同時檢測和鑒別眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)菌、真菌、寄生蟲和病毒感染的新方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于在能夠引起感染的許多可能病原體中鑒別眼睛和中樞系統(tǒng)感染的單種病原體或一種以上病原體的診斷方法。所有感染眼睛或中樞系統(tǒng)的個別區(qū)域的病原體一般引起相同的表現(xiàn)或癥狀，本發(fā)明涉及以單一的檢驗在這組可能的病原體中檢測或鑒別到該病原體，而不需要借助于各針對每一種病原體的檢測的成套檢驗。本發(fā)明致力于用基于癥狀的診斷替代基于個別病原體檢測的診斷。
【專利說明】同時檢測和鑒別眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)菌、真菌、寄生蟲 和病毒感染的新方法
[0001] 本申請是申請日為2008年05月27日和發(fā)明名稱為"同時檢測和鑒別眼睛和中樞 神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)菌、真菌、寄生蟲和病毒感染的新方法"的200880000035. 8號發(fā)明專利申請的 分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及用于在能夠引起感染的許多可能病原體中鑒別眼睛和中樞系統(tǒng)感染 的致病的單種病原體或一種以上病原體的診斷方法。所有影響眼睛或中樞系統(tǒng)的個別區(qū)域 的病原體一般引起相同的表現(xiàn)或癥狀。本發(fā)明涉及以單一的檢驗在這組可能的病原體中檢 測和鑒別該病原體，而不需要借助于一種病原體一種檢測的成套檢驗。本發(fā)明致力于基于 癥狀的診斷替代基于個別病原體檢測的診斷。

【背景技術(shù)】
[0003] 眼睛的感染在臨床上可以按照載有感染物及隨后被感染影響的解剖學(xué)分區(qū)分類。 有許多的生物體能夠引起眼睛感染，它們在"Principles and Practice of Infectious Diseases, 6thEdition, Gerald Mandell et al (Eds)Elsevier Churchill Livingston, pp 1387-1418(2005)"中有詳細(xì)描述，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0004] 眼感染可以基于臨床初期診斷分為以下幾類：
[0005] 1.外眼感染，如角膜炎和結(jié)膜炎
[0006] 2.感染性眼內(nèi)炎
[0007] 3.葡萄膜炎
[0008] 4.視網(wǎng)膜炎
[0009] 許多外眼感染由幾種細(xì)菌和真菌引起。事實上，由于暴露在環(huán)境中，結(jié)膜和角膜載 有許多作為寄生者的非病原性細(xì)菌和真菌，這一事實不利于從結(jié)膜和角膜刮屑或拭子提取 的特定病原體（細(xì)菌和真菌）的檢測。在存在化膿或有膿液的潰瘍的情況下，醫(yī)生作出細(xì) 菌感染的臨時診斷（provisional dignosis)并用局部使用的廣譜抗生素治療病人。但是， 難于診斷卻特別可治愈的重要感染有：
[0010] ?單純性皰疹（引起角膜炎）
[0011] ?腺病毒性結(jié)膜-角膜炎（有時造成流行性擴散）
[0012] ?沙眼衣原體（引起導(dǎo)致沙眼的濾泡性結(jié)膜炎和成人包涵體性結(jié)膜炎）
[0013] ?水痘結(jié)膜炎（也稱為帶狀皰疹結(jié)膜炎）
[0014] ?快速生長的分枝桿菌，如龜分支桿菌（M. chelonae)和偶發(fā)分枝桿菌 (M. fortuitum)(引起用于減輕屈光異常的LASIK手術(shù)后的感染）
[0015] 感染性眼內(nèi)炎可能通常由以下病原體引起：
[0016] ?革蘭氏陽性細(xì)菌
[0017] ?革蘭氏陰性細(xì)菌
[0018] ?厭氣生物體，即痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes)
[0019] 籲真菌。
[0020] 非常常見的是感染在手術(shù)后發(fā)生且蔓延非?？?，導(dǎo)致失明。治療需要的最重要的 信息是，病原體是細(xì)菌還是真菌，而如果是細(xì)菌，它是需氧的還是厭氧的。由血源性傳播引 起的內(nèi)源性感染是很少見的。
[0021] 葡萄膜炎通常由以下病原體引起：
[0022] ?結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)
[0023] ?龜分支桿菌（M. chelonae)
[0024] ?偶發(fā)分枝桿菌（Μ· fortuitum)
[0025] ?鼠弓形體（Toxoplasma gondii)。
[0026] 視網(wǎng)膜炎一般在免疫抑制個體中見到，且由以下病原體引起：
[0027] ?巨細(xì)胞病毒
[0028] ?單純皰疹病毒
[0029] ?水痘帶狀皰疹病毒
[0030] 嚴(yán)重的視力損失在所有這些病人中發(fā)生，因而早期和及時的對這些生物體的診斷 對于防止整個眼球的失明很是重要的。這些感染的實際發(fā)生率在發(fā)展中國家可能相對較 高。許多診斷技術(shù)是如在現(xiàn)有技術(shù)部分詳細(xì)說明的用于眼睛感染的診斷。
[0031] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染可以分為以下幾類：
[0032] 急性化膿性腦膜炎：一般在兒童中發(fā)現(xiàn)，且由以下所列的生物體引起：
[0033] ?流感嗜血桿菌（Haemophilus influenza)
[0034] ?腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitides)和
[0035] ?肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)
[0036] 腦脊液（CSF)的細(xì)菌培養(yǎng)或涂片鏡檢缺乏靈敏度。額外的復(fù)雜因素是，先前用 抗生素對病人進(jìn)行治療可能導(dǎo)致CSF的革蘭氏染色和培養(yǎng)兩項的假陰性結(jié)果。由于這些 原因，醫(yī)生們不太愿意信任培養(yǎng)結(jié)果而傾向于完成一個靜脈注射抗生素的10-14天完整療 程，這在大多數(shù)情況下是不必要的。一旦部分地進(jìn)行了治療，這些情況就不能與由下面的病 原體引起的慢性腦膜炎區(qū)分開了：
[0037] ?結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)
[0038] 籲各種真菌
[0039] ?由一系列可通過治療控制的病毒-如HSV、CMV和VZV-引起的病毒性腦炎。
[0040] 腦炎通常由各種各樣的病毒（地方性的和流行性的都有）引起。但是，單純皰疹、 巨細(xì)胞病毒和水痘帶狀皰疫是具有特定的抗病毒療法的病毒。其它的可治療腦炎病原體是 鼠弓形體（Toxoplasma gondii)。
[0041] 現(xiàn)有技術(shù)
[0042] 檢測臨床樣本中的病原體（細(xì)菌、酵母和其它真菌、寄生蟲和病毒）的經(jīng)典方法 包括培養(yǎng)該樣本以擴大所存在病原體的數(shù)目，直到可觀察的菌落生長，然后該菌落生長可 以通過標(biāo)準(zhǔn)的實驗室檢驗鑒定和計數(shù)。在需要的時候，所述培養(yǎng)也可以進(jìn)行附加的檢驗以 確定病原體對藥物治療的敏感性。為了準(zhǔn)確地鑒定感染種類，醫(yī)生必須依賴于可能需要從 3天（如在大多數(shù)細(xì)菌的情況下，包括快速生長的分枝桿菌）到8周（如在結(jié)核桿菌的情 況下）之間的任何長度的時間的培養(yǎng)結(jié)果。為了準(zhǔn)確地鑒別細(xì)菌的種類，該培養(yǎng)隨后進(jìn)行 可能需要另外數(shù)天甚至數(shù)周時間的大范圍生物化學(xué)檢驗。大多數(shù)情況下，由于疾病的嚴(yán)重 程度和即時的藥物干預(yù)的必要性，使這一確定過程快速完成是重要的。這里所指的培養(yǎng)技 術(shù)在細(xì)菌感染和真菌感染的診斷中多半是有用的，而它們一般不用于病毒感染情況下的診 斷，特別是因為通過培養(yǎng)從臨床樣本中分離病毒的頻率小于15%。
[0043] 用于診斷感染（如眼睛感染和神經(jīng)系統(tǒng)感染）的適當(dāng)?shù)臉颖臼菣z測某癥狀（如 角膜結(jié)膜炎、眼內(nèi)炎、葡萄膜炎、腦膜炎和腦炎）的發(fā)病原因進(jìn)行成功診斷的另一個關(guān)鍵問 題。在這些情況下，感染是高度局部化的，而因此局限于眼睛或CNS。體液，如血液、血漿或 血清，不包含感染物。外眼感染需要如角膜刮屑或結(jié)膜拭子的樣本，而感染性眼內(nèi)炎需要或 者在眼科診所進(jìn)行玻璃體吸出或者更好是玻璃體切除的樣本，在這樣情況下，在手術(shù)室中 取出20ml漢克平衡鹽溶液的玻璃體洗液。簡單的玻璃體吸出物經(jīng)常不足以通過涂片檢查 和培養(yǎng)診斷真菌和細(xì)菌性眼內(nèi)炎。在葡萄膜炎和視網(wǎng)膜炎兩種情況下，較好的樣本是收集 在27號針中的0. 2-0. 3mL玻璃體液。用于診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的最好的生物液體是腦 脊液。在本發(fā)明的一種實施方式中，在眼內(nèi)炎的情況下房水或玻璃體液足以檢測和鑒別感 染物。這消除了在手術(shù)室中進(jìn)行手術(shù)步驟（如玻璃體切除）的必要性。
[0044] 基于DNA的鑒別病原體的方法提供了對費時和需要具有專門訓(xùn)練和技術(shù)的人員 的經(jīng)典方法的簡單、穩(wěn)定和可靠的替代方案。在進(jìn)行經(jīng)典方法時，有可能會產(chǎn)生錯誤，這 些錯誤有時導(dǎo)致對病原體的不明確的鑒定，而因此導(dǎo)致錯誤的診斷/治療。另一方面，基 于DNA的病原體鑒別具有在早得多的階段鑒定病原體的優(yōu)勢，有時比觀察到臨床癥狀還早 (亞臨床階段）。一旦條件被標(biāo)準(zhǔn)化，病原體的鑒別是十分簡單可靠的，且能夠由半熟練人 員完成。基于DNA的方法也可以用于評價醫(yī)療干預(yù)的結(jié)果（預(yù)后價值）。采用基于DNA的 方法（如PCR)篩查人的病原體的臨床樣本提供了靈敏和確定的診斷和有效治療的開始，甚 至對于每個樣本包含非常少（大約20-50)病原生物體的小量的臨床樣本（房水、玻璃體 液、淚水、唾液、血液、腦脊液、粘膜或上皮刮屑，如角膜刮屑、結(jié)膜拭子、組織樣本等）也是 如此。
[0045] 采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)技術(shù)的潛在利益是在相對短的時期內(nèi)鑒定特定的細(xì)菌 或病毒病原體?？尚械幕赑CR的檢測具有在病人仍在急救室中時就幫助醫(yī)生決定如何開 始治療的能力。由于基于PCR的檢測方法不依賴于活的生物體的存在，而是依賴于遺傳物 質(zhì)，基于PCR的技術(shù)可應(yīng)用于所有患者的情況，甚至在提取收集臨床樣本前使用了抗生素 的時候也是如此。但是，基于PCR的方法還有一些困難，如由于污染的核酸產(chǎn)生的假陽性結(jié) 果和由于復(fù)雜試樣導(dǎo)致的PCR反應(yīng)的抑制。下面的PCR檢測已被用于引起眼睛和CNS感染 的生物體。
[0046] 單鈍皰疹1&2 :HSV的基于PCR的DNA檢測已顯示具有比病毒培養(yǎng)高4-5倍的靈 敏度，并且對轉(zhuǎn)運狀態(tài)（transport condition)不敏感，如 Wald A·，et al. "Polymerase chain reaction for detection of Herpes simplex virus (HSV) on mucosal surface ： Comparison with HSV isolation in cell culture，'· J. Inf. Dis. 188 :1345-1351 (2003) 中所述。PCR已用于檢測眼睛樣本（如房水、角膜刮屑、晶狀體吸出物、晶狀體袋囊材料和玻 璃體液）和其它臨床樣本（如CSF、生殖道拭子和子宮頸拭子）中的HSV(Madhavan HN et al. "Detection of herpes simplex virus (HSV) using polymerase chain reaction (PCR) in clinical samples ：Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV".J. Clin. Virol. 14 :145-151 (1999))。這里，PCR 能夠在一個臨 床樣本中檢測1-3個HSV顆粒。PCR也有效地用于鑒別皰疹病毒血清型，如發(fā)明人之一在 公開的文章中所提到的，通過結(jié)合PCR和擴增子的限制性長度多態(tài)性（Madhavan HN et al."Phenotypic and Genotypic methods for the detection of herpes simplex virus serotypes" · J. Virol. Methods，108 :97-102(2003))，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0047] 水痘帶狀皰瘡病毒：PCR R用于檢測水痘感染（Burke DG, et al. iiPolymerase chain reaction detection and clinical significance of varicella zoster in cerebrospinal fluid in human immunodeficiency virus infected patients" · J. Inf. Dis，176 :1080 (1996))。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中HSV和VZV兩者的檢測也通過使用PCR實現(xiàn) (Sauerbrei A and Wutzler P. "Laboratory diagnosis of central nervous system infection caused by herpes viruses" .J. Clin. Virol，25s45_s51，（2002))，作者從中得 出結(jié)論，PCR是檢測VZV的黃金標(biāo)準(zhǔn)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0048] 巨細(xì)胞病毒A :可商購的稱作COBAS Amplicor CMV Monitor of Roche Molecular diagnostics (Pleasanton，CA，USA)的PCR檢驗試劑盒利用CMV的DNA聚合酶基因的365 堿基對區(qū)域進(jìn)行擴增檢測。許多檢測方法利用早期速發(fā)抗原和DNA聚合酶的基因以檢測 CMV 在各種體液中的存在（Stanier P，et al. "Detection of human cytomegalovirus in peripheral mononuclear cells and urine samples using PCR"· Mol.Cell Probes， 6 :51-58(1992)and Gerna G， et al. "Monitoring human cytomegalovirus infection and gancyclovir treatment in heart transplant recipients by determination of viraemia，antigenemia and DNAemia".J. Inf. Dis.，164,488-498 (1991)，其公開內(nèi)容通過 引用并入本文）。患者的CMV感染也通過各種不同樣本（如血液、羊水、鼻吸出物、支氣管肺 泡灌洗液、尿、胎盤材料和支氣管吸出物）的巢式PCROiested PCR)檢測。
[0049] 由所有三種皰疹病毒（HSV、VZV和CMV)引起的眼睛感染通過如發(fā)明人之一在 公開的文章 （Priya K et al. "Association of herpes viruses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditis:a polymerase chain reaction based study".0cular Immunology and Inflammation 9:1-9(2003)，其公開內(nèi)容通過引用并入 本文）中所描述的PCR方法檢測。在該研究中，為了獲得必要的靈敏度，進(jìn)行巢式PCR以檢 測VZV。但是，由于第一輪擴增的產(chǎn)物必須被轉(zhuǎn)移到包含第二組引物（用于擴增第一輪PCR 擴增基因中更小區(qū)域）的第二PCR管中，巢式PCR具有在實驗室中引入擴增子污染的伴生 問題。
[0050] 通過PCR檢測結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)是兩個FDA批準(zhǔn)的檢驗 的方案（參見 The Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct test Gen-ProbeiSan DeigoiUSA and Amplicor M. tuberculosis test of Roche Diagnostic Systems，Basel， Switzerland)。現(xiàn)有技術(shù)中已知有許多其它的檢驗方法。但是，有人用PCR檢測了眼結(jié)核 (Madhavan HN et al. "Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in epiretinal membrane in Eales，" ·Disease. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 :822-825(2000)) 〇
