本發(fā)明涉及一種人參二醇皂苷及人參二醇型皂苷單體的制備方法。

背景技術(shù)：

三七、人參、西洋參是我國(guó)名貴中藥材，主要成分為人參皂苷，目前為止，已從三七的不同部位（根、莖葉、花蕾、種子等）分離得到70余種單體皂苷，這些單體皂苷成分按其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為達(dá)瑪烷型的20（s）-原人參二醇（panaxadiolsaponin,pds）和20（s）-原人參三醇anaxtriolsaponin,pts)兩種類型。三七、人參、西洋參中的原人參二醇型皂苷主要由人參皂苷rb1和rd組成，原人參三醇型皂苷主要由人參皂苷re、rg1，三七則還包括三七皂苷r1組份。

人參二醇型皂苷藥理作用如下：1、改善腦血循環(huán)、保護(hù)腦組織：擴(kuò)張血管降低腦血管阻力，增加頸內(nèi)動(dòng)脈血流量。改善腦缺血引起的腦能量耗竭，腦梗塞引起的功能和行為障礙；2、降低血粘度和抑制血栓形成：抑制adp、aa、paf和凝血酶誘導(dǎo)的人體血小板聚集；3、對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用：對(duì)中樞神經(jīng)有抑制作用，表現(xiàn)出鎮(zhèn)靜、安定和改善睡眠作用；rb1有顯著的鎮(zhèn)靜作用，通過(guò)減少突觸體谷氨酸的量對(duì)中樞起到抑制作用；4、抗炎作用：對(duì)角叉菜膠、磷酸組胺引起的關(guān)節(jié)腫有抑制作用，對(duì)二甲苯引起的毛細(xì)血管通透性增加有顯著抑制作用。

在專利文獻(xiàn)報(bào)道中三七、人參、西洋參根類藥材中人參二醇皂苷及其單體的分離主要通過(guò)大孔樹(shù)脂吸附獲得總皂苷，總皂苷再經(jīng)硅膠柱或凝膠柱分離純化得高純度人參二醇皂苷和人參二醇皂苷單體rb1、rd；這些報(bào)道中，吸附樹(shù)脂采用的大多為大孔徑低選擇性的廣普苯乙烯非極性大孔吸附樹(shù)脂，該類樹(shù)脂脫糖功能教強(qiáng)，然而就算采用梯度洗脫分離二醇、三醇皂苷效果也較差，二醇皂苷中經(jīng)常夾帶三醇皂苷，達(dá)不到較好的分離效果；人參二醇單體分離制備主要是通過(guò)正相硅膠柱層析法或反相c-18硅膠柱層析法得到rb1以及rd單體。硅膠柱層析法有機(jī)溶劑使用量較大，死吸附強(qiáng)，所得單體收率、含量均較低，采用c-18硅膠柱層能很大程度解決硅膠柱層析缺點(diǎn)，然這類型填料每公斤上萬(wàn)元，填料成本太高；總之，現(xiàn)有人參二醇皂苷以及單體提取分離存在選擇性差、分離純度低，成本高，收率低、不適于工業(yè)化生產(chǎn)的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種針對(duì)性強(qiáng)、分離效果好、收率高，純度高的人參二醇皂苷的制備方法。

本發(fā)明人參二醇皂苷的制備方法如下：

（1）以三七、西洋參或人參為原料，粉碎后采用質(zhì)量百分比濃度60-80%的乙醇溶液冷浸提取，過(guò)濾后濾渣再提取2次，合并提取液，減壓濃縮回收有機(jī)溶劑，濃縮液用純凈水稀釋后硅藻土過(guò)濾，收集濾液；

（2）將步驟（1）濾液過(guò)50-70μm孔徑大孔吸附樹(shù)脂柱吸附人參三醇皂苷，收集上柱流出液，濃縮干燥得人參二醇皂苷粗品；粗品中主要含有人參二醇皂苷、多糖、氨基酸等；

（3）向步驟（2）人參二醇皂苷粗品中加入其質(zhì)量3-4倍的質(zhì)量百分比濃度95-100%的甲醇或95-100%乙醇溶液溶解，過(guò)濾去除不溶物，在過(guò)濾后溶液中添加其質(zhì)量4-5倍乙酸乙酯或乙腈，攪拌混勻后靜置2-4小時(shí)，收集沉淀，將沉淀用其質(zhì)量4-5倍的純凈水溶解，減壓濃縮去除有機(jī)溶劑，備用；

