理大約15～60分鐘來進(jìn)行。優(yōu)選該鹽為膽汁鹽。
優(yōu)選，抗致死的熱脅迫(如大約50～60℃)的保護(hù)作用通過用大約37℃-50℃處理大約15-60分鐘或通過大約1％-4％的鹽濃度處理大約30-60分鐘來進(jìn)行。
優(yōu)選，抗凍融(如1-10循環(huán))的保護(hù)作用通過用1％～4％的鹽濃度處理該細(xì)胞來進(jìn)行。
優(yōu)選長雙歧桿菌NCC481細(xì)胞被保護(hù)。更優(yōu)選，長雙歧桿菌NCC48 1細(xì)胞抵抗致死的膽汁鹽濃度(如大約0.2％～0.3％，30分鐘)的保護(hù)作用，在它們生長周期的對數(shù)期通過在致死刺激之前使該細(xì)胞經(jīng)受0.1％的膽汁鹽處理大約30分鐘而獲得。
優(yōu)選，長雙歧桿菌NCC481細(xì)胞抵抗致死的膽汁鹽濃度(如大約0.075％～0.15％，大約30分鐘)的保護(hù)作用，在它們生長周期的穩(wěn)定期通過在致死刺激之前使該細(xì)胞經(jīng)受0.05％的膽汁鹽處理大約30分鐘而獲得。
優(yōu)選，青春雙歧桿菌NCC251細(xì)胞被保護(hù)。更優(yōu)選，(如大約0.3％～0.4％，30分鐘)的青春雙歧桿菌NCC251細(xì)胞抵抗致死膽汁鹽濃度的保護(hù)作用，在它們生長周期的對數(shù)期通過在致死刺激之前使該細(xì)胞經(jīng)受0.1％的膽汁鹽處理大約30分鐘而獲得。
優(yōu)選，青春雙歧桿菌NCC251細(xì)胞抵抗致死的膽汁鹽濃度(如大約0.15％，大約30分鐘)的保護(hù)作用，在它們生長周期的穩(wěn)定期通過在致死刺激之前使該細(xì)胞經(jīng)受0.1％的膽汁鹽處理大約30分鐘而獲得。
優(yōu)選，青春雙歧桿菌NCC251細(xì)胞抵抗否則會(huì)致死的凍融(如大約3～4次循環(huán))(大約-80℃～大約室溫(優(yōu)選大約20℃～30℃，更優(yōu)選25℃))作用保護(hù)作用，在它們生長周期的穩(wěn)定期通過使該細(xì)胞經(jīng)受大約2％NaCl處理大約1小時(shí)而獲得。
優(yōu)選，青春雙歧桿菌NCC251細(xì)胞抵抗否則會(huì)致死的55℃20分鐘處理的保護(hù)作用，在它們生長周期的對數(shù)期通過在大約45℃處理該細(xì)胞大約30分鐘，在大約47℃大約15分鐘或用1％或2％NaCl處理大約1小時(shí)來進(jìn)行。
優(yōu)選，約氏乳桿菌Lal細(xì)胞被保護(hù)。更優(yōu)選，約氏乳桿菌Lal細(xì)胞抵抗否則會(huì)致死的55℃達(dá)1小時(shí)的保護(hù)作用，在它們生長周期的對數(shù)期通過用大約3.5％NaCl處理該細(xì)胞大約15分鐘或大約48℃處理15分鐘來進(jìn)行。
優(yōu)選，約氏乳桿菌Lal細(xì)胞抵抗否則會(huì)致死的55℃達(dá)1小時(shí)的保護(hù)作用，在它們生長周期的對數(shù)期通過用大約48℃處理15分鐘或大約3.5％NaCl處理該細(xì)胞大約15分鐘來進(jìn)行。
參考本發(fā)明的附圖，本發(fā)明的實(shí)施方案將被進(jìn)一步詳細(xì)描述如下

圖1顯示了暴露于不同種類的脅迫10分鐘后，來自于長雙歧桿菌NCC481和青春雙歧桿菌NCC251細(xì)胞RNA的點(diǎn)雜交結(jié)果。NCC481和NCC251分別用特異性探針GSR8和GSR5進(jìn)行雜交。
圖2顯示了在對數(shù)期經(jīng)不同前誘導(dǎo)后，青春雙歧桿菌NCC251在55℃的存活圖。在MRS和半胱氨酸中，37℃下培養(yǎng)細(xì)胞至OD600為0.4～0.7。細(xì)胞被分為幾等份并使之分別經(jīng)受47℃處理15分鐘、45℃處理30分鐘、或1.5％或2％NaCl處理1小時(shí)；對照維持在37℃。樣品被轉(zhuǎn)移至55℃并在10分鐘和20分鐘后測定存活細(xì)胞數(shù)。
