本發(fā)明涉及20(s)-原人參二醇的制備方法，具體涉及通過堿解制備20(s)-原人參二醇的方法。
背景技術：
：人參屬植物和葫蘆科植物絞股藍中存在著大量瑪烷型的四環(huán)三萜類皂苷，目前認為是人參的主要活性成分之一。按皂苷元的不同，可將此型人參皂苷分為兩類，即皂苷元為20(s)-原人參二醇的，稱為20(s)-原人參二醇型皂苷，有rb1、rd等；皂苷元為原人參三醇的，稱為原人參三醇型皂苷，有re、rg1等。人參皂苷利用常規(guī)酸水解條件，無法得到真正皂苷元20(s)-原人參二醇和原人參三醇，而是容易發(fā)生側鏈環(huán)合，生成人參二醇、人參三醇。目前研究表明20(s)-原人參二醇(即ppd)具有明顯的抗腫瘤作用，例如對lewis肺癌的抑制作用、抑制腫瘤血管生成作用、抑制白血病(thp-1)細胞系繁殖并誘發(fā)其凋亡、誘發(fā)nih3t3細胞凋亡、抑制骨髓瘤細胞生長、輔助放化療聯(lián)合抗癌、對結腸癌caco-2細胞抑制作用、與人參皂苷聯(lián)合使用抗癌、對sub-g1細胞的抑制、誘發(fā)hepg2細胞凋亡等。所以研究20(s)-原人參二醇的制備方法很有意義。目前制備20(s)-原人參二醇的方法有堿水解法、酸水解法、酶解法等，但都存在著一些問題。專利(cn1417224a)提出一種人參皂苷酸水解制備20(s)-原人參二醇的方法，通過加入保護劑、惰性氣體保護等措施，解決了人參皂苷接酸水解制備20(s)-原人參二醇中不穩(wěn)定易破壞、易環(huán)化問題。但該方法反應時間較長，一般7天左右；對反應原料純度要求高，人參皂苷純度必須＞90％，且不能含有三醇型皂苷；而且在酸性環(huán)境下多制得20(r)-原人參二醇，而非20(s)型化合物。專利申請(cn1293198a)是將人參皂苷rh1、rh2、rb3等皂苷的單體，或它們的混合物溶于堿金屬氫氧化物與高沸點脂肪醇類有機物組成的溶液中，在常壓下加熱進行水解，獲得一系列稀有皂苷。該反應主要針對人參皂苷單體或混 合物的反應，對反應原料要求高。專利申請(cn1958595a)采用氧氣和過氧化物協(xié)同作用，通過在醇中原位生成的強堿醇鈉堿解人參屬植物的總皂苷提取物和葫蘆科植物的絞股藍總皂苷提取物制備20(s)-原人參二醇和原人參三醇。該專利在有機溶劑中直接加入金屬鈉，金屬鈉性質活潑，平時保存危險系數(shù)高、加入有機溶劑反應劇烈，而且該專利一般反應24小時左右，時間較長。專利申請(cn1569882a)以人參屬植物或葉的總皂苷提取物，絞股藍屬植物的絞股藍提取物為原料，在有機溶劑中進行氧化堿解反應，經柱層析純化得到20(s)-原人參二醇及原人參三醇。該方法使用醇鈉進行堿解，醇鈉性質活潑，不易保存；在反應過程中需持續(xù)通入氧氣或壓縮空氣；反應時間較長，一般需60小時左右。專利申請(cn102311474a)使用含人參總皂苷或三七總皂苷的提取物為原料，在無溶劑的條件下，進行堿解反應。該方法反應原料間混合不均勻，反應效率低。專利(cn100390192c)提出一種利用惰性氣體保護、游離基誘發(fā)劑條件下由天然人參皂苷制備單體低極性人參皂苷的方法。該方法要求在反應過程中加入游離基誘發(fā)劑。技術實現(xiàn)要素：針對目前20(s)-原人參二醇制備方法所存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種成本低、操作簡單、對設備要求低、反應效率高、耗時短、產物純度高的20(s)-原人參二醇的制備方法。本發(fā)明具體公開了一種20(s)-原人參二醇的制備方法，包括如下步驟：(1)取含有人參二醇型皂苷的提取物，加入濃度為1-10mol/l，優(yōu)選3-8mol/l，更優(yōu)選4-6mol/l，最優(yōu)選約5mol/l的堿溶液，在惰性氣體保護下，于100-300℃，優(yōu)選150-280℃，更優(yōu)選200-250℃，最優(yōu)選約230℃反應0.5-10小時，優(yōu)選1-8小時，更優(yōu)選1.5-5小時，最優(yōu)選約2小時，其中，每g提取物加入1-20ml，優(yōu)選5-15ml，更優(yōu)選9-10ml，最優(yōu)選約9.5ml的堿溶液；(2)步驟(1)完成后，反應液冷卻至室溫，回收溶劑，將固形物水洗至 ph值為5-8.5，優(yōu)選7-8，更優(yōu)選約7.5；(3)步驟(2)完成后，對固形物進行分離純化，獲得20(s)-原人參二醇。