[0051] 通過核酸擴增檢測沙眼衣原體已經(jīng)在臨床檢驗中采用，并且該方法在Black CM， "Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infection，'· Clin.Microbiol.Rev. 10:160-184(1997)中有詳細(xì)描述。衣原體性結(jié)膜炎采用PCR對 結(jié)膜拭子進(jìn)行檢測，且少至30個生物體在臨床樣本中被檢測出來，如Malathi. Jet al. "A hospital based study on prevalence of conjunctivitis due to Chlamydia trachomatis". Ind.J. Med. Res.，117 :71-75(2003)中所詳細(xì)描述的。
[0052] 腺病毒結(jié)膜炎如前所述通過結(jié)膜拭子的巢式PCR進(jìn)行診斷（Dalapathy S et al. "Development and use of nested polymerase chain reaction (PCR) for the detection of Adenoviruses from conjunctivitis specimen" · J. Clin. Virol. 11 : 77-84(1998))。
[0053] 鼠弓形體在具有免疫缺陷的病人中引起嚴(yán)重的腦炎和葡萄膜炎。許多PCR檢驗 方案已被用于研究各種體液和組織，且所有PCR檢驗依賴于B 1基因的擴增（Danise A， et al. "Use of polymerase chain reaction assays of aqueous humor in diagnosis of in the differential diagnosis of retinitis in patients infected with human immunodeficiency virus"· Clin.Infect. Dis 24 :1100-1106(1997)，Montoyo. et al. "Use of polymerase chain reaction in diagnosis of ocular toxoplasmosis. Ophthalmology"，106 :1554-1563(1999))。
[0054] 如 Anand AR et al. "Use of polymerase chain reaction (PCR) and DNA probe hybridization to determine the gram reaction of the interacting bacterium in the intraocular fluids of patients with endophthalmitis"·J.Infection， 41 :221-226(2000)中詳細(xì)公開的，由眼睛的術(shù)后感染導(dǎo)致的感染性眼內(nèi)炎采用真細(xì)菌 基因的PCR反應(yīng)和通過區(qū)分革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的探針進(jìn)行了研究。該研究能夠 檢測臨床樣本中的低至6個的細(xì)菌。由厭氧生物（如痤瘡丙酸桿菌）引起的眼睛感染 如 Therese KL et al. "Polymerase chain reaction in the diagnosis of bacterial endophthalmitis"，Brit. J. Opthal. 82 :1078-1082(1998)中詳細(xì)描述的采用 PCR 快速檢 測°如Anand AR et al. "Polymerase chain reaction in the diagnosis of Asperigillus endophthalmitis". Ind.J.Med. Res. 114 :133_140(2001)and Anand AR et al. "Use of polymerase chain reaction in fungal endophthalmitis"·Ophthalmology 108 ： 326-330(2001)中詳細(xì)描述的，真菌性眼內(nèi)炎也可以采用PCR快速診斷。在這兩項研究中， 約0. 4pgs的真菌DNA能被檢測到。
[0055] 這里描述的各種PCR檢驗采用了不同的反應(yīng)熱循環(huán)，因為在各個PCR中引物組和 被檢測的基因是不同的。另外，上述各PCR的試劑濃度經(jīng)過了調(diào)整，為了達(dá)到對于這里描述 的該組反應(yīng)物的最高靈敏度而優(yōu)化PCR。最佳的反應(yīng)條件根據(jù)待擴增核苷酸鏈的序列、其大 小和待檢測的生物體或病原體的整個靶DNA的復(fù)雜性而變化。
[0056] 但是，還需要一種能夠在引起眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)菌性、真菌性、寄生性和病 毒性感染的病原體之間同時進(jìn)行檢測和鑒別的基于PCR的檢驗方法，它除了快速之外，不 易于污染，且具有超過其它方法的增強的靈敏度和特異性。該方法易于在臨床環(huán)境中使用， 其中在24-48小時內(nèi)進(jìn)行感染物的鑒定對于挽救生命是重要的。準(zhǔn)確診斷眼睛和腦感染的 關(guān)鍵問題可以歸納為：
[0057] ?眼睛和腦的感染是高度局部化的。在容易獲得的生物液體-如血液、血清、血 漿、唾液或者外部傷口或潰瘍的膿液或膿性排出物-中沒有病原體的痕跡。
[0058] ?任何急性感染的公認(rèn)的生物標(biāo)志，如C反應(yīng)蛋白，對于所有影響人體的感染是 普遍的和共有的。因此是非特異的。
[0059] ?為鑒定特定的病原體，需要來自眼睛或CSF的樣本。所獲得的樣本對于角膜感 染是角膜刮屑，對于結(jié)膜炎是結(jié)膜拭子，對于眼內(nèi)炎是房水，對于葡萄膜炎和視網(wǎng)膜炎是玻 璃體液。在腦感染的情況下，優(yōu)選的樣本始終是CSF。所有這些樣本中，都存在著通過單次 取樣從病人獲得的樣本的量的限制。一般，你在角膜刮屑或拭子中取得數(shù)千個細(xì)胞及可能 兩到三毫克的樣本。任何時候可能從病人的眼睛取得的房水大約為100 μ L，而玻璃體切除 樣本最多可達(dá)200 μ L。可以取得最多5ml的CSF樣本，但PCR需要的CSF樣本的體積小于 0· 5ml 〇
[0060] ?樣本體積的限制導(dǎo)致存在于樣本中的細(xì)菌/病毒/寄生蟲的數(shù)目受到限制。另 夕卜，感染物的量同樣低于在許多其它體室（body compartment)如血液中觀察到的量。
[0061] ?存在于樣本中的感染粒子的總數(shù)與檢測的成功直接相關(guān)。低于臨界質(zhì)量，感染 物細(xì)菌和真菌不能在培養(yǎng)基中生長，因此難于診斷。存在于眼樣本中的病毒顆粒的數(shù)目通 常低于熒光抗體檢測實驗及病毒培養(yǎng)的檢測限，因此使檢測靈敏度低于25%?，F(xiàn)有沒有用 于寄生蟲如鼠弓形體（Toxoplasma gondii)的方便的檢測系統(tǒng)，且寄生蟲的數(shù)目對于檢測 來說也太少。如對于批￥、01^、￥2￥、腺病毒、衣原體和弓形體的1811或186檢測是非常非特 異性的，因而沒有診斷意義。
[0062] ?診斷中的另一個主要困難是所有上面描述的眼睛疾患都是急性的，且需要即時 和準(zhǔn)確的診斷以指導(dǎo)適當(dāng)?shù)闹委?。由病毒感染引起的感染性眼?nèi)炎和壞死性視網(wǎng)膜炎需要 在首個癥狀出現(xiàn)的96小時內(nèi)進(jìn)行治療，在這種情況下延遲超過48小時將導(dǎo)致失明。
[0063] 多重PCR也已被用于既定情形下的某些病原體，且通過用質(zhì)譜確定分子量來 鑒定擴增產(chǎn)物。詳細(xì)描述見 Detection and identification of pathogens by mass spectrometric determination of the base composition of PCR products. (Ecker, David J. ：Griffey Richard 11. ：Sampath,Rangarajan ；Hofstandler, Steven A. ：Meneil, John ;Crooke，Sstanley T. (USA) ·美國專利申請公開 U. S. Pat. Appl. Publ. (2004)，168 頁，美國申請?zhí)?23,233的部分繼續(xù)申請。專利申請：US 2003-66012220030911.優(yōu)先 權(quán)：US 2001-798007 20010302 ;US 2002-43131920021206 ;US 2002-323233 20021218 ; US 2002-326051 20021218 ;US 2002-325526 20021218 ;US 2002-325527 20021218 ;US 2003-44344320030129 ;US 2003-443788 20030130 ;US 2003-44752920030214)。
[0064] 多重PCR之后進(jìn)行鑒定產(chǎn)物的凝膠電泳被試圖用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染，如 Read, SJ. and Kurtz, JB. "Laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system by using a single multiplex PCR screening assay". J. Clin. Microbiol. 37 :1352-1355(1999)中所述。
[0065] 多重PCR之后進(jìn)行用于檢測病原體的微陣列據(jù)報道用于引起呼吸道疾病的病原 體的檢測（Wang D et al. "Microarray based detection and genotyping of viral pathogens" · Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99 :15687-15692 (2002))。擴增子的檢測也試圖 采用比色微滴定板分析系統(tǒng)，其中擴增子用洋地黃毒苷11-dUTP標(biāo)記，且生物素化的探 針被用于捕獲滴定板上的擴增子。該產(chǎn)物采用酶標(biāo)記的抗地高辛展現(xiàn)（Smalling TW et al. "Molecular approaches to detecting herpes simplex virus and enteroviruses in the central nervous system，'.J. Clin. Microbiol. 40 :2317-2322 (2002))。
[0066] 如Madhavan HN et al. ,"Development and application of a novel multiplex polymerase chain reaction for semiquantitation of human cytomegalovirus in clinical specimen"，J Virol Methods. 141 :166-72 (2007)中所詳細(xì)描述的，對于同一生 物體的三個不同基因，即巨細(xì)胞病毒的形態(tài)轉(zhuǎn)化區(qū)II、UL83和糖蛋白0基因，成功地嘗試了 多重PCR分析，以定量臨床樣本中的病毒。
[0067] 在擴增所有19個高危險基因型的Ll區(qū)后，線性探針分析也被用于檢測和鑒別 乳頭瘤病毒的基因型（Bauer HM et al. "Detection of human papilloma viruses by polymerase chain reaction"US Patent No5639871)〇
[0068] 如質(zhì)譜這樣的方法即使在先進(jìn)的三級醫(yī)護(hù)中心也不是切實可行的，而基于昂貴的 掃描儀的微陣列檢測在臨床環(huán)境下是不可能提供的。線性探針分析易發(fā)生擴增子污染。
[0069] I.定義
[0070] "核苷酸"意指DNA或RNA的結(jié)構(gòu)單元，由一個堿基、一個磷酸分子和一個糖分子 (DNA中為脫氧核糖，RNA中為核糖）組成。
[0071] "寡核苷酸"意指核苷酸的短鏈。寡核苷酸經(jīng)常用作發(fā)現(xiàn)DNA或RNA的匹配序列的 探針，且可用各種標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，如放射性同位素及熒光和化學(xué)發(fā)光基團(tuán)。
[0072] "引物"意指與DNA的特定靶序列互補的寡核苷酸短鏈，其用于起動DNA合成。
[0073] "單重（uniplex) "意指在擴增單個病原體特異的DNA序列的各反應(yīng)中利用單組引 物的基于PCR的分析。
[0074] "多重"意指在單反應(yīng)中利用多個引物組的基于PCR的分析，其中每個引物可以擴 增單個病原體特異的DNA序列。
[0075] 術(shù)語"探針"指的是由靶DNA的PCR擴增產(chǎn)生的DNA產(chǎn)物（擴增子）。
[0076] 術(shù)語"靶"指的是對于某個病原體特異性的DNA序列，其固定在惰性基質(zhì)如尼龍 上。
[0077] "雜交"指的是將兩條互補的DNA鏈結(jié)合以形成雙鏈分子的過程，在這里更具體地 指"探針"和"靶" DNA序列之間的過程。
[0078] 這里所用的術(shù)語"檢測系統(tǒng)"指的是使PCR擴增的DNA產(chǎn)物可視化的方法。合適 的檢測系統(tǒng)的例子包括依賴于色彩、放射性、熒光或化學(xué)發(fā)光的系統(tǒng)。
[0079] "泛真菌的"意指在所有病原性真菌-如隱球菌、假絲酵母、毛霉菌、曲霉菌和根霉 菌等-中發(fā)現(xiàn)的共有基因序列，且被用于鑒別任何/所有的真菌種類。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0080] 本發(fā)明提供一系列化學(xué)標(biāo)記的病原體特異性的正向和反向引物，其被獨一地設(shè)計 為在95°C的變性溫度、58-65°C的退火溫度和在72°C延伸的多重聚合酶鏈反應(yīng)中特異地擴 增來自病原體的靶序列。本發(fā)明還提供一系列源自病原體特異性基因的靶DNA序列，其被 固定在惰性載體上并特異地與使用病原體特異性正向和反向PCR引物獲得的PCR擴增產(chǎn)物 雜父。
[0081] 本發(fā)明提供同時檢測引起眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原體的快速分析方法，對 于這些病原體，免疫學(xué)的參數(shù)并不顯示出活動的感染而僅表現(xiàn)為暴露于病原體，且對于這 些病原體，經(jīng)典的微生物學(xué)分析如細(xì)菌和真菌培養(yǎng)，既不足夠靈敏以檢測到病原體，也不足 夠快速以在48小時內(nèi)鑒定出病原體。
[0082] 本發(fā)明結(jié)合了 PCR分析的高靈敏性和通過雜交到宏陣列上用色彩檢測方法檢測 雜交的鑒別方法的高特異性，其最終結(jié)果可以通過肉眼監(jiān)測。但是，如Quantum Dots、Cy3、 Cy5和FITC的熒光標(biāo)記也可使用，且產(chǎn)物可以通過熒光顯微鏡觀察到。
[0083] 本發(fā)明的特征是同時檢測和鑒別引起眼睛和CNS感染的病原體的多重分析，包 括：
[0084] i)對來自懷疑患有眼睛或CNS感染的病人的臨床樣本（如角膜刮屑或結(jié)膜拭子或 房水或玻璃體液或收集的玻璃體切除洗液或腦脊液吸出物或從腦膿腫材料收集的膿液或 視網(wǎng)膜前膜）進(jìn)行處理以通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離DNA。
[0085] ii)使用已知引起CNS和眼睛感染的各病原體的標(biāo)記的擴增引物通過單管PCR技 術(shù)擴增各病原體特異性的基因的特定DNA區(qū)域。
[0086] iii)利用DNA雜交檢測和鑒別病原體，其中各病原體特異性的固定化的靶序列與 由PCR反應(yīng)產(chǎn)生的擴增的DNA探針反應(yīng)，并且通過利用特定的試劑組的顯色監(jiān)測雜交。
[0087] 特別地，本發(fā)明涉及以下各項：
[0088] 1.用于檢測和鑒別引起病癥的病原體的引物組：
[0089] 組 1 為 FP :5' cgcttggtttcggatgggag 3' （SEQ ID No. 1)
[0090] RP :5' gcccccagagacttgttgtagg 3' （SEQ ID No. 2)
[0091] 組 2 為 FP :5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3' （SEQ ID No. 3)
[0092] RP :5' cgggggggtcttgcgttac 3' （SEQ ID No. 4)
[0093] 組 3 為 FP :5' caagctgacggacatttacaagg 3' （SEQ ID No. 5)
[0094] RP :5' gtcccacacgcgaaacacg 3' (SEQ ID No. 6)
[0095] 組 4 為 FP :5' ttccggctcatggcgttaacc 3' （SEQ ID No. 7)
[0096] RP :5' cgccctgcttttacgttacgc 3' （SEQ ID No. 8)
[0097] 組 5 為 FP :5' cggcgacgacgacgataaag 3' （SEQ ID No. 9)
[0098] RP :5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3' （SEQ ID No. 10)