圖3顯示了經(jīng)3和4次反復(fù)凍融后青春雙歧桿菌NCC251的存活圖。取穩(wěn)定期細(xì)胞并使之經(jīng)受2％NaCl處理1小時(shí)，對照不加鹽。樣品被轉(zhuǎn)移至-80℃并在室溫融化。在測定存活細(xì)胞數(shù)之前，這種循環(huán)被重復(fù)3～4次。
圖4顯示了在對數(shù)期致死膽汁鹽條件下長雙歧桿菌NCC481的存活圖。細(xì)胞培養(yǎng)至OD600(在600nm處的光密度)為0.4～0.7并使之經(jīng)受0.1％牛膽汁處理30分鐘。對照不加牛膽汁。樣品被分成幾等份并轉(zhuǎn)移至0.2％、0.25％和0.3％的牛膽汁處理30分鐘，并測定存活細(xì)胞數(shù)。
圖5顯示了在穩(wěn)定期致死膽汁鹽條件下長雙歧桿菌NCC481的存活圖。細(xì)胞經(jīng)0.05％牛膽汁處理30分鐘。對照不加牛膽汁。樣品被分成幾等份并轉(zhuǎn)移至0.075％、0.1％和0.15％的膽汁處理30分鐘，并測定存活細(xì)胞數(shù)。
圖6顯示了在對數(shù)期致死膽汁鹽條件下青春雙歧桿菌NCC251的存活圖。細(xì)胞培養(yǎng)至OD600(在600nm處的光密度)為0.4～0.7并使之經(jīng)受0.1％牛膽汁處理30分鐘。對照不加任何牛膽汁。樣品被分成幾等份并轉(zhuǎn)移至0.3％和0.4％的牛膽汁處理30分鐘，并測定存活細(xì)胞數(shù)。
圖7顯示了在穩(wěn)定期致死膽汁鹽條件下青春雙歧桿菌NCC251的存活圖。細(xì)胞經(jīng)受0.1％牛膽汁處理30分鐘。對照不加任何牛膽汁。樣品被分成幾等份并轉(zhuǎn)移至0.15％的牛膽汁處理30分鐘，并測定存活細(xì)胞數(shù)。
圖8顯示了在致死溫度條件下約氏乳桿菌Lal的存活圖。在MRS中，37℃下培養(yǎng)細(xì)胞至OD600(在600nm處的光密度)為0.4～0.7。取出樣品并使之經(jīng)受3.5％NaCl或48℃處理15分鐘。對照維持在37℃。然后樣品被轉(zhuǎn)移至55℃并在30和60分鐘后測定存活細(xì)胞數(shù)。
圖9顯示了在生長周期的穩(wěn)定期在致死溫度條件下約氏乳桿菌Lal的存活圖。取出樣品并使之經(jīng)受3.5％NaCl或48℃處理15分鐘。對照維持在37℃。然后樣品被轉(zhuǎn)移至55℃并在60分鐘后測定存活細(xì)胞數(shù)。
菌株及生長條件在補(bǔ)充有0.5g/l半胱氨酸的MRS培養(yǎng)基中，37℃、厭氧條件下(98％N2和2％H2)培養(yǎng)青春雙歧桿菌NCC251，長雙歧桿菌NCC481，長雙歧桿菌NCC490，長雙歧桿菌NCC585，和短雙歧桿菌NCC298。在MRS培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)乳酸乳球菌MG1363。在Laria-Bertani培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)大腸桿菌TG1(Amersham)。在MRS中，37℃培養(yǎng)約氏乳桿菌Lal。
脅迫處理細(xì)胞培養(yǎng)至OD600(在600nm處的光密度)為0.4～0.7或在穩(wěn)定期取出并使之經(jīng)受不同時(shí)間不同脅迫條件的處理。用于凍融試驗(yàn)的細(xì)胞在使之經(jīng)受-80℃處理之前被濃縮于鹽溶液中。通過向樣品中加入NaCl來實(shí)施鹽脅迫，而OXGALL(商標(biāo))(Difco)被用于膽汁鹽脅迫。
