專利名稱：基于16S rDNA基因種專一序列的臨床常見病原菌診斷的生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)臨床診斷用的DNA芯片，特別是基于16S rDNA種特異序列的用于臨床常見致病細(xì)菌的診斷芯片。
目前臨床上對細(xì)菌引起的疾病的診斷，主要依據(jù)患者病灶所在的部位、癥狀，以及對臨床標(biāo)本中的細(xì)菌經(jīng)分離培養(yǎng)后，通過形態(tài)、生化、免疫學(xué)等方法進(jìn)行檢驗(yàn)分析，最終確診病原菌的種類。該方法的鑒定周期較長，尤其對于生長緩慢的病原微生物(如結(jié)核分枝桿菌(Mycrobacterium tuberculosis))、以及難以培養(yǎng)的病原微生物(如厭氧微生物(anaerobic bacteria))。
16S rDNA基因編碼細(xì)菌16S核糖體RNA，長度約為1600個堿基。由于核糖體的重要生理功能使得16S rDNA序列中有較多的高度保守的片段，通過分析可以找出每種病原菌的種專一序列片段；同時，也容易設(shè)計引物對各種細(xì)菌的16S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，在DNA數(shù)據(jù)庫中，16SrDNA序列的所涵蓋的物種數(shù)量是最多的。1992年Wisotzkey等采用16SrDNA序列分析，對芽孢桿菌屬的幾種進(jìn)行了分類研究(Wisotzkey，J.D.，Jurtshuk，P.JR.，F(xiàn)ox，G.E.，et al，1992.Comparative sequence analyses on the16S rRNA(rDNA)of Bacillus acidocaldarius，Bacillus acidoterrestris，andBacillus cycloheptanicus and proposal for creation of a new genus，Alicyclobacillus gen.nov.Int.J.System.Bacteriol，Vol.42(2)263-269.)該研究以及同類的研究表明，16S rDNA基因用于細(xì)菌的定種鑒別是科學(xué)和可靠的。依據(jù)16S rDNA基因序列進(jìn)行細(xì)菌種類鑒定雖然有準(zhǔn)確性高和快速等優(yōu)點(diǎn)，但是也存在操作步驟多，涉及多種昂貴的儀器設(shè)備、難以實(shí)現(xiàn)自動化等缺點(diǎn)，尤其是測序這一環(huán)節(jié)，多數(shù)醫(yī)院無法獨(dú)立完成，而大量樣品的委托測序，由于樣品、報告交接等中間環(huán)節(jié)的增加，使診斷周期以及準(zhǔn)確性等受到較大的影響。
1997年7月Affymetrix，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.(Encinitas，CA)；Mack；David(Menlo Park，CA)；Chee；Mark S.(Palo Alto，CA)；Bemo；Anthony J.(San Jose，CA)；Stryer；Lubert(Stanford，CA)；Ghandour；Ghassan(Atherton，CA)；Wang；等人公布了US6,228,575號專利，發(fā)明了以生物芯片技術(shù)對微生物進(jìn)行定種和表型分析的方法。由于DNA芯片的高度集成性，使其具有靈敏度高、速度快和通量高等優(yōu)點(diǎn)。
因此，如果將生物芯片技術(shù)與基因型細(xì)菌鑒定技術(shù)相結(jié)合，可以形成一個準(zhǔn)確性高、高靈敏、快速和高通量同時所需的設(shè)備條件又大大簡化的技術(shù)平臺，為基因型菌種鑒定技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用鋪平了道路。
1994年12月美國AMOCO CORP公司的PELLETIER DALE A；；WEISBURG WILLIAM G等人公布了WO9428174號專利，發(fā)明了一組核酸探針可以專一的檢測軍團(tuán)菌屬的病原菌。該專利的核酸探針是根據(jù)軍團(tuán)菌(Legionella)的16S和23S核糖體RNA序列設(shè)計的。
Harmsen等人2002年報導(dǎo)，根據(jù)16S rRNA序列設(shè)計的17條16-20個堿基的寡聚核苷酸探針，可以分析人體腸道內(nèi)的六組厭氧微生物，包括Phascolarctobacterium，Veillonella，Eubacterium hallii，Lachnospira，Eubacterium cylindroides，Ruminococcus等(Harmsen，H.J.M.，Raangs，G.C.，He，T.，et al.，2002.Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection ofbacteria in Human feces.Appl.Environ.Microbiol.，Vol.68(6)2982-2990)。