在本發(fā)明中，步驟(1)中所使用的含有人參二醇型皂苷的提取物，包括但不限于西洋參根提取物、西洋參莖葉提取物、人參根提取物、人參莖葉提取物、三七提取物、絞股藍提取物及其任意混合物。所使用的堿，包括但不限于氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋇、氫氧化鈣、甲醇鈉、乙醇鈉及其任意混合物。所使用的溶劑包括但不限于水、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、戊醇、二甲基亞砜、二氧六環(huán)、乙二醇、丙二醇、甘油、丁二醇、聚乙二醇及其任意混合物。所使用的惰性氣體包括但不限于氮氣、二氧化碳、氦氣、氬氣、氖氣及其任意混合物。在優(yōu)選的實施方案中，步驟(1)的反應在恒溫下進行。在本發(fā)明中，步驟(2)中回收溶劑可以為常壓回收或減壓回收。在本發(fā)明中，步驟(3)中分離純化為柱層析和/或重結晶。柱層析所使用的填料，包括但不限于硅膠、反相硅膠、大孔樹脂、聚酰胺、硅藻土。重結晶所使用的溶劑，包括但不限于環(huán)己烷、正己烷、二氯甲烷、苯、甲苯、二甲苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、甲酸乙酯、甲醇、乙醇及其任意混合物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，成本低、操作簡單、對設備要求低、反應效率高(轉化率＞90％)、耗時短(不超過10小時，在最優(yōu)選的技術方案中僅約2小時)、產物純度高(產物純度＞90％)，適于工業(yè)化大生產。具體實施方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步詳細描述，不應被理解為對本發(fā)明的限制。實施例1取西洋參莖葉皂苷提取物30g，平均分成三份，每份10g。對第一份使用方法一進行制備：加入95ml含有5mol/l氫氧化鈉的甘油溶液，在氮氣保護條件下，在230℃反應2小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，減壓回收溶劑，將固形物水洗至中性，將固形物減壓干燥，粉碎，稱重；對第二份使用方法二進行制備：加入95ml含有5mol/l氫氧化鈉的甘油溶液，在230℃反應2小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，減壓回收溶劑，將固形物水洗至中性，將固形物 減壓干燥，粉碎，稱重；對第三份使用方法三進行制備：加入95ml含有5mol/l氫氧化鈉的甘油溶液，加入過氧化苯甲酰0.1g，在氮氣保護條件下，在230℃反應2小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，減壓回收溶劑，將固形物水洗至中性，將固形物減壓干燥，粉碎，稱重。分別精密稱取以上三個方法制備得到的固形物粉末各100mg，分別加入10ml甲醇超聲溶解，過濾，高效液相測定固形物中含有的20(s)-原人參二醇含量，計算粗產物產率和轉化率，結果見下表。產率(％)轉化率(％)方法一5.8493.4方法二4.7676.2方法三5.1682.5產率(％)＝【20(s)-原人參二醇重量(g)】÷【西洋參莖葉皂苷提取物重量(g)】×100％轉化率＝【20(s)-原人參二醇重量(g)】÷【10g西洋參莖葉皂苷提取物中人參二醇重量(g)】×100％曾有文獻采用hplc法測量樣品中二醇型皂苷含量，從而折算樣品理論上生成原人參二醇最大量的方法，但該方法僅測定樣品中幾個含量較高的二醇型皂苷，忽略了許多含量較少的其他二醇型皂苷，造成得到的原人參二醇理論生成量較低，進而轉化率偏高。為了解決這個問題，本研究采用一種新的方法計算樣品中原人參二醇理論生成量的方法。西洋參莖葉皂苷提取物中二醇型皂苷經強酸水解后可全部轉化為人參二醇(即20(s)-原人參二醇的環(huán)合形式，同分異構體)。本發(fā)明采用測定西洋參莖葉皂苷提取物強酸水解產物中人參二醇的含量作為該提取物理論上20(s)-原人參二醇的最大生成量。水解條件：精密稱取0.5g西洋參莖葉皂苷提取物，加入20ml10％的硫酸溶液，加熱回流4小時，放冷后，加入20ml飽和氫氧化鈉溶液調ph值為堿性，氯仿萃取3次，每次20ml。合并氯仿液，用水洗2次，每次20ml，回收氯仿至干，用10ml甲醇溶解。用hplc測定人參二醇的含量。從上述實驗結果可見，本發(fā)明制備方法的產率明顯高于沒有用惰性氣體保護的方法的產率，甚至高于加入游離基誘發(fā)劑的方法的產率，故本發(fā)明的方法操作簡單，而且反應效率高。