雙歧桿菌的脅迫處理在厭氧條件下進(jìn)行，而存活細(xì)胞數(shù)的測定在好氧條件下進(jìn)行。在微好氧條件下培養(yǎng)乳桿菌，在好氧條件下進(jìn)行脅迫處理和存活細(xì)胞數(shù)測定。
雙歧桿菌誘導(dǎo)及致死刺激的范圍前誘導(dǎo)致死刺激pH(如HCl)pH6.0-3.5 pH2.5-2膽汁(如牛膽汁) 0.01％-0.1％0.075％-0.4％溫度 37℃-48℃ 50℃-60℃鹽(如NaCl) 0.5％-3％ 3％-8％前誘導(dǎo)及致死刺激的時(shí)間可根據(jù)菌株和脅迫條件在5分鐘-2小時(shí)間變化。
乳桿菌誘導(dǎo)及致死刺激的范圍前誘導(dǎo)致死刺激pH(如HCl，乳酸) pH6.0-4.5 pH4.0-2溫度 40℃-50℃ 50℃-60℃鹽(如NaCl) 0.5％-3.5％4％-8％前誘導(dǎo)及致死刺激的時(shí)間可根據(jù)菌株和脅迫條件在5分鐘-2小時(shí)間變化。
DNA技術(shù)染色體DNA的提取按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。
mRNA的分析至于斑點(diǎn)雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)方法將總RNA提取、變性、轉(zhuǎn)移至無電荷的尼龍膜(GeneScreen，NEN)。膜經(jīng)預(yù)雜交(1小時(shí)，40℃)并隨后用100pmol地高辛標(biāo)記的探針(Boehringer)雜交4小時(shí)。在含有0.1％SDS的2×SSC中40℃洗膜兩次，每次5分鐘，并在對應(yīng)于探針的溫度下洗一次，對于兩個(gè)dnaK特異性探針GSR5(5’-CATCGAAGGTGCCGCCAC-3’)和GSR8(5’-TCGTCACCACCGAGGTG-3’)，溫度分別為46℃和48℃，對于通用探針1028R(5’-CCTTCTC CCGAAGTTACGG-3’)，溫度為51℃。檢測按照操作說明進(jìn)行。
PCR擴(kuò)增用簡并引物HS1(5’-ATIACIGTICCIGCITA(T/C)TT(T/C)AA(T/C)GA-3’)和HS2(5’-CATIGT(T/C)TCIATICIA(A/G)IGAIA(G/A)IGG-3’)及1μg的染色體DNA作為模板擴(kuò)增dnaK的核心區(qū)域。
擴(kuò)增在100μl體系(含dATP，dCTP，dGTP及dTTP各200μM，引物各50pmol，2.5單位的Super-TaqDNA聚合酶(HT Biotechnology)，和相應(yīng)的1×PCR緩沖液)中進(jìn)行。反應(yīng)用Perkin-Elmer熱循環(huán)儀進(jìn)行在95℃預(yù)變性5分鐘，接著95℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1分鐘循環(huán)30次；最后72℃延伸10分鐘。
DnaK基因的鑒定在Barril等(1994)的序列比對的基礎(chǔ)上，我們選擇具有相同氨基酸序列的乳酸乳球菌，大腸桿菌和巨大芽孢桿菌的DnaK的兩個(gè)區(qū)域并設(shè)計(jì)了兩個(gè)簡并引物HS1和HS2，這兩個(gè)引物分別對應(yīng)乳酸乳球菌DnaK的114-122位和366-374位的氨基酸。這一對引物用于以NCC481，NCC490，NCC585，NCC251和NCC298的染色體DNA作為模板的PCR擴(kuò)增。每個(gè)菌株獲得兩個(gè)片段。所有菌株中，大小與兩個(gè)陽性對照大腸桿菌和巨大芽孢桿菌相對應(yīng)的片段被從瓊脂糖凝膠中分離、純化并測序。每個(gè)片段鑒定出一個(gè)開放閱讀框，顯示了與已知的DnaK蛋白高度的序列相似性。尤其是與鏈霉菌和藍(lán)細(xì)菌及清酒乳桿菌，桿菌和鏈球菌有高度同一性。