以上兩個例子充分說明了基于種專一序列的DNA芯片技術(shù)用于細(xì)菌種的鑒定的可行性及優(yōu)勢。
但是，目前應(yīng)用DNA芯片技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌種的鑒定的工作仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，一般芯片的規(guī)模較小，只能用于檢測有限的幾種或特定的一類細(xì)菌。
本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明的芯片包括固相載體和點(diǎn)載在固相載體上的500-800條寡聚核苷酸，構(gòu)成中低密度DNA微矩陣，優(yōu)選的固相載體為玻片。
所述及的寡聚核苷酸為基于病原菌16S rDNA基因的種專一序列，包括130余種呼吸道、消化道及泌尿生殖道臨床常見病原菌以及臨床樣品中常見的非致病菌16S rDNA基因片段。
上述的寡聚核苷酸是通過對所有病原細(xì)菌的16S rDNA序列的比對分析而獲得的，每種病原菌獲得5-10條特有的16-20個堿基的候選短序列，經(jīng)進(jìn)一步雜交檢驗(yàn)后，最終每種病原菌確定4條特有序列，稱為“種專一序列”。
所述及的病原菌包括132種常見病原細(xì)菌，分別為46種消化道病原細(xì)菌，66種呼吸道病原細(xì)菌，20種泌尿生殖道病原細(xì)菌。
所述及的腸道病原細(xì)菌(gastrointestinal infectious agents)包括副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphi、薛氏沙門氏菌SalmonellaSchottmuelleri、斯坦利沙門氏菌Salmonella Stanley、德爾比沙門氏菌Salmonella Derby、鼠傷寒沙門氏菌Salmonella Typhimurium、海德爾堡沙門氏菌Salmonella Heidelbeg、豬霍亂沙門氏菌SalmonellaHirschfeldii、豬霍亂沙門氏菌Salmonella Choleraesuis、昆氏沙門氏菌Salmonella kunzondolf、湯普森沙門氏菌Salmonella Thompson、波茨坦沙門氏菌Salmonella Potsdam、紐波特沙門氏菌Salmonella Newport、病牛沙門氏菌Salmonella bovis-morbificans、仙臺沙門氏菌Salmonellasandai、傷寒沙門氏菌Salmonella typhi、腸炎沙門氏菌Salmonellaenteritidis、都柏林沙門氏菌Salmonella Dublin、雞沙門氏菌Salmonellagallinarum、鴨沙門氏菌Salmonella anatum、火雞沙門氏菌Salmonellameleagridi s、紐因吞沙門氏菌Salmonella Newington、森夫頓堡沙門氏菌Salmonella senftenberg、阿柏丁沙門氏菌Salmonella Aberdeen、痢疾志賀氏菌Shigella dysenteriae、弗氏志賀氏菌Shigella flexneri、鮑氏志賀氏菌Shigella boydii、索氏志賀氏菌Shigella sonnei、產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌ETECenterotoxigenic E.Coli、侵襲腸粘膜的大腸桿菌EIECenteroinvasive E.Coli、致腸病的大腸桿菌EPECenteropathogenic E.Coli、腸出血性大腸桿菌EHECenterohemorrhagic E.Coli、腸聚集性大腸桿菌EaggECenteroaggregative E.Coli、霍亂弧菌O1 Vibrio choleraeO1、霍亂弧菌O139 Vibrio cholerae O139、副溶血弧菌Vibrioparahemolyticus、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌Yersinia enterocolitica、空腸彎曲桿菌Campylobacter jejuni、氣單胞菌Aeromonas、鄰單胞菌plesiomonas、產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens、肉毒梭菌Clostridiumbotulinum、艱難梭菌Clostridium difficile、蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌Listeriamonocytogenes和擬桿菌屬Bacteroides；所述及的呼吸道病原菌包括結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis、白喉棒桿菌Corynebacterium