[0099] 組 6 為 FP :5' gggcacgtcctcgcagaag 3' （SEQ ID No. 11)
[0100] RP :5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3' （SEQ ID No. 12)
[0101] 組 7 為 FP :5' ggtcttgccggagctggtattac 3' （SEQ ID No. 13)
[0102] RP :5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3' （SEQ ID No. 14)
[0103] 組 8 為 FP :5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3' （SEQ ID No. 15)
[0104] RP :5' acgttccggtagcgagttatctg 3' （SEQ ID No. 16)
[0105] 組 9 為 FP :5' cgccgccaacatgctctacc 3' （SEQ ID No. 17)
[0106] RP :5' gttgcgggaggggatggata 3' （SEQ ID No. 18)
[0107] 組 10 為 FP :5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3' （SEQ ID No. I9)
[0108] RP :5' cggactacgatcggttttgtgaga 3' （SEQ ID No. 20)
[0109] 組 11 為 FP :5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3' （SEQ ID No. 21)
[0110] RP :5' ggcagattcctaggcattactcacc 3' （SEQ ID No. 22)
[0111] 組 12 為 FP :5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3' （SEQ ID No. 23)
[0112] RP :5r tgcagccctttgtaccgtccat 3' （SEQ ID No. 24)
[0113] 組 13 為 FP :5' gcggaacgtgggaccaatac 3' （SEQ ID No. 25)
[0114] RP :5' cgacggggtgattttcttcttc 3' （SEQ ID No. 26)
[0115] 組 14 為 FP :5' aacttttttgactgccagacacactattg 3' （SEQ ID No. 27)
[0116] RP :5，ggatgccaccccccaaaag 3' （SEQ ID No. 28)
[0117] 組 15 為 FP :5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3' （SEQ ID No. 29)
[0118] RP :5' gacgttttgccgactacctatcc 3' （SEQ ID No. 30)
[0119] 組 16 為 FP :5' cccctctgctggcgaaaagtg 3' （SEQ ID No. 31)
[0120] RP :5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3' （SEQ ID No. 32)
[0121] 組 17 為 FP :5，aatcgtatctcgggttaatgttgc 3' （SEQ ID No. 33)
[0122] RP :5，tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3' （SEQ ID No. 34)
[0123] 組 18 為 FP :5' gctgggactgaggactgcgac 3' （SEQ ID No. 35)
[0124] RP :5' ttcaagacgggcggcatataac 3' （SEQ ID No. 36)
[0125] 組 19 為 FP :5' tggcgaacgggtgagtaaca 3' （SEQ ID No. 37)
[0126] RP :5r ccggtattagccccagtttcc 3' （SEQ ID No. 38)
[0127] 組 2〇 為 FP :5' cggcggcaagttcgacgac 3' （SEQ ID No. 39)
[0128] RP :5' ccaccgagacgcccacacc 3' （SEQ ID No. 40)
[0129] 組 21 為 FP :5' ccaggtcggcggagaagc 3' （SEQ ID No. 41)
[0130] RP :5' ccaccggcccgatgacc 3' （SEQ ID No. 42)
[0131] 組 22 為 FP :5' gccgccctgaccaccttc 3' （SEQ ID No. 43)
[0132] RP :5' gcgggttgttcggcatcag 3' （SEQ ID No. 44)
[0133] 其中所述引物單獨或組合使用。
[0134] 2.如第1項所述的引物組，可用于通過對臨床樣本進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)擴增病 原體的目標(biāo)基因來檢測和鑒別引起感染性眼內(nèi)炎或角膜炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜 炎的病癥的病原體。
[0135] 3.如第1項所述的引物組，其特征在于具有58°C-65°C范圍內(nèi)的均勻的退火溫度， 長度在17-29個堿基的范圍內(nèi)。
[0136] 4. 一組如下所列的病原體特異性DNA探針序列，其通過單重或多重PCR反應(yīng)利用 第1項中所述的引物從標(biāo)準(zhǔn)或臨床樣本擴增：
[0137] 1)探針DNA序列
[0138] ''cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatget cctacaacaagtctctgggggc"（SEQ ID No. 45)
[0139] 2)探針DNA序列
[0140] '' ggcaat cgtgt acgt cgt ccgcacat cacagt cgcggcagcg teat cggcggt aacgcaagac ccccccg"（SEQ ID No. 46)
[0141] 3)探針DNA序列
[0142] '' caagctgacggacat ttacaaggt c cccc tggacgggtacggccgcatgaacggc cggggcg tgtttcgcgtgtgggac"（SEQ ID Νο·47)
[0143] 4)探針DNA序列
[0144] ^ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagc agggcg"（SEQ ID No. 48)
[0145] 5)探針DNA序列
[0146] '' cggcgac gacgac gat aaagaatacaaagc cgcagtgt cgtccagagga ttacgcgaccagat tg"（SEQ ID No. 49)
[0147] 6)探針DNA序列
[0148] "gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatct tgg"（SEQ ID No. 50)
[0149] 7)探針DNA序列
[0150] "ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatctgtctttgtctt tc acggaggca"（SEQ ID No. 51)
[0151] 8)探針DNA序列
[0152] ^tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagata actcgctaccggaacgt"（SEQ ID No. 52)
[0153] 9)探針DNA序列
[0154] "cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctccc gcaac"（SEQ ID No. 53)
[0155] 10)探針DNA序列
[0156] '' tgggctacac acgt get acaatggt cggt acagagggt cgcc aaac cgcgaggt ggagctaat ctcacaaaaccgatcgtagtccg，'（SEQ ID No. 54)
[0157] 11)探針DNA序列
[0158] '' ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacggg tgagtaatgcctaggaatctgcc，'（SEQ ID No. 55)
[0159] 12)探針DNA序列
[0160] "acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggct gca"（SEQ ID No. 56)
[0161] 13)探針DNA序列
[0162] '' gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggct get tcgggcagcaact ccc ccgggttg aagaagaaaatcaccccgtcg，'（SEQ ID No. 57)
[0163] 14)探針DNA序列
[0164] "aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtgccccttttggggggt ggcatcc"（SEQ ID No. 58)
[0165] 15)探針DNA序列
[0166] ^tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaac gtc"（SEQ ID No. 59)
[0167] 16)探針DNA序列
[0168] "cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtc gee"（SEQ ID No. 60)
[0169] 17)探針DNA序列
[0170] "aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagatccgtttctcatacg g ttttcctcga"（SEQ ID No. 61)
[0171] 18)探針DNA序列
[0172] ^gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtctt gaa"（SEQ ID No. 62)
[0173] 19)探針DNA序列
[0174] ^tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcaggaaactgg ggctaataccgg"（SEQ ID No. 63)
[0175] 20)探針DNA序列
[0176] '' cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctc ggtgg"（SEQ ID No. 64)
[0177] 21)探針DNA序列
[0178] '' cc aggt cggcggagaagc cgaggc aggcgaggt cc ttcagtt cgt cgcgggt c at cgggccg gtgg"（SEQ ID No. 65)
[0179] 22)探針DNA序列
[0180] ''gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc"（SE Q ID No. 66) 〇
[0181] 5. -組如下所列的DNA靶序列，具有58. 9°C_83°C范圍內(nèi)的均勻的解鏈溫度，雜交 過程中在固定在固相基質(zhì)上后與使用的擴增序列互補以進(jìn)一步檢測和鑒別所研究的特定 病原體，該序列為：
[0182] 1) 5，gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3'（SEQ ID No. 67)
[0183] 2) 5，cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3，（SEQ ID No. 68)
[0184] 3) 5，tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3，（SEQ ID No. 69)
[0185] 4) 5，aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3，（SEQ ID No. 70)
[0186] 5) 5，aatacaaagccgcagtgtcgtc 3，（SEQ ID No. 71)
[0187] 6) 5，gactccaggtacaccttgacgtactg 3，（SEQ ID No. 72)
[0188] 7) 5，cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3，（SEQ ID No. 73)
[0189] 8) 5，ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3，（SEQ ID No. 74)
[0190] 9) 5，ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3，（SEQ ID No. 75)
[0191] 10)5，tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3，（SEQ ID No. 76)
[0192] 11)5，ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3，（SEQ ID No. 77)
[0193] 12)5，gacctgggctacacacgtgctaca 3，（SEQ ID No. 78)
[0194] 13)5，ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3，（SEQ ID No. 79)
[0195] 14)5，ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3，（SEQ ID No. 80)
[0196] 15)5，tttataaatcctgtccaccccgt 3，（SEQ ID No. 81)
[0197] 16)5，aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3，（SEQ ID No. 82)
[0198] 17)5，atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3，（SEQ ID No. 83)
[0199] 18)5，gtaagtcaaggatgctggcataatg 3，（SEQ ID No. 84)
[0200] 19)5，gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3，（SEQ ID No. 85)
[0201] 20)5，aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3，（SEQ ID No. 86)
[0202] 21)5，cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3，（SEQ ID No. 87)
[0203] 22)5，atcagcctggccggccgttacctggtg 3，（SEQ ID No. 88)。
[0204] 6.用于檢測和鑒別引起如感染性眼內(nèi)炎或角膜炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜 炎的病癥的病原體的方法，其中通過使用如第1項所述的正向和反向引物組的獨特集合對 臨床樣本進(jìn)行多重PCR(聚合酶鏈反應(yīng)）擴增該病原體的特定基因，且在進(jìn)一步的步驟中， 擴增的產(chǎn)物（探針）通過已知的方法與以多重形式固定在固相基質(zhì)上的互補DNA序列（靶） 雜交，并且雜交產(chǎn)物通過已知方法檢測以進(jìn)一步檢測和鑒別引起所研究病癥的特定病原 體。
[0205] 7.使用第1項中所述的所有或一些引物組的多重PCR分析，其中所有引物可以采 用統(tǒng)一的熱循環(huán)條件在單個管中一起使用，所述熱循環(huán)條件特征在于，具有94°C 5分鐘的 變性步驟，隨后40個循環(huán)的60°C -64°C 45秒、72°C 45秒和94°C 45秒及72°C 10分鐘的延 伸反應(yīng)。
[0206] 8.如第6項中所述的方法，其中所述引物采用生物素基團(tuán)在5'端標(biāo)記，導(dǎo)致通過 形成有色產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
[0207] 9.如第6項中所述的方法，其中所述引物通過熒光標(biāo)記，例如，如異硫氰酸熒光素 的有機突光標(biāo)記或如Quantum Dots?或Cy3或Cy5的無機突光納米顆粒，使得能夠通過任 何熒光掃描設(shè)備或顯微鏡檢方法檢測。
[0208] 10.如第1項中所述的引物集合、如第4項中所述的探針、如第5項中所述的靶的 用途，其中所述分析是用于檢測病原體的實時PCR。
[0209] 11.如第1中所述的引物集合、如第4項中所述的探針、如第5項中所述的靶的用 途，其中所述分析是定量測定臨床樣本中病原體的實時PCR，用于監(jiān)測疾病的預(yù)后或治療。
[0210] 12.采用如第4項中所述的特定探針對如第6項中所述的擴增產(chǎn)物的檢測，其采取 宏陣列或狹縫雜交或線性探針分析的形式。
[0211] 13.如第12項中所述的宏陣列，其由固定在含硝基纖維素、尼龍、帶電尼龍、玻璃 或聚苯乙烯的固體相上的如權(quán)利要求5中所述的靶組成。
