本發(fā)明屬于食品科學領域，特別涉及一種用于食用菌保鮮的酚酸改性殼聚糖涂膜液的制備方法。

背景技術：

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾丁質經(jīng)過脫乙酰作用所得。殼聚糖無毒無污染易降解，并具有良好的吸附性、成膜性以及生物相容性，在食品、生物、農業(yè)等領域都有應用。殼聚糖作為一種天然多糖，其來源豐富，無毒、無污染，可在食品表面形成半透膜，能有效地抑制病菌入侵和生長，越來越受到人們的關注。但是，天然殼聚糖的水溶性較差且抗氧化活性較低，極大地限制了其應用范圍。因此，需要對殼聚糖進行改性，合成具有強抗氧化活性的殼聚糖衍生物。由于殼聚糖分子上存在大量活潑的氨基和羥基，為其化學改性提供了可能。目前為止研究較多的殼聚糖衍生物有醚化、含氧無機酸酯化、季銨鹽、n-?；⒔饘倥浜衔锏?，這些衍生物與殼聚糖相比，溶解性和抗氧化性能都得到了一定程度的改善。然而，上述殼聚糖衍生物的抗氧化活性并不高，若將該類衍生物作為抗氧化劑用于食品工程領域，難以產生良好的經(jīng)濟效益。

相比于傳統(tǒng)化學改性方法，采用edc介導的殼聚糖改性方法是將原兒茶酸接枝到殼聚糖分子的支鏈中，所得的殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物具有較高的抗氧化活性。現(xiàn)有的殼聚糖-酚酸接枝共聚物的合成方法主要采用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(edac)為交聯(lián)劑，但該方法所得的產物接枝率低，不利于大規(guī)模生產應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于食用菌保鮮的酚酸改性殼聚糖涂膜液的制備方法，將具有強抗氧化活性的酚酸改性殼聚糖的制備方法，并將合成的殼聚糖衍生物用于食用菌涂膜保鮮，以解決現(xiàn)有的殼聚糖衍生物抗氧化活性較低，不利于大規(guī)模生產應用的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種用于食用菌保鮮的酚酸改性殼聚糖涂膜液的制備方法，其特征在于：以殼聚糖和原兒茶酸分子作為反應底物，在冰水浴環(huán)境中，采用edc介導法合成殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物，并將接枝共聚物用于食用菌的涂膜保鮮。

具體步驟如下：

(1)將殼聚糖溶于乙酸溶液，磁力攪拌直至完全溶解，同時將原兒茶酸溶于乙醇；

(2)將edc加入到含有mes緩沖液的反應器中；

(3)將步驟(1)所得的原兒茶酸溶液加入反應器中，立即加入n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)并調節(jié)溶液ph值，隨后置于冰水浴中反應，磁力攪拌；

(4)將步驟(1)所得的殼聚糖溶液加入反應器中，反應；

(5)將步驟(4)所得的反應液裝入透析袋中，先用自來水透析，再用去離子水透析；

(6)將步驟(5)所得的透析液冷凍干燥后即得殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物；

(7)將步驟(6)所得的接枝共聚物配成水溶液，涂抹于食用菌表面。

優(yōu)選的，步驟(3)中，溶液ph值為5.5，反應時間為1h。

優(yōu)選的，步驟(4)中，在20℃下反應12h。

優(yōu)選的，所述殼聚糖的濃度為5g/l，原兒茶酸的濃度為11.6g/l，edc的濃度為43g/l，nhs的濃度為8.6g/l。

優(yōu)選的，步驟(7)中，接枝共聚物涂膜液的濃度為10g/l。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述食用菌選用杏鮑菇。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明合成所得的殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物的接枝率和體外抗氧化活性均較高。本項發(fā)明可以解決殼聚糖在化學修飾過程中接枝率低、產品有污染等問題，可顯著改善殼聚糖的水溶性和抗氧化活性，并擴大其應用范圍。該方法投入少，適合于大規(guī)模生產使用，具有極好的應用前景。制備的殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物的接枝率為279.6mg/g，該接枝共聚物對dpph自由基具有較高的清除活性，清除作用呈現(xiàn)劑量依賴關系，當接枝共聚物的濃度為5mg/ml時，最高清除率為92.52％。

附圖說明

圖1是殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物的核磁共振氫譜圖。

圖2是殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物對dpph自由基的清除活性。

圖3是殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物溶液對杏鮑菇貯藏過程中丙二醛含量的影響。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物的合成過程：

(1)稱取0.5g殼聚糖溶于25ml乙酸溶液，磁力攪拌直至完全溶解，同時稱取1.16g原兒茶酸溶于3ml無水乙醇中；

(2)稱取4.3gedc溶于20mlmes緩沖液中，震蕩使edc完全溶解，；

(3)將完全溶解的原兒茶酸溶液加入反應器中，立即加入0.86gnhs并調節(jié)溶液ph值至5.5，隨后置于冰水浴中，磁力攪拌反應1h；

(4)將完全溶解的殼聚糖溶液加入反應器中，20℃下反應12h；

(5)將反應液裝入透析袋中，先用自來水透析48h，再用去離子水透析24h；

(6)將透析液冷凍干燥后即得殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物，為紫紅色樣品，其接枝率為279.6mg/g；