diphtheriae、博德特氏菌Bordetella、葡萄球菌Staphylococcus、鏈球菌Streptococcus、肺炎鏈球菌Streptococcuspneumonia、腦膜炎奈瑟氏球菌Neisseria meningitids、粘膜炎布蘭漢氏球菌B.Catarrhalis、大腸桿菌E.Coli、銅綠假單細(xì)胞菌Pseudomonasaeruginosa、流感嗜血菌Haemophilus influenzae、侵肺軍團(tuán)菌Legionellapneumop、鼠疫耶爾森氏菌Yersinia pestis、枝原體Mycoplasma、布魯氏菌Brucella、擬桿Bacteroid、普雷沃氏菌Prevotella、卟啉單胞菌Porphyromonas、梭桿菌Fusobacterium、韋榮氏球菌Veillon、消化鏈球菌peptostreptococcus、炭疽芽孢桿菌Bacillu anthracis、弗朗西絲氏菌Francisella、變形菌Proteus、伯氏考克斯氏體C.Bumetii、砂眼衣原體Chlamydia trachomatis、肺炎衣原體Chlamydia pneumoniae、鸚鵡熱衣原體Chlamydia psittaci、贅生物隱球菌Cryptococcus neoformans、白色念珠菌Candid、莢膜組織胞漿菌Histoplasma capsulatum、曲霉菌Aspergillus和突網(wǎng)脊肺囊蟲病Pneumocystosis carinii；所述及的尿道病原菌包括埃希氏菌Escherichia、腸桿菌Enterobacter、克雷伯氏菌Klebsiella、檸檬酸桿菌Citrobacter、沙雷氏菌Serratia、假單胞菌Pseudomonas、變形菌Proteus、嗜血菌Haemophilus、利斯特氏菌Listeria、葡萄球菌StaphyloCOccus、鏈球菌Streptococcus、淋病奈瑟氏球菌Neisseria gonorrhoeae、蒼白密螺旋體Treponema pallidum、砂眼衣原體Chlamydia trachomatis、肉芽腫鞘桿菌Calymmatobacterium granulomatis、解脲脲枝原體Ureaplasma urealyticum、擬桿菌Bacteroides、消化球菌Peptococcus和消化鏈球菌Peptostrptococcus、白色念珠菌Candidaalbicans。
本發(fā)明的基因芯片可用于呼吸道、消化道和泌尿生殖道臨床常見的130余中病原菌引起的傳染性疾病的診斷。
本發(fā)明的基因芯片在臨床應(yīng)用時應(yīng)當(dāng)對臨床樣品進(jìn)行預(yù)處理。
由于本發(fā)明的基因芯片點(diǎn)載了基于病原菌16S rDNA基因種專一序列，為一種規(guī)模大、集成度高、涵蓋面廣的臨床診斷芯片，可以檢測呼吸道、消化道和泌尿生殖道臨床常見的130余中病原菌。具有操作簡單、診斷周期短，結(jié)果可靠、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，易于在臨床中推廣應(yīng)用。
圖2為芯片點(diǎn)樣區(qū)構(gòu)成圖。
圖3為芯片雜交后的局部信號圖。
由圖2可見，在固相玻片載體的點(diǎn)樣區(qū)2分成三個區(qū)，分別為呼吸道病原菌中專一序列區(qū)201，消化道病原菌中專一序列區(qū)202，泌尿生殖道病原菌的種專一序列區(qū)203。每區(qū)內(nèi)病原菌的種專一序列依次排列。
實(shí)施例1臨床樣品的預(yù)處理方法從采集的臨床樣品中，取樣0.5毫升，加入1毫升樣品預(yù)處理緩沖液，混勻，37℃保溫10分鐘。冰上冷卻5分鐘，4℃，12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；取上清，加入預(yù)冷的5M NaAc(pH4.8)100微升，混勻；加入-20℃預(yù)冷的無水乙醇2.75毫升，混勻。
樣品與處理緩沖液成分
100mM Tri(pH8.0)，100mM EDTA(pH8.0)，100mM NaCl，1％PVP，2％SDS。
-70℃放置30分鐘。4℃、12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清。70％乙醇洗滌，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清，室溫干燥，最后向總DNA中加入20微升10mM的Tris-EDTA(pH8.0)溶解后，4℃保存。然后采用本領(lǐng)域公知的方法經(jīng)PCR擴(kuò)增并同時完成Cy-3或Cy-5熒光標(biāo)記或Biotin標(biāo)記后，與點(diǎn)載在玻片上的基因進(jìn)行雜交，結(jié)果如圖3所示，在圖3中，箭頭示兩個信號點(diǎn)，上面的信號為陽性信號，下面的是陰性信號。
由于種專一序列在芯片上排列規(guī)律決定每種病原菌有其獨(dú)特的雜交圖譜，臨床診斷時可根據(jù)特定區(qū)域內(nèi)的特定雜交譜確診致病菌的種類。
權(quán)利要求