[0212] 14.如第12項中所述的檢測方法，其中待檢測的病原體為單純皰疹病毒1和2、巨 細(xì)胞病毒、水痘帶狀皰疹病毒、腺病毒、真細(xì)菌、革蘭氏陽性生物、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、結(jié) 核桿菌、龜分支桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、鼠弓形體、沙眼衣原體。
[0213] 15.如第6項中所述的檢測方法，其使得能夠從引起具有相似表現(xiàn)的眼睛或神經(jīng) 系統(tǒng)疾病的第14項中所述的一組可能病原體中檢測出個別的病原體。
[0214] 16.采用如第1項中所述的一些選定的或所有的引物的多重PCR分析，其中由如第 14項中所述的生物體中的一些或所有引起的任何臨床癥狀被研究，以檢測臨床樣本中存在 的任何一種個別病原體或病原體組。
[0215] 17.用于同時檢測引起外眼感染、眼內(nèi)炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜腦炎的所 有病原體的方法，包括如下步驟：
[0216] a)從患有感染的患者取得臨床樣本，
[0217] b)從步驟a)中取得的臨床樣本的一部分或全部提取DNA，
[0218] c)采用用生物素或熒光示蹤劑標(biāo)記的如第1項中所述的引物集合和標(biāo)準(zhǔn)的PCR試 劑對步驟b)中獲得的模板DNA進(jìn)行多重PCR，
[0219] d)使步驟c)中獲得的PCR產(chǎn)物變性，
[0220] e)使所述PCR產(chǎn)物與固定在固體基質(zhì)上的如第5項中所述的靶雜交，
[0221] f)通過酶法或熒光方法檢測固體基質(zhì)上的在步驟e)中獲得的DNA雜交體。
[0222] 18.用于同時檢測引起外眼感染、眼內(nèi)炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜腦炎的所 有病原體的試劑盒，包括：
[0223] a)如第1項中所述的正向和反向引物的集合，
[0224] b)固定在合適的固體相上的如第5項中所述的DNA序列的基質(zhì)，
[0225] c)通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增DNA所需的標(biāo)準(zhǔn)試劑，
[0226] d)將PCR擴增產(chǎn)物雜交到固定在合適固體相上的DNA序列基質(zhì)所需的標(biāo)準(zhǔn)試劑，
[0227] e)檢測和鑒別最終的雜交產(chǎn)物所需的標(biāo)準(zhǔn)試劑。
[0228] 附圖簡要說明
[0229] 凰I :顯示腺病毒六鄰體基因和沙眼衣原體基因組的單重和多重PCR擴增產(chǎn)物的 6%瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，道：NC-陰性對照；1-陽性對照-腺病毒；2-陽性對照-沙眼 衣原體；3-陽性對照-多重PCR(腺病毒和沙眼衣原體）；MW-100bp DNA梯狀條帶。
[0230] M2 :顯示單純皰疹病毒（HSV)糖蛋白D、DNA聚合酶、UL-44區(qū)域的擴增產(chǎn)物的4% 瓊脂糖凝膠電泳圖。道：NC-陰性對照；1-陽性對照糖蛋白D區(qū)域；2-陽性對照DNA聚合酶 區(qū)域；3-陽性對照UL-44區(qū)域；MW-IOObp梯狀條帶。
[0231] 圖3 :顯示外眼感染的多重PCR擴增產(chǎn)物的6%瓊脂糖凝膠電泳圖。道：NC-陰性 對照；1-陽性對照（HSV) ;2_陽性對照（沙眼衣原體）；3_陽性對照（腺病毒）；4_陽性對 照（所有三種基因組）；MW-.CpX 174 DNA的HinfI消化物。
[0232] Mi:與多重PCR擴增子雜交的尼龍膜上的宏陣列照片，用于特異性識別HSV、沙眼 衣原體、腺病毒的基因組的外眼感染的鑒定。DNA陣列（左至右）：顯示尼龍膜上DNA探針點 樣的模板。HSV-單純皰疹病毒，顯示點樣處標(biāo)記為HGD = HSV糖蛋白D，HDP = HSVDNA聚合 酶，HUL = UL 44基因；IstComp. = H⑶的互補鏈探針，CT-沙眼衣原體，AV-腺病毒。NC-陰 性對照，HSV-用管1的擴增子雜交的膜，CT-用管2的擴增子雜交的膜，AV-用管3的擴增 子雜交的膜。
[0233] :與多重PCR擴增子雜交的尼龍膜上的宏陣列照片，用于特異性識別鼠弓形 體、結(jié)核桿菌、偶發(fā)分枝桿菌和龜分枝桿菌的基因組的葡萄膜炎及其它可疑分枝桿菌感染 的檢測。從左至右，第一是顯示靶如何點在膜上的模板。MBT-結(jié)核桿菌，MBF-偶發(fā)分枝桿 菌，MBC-龜分枝桿菌，TG-鼠弓形體。第二是與標(biāo)記為NC的陰性對照管雜交的NC，與從管 1、2、3和4獲得的擴增子雜交的尼龍膜分別標(biāo)記為MBT、MBF、MBC和TG。
[0234] 胞.與多重PCR的擴增子雜交的尼龍膜上的宏陣列照片，用于特異性識別HSV、 CMV和VZV的基因組的病毒性視網(wǎng)膜炎的鑒定。從左至右，顯示探針如何點在各尼龍膜上的 模板。HSV-單純皰疹病毒，顯示為HGD = HSV糖蛋白D，HDP = HSV DNA聚合酶，HUL = UL 44基因，IstComp. = H⑶的互補鏈探針；CMV-巨細(xì)胞病毒，顯示為CMT =形態(tài)轉(zhuǎn)化基因 II， CGO =巨細(xì)胞病毒糖蛋白0,⑶L = UL 83基因，5thComp. = CMT的互補鏈探針；VZV-水痘帶 狀皰疹病毒，顯示為VO =水痘帶狀皰疹0RF29基因 ，VDP =水痘帶狀皰疹DNA聚合酶；NC : 與標(biāo)記為NC的管的內(nèi)容雜交的膜；HSV-與從1號管獲得的擴增子雜交的尼龍膜；CMV-與從 2號管獲得的擴增子雜交的尼龍膜和VZV-與3號管的內(nèi)容雜交的尼龍膜。
[0235] Ml.與多重PCR的擴增子雜交的尼龍膜上的宏陣列的照片，用于感染性眼內(nèi)炎特 別是真細(xì)菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、痤瘡丙酸桿菌和真菌的基因組鑒定。NC =陰性 對照，GN顯示ERR =真細(xì)菌組I的16s核糖體RNA基因 ，ERW =真細(xì)菌組II的16s核糖體 RNA基因，GN31 =革蘭氏陰性細(xì)菌的gyr B基因，GN67 =革蘭氏陰性細(xì)菌的烏頭酸水合酶 基因，GN87 =革蘭氏陰性細(xì)菌的核糖核酸酶基因 ，GP =革蘭氏陽性細(xì)菌的16s核糖體RNA 基因 ，PA =痤瘡丙酸桿菌16s核糖體RNA基因 ，PF =真菌28s核糖體RNA基因。頂端左角 為探針點樣的模板。NC為與陰性對照管雜交的尼龍膜。GN、GP、PA和PF為分別與管1、2、3 和4的擴增子雜交的尼龍膜。

【具體實施方式】
[0236] 適用于眼睛感染患者臨床樣本病原體DNA多重PCR的獨特PCR引物設(shè)計。
[0237] 下面來自各種已知引起眼睛感染的病原體的基因是基于文獻(xiàn)中的已知信息選擇 的。
[0238] 1.單純皰疹病毒1&2糖蛋白D
[0239] 2.單純皰疹病毒1&2UL 44基因
[0240] 3.單純皰疹病毒1&2DNA聚合酶基因
[0241] 4.巨細(xì)胞病毒糖蛋白0基因
[0242] 5.巨細(xì)胞病毒形態(tài)轉(zhuǎn)化基因
[0243] 6.巨細(xì)胞病毒UL 88基因
[0244] 7.水痘帶狀皰疹ORF 29
[0245] 8.水痘帶狀皰疹DNA聚合酶基因
[0246] 9.腺病毒六鄰體（Hexon)基因
[0247] 10.真細(xì)菌16s核糖體RNA基因 I
[0248] 11.真細(xì)菌16s核糖體RNA基因區(qū)II
[0249] 12. 16s核糖體RNA基因的革蘭氏陽性細(xì)菌特異性部分
[0250] 13.結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)MPB 64 基因
[0251] 14.偶發(fā)分枝桿菌（Mycobacterium fortuitum) 16s_23s RNA 基因
[0252] 15.龜分枝桿菌（Mycobacterium chelonei) 16s_23s RNA 基因
[0253] I6·鼠弓形體（Toxoplasma gondii)B 1 基因
[0254] 17.沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis)多態(tài)蛋白（polymorphic protein) II
[0255] 18. 28s核糖體RNA基因的真菌特異性部分
[0256] 19. 16s_23s核糖體RNA基因的痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes)特異性 部分
[0257] 20. gyr B基因的革蘭氏陰性細(xì)菌特異性部分
[0258] 21.革蘭氏陰性細(xì)菌烏頭酸水合酶基因
[0259] 22.革蘭氏陰性核糖核酸酶1基因
[0260] 為進(jìn)一步提高檢測某些生物體（如單純皰疹1和2、巨細(xì)胞病毒、水痘帶狀皰疹和 革蘭氏陰性細(xì)菌）的可靠性，選擇擴增各生物體的一種以上的基因。在單純皰疹1和2和巨 細(xì)胞病毒的情況中，選擇各生物體的三種不同基因，而對于水痘帶狀皰疹，選擇兩種基因。
[0261] 皰疹病毒的DNA聚合酶基因是一種賦予PCR靈敏性的基因，且被用于許多研究 中。在第一個研究中，179bp產(chǎn)物使用95°C變性45秒、64°C退火45秒和72°C延伸45秒的 熱循環(huán)條件進(jìn)行擴增（Madhavan HN et al，Detection of herpes simplex virus (HSV) using polymerase chain reaction (PCR) in clinical samples Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV, J. Clin. Virol. 14 ： 145-151(1999))。而在另一個研究中，相同基因的469和391bp區(qū)域使用不同的引物組 和熱循環(huán)條件（95°C變性45秒、60°C退火45秒和72°C延伸45秒）進(jìn)行擴增（Madhavan HN et al, Phenotypic and Genotypic methods for the detection of herpes simplex virus serotypes. J.Virol.Methods，108 :97-102. (2003))?？傊跈z測不同病毒時，使用 不同的熱條件，如在用于鑒定眼睛感染的HSV、CMV和VZV的PCR的情況中（Priya K et al， Association of herpes viruses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditis ：a polymerase chain reaction based study, Ocular Immunology and Inflammation 9:1-9(2003))。在這一研究中，反應(yīng)條件和引物濃度對于不同病毒是不同 的。因此很明顯，難于設(shè)計出用于一系列已知病原體的引物和特異性靶序列以能夠?qū)崿F(xiàn)使 快速檢測和鑒別給定的臨床樣本中的一種或多種病原體的單管多重PCR反應(yīng)。
[0262] 因此，考慮有必要探索使用已知生物信息學(xué)方法設(shè)計合適的PCR引物和與PCR擴 增產(chǎn)物互補的靶DNA序列的可能性。
[0263] 為達(dá)到這一目的，本發(fā)明首先確定下面的優(yōu)先用于進(jìn)行HSV、CMV和VZV的檢測的 多重PCR反應(yīng)的條件，即在95°C變性、隨后在58°C -65°C退火，然后在72°C延伸。如此獲得 的PCR擴增產(chǎn)物與固定在固相基質(zhì)上的各病原體特異性的靶DNA序列的最佳雜交溫度確定 在48°C到55°C。因此考慮有必要設(shè)計所研究的各病原體的靶DNA序列組，從而特異性的PCR 擴增產(chǎn)物在統(tǒng)一溫度下與其互補靶DNA序列雜交，而不產(chǎn)生DNA序列的非特異性的結(jié)合。
[0264] 在設(shè)計多重PCR反應(yīng)的引物中最困難的部分是設(shè)計成所有引物具有相同的解鏈 溫度，從而使所有基因在相同的熱循環(huán)溫度下擴增成為可能。
[0265] 用于擴增的這些引物組從上面提到的基因序列中選擇以使所有的引物具有 58-65°C范圍內(nèi)的退火溫度，從而所有22個基因可以在同一個管中利用PCR擴增，其總是代 表所研究的特定病原體的所有種株或基因型。
[0266] 不同大小的擴增子可能干擾PCR方法的多重擴增的效率。因此選擇引物的第二個 標(biāo)準(zhǔn)確定為擴增子在66-90核苷酸范圍內(nèi)的均勻大小。對上節(jié)中提到的所有基因選擇包含 66-90bp長度的區(qū)域（包括引物序列）。
[0267] 為保持解鏈溫度均一，引物長度在17-29堿基對之間變化。
[0268] 另外，在多重反應(yīng)中，由于存在互補區(qū)域?qū)е乱镏谐森h(huán)或交叉雜交可能干擾PCR 擴增本身。為避免所有這種復(fù)雜情況，所有引物被仔細(xì)地設(shè)計以消除它們自身之間的成環(huán) 或引物的交叉雜交。也注意避免引物組的任何非特異性的（交叉的）擴增，即一種生物體 /基因的引物不應(yīng)該與反應(yīng)混合物中任何其它生物體/基因的基因反應(yīng)。
[0269] 所有引物被設(shè)計為它們一般匹配病原體基因的所有核苷酸堿基。但是，如果在某 些株或物種中存在錯配，如在設(shè)計擴增革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌的引物的情況 中，錯配限制為引物中間的最多兩個核音酸。各引物的3'端確保在診斷的物種的所有株中 總是具有完全的匹配。
[0270] 所描述的標(biāo)準(zhǔn)之外，這里引用現(xiàn)有技術(shù)中用于選擇引物序列的一般標(biāo)準(zhǔn)，在 Molecular cloning ：A laboratory manual, Vol 2，Sambrook. J，Russell DW(Eds)Cold Spring Harbor Laboratory Press NY(2001)中對此有詳細(xì)說明。這些標(biāo)準(zhǔn)是，3'端為G 或C，避免串列的GC重復(fù)和一般任何引物不以T終止等。
[0271] 設(shè)計后，利用所列的所有病原體的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列（基因），引物被個別地和以復(fù) 合的形式使用以檢驗靈敏性和特異性。在識別一些生物體或病毒顆粒中，當(dāng)靈敏性達(dá)不到 現(xiàn)有技術(shù)中報道的水平的時候，采用相同的標(biāo)準(zhǔn)選擇了不同的引物組，所述現(xiàn)有技術(shù)例如 有 Madhavan HN，et al，Detection of herpes simplex virus (HSV) using polymerase chain reaction (PCR) in clinical samples Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV, J. Clin. Virol. 14 :145-151 (1999)； Malathi. Jet al. A hospital based study on prevalence of conjunctivitis due to Chlamydia trachomatis Ind.J. Medical research，117 :71-75 (2003) ；Anand ARet al Use ofpolymerase chain reaction (PCR) and DNA probe hybridization to determine the gram reaction of the interacting bacterium in the intraocular fluids of patients with endophthalmitis. Journal of Infection，41 :221-226(2000) ；Anand AR et al. Use of polymerase Chain reaction in fungal endophthalmitis Ophthalmology 108 :326-330 (2001)。即使某些引物在58°C退火，也在實驗上確保所有的引物在60°C產(chǎn)生 良好的擴增。
[0272] 在本實施方式中，經(jīng)過仔細(xì)的評價，選擇了下面這些獨并用于病原體的檢 測和鑒別。這些序列是獨特的和現(xiàn)有技術(shù)中未知的。
[0273] L 通過包括SEQ ID No. 1和 2 (FP :5' cgcttggtttcggatgggag 3'（SEQ ID No. 1) 和 RPj' gcccccagagacttgttgtagg 3' (SEQ ID Νο·2))的引物組 1 擴增單純皰疫病毒 1 和2糖蛋白D基因
[0274] 2.通過包括 SEQ ID No. 3 和 4(FP :5 ' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3 ' (SEQ ID Νο·3)和 RPd' cgggggggtcttgcgttac 3' (SEQ ID Νο·4))的引物組 2 擴增單純皰疫病 毒1和2UL 44基因
[0275] 3.通過包括 SEQ ID No. 5 和 6 (FP :5' caagctgacggacatttacaagg 3' （SEQ ID Νο·5)和 RPd' gtcccacacgcgaaacacg 3' (SEQ ID Νο·6))的引物組 3 擴增單純皰疫病 毒1和2DNA聚合酶基因