實施例2

殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物的結構和體外抗氧化活性測定：

(1)分別精確稱取5mg的殼聚糖與殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物樣品，溶于0.5ml重水中，25℃下測定其核磁共振氫譜。

(2)殼聚糖和殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物的¹hnmr譜如圖1所示，殼聚糖在δ＝1.7ppm處的峰對應于乙酰氨基葡萄糖殘基的甲基質子，在δ＝3.3ppm處的峰對應于吡喃糖環(huán)c-3上的質子；在δ＝3.4ppm處的峰對應于吡喃糖環(huán)c-4上的質子；在δ＝3.7ppm處的峰對應于吡喃糖環(huán)c-5上的質子；在δ＝4.3ppm處的峰對應于吡喃糖環(huán)c-6上的質子；在δ＝2.8ppm處的微弱峰對應于c-2上的質子；在δ＝4.7ppm處的峰對應于c-1上的質子。而在殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物中，兩個新的峰分別出現(xiàn)在δ＝6.68ppm和δ＝7.22ppm處，對應于原兒茶酸殘基上的質子。這個結果進一步確認殼聚糖與原兒茶酸的成功接枝。

(3)測定殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物對dpph自由基的清除活性，具體方法如下：稱取接枝共聚物干燥粉末溶于蒸餾水中，配制成不同濃度的樣品溶液(1-5mg/ml)，取2mldpph·乙醇溶液與2ml樣品溶液混勻后，室溫下放置30min，用無水乙醇調零，在517nm下測吸光值，記作a1。取2mldpph·乙醇溶液與2ml無水乙醇混勻后，室溫下放置30min，用無水乙醇調零，在517nm下測吸光值，記作a0。取2ml無水乙醇溶液與2ml樣品溶液混勻后，室溫下放置30min，用無水乙醇調零，在517nm下測吸光值，記作a2。按照下式計算不同濃度受試物對dpph自由基的清除率。

清除率(％)＝[a0–(a1–a2)]/a0×100

(4)殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物的dpph自由基清除活性的結果如圖2所示。殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物的dpph自由基清除活性隨著樣品濃度的增加而增大，當樣品濃度為5mg/ml時，接枝物的dpph自由基清除活性達92.52％，而相同濃度殼聚糖的dpph 自由基清除活性僅為10.06％，結果表明，通過edc介導的接枝共聚物反應合成殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物可顯著增強天然殼聚糖的體外抗氧化活性。

實施例3

殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物對食用菌(杏鮑菇)的涂膜保鮮效果。

(1)食用菌采收當天置于5—8℃冷鏈運輸裝置中，并根部帶培養(yǎng)基，運到實驗室后立即處理。棄去根部培養(yǎng)基，選取菇體完整、頗色潔白、無病蟲害、無機械傷、子實體大小基本一致的食用菌。

(2)將挑選45個食用菌隨機分成3部分，即3種處理：分別用10g/l的殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物涂膜處理；用10g/l的殼聚糖涂膜處理；以及不作處理的空白組。使用大小為27cm×28cm的聚乙烯薄膜袋封口袋貯藏在濕度95％、4℃條件下貯藏，每個處理分5個小組(袋)，每3天取樣一次，每次隨機取樣3個食用菌，切塊后用液氮處理，-80℃下保存。

(3)取1.0g食用菌冷凍組織測定丙二醛含量。用5ml5％(m/v)的三氯乙酸溶液冰浴研磨，然后離心20min(10000×g，4℃)。取1ml上清液與1ml10％三氯乙酸溶液(含0.67％硫代巴比妥酸)混合，并將混合物在沸水浴加熱20min(從溶液出現(xiàn)氣泡開始計時)，冰浴冷卻，離心10min(10000×g，4℃)。取上清液分別測定450cm、532nm、600nm處的吸光值，并按下式計算mda含量：

mda含量(umol/g)＝{[6.45(od532－od600)－0.56od450]×v×(a/a)}/m

式中：a為反應液總量(ml)；v為提取液總量(ml)；a為測定提取液量(ml)；m為食用菌樣品質量(g)。

(4)丙二醛是膜脂質過氧化作用的最終產物，也是評價食用菌膜脂質過氧化程度的重要指標之一。如圖3所示，隨著貯藏時間的延長，食用菌的mda含量呈逐漸增加的趨勢，貯藏至15d時，空白對照組食用菌的mda含量達1.21umol/g，顯著高于殼聚糖處理組(1.04umol/g)和接枝共聚物處理組(0.76umol/g)。在整個貯藏過程中，接枝共聚物處理組食用菌的mda含量始終低于殼聚糖處理組和空白對照組，說明殼聚糖-原兒茶酸接枝共聚物可顯著降低食用菌的脂質過氧化程度，從而延緩食用菌的衰老。