而且本發(fā)明中采用測定轉化率的方法較傳統(tǒng)方法更為合理。將方法一得到的粗品用乙醇溶解，固形物硅膠拌樣后，20倍柱層析純化，用石油醚：乙酸乙酯(1:1)洗脫，收集20(s)-原人參二醇。將粗品20(s)-原人參二醇用熱乙酸乙酯重結晶，抽濾，以乙酸乙酯洗滌，烘干得20(s)-原人參二醇白色針狀晶體0.53g。hplc歸一化法檢測產物純度94.8％。實施例2取西洋參根皂苷提取物30g，平均分成三份，每份10g。對第一份使用方法一進行制備：加入100ml含有4mol/l氫氧化鈉的甘油溶液，在氮氣保護條件下，在200℃反應8小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，減壓回收溶劑，將固形物水洗至中性，將固形物減壓干燥，粉碎，稱重；對第二份使用方法二進行制備：加入100ml含有4mol/l氫氧化鈉的甘油溶液，在200℃反應8小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，減壓回收溶劑，將固形物水洗至中性，將固形物減壓干燥，粉碎，稱重；對第三份使用方法三進行制備：加入100ml含有4mol/l氫氧化鈉的甘油溶液，加入過氧化苯甲酰0.1g，在氮氣保護條件下，在200℃反應8小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，減壓回收溶劑，將固形物水洗至中性，將固形物減壓干燥，粉碎，稱重。分別精密稱取以上三個方法制備得到的固形物粉末各100mg，分別加入10ml甲醇超聲溶解，過濾，高效液相測定固形物中含有的20(s)-原人參二醇含量，計算粗產物產率和轉化率，結果見下表。產率(％)轉化率(％)方法一9.5490.4方法二7.4170.2方法三8.5080.5上述實驗結果可見，本發(fā)明制備方法的產率和轉化率明顯高于其他兩種方法的產率和轉化率。將方法一得到的粗品用乙醇溶解，固形物硅膠拌樣后，20倍柱層析純化，用石油醚：乙酸乙酯(1:1)洗脫，收集20(s)-原人參二醇。將粗品20(s)-原人參二醇用熱乙酸乙酯重結晶，抽濾，以乙酸乙酯洗滌，烘干得20(s)-原人參二醇白色針狀晶體0.92g。hplc歸一化法檢測產物純度94.8％。實施例3取人參總皂苷提取物30g，平均分成三份，每份10g。對第一份使用方法一進行制備：加入90ml含有6mol/l氫氧化鈉的甘油溶液，在氮氣保護條件下，在250℃反應2小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，減壓回收溶劑，將固形物水洗至中性，將固形物減壓干燥，粉碎，稱重；對第二份使用方法二進行制備：加入90ml含有6mol/l氫氧化鈉的甘油溶液，在250℃反應2小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，減壓回收溶劑，將固形物水洗至中性，將固形物減壓干燥，粉碎，稱重；對第三份使用方法三進行制備：加入90ml含有6mol/l氫氧化鈉的甘油溶液，加入過氧化苯甲酰0.1g，在氮氣保護條件下，在250℃反應2小時，反應完成后，反應液冷卻至室溫，減壓回收溶劑，將固形物水洗至中性，將固形物減壓干燥，粉碎，稱重。分別精密稱取以上三個方法制備得到的固形物粉末各100mg，加入10ml甲醇超聲溶解，過濾，高效液相測定固形物中含有的20(s)-原人參二醇含量，計算粗產物產率和轉化率，結果見下表。產率(％)轉化率(％)方法一12.8396.1方法二9.8974.1方法三11.4485.7上述實驗結果可見，本發(fā)明制備方法的產率和轉化率明顯高于其他兩種方法的產率和轉化率。將方法一得到的粗品用乙醇溶解，上大孔樹脂柱，用95％乙醇洗脫，收集20(s)-原人參二醇。將粗品20(s)-原人參二醇用熱丙酮重結晶，抽濾，以乙酸乙酯洗滌，烘干得20(s)-原人參二醇白色針狀晶體1.15g。hplc歸一化法檢測產物純度93.9％。實施例4取三七總皂苷100g，放入反應釜，加入8mol/l的氫氧化鈉甘油溶液1000ml，于240℃恒溫反應1.5小時。待釜內溫度降至室溫后，減壓回收甘油，固形物用水洗至ph7.5。固形物硅膠拌樣后，20倍柱層析純化，用石油醚：乙酸乙酯(1:1)洗脫，收集20(s)-原人參二醇。將粗品20(s)-原人參二醇用熱乙酸乙酯重結晶，抽濾，以乙酸乙酯洗滌，烘干得20(s)-原人參二醇白色針狀晶體10.25g。hplc歸一化法檢測產物純度91.8％。產品轉化率96.2％。當前第1頁12