[0276] 4.通過包括 SEQ ID No. 7 和 8 (FP :5 ' ttccggctcatggcgttaacc 3 ' (SEQ ID Νο·7)和 RPd' cgccctgcttttacgttacgc 3' （SEQ ID Νο·8))的引物組 4 擴增巨細(xì)胞病 毒糖蛋白0基因
[0277] 5.通過包括 SEQ ID No. 9 和 10 (FP :5 ' cggcgacgacgacgataaag 3 ' （SEQ ID Νο·9)和 RPd' caatctggtcgcgtaatcctctg 3' （SEQ ID No.10))的引物組 5 擴增巨細(xì)胞 病毒形態(tài)轉(zhuǎn)化基因
[0278] 6.通過包括 SEQ ID No. 11 和 12 (FP :5 ' gggcacgtcctcgcagaag 3 ' (SEQ ID No. 11)和 RPd' ccaagatgcaggtgataggtgac 3'（SEQ ID No. 12))的引物組 6 擴增巨細(xì)胞 病毒UL 88基因
[0279] 7.通過包括 SEQ ID No. 13 和 14(FP :5' ggtcttgccggagctggtattac 3'（SEQ ID No. I3)和 RP :5/ tgcctccgtgaaagacaaagaca 3' （SEQ ID No. 14))的引物組 7 擴增水痘 帶狀皰疹ORF 29
[0280] 8.通過包括 SEQ ID No. 15 和 16 (FP :5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3'（SEQ ID No. 15)和 RPdr acgttccggtagcgagttatctg 3' （SEQ ID No. 16))的引物組 8 擴增水 痘帶狀皰疹DNA聚合酶基因
[0281] 9.通過包括 SEQ ID No. 17 和 18 (FP :5 ' cgccgccaacatgctctacc 3 ' （SEQ ID No. I7)和 RP :5/ gttgcgggaggggatggata 3' （SEQ ID No. I8))的引物組 9 擴增腺病毒六 鄰體基因
[0282] 10.通過包括 SEQ ID No. 19 和 20 (FP :5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3' （SEQ ID Νο·19)和 RPd' cggactacgatcggttttgtgaga 3' （SEQ ID Νο·20))的引物組 10 擴增 真細(xì)菌16s核糖體RNA基因區(qū)I
[0283] 11.通過包括 SEQ ID No. 21 和 22(FP :5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3' （SEQ ID Νο·21)和 RPdr ggcagattcctaggcattactcacc 3' （SEQ ID Νο·22))的引物組 11 擴 增真細(xì)菌16s核糖體RNA基因區(qū)II
[0284] 12.通過包括 SEQ ID No. 23 和 24(FP :5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'（SEQ IDNo·23)和RP:5/tgcagccctttgtaccgtccat3'（SEQIDNo·24))的引物組12擴增16s 核糖體RNA基因的革蘭氏陽性細(xì)菌特異性部分
[0285] 13.通過包括 SEQ ID No. 25 和 26 (FP :5' gcggaacgtgggaccaatac 3' （SEQ ID Νο·25)和 RPd' cgacggggtgattttcttcttc 3'（SEQ ID Νο·26))的引物組 13 擴增結(jié)核桿 菌MPB 64基因
[0286] 14.通過包括 SEQ ID No. 27 和 28 (FP :5 ' aacttttttgactgccagacacactattg 3' （SEQ ID Νο·27)和 RP:5'ggatgccaccccccaaaag 3' （SEQ ID Νο·28))的引物組 14 擴 增偶發(fā)分枝桿菌16s-23s RNA基因
[0287] 15.通過包括 SEQ ID No. 29 和 30 (FP :5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3' （SEQ ID Νο·29)和 RPdr gacgttttgccgactacctatcc 3' （SEQ ID Νο·30))的引物組 15 擴增 龜分枝桿菌16s-23s RNA基因
[0288] 16.通過包括 SEQ ID No. 31 和 32 (FP :5r cccctctgctggcgaaaagtg 3' （SEQ ID No·31)和RP:5/ggcgaccaatctgcgaatacac3'（SEQIDNo·32))的引物組16擴增鼠弓 形體B1基因
[0289] 17.通過包括 SEQ ID No. 33 和 34(FP :5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3' （SEQ ID Νο·33)和 RPdr tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3' （SEQ ID Νο·34))的引物組 17 擴增 沙眼衣原體多態(tài)蛋白II
[0290] 18.通過包括 SEQ ID No. 35 和 36 (FP :5' gctgggactgaggactgcgac 3 ' （SEQ ID Νο·35)和 RPjr ttcaagacgggcggcatataac 3(SEQ ID Νο·36))的引物組 18 擴增 28s 核糖 體RNA基因的真菌特異性部分
[0291] 19.通過包括 SEQ ID No. 37 和 38 (FP :5' tggcgaacgggtgagtaaca 3' （SEQ ID No·37)和RP:5/ccggtattagccccagtttcc3'（SEQIDNo·38))的引物組19擴增16s-23s 核糖體RNA基因的痤瘡丙酸桿菌特異性部分
[0292] 20·通過包括SEQIDNo·39和40(FP:5'cggcggcaagttcgacgac3，（SEQID Νο·39)和 RPdr ccaccgagacgcccacacc 3' （SEQ ID Νο·40))的引物組 20 擴增 gyr B 基 因的革蘭氏陰性細(xì)菌特異性部分
[0293] 21.通過包括 SEQ ID No. 41 和 42 (FP :5 ' ccaggtcggcggagaagc 3 ' （SEQ ID Νο·41)和 RPj' ccaccggcccgatgacc 3' (SEQ ID Νο·42))的引物組 21 擴增革蘭氏陰性 細(xì)菌烏頭酸水合酶基因
[0294] 22.通過包括 SEQ ID No. 43 和 44(FP :5 ' gccgccctgaccaccttc 3 ' (SEQ ID Νο·43)和 RP:5/ gcgggttgttcggcatcag 3' (SEQ ID Νο·44))的引物組 22 擴增革蘭氏陰 性核糖核酸酶1基因
[0295] 在本發(fā)明的另一實施方式中，具有SEQ ID No. 45_66的探針序列通過用于設(shè)計識 別所述病原體獨有的特定基因片段的引物的計算機程序獲得。探針序列的長度在66-90核 苷酸之間變化。探針自身內(nèi)不形成發(fā)夾環(huán)。它們與任何其它擴增子不共有同源性。探針可 以從病原體DNA兩條鏈的任一條鏈擴增。
[0296] 探針序列詳述如下：
[0297] L單純皰疫病毒1和2糖蛋白D基因的探針DNA序列"cgcttggtttcggatggga ggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgetccta caacaagtctctgggggc" （SEQ ID No. 45)(通過包括 FP :5 z cgcttggtttcggatgggag 3 z (SEQ ID No. I)和 RP : 5' gcccccagagacttgttgtagg 3' （SEQ ID Νο·2)的引物組 I 擴增）
[0298] 2.單純瘤疫病毒1和2UL 44基因的探針DNA序列"ggcaatcgtgtacgtcgtccgcac atcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagaccccc ccg"（SEQ ID No. 46)(通過包括 FP : 5'ggcaatcgtgtacgtcgtccg3'（SEQIDNo·3)和RP:5'cgggggggtcttgcgttac3'（SEQ ID No. 4)的引物組2擴增）
[0299] 3.單純皰疫病毒1和2DNA聚合酶基因的探針DNA序列"caagctgacggacat ttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgttt cgcgtgtgggac，'（SEQ ID No. 47)(通過包括 FP :5 z caagctgacggacatttacaagg 3 z (SEQ ID No. 5)和 RP : 5' gtcccacacgcgaaacacg 3' （SEQ ID Νο·6)的引物組 3 擴增）
[0300] 4.巨細(xì)胞病毒糖蛋白0基因的探針DNA序列"ttccggctcatggcgttaaccaggtag aaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagg geg"（SEQ ID No. 48)(通過包括 FP : 5 ! ttccggctcatggcgttaacc 3 ! (SEQ ID No. 7)和 RP :5 ! cgccctgcttttacgttacgc 3' (SEQ ID No. 8)的引物組4擴增）
[0301] 5.巨細(xì)胞病毒形態(tài)轉(zhuǎn)化區(qū)II基因的探針DNA序列" cggcgacgacgacgataaag aatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccagattg"（SEQ ID No. 49)(通過包括 FP : 5 ! cggcgacgacgacgataaag 3 ! (SEQ ID No. 9)和 RP :5 ' caatctggtcgcgtaatcctctg 3' (SEQ ID No. 10)的引物組5擴增）
[0302] 6.巨細(xì)胞病毒 UL 88 基因的探針 DNA 序列 "gggcacgtcctcgcagaaggactcc aggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg"（SEQ ID No. 5〇)(通過包括 FP : 5 ! gggcacgtcctcgcagaag 3 ! (SEQ ID No. 11)和 RP :5 ' ccaagatgcaggtgataggtgac 3'（SEQ ID No. 12)的引物組6擴增）
[0303] 7.水痘帶狀皰疫 ORF 29 的探針 DNA 序列 "ggtcttgccggagctggtattaccttaaaact cactaccagtcatttctatccatctgtctttgtctttcacg gaggca"（SEQ ID No. 51)(通過包括 FP : 5! ggtcttgccggagctggtattac 3! (SEQ ID No. 13)和 RP :5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3' (SEQ ID No. 14)的引物組7擴增）
[0304] 8.水痘帶狀皰疫DNA聚合酶基因的探針DNA序列"tccatttaacgttgcatcattt tgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagataactc gctaccggaacgt，'（SEQ ID No. 52)(通過包括 FP :5 z tccatttaacgttgcatcattttgtg 3 z (SEQ ID No. 15)和 RP : 5' acgttccggtagcgagttatctg 3' （SEQ ID Νο·16)的引物組 8 擴增）
[0305] 9.腺病毒六鄰體基因的探針 DNA 序列 "cgccgccaacatgctctaccctatacccg ccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgca ac"（SEQ ID No. 53)(通過包括 FP : 5 ! cgccgccaacatgctctacc 3 ! (SEQ ID No. 17)和 RP :5 ! gttgcgggaggggatggata 3' (SEQ ID No. 18)的引物組9擴增）
[0306] 10.真細(xì)菌16s核糖體RNA基因區(qū)I的探針DNA序列"tgggctacacacgtgctac aatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaatctca caaaaccgatcgtagtccg" （SEQ ID No. 54)(通過包括 FP :5 z tgggctacacacgtgctacaatgg 3 ' （SEQ ID No. 19)和 RP : 5' cggactacgatcggttttgtgaga 3' （SEQ ID Νο·20)的引物組 10 擴增）
[0307] 11.真細(xì)菌16s核糖體RNA基因區(qū)II的探針DNA序列"ggcctaacacatgcaagtc gagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtga gtaatgcctaggaatctgcc，'（SEQ ID No. 55)(通過包括 FP :5 z ggcctaacacatgcaagtcgagc 3 z (SEQ ID No. 21)和 RP : 5' ggcagattcctaggcattactcacc 3' （SEQ ID Νο·22)的引物組 11 擴增）
[0308] 12. 16s核糖體RNA基因的革蘭氏陽性細(xì)菌特異性部分的探針DNA序列"acgt caaateatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaat ggacggtacaaagggctgca" （SEQ ID No. 56)(通過包括 FP :5 z acgtcaaatcatcatgcccccttat 3 ' （SEQ ID No. 23)和 RP : 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3' （SEQ ID Νο·24)的引物組 12 擴增）
[0309] 13.結(jié)核桿菌 MPB 64 基因的探針 DNA 序列"gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggcc ggctgcttcgggcagcaactcccccgggttgaag aagaaaatcaccccgtcg，'(SEQ ID No. 57)(通過包括 FP :5r gcggaacgtgggaccaatac 3! (SEQ ID No. 25)和 RP :5r cgacggggtgattttcttcttc 3'（SEQ ID No. 26)的引物組13擴增）
[0310] 14.偶發(fā)分枝桿菌 16s_23s RNA 基因的探針 DNA 序列 "aacttttttgactgccag acacactattgggctttgagacaacaggcccgtgccccttttggggggtggc atcc"（SEQ ID No. 58) (通過包括 FP :5 z aacttttttgactgccagacacactattg 3 z (SEQ ID No. 27)和 RP : 5' ggatgccaccccccaaaag 3' （SEQ ID Νο·28)的引物組 14 擴增）
[0311] 15.龜分枝桿菌 16s_23s RNA 基因的探針 DNA 序列 "tggttactcgcttggtgaatatg ttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc"（SEQ ID No. 59)(通過包括 FP : 5! tggttactcgcttggtgaatatgt 3! (SEQ ID No. 29)和RP :5' gacgttttgccgactacctatcc 3' (SEQ ID No. 30)的引物組15擴增）
[0312] 16.鼠弓形體 B 1 基因的探針 DNA 序列 "cccctctgctggcgaaaagtgaaattca tgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcc"（SEQ ID No. 60)(通過包括 FP : 5 ' cccctctgctggcgaaaagtg 3 ' (SEQ ID No. 31)和 RP :5 ' ggcgaccaatctgcgaatacac 3' (SEQ ID No. 32)的引物組16擴增）
[0313] 17.沙眼衣原體多態(tài)蛋白 II 的探針DNA序列"aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgc tttatcaaatgacaagcttagatccgtttctcatacggttttc ctcga，'（SEQ ID No. 61)(通過包括 FP : 5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3' (SEQ ID No. 33) #口RP :5^ tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3' (SEQ ID No. 34)的引物組17擴增）
[0314] 18. 28s核糖體RNA基因的真菌特異性部分的探針DNA序列"gctgggactgaggactg cgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa，'（SEQ ID No. 62)(通過包括 FP :5' gctgggactgaggactgcgac 3' (SEQ ID No. 35)和 RP :5' ttcaagacgggcggcatataac 3 (SEQ ID No. 36)的引物組18擴增）