dnaK基因表達(dá)的mRNA分析將細(xì)胞暴露于熱休克和其它通常的脅迫條件下研究dnaK的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)。對數(shù)期的長雙歧桿菌NCC481和青春雙歧桿菌NCC251細(xì)胞經(jīng)受0.1％膽汁鹽、1.5％NaCl或42℃和45℃熱休克10分鐘處理，NCC481和NCC251分別進(jìn)行了最高溫度為47℃和50℃的試驗(yàn)。始終用來自于對數(shù)期和穩(wěn)定期的未誘導(dǎo)細(xì)胞作對照。提取總RNA并進(jìn)行點(diǎn)雜交。DnaK特異性探針GSR8和GRS5分別被用于NCC481和NCC251。通用探針被選用以檢查膜上RNA的量和質(zhì)量。隨著處理溫度的升高，觀察到被處理細(xì)胞的dnaK特異性mRNA的濃度隨之增加(圖1)。與NCC251相反，NCC481的dnaK在進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)細(xì)胞中僅被微弱地誘導(dǎo)。而且在膽汁鹽和NaCl處理后，在NCC251中觀察到dnaK的微弱的誘導(dǎo)。在同樣的條件下在NCC481中沒有獲得顯著的誘導(dǎo)。
存活和交叉保護(hù)作用在不同溫度、膽汁鹽和鹽條件下進(jìn)行約氏乳桿菌Lal，青春雙歧桿菌NCC251和長雙歧桿菌NCC481的生長和存活試驗(yàn)。
很顯然，對數(shù)期的NCC251在經(jīng)過亞致死的熱脅迫后，顯示出對一般致死的溫度55℃的更強(qiáng)抗性。在熱休克10分鐘和20分鐘前使細(xì)胞經(jīng)受47℃處理15分鐘，熱耐受能力分別提高幾乎24倍和128倍(圖2)。這些數(shù)字是值得注意的，因?yàn)樗鼈儽砻骷?xì)胞的前誘導(dǎo)對保護(hù)它們抵抗否則是致死的刺激具有出乎意料的效果。通過1.5％NaCl前處理1小時(shí)實(shí)現(xiàn)了抗55℃的9倍和15倍的細(xì)胞交叉保護(hù)。通過45℃前誘導(dǎo)30分鐘或2％NaCl前誘導(dǎo)1小時(shí)，相等的抗熱脅迫的保護(hù)作用也被觀察到(圖2)。
約氏乳桿菌Lal的處于生長周期對數(shù)期的細(xì)胞被用3.5％NaCl預(yù)處理或48℃預(yù)處理15分鐘后，顯示了抗55℃30分鐘400倍高的保護(hù)作用。在55℃1小時(shí)后，用3.5％NaCl預(yù)處理或48℃預(yù)處理15分鐘的樣品，分別觀察到抗55℃的10倍和5倍高的保護(hù)作用(圖8)。
在48℃用3.5％NaCl處理15分鐘后，約氏乳桿菌La1的穩(wěn)定期的細(xì)胞顯示了抗55℃1小時(shí)20倍高的顯著的保護(hù)作用(圖9)。
如果用2％NaCl預(yù)脅迫1小時(shí)，處于穩(wěn)定期青春雙歧桿菌NCC251的細(xì)胞在連續(xù)的反復(fù)凍融后顯示出了14倍高的存活(圖3)。在4次反復(fù)凍融后，觀察到10倍高的存活。
抗致死膽汁鹽濃度的保護(hù)作用可在青春雙歧桿菌NCC251和長雙歧桿菌NCC481的對數(shù)期及穩(wěn)定期被觀察到。在青春雙歧桿菌NCC251的對數(shù)期用0.1％的膽汁鹽預(yù)處理細(xì)胞(如30分鐘)導(dǎo)致分別抗0.3％和0.4％膽汁鹽的300倍和21倍的保護(hù)作用(圖6)。在0.15％膽汁鹽的致死濃度下青春雙歧桿菌NCC251(用0.1％膽汁鹽前誘導(dǎo))的穩(wěn)定期細(xì)胞的81倍高的存活被觀察到(圖7)。從長雙歧桿菌NCC481得到了相似的結(jié)果。對數(shù)期細(xì)胞，用0.15％牛膽汁前誘導(dǎo)，顯示了分別抗0.2％、0.25％、0.3％牛膽汁的400倍、1800倍及580倍的存活(圖4)。當(dāng)穩(wěn)定期的細(xì)胞被用0.05％的牛膽汁前誘導(dǎo)30分鐘時(shí)，顯示出了抗0.075％、0.1％及0.15％的牛膽汁30分鐘的3倍、29倍及150倍的存活(圖5)。