1.一種基于16S rDNA基因種專一序列的病原菌診斷的生物芯片，包括固相載體，其特征在于包括點(diǎn)載在固相載體上的500-800條寡聚核苷酸片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物芯片，其特征在于所述及的寡聚核苷酸片段為基于病原菌的16S rDNA基因種專一序列，包括呼吸道、消化道及泌尿生殖道臨床常見病原菌以及臨床樣品中常見的非致病菌16SrDNA基因片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物芯片，其特征在于所述及的的寡聚核苷酸片段是通過對所有病原菌的16S rDNA基因序列的比對分析而獲得的，每種病原菌獲得5-10條該細(xì)菌特有的16-20個堿基的候選短序列，經(jīng)進(jìn)一步雜交檢驗(yàn)后，最終每種病原菌確定4條特有序列，稱為“種專一序列”。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物芯片，其特征在于固相載體的點(diǎn)樣品區(qū)內(nèi)分成呼吸道病原菌中專一序列區(qū)(201)，消化道病原菌中專一序列區(qū)(202)，泌尿生殖道病原菌的種專一序列區(qū)(203)，區(qū)內(nèi)病原菌的種專一序列依次排列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的生物芯片，其特征在于所述及的病原菌包括130種常見病原細(xì)菌，分別為46種消化道病原細(xì)菌，66種呼吸道病原細(xì)菌，20種泌尿生殖道病原細(xì)菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物芯片，其特征在于所述及的腸道病原細(xì)菌包括副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphi、薛氏沙門氏菌Salmonella Schottmuelleri、斯坦利沙門氏菌Salmonella Stanley、德爾比沙門氏菌Salmonella Derby、鼠傷寒沙門氏菌Salmonella Typhimurium、海德爾堡沙門氏菌Salmonella Heidelbeg、豬霍亂沙門氏菌SalmonellaHirschfeldii、豬霍亂沙門氏菌Salmonella Choleraesuis、昆氏沙門氏菌Salmonella kunzondolf、湯普森沙門氏菌Salmonella Thompson、波茨坦沙門氏菌Salmonella Potsdam、紐波特沙門氏菌Salmonella Newport、病牛沙門氏菌Salmonella bovis-morbificans、仙臺沙門氏菌Salmonellasandai、傷寒沙門氏菌Salmonella typhi、腸炎沙門氏菌Salmonellaenteritidis、都柏林沙門氏菌Salmonella Dublin、雞沙門氏菌Salmonellagallinarum、鴨沙門氏菌Salmonella anatum、火雞沙門氏菌Salmonellameleagridi s、紐因吞沙門氏菌Salmonella Newington、森夫頓堡沙門氏菌Salmonella senftenberg、阿柏丁沙門氏菌Salmonella Aberdeen、痢疾志賀氏菌Shigella dysenteriae、弗氏志賀氏菌Shigella flexneri、鮑氏志賀氏菌Shigella boydii、索氏志賀氏菌Shigella sonnei、產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌ETECenterotoxigenic E.Coli、侵襲腸粘膜的大腸桿菌EIECenteroinvasive E.Coli、致腸病的大腸桿菌EPECenteropathogenic E.Coli、腸出血性大腸桿菌EHECenterohemorrhagic E.Coli、腸聚集性大腸桿菌EaggECenteroaggregative E.Coli、霍亂弧菌O1 Vibrio choleraeO1、霍亂弧菌O139 Vibrio cholerae O139、副溶血弧菌Vibrioparahemolyticus、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌Yersinia enterocolitica、空腸彎曲桿菌Campylobacter jejuni、氣單胞菌屬Aeromonas、鄰單胞菌屬plesiomonas、產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens、肉毒梭菌Clostridiumbotulinum、艱難梭菌Clostridium difficile、蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌Listeriamonocytogenes和擬桿菌Bacteroides；