[0315] 19. 16s_23s核糖體RNA基因的痤瘡丙酸桿菌特異性部分的探針DNA序列"tggcga acgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcagg aaactggggctaataccgg，' （SEQ ID No. 63)(通過包括 FP ：5 ' tggcgaacgggtgagtaaca 3 ' (SEQ ID No. 37)和 RP : 5' ccggtattagccccagtttcc 3' （SEQ ID Νο·38)的引物組 19 擴增）
[0316] 20. Gyr B基因的革蘭氏陰性細(xì)菌特異性部分的探針DNA序列"cggcggcaagttcga cgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctc ggtgg,? (SEQ ID No. 64) ( 括 FP :5 ' cggcggcaagttcgacgac 3 ' （SEQ ID No. 39)和 RP :5 ' ccaccgagacgcccacacc 3' (SEQ ID No. 40)的引物組2〇擴增）
[0317] 21.革蘭氏陰性細(xì)菌烏頭酸水合酶基因的探針DNA序列"ccaggtcggcggagaagccg aggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcatcgggccggtg (SEQ ID No. 65)(通過包f舌 FP : 5'ccaggtcggcggagaagc3'（SEQIDNo·41)和RP:5'ccaccggcccgatgacc3'（SEQID No. 42)的引物組21擴增）
[0318] 22.革蘭氏陰性核糖核酸酶1基因的探針DNA序列" gccgccctgaccaccttcat cagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc"（SEQ ID No. 66)(通過包括 FP : 5' gccgccctgaccaccttc 3' （SEQ ID Νο·43)和 RP:5' gcgggttgttcggcatcag 3' （SEQ ID No. 44)的引物組22擴增）
[0319] 似乎重復(fù)一遍。
[0320] 在本發(fā)明的另一實施方式中，具有SEQ ID No. 67-88的靶序列使用計算機稈序從 探針序列產(chǎn)生。這些靶用于固定在惰性材料上，如尼龍，并用UV輻射交聯(lián)或化學(xué)固定。靶 按照下面的標(biāo)準(zhǔn)選擇：
[0321] 1.所有靶序列是病原體特異性的且不與其它病原體的任何其它序列重疊。
[0322] 2.所有靶序列在23-28堿基長度的范圍內(nèi)。
[0323] 3.所有靶具有在58. 9°C -88°C范圍內(nèi)的均勻的解鏈溫度。
[0324] 4.靶序列落在擴增子區(qū)域且不包含正向或反向引物序列，從而標(biāo)記的探針（具有 SEQ ID No. 45-66)不與這些靶非特異性地結(jié)合。
[0325] 5.所有靶以它們一般匹配所有核苷酸堿基的方式設(shè)計。但如果在某些探針中存在 錯配，錯配限制為探針中部最多兩個核苷酸。
[0326] 靶序列詳細(xì)描述如下：
[0327] 1. 5，gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3'（SEQ ID No. 67)，通 過引物組1擴增的HSV糖蛋白D的靶
[0328] 2. 5' cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3'（SEQ ID No. 68)，通過引物組 2 擴增 的HSV UL 44的靶
[0329] 3. 5, tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3，（SEQ ID No. 69)，通過引物組 3擴增的HSV聚合酶的靶
[0330] 4. 5'aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3'（SEQ ID No. 70)，通過引物組 4 擴增 的CMV糖蛋白0的靶
[0331] 5. 5' aatacaaagccgcagtgtcgtc 3'（SEQ ID No. 71)，通過引物組 5 擴增的巨細(xì)胞 病毒形態(tài)轉(zhuǎn)化基因 II的靶
[0332] 6. 5' gactccaggtacaccttgacgtactg 3'（SEQ ID No. 72)，通過引物組 6 擴增的巨 細(xì)胞病毒UL 88基因的靶
[0333] 7. 5, cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3，（SEQ ID No. 73)，通過引物組 7 擴 增的水痘帶狀皰疹病毒ORF 29基因的靶
[0334] 8· 5，ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3，（SEQ ID No. 74)，通過引物組 8擴增的水痘帶狀皰疹病毒DNA聚合酶基因的靶
[0335] 9. 5' ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3'（SEQ ID No. 75)，通過引物組 9 擴增 的腺病毒六鄰體基因的靶
[0336] 10. 5, tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3，（SEQ ID No. 76)，通過引物 組10擴增的真細(xì)菌16s核糖體RNA基因區(qū)I的靶
[0337] 11. 5, ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3，（SEQ ID No. 77)，通過引物 組11擴增的真細(xì)菌16s核糖體RNA基因區(qū)II的靶
[0338] 12. 5' gacctgggctacacacgtgctaca 3'（SEQ ID No. 78)，通過引物組 12 擴增的革 蘭氏陽性生物體的16s核糖體RNA基因的靶
[0339] 13. 5, ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3，（SEQ ID No. 79)，通過 引物組13擴增的結(jié)核桿菌MPB 64基因的靶
[0340] 14. 5' ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3'（SEQ ID No. 80)，通過引物組 14 擴增的 偶發(fā)分枝桿菌16s-23s RNA基因的靶
[0341] 15. 5'tttataaatcctgtccaccccgt 3'（SEQ ID No. 81)，通過引物組 15 擴增的龜分 枝桿菌16s-23s RNA基因的靶
[0342] 16. 5'aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3'（SEQ ID No. 82)，通過引物組 16 擴增的 鼠弓形體B1基因的靶
[0343] 17. 5，atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3，（SEQ ID No. 83)，通過引物組 17 擴增的沙眼衣原體多態(tài)蛋白II的靶
[0344] 18. 5'gtaagtcaaggatgctggcataatg 3'（SEQ ID No. 84)，通過引物組 18 擴增的所 有真菌的28s核糖體RNA基因的靶
[0345] 19. 5' gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3'（SEQ ID No. 85)，通過引物組 19 擴增的 痤瘡丙酸桿菌的16s核糖體RNA基因的靶
[0346] 20. 5' aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3'（SEQ ID No. 86)，通過引物組 20 擴 增的革蘭氏陰性生物體的促旋酶基因的靶
[0347] 21. 5, cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3，（SEQ ID No. 87)，通過引物組 21 擴 增的革蘭氏陰性生物體的烏頭酸水合酶基因的靶
[0348] 22. 5' atcagcctggccggccgttacctggtg 3'（SEQ ID No. 88)，通過引物組 2, 2 擴增 的革蘭氏陰性生物體的核糖核酸酶基因的靶
[0349] 上面報告的用于固定在惰性基質(zhì)上的這些寡核苷酸，使用由標(biāo)準(zhǔn)DNA產(chǎn)生的產(chǎn)物 以及臨床樣本（通過序列分析）進(jìn)行確認(rèn)。這些序列是獨特的且是未知的或沒有被提到過 用于多重或單重PCR。
[0350] 在本發(fā)明的再另一實施方式中，提供了使用所有或一些上述引物組的多重PCR分 析方法，其中所有引物可以利用統(tǒng)一的熱循環(huán)條件在單個管中一起使用，包括94°C 5分鐘 的變性步驟，隨后是40次循環(huán)的60°C -64°C 45秒、72°C 45秒和94°C 45秒及在72°C延伸 反應(yīng)10分鐘。
[0351] 在進(jìn)一步的實施方式中，在5'端用生物素標(biāo)記的引物組使得可以檢測有色產(chǎn)物。
[0352] 在再另一實施方式中，所述引物用熒光標(biāo)記（如異硫氰酸熒光素 FITC的有機熒光 標(biāo)記或如Quantum Dots?或Cy3或Cy5的無機突光納米顆粒）進(jìn)行標(biāo)記以便可以通過任何 熒光掃描裝置或顯微鏡進(jìn)行檢測。
[0353] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供所述引物和探針集合的用途，其中檢驗分析是 用于檢測病原體的實時PCR。
[0354] 在再另一實施方式中，本發(fā)明提供所述引物和探針集合的用途，其中檢驗分析是 用于定量測定臨床樣本中病原體的實時PCR，以監(jiān)測疾病的預(yù)后或治療。
[0355] 在再另一實施方式中，本發(fā)明提供所述引物集合的用途，其中擴增產(chǎn)物的檢測可 以是宏陣列或狹縫雜交或線性探針分析的形式。
[0356] 在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明提供由固定在含硝基纖維素、尼龍、帶電尼龍、玻 璃或聚苯乙烯的固體相上的所述探針組成的宏陣列。
[0357] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供用于檢測和鑒別引起如感染性眼內(nèi)炎或角膜炎 或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜炎的病癥的病原體的方法，其中被檢測的病原體為單純皰疹 病毒1和2、巨細(xì)胞病毒、水痘帶狀皰疹病毒、腺病毒、真細(xì)菌、革蘭氏陽性生物體、革蘭氏陰 性細(xì)菌、真菌、結(jié)核桿菌、龜分支桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、鼠弓形體、沙眼衣原體。
[0358] 在再另一實施方式中，本發(fā)明提供用于在一組引起具有相似癥狀的眼睛或中樞系 統(tǒng)疾病的可能病原體中檢測出個別的病原體的方法。
[0359] 在再另一實施方式中，本發(fā)明提供使用選定的一些或所有前述引物的任何多重 PCR分析，其中由一些或所有所述生物體引起的任何臨床癥狀被研究，用于檢測存在于臨床 樣本中的任何一種個別病原體或病原體組。
[0360] 在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明提供用于同時檢測引起外眼感染、眼內(nèi)炎或葡萄 膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜腦炎的所有病原體的方法，包括如下步驟：
[0361] a)從患有所述感染的患者取得臨床樣本，
[0362] b)從步驟a)中取得的樣本的一部分或全部提取DNA，
[0363] c)采用生物素或熒光示蹤劑標(biāo)記的如權(quán)利要求1中所述的引物集合和標(biāo)準(zhǔn)的PCR 試劑對步驟b)中獲得的DNA進(jìn)行多重PCR，
[0364] d)使步驟c)中獲得的PCR產(chǎn)物變性，
[0365] e)使步驟d)中獲得的PCR產(chǎn)物與固定在固體基質(zhì)上的靶雜交，
[0366] f)通過酶或熒光方法檢測在步驟e)中獲得的固體基質(zhì)上的DNA雜交體。
[0367] 在另一實施方式中，本發(fā)明提供用于同時檢測引起外眼感染、眼內(nèi)炎或葡萄膜炎 或視網(wǎng)膜炎或腦膜腦炎的所有病原體的試劑盒，包括：
[0368] a)如前所述的正向和反向引物的集合，
[0369] b)固定在合適的固體載體上的如前所述的DNA靶基質(zhì)，
[0370] c)通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增DNA所需的標(biāo)準(zhǔn)試劑，
[0371] d)將PCR擴增產(chǎn)物雜交到DNA探針的固定基質(zhì)所需的標(biāo)準(zhǔn)試劑，
[0372] e)檢測用于檢測和鑒別特定病因病原體的最終雜交產(chǎn)物所需的標(biāo)準(zhǔn)試劑。
[0373] 在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明提供用于同時檢測引起外眼感染、眼內(nèi)炎或葡萄 膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜腦炎的所有病原體的方法，包括：
[0374] a)從患有所述感染的患者取得臨床樣本，
[0375] b)從步驟a)中取得的樣本的一部分或全部提取DNA，
[0376] c)采用生物素或熒光示蹤劑標(biāo)記的如前所述的引物集合和標(biāo)準(zhǔn)的PCR試劑對步 驟b)中獲得的DNA進(jìn)行多重PCR，
[0377] d)使步驟c)中獲得的PCR產(chǎn)物變性，
[0378] e)使步驟d)中獲得的PCR產(chǎn)物與固定在固體基質(zhì)上的如前所述的靶雜交，
[0379] f)通過酶或熒光方法檢測在步驟e)中獲得的固體基質(zhì)上的DNA雜交體。
[0380] 實施例
[0381] 下面的實施例以對本發(fā)明舉例說明的方式給出，因此不應(yīng)構(gòu)成對本發(fā)明的范圍的 限制。
[0382] 實施例1 :
[0383] 使用能夠分別擴增腺病毒六鄰體基因和沙眼衣原體多態(tài)蛋白II基因的引物組9 和17進(jìn)行多重PCR。PCR混合物包含10-20pmol的各正向和反向引物、20(^11的各(^^、 d-UTP、d-CTP 和 d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的 2 單位的 Taq 聚合酶、1.5mM MgCl2、 5mM KC1、0. 01 %明膠、ImM EDTA和1單位的UDP糖基化酶（以防止擴增子污染）。循環(huán)條 件是在37°C孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，50°C進(jìn)行2分鐘，94°C進(jìn)行5分鐘 的變性步驟，接著40個循環(huán)的60°C 45秒、72°C 45秒和94°C 45秒及在72°C進(jìn)行10分鐘的 延伸反應(yīng)。產(chǎn)物通過6%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析。如圖1中所見，兩個基因都得到擴增。Ipg 腺病毒和IOfg衣原體DNA的標(biāo)準(zhǔn)DNA用于擴增。
[0384] 實施例2 :
[0385] 使用能夠分別擴增糖蛋白D、UL 44和DNA聚合酶基因的引物組1、2和3進(jìn)行多 重PCR。PCR混合物包含IOpmol的各正向和反向引物、200 μ M的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和 d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 7.5)中的 2 單位的 Taq 聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KC1、0.01% 明 膠、ImM EDTA和1單位的UDP糖基化酶（以防止擴增子污染）。循環(huán)條件是在37°C孵育30 分鐘以完全消化任何擴增子污染物，50°C進(jìn)行2分鐘，94°C進(jìn)行5分鐘的變性步驟，接著40 個循環(huán)的60°C 45秒、72°C 45秒和94°C 45秒及在72°C進(jìn)行10分鐘的延伸反應(yīng)。產(chǎn)物通過 6%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析。如圖2中所見，所有三個基因都得到擴增。
[0386] 實施例3