與Flahaut等(1996)發(fā)表的糞腸球菌細(xì)胞抗0.3％膽汁鹽的保護(hù)作用僅能達(dá)到30秒的結(jié)果相反，顯然細(xì)胞能被保護(hù)抗致死的膽汁鹽濃度30分鐘。這是沒有預(yù)料到的。
長雙歧桿菌NCC481，長雙歧桿菌NCC490，長雙歧桿菌NCC585，青春雙歧桿菌NCC251，和短雙歧桿菌NCC298的dnaK的核心區(qū)域被PCR擴(kuò)增并鑒定。隨后的mRNA分析揭示了在NCC251和NCC481中，dnaK的誘導(dǎo)在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)控。轉(zhuǎn)錄通常被熱誘導(dǎo)，而且對于NCC251也被鹽和膽汁鹽處理誘導(dǎo)。
根據(jù)這些結(jié)果得出結(jié)論雙歧桿菌和/或乳桿菌的脅迫預(yù)處理能導(dǎo)致在否則是致死的相似的或不同的脅迫條件下顯著增加的存活機(jī)會(huì)。
權(quán)利要求
1.一種具有抵抗對非保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞是致死的條件的保護(hù)作用的細(xì)菌細(xì)胞，其中，這種受保護(hù)的細(xì)胞通過使細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)受亞致死水平的脅迫處理而獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌細(xì)胞，選自雙歧桿菌、乳酸細(xì)菌、腸球菌、鏈霉菌和桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的細(xì)菌細(xì)胞，選自長雙歧桿菌NCC481，青春雙歧桿菌NCC251和約氏乳桿菌Lal。
4.一種營養(yǎng)組合物，該組合物含有具有抵抗對非保護(hù)細(xì)菌是致死的條件的保護(hù)作用的細(xì)菌，其中，這種受保護(hù)的細(xì)菌通過使細(xì)菌經(jīng)受亞致死水平的脅迫處理而獲得。
5.一種保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞抵抗脅迫的方法，該方法包括用選自熱休克、滲透休克、pH休克、氧化脅迫、化學(xué)脅迫營養(yǎng)脅迫、紫外脅迫和冷脅迫的亞致死水平的脅迫處理細(xì)菌細(xì)胞的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，該方法包括用大約0.01％～0.1％的鹽處理大約30分鐘的步驟。
全文摘要
具有抵抗對非保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞是致死的條件的保護(hù)作用的細(xì)菌細(xì)胞,其中受保護(hù)的細(xì)胞通過使細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)受亞致死水平的脅迫處理獲得。
文檔編號A61K35/66GK1378591SQ00808820
公開日2002年11月6日 申請日期2000年6月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月11日
發(fā)明者G·施米德特, R·青克 申請人:雀巢制品公司