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物芯片，其特征在于所述及的呼吸道病原菌包括結(jié)合分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis、白喉棒桿菌Corynebacterium diphtheriae、博德特氏菌Bordetella、葡萄球菌Staphylococcus(32 species)、鏈球菌屬Streptococcus、肺炎鏈球菌Streptococcus pneumonia、腦膜炎奈瑟氏球菌Neisseria meningitids、粘膜炎布蘭漢氏球菌B.Catarrhalis、大腸桿菌E.Coli、銅綠假單細(xì)胞菌Pseudomonas aeruginosa、流感嗜血菌Haemophilus influenzae、侵肺軍團(tuán)菌Legionella pneumop、鼠疫耶爾森氏菌Yersinia pestis、枝原體Mycoplasma、布魯氏菌brucella、擬桿菌Bacteroid、普雷沃氏菌Prevotella、卟啉單胞菌Porphyromonas、梭桿菌Fusobacterium、韋榮氏球菌Veillon、消化鏈球菌peptostreptococcus、炭疽芽孢桿菌Bacilluanthracis、弗朗西絲氏菌Francisella、變形菌屬Proteus、伯氏考克斯氏體C.Bumetii、砂眼衣原體Chlamydia trachomatis、肺炎衣原體Chlamydiapneumoniae、鸚鵡熱衣原體Chlamydia psittaci、贅生物隱球菌Cryptococcusneoformans、白色念珠菌Candid、莢膜組織胞漿菌Histoplasmacapsulatum、曲霉菌Aspergillus和突網(wǎng)脊肺囊蟲病Pneumocystosiscarinii。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物芯片，其特征在于所述及的尿道病原菌包括埃希氏菌Escherichia、腸桿菌Enterobacter、克雷伯氏菌Klebsiella、檸檬酸桿菌Citrobacter、沙雷氏菌Serratia、假單胞菌Pseudomonas、變形菌Proteus、嗜血菌Haemophilus、利斯特氏菌Listeria、葡萄球菌StaphyloCOccus、鏈球菌Streptococcus、淋病奈瑟氏球菌Neisseria gonorrhoeae、蒼白密螺旋體Treponema pallidum、砂眼衣原體Chlamydia trachomatis、肉芽腫鞘桿菌Calymmatobacterium granulomatis、解脲脲枝原體Ureaplasma urealyticum、擬桿菌Bacteroides、消化球菌Peptococcus和消化鏈球菌Peptostrptococcus、白色念珠菌Candidaalbicans。
9.根據(jù)權(quán)利要求4～8任一項所述的生物芯片的應(yīng)用，其特征在于用于呼吸道、消化道和泌尿生殖道臨床常見的病原菌的診斷。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物芯片的應(yīng)用，其特征在于基因芯片在臨床應(yīng)用時對臨床樣品進(jìn)行預(yù)處理。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的生物芯片的應(yīng)用，其特征在于，臨床樣品的預(yù)處理包括如下步驟在臨床樣品中樣品預(yù)處理緩沖液，使其pH值為7.5-8.5，37℃保溫10分鐘，冷卻至4℃，離心分離；取上清，加入預(yù)冷的5M NaAc(pH4.8)100微升，混勻；加入-20℃乙醇2.75毫升，混勻，-70℃放置30分鐘，4℃、離心分離，棄上清，70％乙醇洗滌，離心分離，棄上清，室溫干燥，最后向總DNA中加入20微升10毫摩爾的Tris-EDTA(pH8.0)緩沖液，待DNA溶解后，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于16S rDNA基因種專一序列的病原菌診斷的生物芯片。包括固相載體和點(diǎn)載在固相載體上的500－800條寡聚核苷酸。所述及的寡聚核苷酸為基于病原菌的16S rDNA基因種專一序列，包括130種呼吸道、消化道及泌尿生殖道臨床常見病原菌以及臨床樣品中常見的非致病菌16S rDNA基因片段?？捎糜诤粑馈⑾篮兔谀蛏车?30余種臨床常見原菌引起的傳染性疾病的診斷。本發(fā)明的基因芯片為一種規(guī)模大、集成度高、涵蓋面廣的臨床診斷芯片。具有診斷周期短、操作簡單、結(jié)果可靠、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，易于在臨床中推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/04GK1397649SQ0213656
公開日2003年2月19日 申請日期2002年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月19日
發(fā)明者馬偉, 郭曉奎, 金維榮, 趙國屏 申請人:上海華冠生物芯片有限公司