[0387] 使用能夠分別擴增HSV糖蛋白D基因 、UL 44基因和DNA聚合酶基因、腺病毒六 鄰體基因和沙眼衣原體多態(tài)蛋白II基因的引物組1、2、3、9和17進(jìn)行多重PCR。PCR混 合物包含1〇口111〇1的各正向和反向引物、20(^]\1的各(^^\(1-^1\(1-〇1 3和(1-6了？、1〇1111 Tris-HCl(pH 9.0)中的 2 單位的 Taq 聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KC1、0.01% 明膠、ImM EDTA 和1單位的UDP糖基化酶（以防止擴增子污染）。循環(huán)條件是在37°C孵育30分鐘以完全 消化任何擴增子污染物，50°C進(jìn)行2分鐘，94°C進(jìn)行5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的 60°C 45秒、72°C 45秒和94°C 45秒及在72°C進(jìn)行10分鐘的延伸反應(yīng)。5管如上所述的PCR 混合物與下面的DNA制劑一起孵育，其中管NC沒有添加任何DNA，管1包含Ipg的HSV DNA， 管2包含4fg的沙眼衣原體,管3包含IOpg的腺病毒DNA,而管4包含上述量的所有三種 DNA。產(chǎn)物通過6%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析。如圖3中所見，所有基因都得到擴增。
[0388] 尼龍膜各點有 0· 26N NaOH 中的 IOOpmol 的具有 SEQ ID No. 67、68、69、75 和 83 的 靶（圖4)。然后膜使用含有0. 1% SDS和1% BSA的2X SSPE在37°C封閉1小時。擴增子 加熱到95°C 10分鐘，并在含有0. 1% SDS的2X SSPE中混合和在52°C雜交2小時。雜交 后，膜各在含有0. 1 % SDS的IX SSPE中清洗3分鐘，清洗5次。膜與鏈霉抗生物素-過氧 化物酶偶聯(lián)物在含有 1 % BSA、150mM NaCl 和 0.3 % tween-20 的 0· IM Tris-HCl(pH 7.4)中 孵育。在37°C 30分鐘后，膜各以相同的緩沖液清洗3分鐘，清洗5次。為顯色，膜在37°C 與每毫升磷酸鹽緩沖鹽水〇. 5mg的鹽酸二氨基聯(lián)苯胺一起孵育10分鐘。棕色色斑的出現(xiàn) 表明特定病原體的存在。
[0389] 實施例4 :
[0390] 使用能夠分別擴增結(jié)核桿菌的MPB 64基因、偶發(fā)分枝桿菌的16s-23s RNA基因、 龜分枝桿菌的16s-23s RNA基因和鼠弓形體的Bl基因的引物組13、14、15和16進(jìn)行多重 卩0?。？0?混合物包含1(^111〇1的各正向和反向引物、20(^]\1的各(^^\(1-^1\(1-〇1 3和 d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的 2 單位的 Taq 聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KC1、0.01% 明 膠、ImM EDTA和1單位的UDP糖基化酶（以防止擴增子污染）。循環(huán)條件是在37°C孵育30 分鐘以完全消化任何擴增子污染物，50°C進(jìn)行2分鐘，94°C進(jìn)行5分鐘的變性步驟，接著40 個循環(huán)的60°C 45秒、72°C 45秒和94°C 45秒及在72°C進(jìn)行10分鐘的延伸反應(yīng)。5管如上 所述的PCR混合物與下面的DNA制劑一起孵育，其中管NC不包含任何DNA，管1包含Ifg的 結(jié)核桿菌DNA，管2包含IOOfg的偶發(fā)分枝桿菌DNA，管3包含IOOfg的龜分枝桿菌DNA，而 管4包含Ifg的鼠弓形體DNA。圖5顯示了五片尼龍膜，各點有0.26N NaOH中的IOOpmol 的具有SEQ ID No. 79、80、81和82的靶。然后膜使用含有0. 1 % SDS和1 % BSA的2X SSPE 在37°C封閉1小時。擴增子加熱到95°C 10分鐘，并在含有0. 1% SDS的Iml 2X SSPE中混 合和在52°C雜交2小時。雜交后，膜各在含有0. 1% SDS的IX SSPE中清洗3分鐘，清洗5 次。膜與鏈霉抗生物素-過氧化物酶偶聯(lián)物在含有1 % BSA、150mM NaCl和0. 3% tween-20 的0. IM Tris-HCl (pH 7. 4)中孵育。在37°C 30分鐘后，膜各以相同的緩沖液清洗3分鐘， 清洗5次。為顯色，膜在37°C與每毫升磷酸鹽緩沖鹽水0. 5mg的鹽酸二氨基聯(lián)苯胺一起孵 育10分鐘。棕色色斑的出現(xiàn)表明特定病原體的存在。
[0391] 實施例5
[0392] 使用能夠分別擴增HSV的糖蛋白D基因 、UL 44基因和DNA聚合酶基因、CMV的糖 蛋白0基因、形態(tài)轉(zhuǎn)化和UL 88基因及VZV的0RF29基因和DNA聚合酶基因的引物組1、2、 3、4、5、6、7和8進(jìn)行多重PCR。PCR混合物包含IOpmol的各正向和反向引物、200 μ M的各 d-ATP、d-UTP、d-CTP 和 d-GTP、10mM Tris-HCl (pH 9. 0)中的 2 單位的 Taq 聚合酶、I. 5mM 1%(：12、511111((：1、0.01%明膠、11111^0了4和1單位的皿？糖基化酶（以防止擴增子污染）。循 環(huán)條件是在37°C孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，50°C進(jìn)行2分鐘，和94°C進(jìn)行 5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的60°C 45秒、72°C 45秒和94°C 45秒及在72°C進(jìn)行10 分鐘的延伸反應(yīng)。
[0393] 4管如上所述的PCR混合物與下面的DNA制劑一起孵育，其中管NC不包含任何 DNA，管1包含Ipg的HSV DNA，管2包含IOpg的CMV DNA，管3包含Ipg的VZV DNA。圖6 顯示了四片尼龍膜，各點有0.26N NaOH中的IOOpmol的具有SEQ ID No. 67、68、69、70、71、 72、73和74的靶。然后膜使用含有0. 1% SDS和1% BSA的2X SSPE在37°C封閉1小時。 擴增子加熱到95°C 10分鐘，并在含有0. 1% SDS的2X SSPE中混合和在52°C雜交2小時。 雜交后，膜各在含有〇. 1 % SDS的IX SSPE中清洗3分鐘，清洗5次。膜與鏈霉抗生物素-過 氧化物酶偶聯(lián)物在含有 1% BSA、150mM NaCl 和 0· 3% tween-20 的 0· IM Tris-HCl (pH 7. 4) 中孵育。在37°C 30分鐘后，膜各以相同的緩沖液清洗3分鐘，清洗5次。為顯色，膜在37°C 與每毫升磷酸鹽緩沖鹽水〇. 5mg的鹽酸二氨基聯(lián)苯胺一起孵育10分鐘。棕色色斑的出現(xiàn) 表明特定病原體的存在。
[0394] 實施例6
[0395] 使用能夠分別擴增真細(xì)菌基因組的16s核糖體RNA基因 I和II組、革蘭氏陽性 細(xì)菌的16s核糖體RNA基因、所有真菌的28sRNA基因、痤瘡丙酸桿菌的16s核糖體RNA基 因、革蘭氏陰性細(xì)菌的gyrB基因、烏頭酸水合酶基因和核糖核酸酶基因的引物組10、11、 12、18、19、20、21和22進(jìn)行多重PCR。PCR混合物包含10-20pmol的各正向和反向引物、 200 μ M 的各 d-ATP、d-UTP、d-CTP 和 d-GTP、50mM Tris-HCl (pH 7. 5)中的 2 單位的 Taq 聚 合酶、5mMMgCl2、5mMKCl、0.01%牛血清白蛋白、lmMEDTA和l單位的UDP糖基化酶（以防 止擴增子污染）。循環(huán)條件是在37°C孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，94°C進(jìn)行 5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的60°C 45秒、72°C 45秒和94°C 45秒及在72°C進(jìn)行10 分鐘的延伸反應(yīng)。5管如上所述的PCR混合物與下面的DNA制劑一起孵育，其中管NC不包 含任何DNA，管1包含5fg的大腸桿菌（E. coli) DNA，管2包含IOfg的金黃色釀膿葡萄球菌 (S. aureus)DNA，管3包含IOfg的痤瘡丙酸桿菌（P. acnes)DNA，和管4包含IOfg的白色念 珠菌（C. albicans)DNA。圖7顯示了五片尼龍膜，各點有0· 26N NaOH中的IOOpmol的具有 SEQ ID No. 76、77、78、84、85、86、87 和 88 的靶。然后膜使用含有 0. 1% SDS 和 1% BSA 的 2X SSPE在37°C封閉1小時。擴增子加熱到95°C 10分鐘，并在含有0. 1 % SDS的2X SSPE中混 合和在52°C雜交2小時。雜交后，膜各在含有0. 1% SDS的IX SSPE中清洗3分鐘，清洗5 次。膜與鏈霉抗生物素-過氧化物酶偶聯(lián)物在含有1 % BSA、150mM NaCl和0. 3% tween-20 的0. IM Tris-HCl (pH 7. 4)中孵育。在37°C 30分鐘后，膜各以相同的緩沖液清洗3分鐘， 清洗5次。為顯色，膜在37°C與每毫升磷酸鹽緩沖鹽水0. 5mg的鹽酸二氨基聯(lián)苯胺一起孵 育10分鐘。棕色色斑的出現(xiàn)表明特定病原體的存在。
[0396] 實施例7
[0397] 由11名死前出現(xiàn)葡萄膜炎/視網(wǎng)膜炎的AIDS患者的尸檢中收集玻璃體液，樣本 在多重PCR上測試，隨后在宏陣列上鑒定擴增子。使用QIAGEN DNA純化試劑盒從100 μ 1的 各玻璃體樣本提取DNA。DNA在50 μ 1的洗脫緩沖液中重配。多重PCR使用可以擴增所有 22個基因的引物組1-22進(jìn)行，所述基因有單純皰疹病毒1&2糖蛋白D、單純皰疹病毒1&2UL 44基因、單純皰疹病毒1&2DNA聚合酶基因、巨細(xì)胞病毒糖蛋白O基因、巨細(xì)胞病毒形態(tài)轉(zhuǎn)化 基因、巨細(xì)胞病毒UL 88基因、水痘帶狀皰疹ORF 29、水痘帶狀皰疹DNA聚合酶基因、腺病毒 六鄰體基因、真細(xì)菌16s核糖體RNA基因 I、真細(xì)菌16s核糖體RNA基因區(qū)域II、16s核糖體 RNA基因的革蘭氏陽性細(xì)菌特異性部分、結(jié)核桿菌MPB 64基因、偶發(fā)分枝桿菌16s-23s RNA 基因、龜分枝桿菌16s-23s RNA基因、鼠弓形體B 1基因、沙眼衣原體多態(tài)蛋白II、28s核糖 體RNA基因的真菌特異性部分、16s-23s核糖體RNA基因的痤瘡丙酸桿菌特異性部分、gyr B基因的革蘭氏陰性細(xì)菌特異性部分、革蘭氏陰性細(xì)菌烏頭酸水合酶基因、革蘭氏陰性細(xì)菌 核糖核酸酶I基因。
[0398] PCR混合物包含10-20pmo 1的各正向和反向引物、200μΜ的各d-ATP、d-UTP、d-CTP 和 d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的 2 單位的 Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KC1、0.01% 明膠、ImM EDTA和1單位的UDP糖基化酶（以防止擴增子污染）以及10 μ 1從樣本中提取 的DNA。循環(huán)條件是在37°C孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，在50°C處理2分 鐘，和94°C進(jìn)行5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的60°C 45秒、72°C 45秒和94°C 45秒及 隨后在72°C進(jìn)行10分鐘的延伸反應(yīng)。
[0399] 如上所述，PCR使用濃度為10-20pmol/50 μ 1反應(yīng)混合物的包括SEQ ID NO. 1-44 的22組引物進(jìn)行。所有樣本的PCR產(chǎn)物在用SEQ ID No. 45-66的探針點樣的尼龍膜上進(jìn) 行雜交。尼龍膜各點有0.26N NaOH中的IOOpmol具有SEQ ID No. 67-88的靶。然后膜使 用含有0. 1% SDS和1% BSA的2X SSPE在37°C封閉1小時。擴增子加熱到95°C 10分鐘， 并在含有0.1 % SDS的2X SSPE中混合和在52°C雜交2小時。雜交后，膜各在含有0.1 % SDS的IX SSPE中清洗3分鐘，清洗5次。膜與鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶連接體在含 有 1% BSA、150mM NaCl 和 0· 3% tween-20 的 0· IM Tris-HCl (pH 7. 4)中孵育。在 37? 30 分鐘后，膜各以相同的緩沖液清洗3分鐘，清洗5次。為顯色，膜在37°C與每毫升磷酸鹽緩 沖鹽水0. 5mg的鹽酸二氨基聯(lián)苯胺一起孵育10分鐘。棕色色斑的出現(xiàn)表明特定病原體的 存在
[0400] 所獲得的結(jié)果概括于表1中。所有11個樣本被鑒定為HSV視網(wǎng)膜炎和結(jié)核桿菌 的葡萄膜炎，同時其中10個樣本玻璃體中另外有鼠弓形體。多重PCR和DNA宏陣列準(zhǔn)確地 鑒定了所有樣本。
[0401] 蓋1 :使用多重PCR和宏陣列上的雜交對11份從AIDS病人得到的尸檢玻璃體液 樣本進(jìn)行病原體同時檢測和鑒別的結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 用于鑒別檢測樣本中引起病癥的病原體的引物組組合，其中所述組合為： 用于檢測樣本中已知引起葡萄膜炎的一種或多種病原體的第一引物組組合，其由SEQ ID No. 25 和 SEQ ID No. 26 的組 13、SEQ ID No. 27 和 SEQ ID No. 28 的組 14、SEQ ID No. 29 和 SEQ ID No. 30 的組 15 及 SEQ ID No. 31 和 SEQ ID No. 32 的組 16 組成； 用于檢測樣本中已知引起感染性眼內(nèi)炎的一種或多種病原體的第二引物組組合，其由 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 的組 10、SEQ ID No. 21 和 SEQ ID No. 22 的組 11、SEQ ID No. 23 和 SEQ ID No. 24 的組 12、SEQ ID No. 35 和 SEQ ID No. 36 的組 18、SEQ ID No. 37 和 SEQ ID No. 38 的組 19、SEQ ID No. 39 和 SEQ ID No. 40 的組 20、SEQ ID No. 41 和 SEQ ID No. 42 的組 21 及 SEQ ID No. 43 和 SEQ ID No. 44 的組 22 組成； 用于檢測樣本中已知引起腦膜腦炎的一種或多種病原體的第三引物組組合，其由SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 的組 1、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 的組 2、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 的組 3、SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8 的組 4、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 10 的組 5、SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12 的組 6、SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14 的組 7、SEQ ID No. 15 和 SEQ ID No. 16 的組 8、SEQ ID No. 25 和 SEQ ID No. 26 的組 13、SEQ ID No. 31 和 SEQ ID No. 32 的組 16 及 SEQ ID No. 35 和 SEQ ID No. 36 的組 18 組成； 用于檢測樣本中革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細(xì)菌的第四引物組組合，其由SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 的組 10、SEQ ID No. 21 和 SEQ ID No. 22 的組 11、SEQ ID No. 23 和 SEQ ID No. 24 的組 12、SEQ ID No. 35 和 SEQ ID No. 36 的組 18、SEQ ID No. 39 和 SEQ ID No. 40 的組 20、SEQ ID No. 41 和 SEQ ID No. 42 的組 21 及 SEQ ID No. 43 和 SEQ ID No. 44 的組22組成；和/或 用于區(qū)分樣本中已知引起急性和慢性腦膜炎的病原體的第五引物組組合，其由SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 的組 10、SEQ ID No. 21 和 SEQ ID No. 22 的組 11、SEQ ID No. 23 和 SEQ ID No. 24 的組 12、SEQ ID No. 25 和 SEQ ID No. 26 的組 13、SEQ ID No. 35 和 SEQ ID No. 36 的組 18、SEQ ID No. 39 和 SEQ ID No. 40 的組 20、SEQ ID No. 41 和 SEQ ID No. 42 的 組 21 及 SEQ ID No. 43 和 SEQ ID No. 44 的組 22 組成。
2. 如權(quán)利要求1所述的引物組組合，其中所述病原體選自單純皰疹病毒1和2、巨細(xì)胞 病毒、水痘帶狀皰疹病毒、真細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、結(jié)核桿菌、龜分 支桿菌、偶發(fā)分枝桿菌和鼠弓形體。
3. 如權(quán)利要求1所述的引物組組合，其中所述病癥選自感染性眼內(nèi)炎、葡萄膜炎、腦膜 炎和腦膜腦炎。
4. 如權(quán)利要求1所述的引物組組合，其中組1-8U0-16和18-22(SEQ ID No. 1-16、 19-32和35-44)的組合檢測樣品中單純皰疹病毒1和2、巨細(xì)胞病毒、水痘帶狀皰疹病毒、 真細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、結(jié)核桿菌、龜分支桿菌、偶發(fā)分枝桿菌和 鼠弓形體的靶核酸。
5. 如權(quán)利要求1所述的引物組組合，其中所述樣本選自房水、玻璃體液、玻璃體切除洗 液、角膜刮屑和結(jié)膜拭子。
6. 如權(quán)利要求1所述的引物組組合，其中所述引物采用生物素基團(tuán)在5'端標(biāo)記，導(dǎo)致 通過形成有色產(chǎn)物進(jìn)行檢測；或者所述引物通過選自如異硫氰酸熒光素FITC的有機熒光 標(biāo)記和如突光納米顆粒、Quantum DotsTM、Cy3和Cy5的無機突光標(biāo)記的突光標(biāo)記進(jìn)行標(biāo) 記。
7.用于檢測和鑒別研究的特定病原體的病原體特異性探針DNA序列的組合，其中所述 探針DNA序列選自： 1) 探針DNA序列 ''cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgetcctacaa caagtctctgggggc"（SEQ ID No.45) 2) 探針DNA序列 "ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagacccccccg" （ SEQ ID No. 46) 3) 探針DNA序列 "caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttcgcgt gtgggac"（SEQ ID No.47) 4) 探針DNA序列 ^ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagggcg "（SEQ ID No. 48) 5) 探針DNA序列 "cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccagattg" （SEQ ID No. 49) 6) 探針DNA序列 ^gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg(SE Q ID No. 50) 7) 探針DNA序列 "ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatctgtctttgtctttcac ggaggea"（SEQ ID No. 51) 8) 探針DNA序列 ^tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagataactc gctaccggaacgt"（SEQ ID No. 52) 9) 探針DNA序列 ^tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaatctcacaaaa ccgatcgtagtccg"（SEQ ID No. 54) 10) 探針DNA序列 ^ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatg cctaggaatctgcc"（SEQ ID No. 55) 11) 探針DNA序列 "acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggctgca" (SEQ ID No. 56) 12) 探針DNA序列 '' gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgettcgggcagcaactcccccgggttgaagaagaaa atcaccccgtcg"（SEQ ID No. 57) 13) 探針DNA序列 "aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtgccccttttggggggtggcat cc"（SEQ ID No. 58) 14) 探針DNA序列 '' tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc，'（ SEQ ID No. 59) 15) 探針DNA序列 '' cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcc，'（ SEQ ID No. 60) 16) 探針DNA序列 ^gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa(SE Q ID No. 62) 17) 探針DNA序列 ^tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcaggaaactggggctaat accgg"（SEQ ID No. 63) 18) 探針DNA序列 ''cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctcggtgg"（SE Q ID No. 64) 19) 探針DNA序列 ''ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcatcgggccggtgg，'（SEQ ID No. 65)，和 20) 探針DNA序列 "gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc" （SEQ ID No. 66)。
8. 如權(quán)利要求7所述的病原體特異性探針DNA序列的組合，其中所述探針DNA序列選 自下列組合： 由SEQ ID No. 57-60組成的第一組合； 由SEQ ID No. 54-56和62-66組成的第二組合； 由SEQ ID No. 45-52, 57,60和62組成的第三組合； 由SEQ ID No. 54-56,62和64-66組成的第四組合；和 由SEQ ID No. 54-57,62和64-66組成的第五組合。
9. 靶DNA序列的組合，其中所述序列選自： 1) 5' gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3, (SEQ ID No. 67) 2) 5' cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg3' (SEQ ID No. 68) 3) 5' tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg3, (SEQ ID No. 69) 4) 5' aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg3' (SEQ ID No. 70) 5) 5， aatacaaagccgcagtgtcgtc3' （SEQ ID No.71) 6) 5， gactccaggtacaccttgacgtactg3， （SEQ ID No.72) 7) 5' cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc3' (SEQ ID No. 73) 8) 5f ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata3, (SEQ ID No. 74) 9. tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa3, (SEQ ID No. 76) 10. ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg3, (SEQ ID No. 77) 11) 5， gacctgggctacacacgtgctaca3， （SEQ ID No.78) 12) 5，ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt3，(SEQ ID No. 79) 13) 5， ggctttgagacaacaggcccgtgccc3， （SEQ ID No.80) 14) 5， tttataaatcctgtccaccccgt3， （SEQ ID No.81) 15) 5， aaattcatgagtatctgtgcaactttg3' （SEQ ID No.82) 16) 5J gtaagtcaaggatgctggcataatg3, (SEQ ID No. 84) 17. gcttcagcgccgtcagcgaggataac3, (SEQ ID No. 85) 18) 5， aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac3， （SEQ ID No.86) 19) 5， cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg3' （SEQ ID No.87)和 20) 5， atcagcctggccggccgttacctggtg3' （SEQ ID No.88)。
10. 用于檢測和/或區(qū)分尸檢測試樣本中兩組或更多組病原體的靶核酸的方法，所述 測試樣本選自玻璃體液、玻璃體切除洗液和房水，所述方法包括： a) 采用引物組1-8U0-16和18-22(SEQ ID No. 1-16U9-32和35-44)的組合進(jìn)行多重 聚合酶鏈反應(yīng)以獲得擴增的產(chǎn)物， b) 使所述擴增產(chǎn)物與靶DNA序列雜交，從而通過檢測雜交來鑒別所述病原體。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述病原體引起選自感染性眼內(nèi)炎、葡萄膜炎、腦 膜炎、眼感染和腦膜腦炎的病癥。
12. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述靶DNA序列選自SEQ ID No. 67、SEQ ID No. 68、SEQ ID No. 69、SEQ ID No. 70、SEQ ID No. 71、SEQ ID No. 72、SEQ ID No. 73、SEQ ID No. 74,SEQ ID No. 76,SEQ ID No. 77,SEQ ID No. 78,SEQ ID No. 79,SEQ ID No. 80,SEQ ID No. 81、SEQ ID No. 82、SEQ ID No. 84、SEQ ID No. 85、SEQ ID No. 86、SEQ ID No.87 和 SEQ ID No. 88或及其互補序列。
13. 如權(quán)利要求10-12中任一項所述的方法，其中所述聚合酶鏈反應(yīng)條件包括94°C 5 分鐘的變性步驟，隨后40個循環(huán)的60°C -64°C 45秒、72°C 45秒和94°C 45秒，及72°C 10 分鐘的延伸反應(yīng)。
14. 如權(quán)利要求10-13中任一項所述的方法，其中所述引物采用生物素基團(tuán)在5'端標(biāo) 記，導(dǎo)致通過形成有色產(chǎn)物進(jìn)行檢測；或者其中所述引物通過選自如異硫氰酸熒光素FITC 的有機熒光標(biāo)記和如熒光納米顆粒、Quantum DotsTM、Cy3和Cy5的無機熒光標(biāo)記的熒光標(biāo) 記進(jìn)行標(biāo)記，使得能夠通過任何熒光掃描設(shè)備或顯微鏡檢方法檢測。
15. 如權(quán)利要求10-14中任一項所述的方法，其中所述雜交在宏陣列、狹縫雜交或線性 探針分析中采用選自SEQ ID No. 45-52、54-60和62-66的探針DNA序列進(jìn)行檢測。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述宏陣列包含固定在含硝基纖維素、尼龍、帶 電尼龍、玻璃、聚苯乙烯或其組合的固體相上的選自SEQ ID No. 67、SEQ ID No. 68、SEQ ID No. 69,SEQ ID No. 70,SEQ ID No. 7USEQ ID No. 72,SEQ ID No. 73,SEQ ID No. 74,SEQ ID No. 76、SEQ ID No. 77、SEQ ID No. 78、SEQ ID No. 79、SEQ ID No. 80、SEQ ID No. 81、SEQ ID No. 82、SEQ ID No. 84、SEQ ID No. 85、SEQ ID No. 86、SEQ ID No. 87、SEQ ID No. 88 或及其 互補序列的靶DNA序列。
17. 用于同時檢測引起眼內(nèi)炎或葡萄膜炎或腦膜腦炎的所有病原體的試劑盒，所述試 劑盒包括： a) 如權(quán)利要求1中所述的正向和反向引物的集合， b) 固定在合適的固體相上的如權(quán)利要求9中所述的DNA序列的基質(zhì)， c) 通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增DNA所需的標(biāo)準(zhǔn)試劑， d) 將PCR擴增產(chǎn)物雜交到固定在合適固體相上的DNA序列基質(zhì)所需的標(biāo)準(zhǔn)試劑， e) 檢測和鑒別最終的雜交產(chǎn)物所需的標(biāo)準(zhǔn)試劑。
18. 用于檢測樣本中的病原體的試劑盒，所述試劑盒包括引物組1-8U0-16和 18-22 (SEQ ID No. 1-16、19-32和35-44)，其中所述病原體為單純皰疹病毒1和2、巨細(xì)胞病 毒、水痘帶狀皰疹病毒、真細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、結(jié)核桿菌、龜分支 桿菌、偶發(fā)分枝桿菌和鼠弓形體。
19. 包含以下引物組組合的試劑盒： 由 SEQ ID No. 25 和 SEQ ID No. 26 的組 13、SEQ ID No. 27 和 SEQ ID No. 28 的組 14、 SEQ ID No. 29 和 SEQ ID No. 30 的組 15 及 SEQ ID No. 31 和 SEQ ID No. 32 的組 16 組成的 第一引物組組合，其用于已知引起葡萄膜炎的一種或多種病原體的檢測；或者 由 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 的組 10、SEQ ID No. 21 和 SEQ ID No. 22 的組 11、 SEQ ID No. 23 和 SEQ ID No. 24 的組 12、SEQ ID No. 35 和 SEQ ID No. 36 的組 18、SEQ ID No. 37 和 SEQ ID No. 38 的組 19、SEQ ID No. 39 和 SEQ ID No. 40 的組 20、SEQ ID No. 41 和 SEQ ID No. 42的組21及SEQ ID No. 43和SEQ ID No. 44的組22組成的第二引物組組合， 其用于已知引起感染性眼內(nèi)炎的一種或多種病原體的檢測；或者 由 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 的組 1、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 的組 2、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 的組 3、SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8 的組 4、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 10 的組 5、SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12 的組 6、SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14 的組 7、SEQ ID No. 15 和 SEQ ID No. 16 的組 8、SEQ ID No. 25 和 SEQ ID No. 26 的組 13、SEQ ID No. 31和SEQ ID No. 32的組16及SEQ ID No. 35和SEQ ID No. 36的組18組成的第三引物 組組合，其用于已知引起腦膜腦炎的一種或多種病原體的檢測；或者 由 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 的組 10、SEQ ID No. 21 和 SEQ ID No. 22 的組 11、 SEQ ID No. 23 和 SEQ ID No. 24 的組 12、SEQ ID No. 35 和 SEQ ID No. 36 的組 18、SEQ ID No. 39 和 SEQ ID No. 40 的組 20、SEQ ID No. 41 和 SEQ ID No. 42 的組 21 及 SEQ ID No. 43 和SEQ ID No. 44的組22組成的第四引物組組合，其用于樣本中革蘭氏陽性和/或革蘭氏 陰性細(xì)菌的檢測；或者 由 SEQ ID No. 19 和 SEQ ID No. 20 的組 10、SEQ ID No. 21 和 SEQ ID No. 22 的組 11、 SEQ ID No. 23 和 SEQ ID No. 24 的組 12、SEQ ID No. 25 和 SEQ ID No. 26 的組 13、SEQ ID No. 35 和 SEQ ID No. 36 的組 18、SEQ ID No. 39 和 SEQ ID No. 40 的組 20、SEQ ID No. 41 和 SEQ ID No. 42的組21及SEQ ID No. 43和SEQ ID No. 44的組22組成的第五引物組組合， 其用于樣本中的已知引起急性和/或慢性腦膜炎的病原體的檢測和/或區(qū)分。
20. 單獨或組合地固定有具有如SEQ ID No. 67-74、76-82和84-88所示的核苷酸序列 的靶DNA序列的基質(zhì)。
【文檔編號】C12R1/01GK104313180SQ201410521073
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2007年6月1日
【發(fā)明者】C·M·拉奧, K·S·拉奧, P·V·拉姆錢德, H·N·瑪?shù)鹿? S·沙瑪, G·薩特帕泰, V·B·拉維·庫瑪 申請人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會