（4）將步驟（3）人參二醇皂苷水溶液濕法上色譜樹(shù)脂柱，上樣完后靜置半小時(shí)，然后用質(zhì)量百分比濃度40-45%的乙醇溶液解析雜質(zhì)，tlc鑒別到無(wú)人參三醇類雜質(zhì)停止解析，更換質(zhì)量百分比濃度60-70%的乙醇溶液或甲醇溶液解析，收集解析液即得人參二醇皂苷溶液；

（5）將步驟（4）人參二醇皂苷溶液進(jìn)行低溫減壓濃縮回收有機(jī)溶劑，得人參二醇皂苷流浸膏，冷凍干燥得人參二醇皂苷。

本發(fā)明另一目的是提供人參二醇型皂苷單體的制備方法，具體如下：

（1）以三七、西洋參或人參為原料，粉碎后采用質(zhì)量百分比濃度60-80%的乙醇溶液冷浸提取，過(guò)濾后濾渣再提取2次，合并提取液，減壓濃縮回收有機(jī)溶劑，濃縮液用純凈水稀釋后硅藻土過(guò)濾，收集濾液；

（2）將步驟（1）濾液過(guò)50-70μm孔徑大孔吸附樹(shù)脂柱吸附人參三醇皂苷，收集上柱流出液，濃縮干燥得人參二醇皂苷粗品；

（3）向步驟（2）人參二醇皂苷粗品中加入其質(zhì)量3-4倍的質(zhì)量百分比濃度95-100%的甲醇或95-100%乙醇溶液溶解，過(guò)濾去除不溶物，該不溶物主要為多糖類雜質(zhì)，在過(guò)濾后溶液中添加其質(zhì)量4-5倍乙酸乙酯或乙腈，攪拌混勻后靜置2-4小時(shí)，收集沉淀，將沉淀用其質(zhì)量4-5倍的純凈水溶解，減壓濃縮去除有機(jī)溶劑，備用；

（4）將步驟（3）人參二醇皂苷水溶液濕法上色譜樹(shù)脂柱，上樣完后靜置半小時(shí)，然后用質(zhì)量百分比濃度40-45%的乙醇溶液解析雜質(zhì)，tlc鑒別到無(wú)人參三醇類雜質(zhì)停止解析，更換質(zhì)量百分比濃度50-55%乙醇溶液或甲醇溶液解析，收集解析液，解析液為人參皂苷rb1單體解析液，rb1洗脫完后，更換質(zhì)量百分比濃度60-65%的乙醇溶液或甲醇溶液洗脫，收集洗脫液為人參皂苷rd單體解析液；

（5）將步驟（4）所得人參皂苷rb1單體解析液、人參皂苷rd單體解析液分別進(jìn)行低溫減壓濃縮回收有機(jī)溶劑，得人參皂苷rb1濃縮液和人參皂苷rd濃縮液，將rb1濃縮液進(jìn)行丙酮水或丙酮甲醇重結(jié)晶，取結(jié)晶體冷凍干燥得人參皂苷rb1粉末；將人參皂苷rd濃縮液進(jìn)行真空減壓干燥得人參皂苷rd粉末。

上述人參二醇皂苷及其單體制備中，所述步驟（1）中第一次提取添加生藥質(zhì)量7-8倍的乙醇溶液，第二次提取添加生藥質(zhì)量5-6倍的乙醇溶液，第三次提取添加生藥質(zhì)量3-4倍的乙醇溶液，每次提取時(shí)間12h；濃縮液用純凈水稀釋到4-5倍生藥量。

所述步驟（2）中50-70μm孔徑大孔吸附樹(shù)脂型號(hào)為zgcad45、iiz-803或d4006，大孔吸附樹(shù)脂用量為生藥量的1.5-2倍，上柱流速為2.5-3柱體積/h。

所述色譜樹(shù)脂為r型樹(shù)脂chroma-r204或prp樹(shù)脂（型號(hào)512a、512b、512c、0831），樹(shù)脂用量為步驟（3）沉淀質(zhì)量的6-7倍。

本發(fā)明采用孔徑合理的大孔吸附樹(shù)脂粗分人參皂苷二醇事半功倍，人參皂苷二醇分子量大于三醇皂苷，選用均粒的50-70μm孔徑非極性苯乙烯大孔吸附樹(shù)脂則具有較好分離功能，這類樹(shù)脂能較好的吸附小分子量的人參三醇皂苷，人參二醇皂苷分子量較大不易吸附，上柱時(shí)易順?biāo)鞒?；人參二醇皂苷和人參三醇皂苷由于化學(xué)結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致人參二醇皂苷在一定比例的乙腈水、乙腈甲醇、乙腈乙醇、乙酸乙酯甲醇或乙酸乙酯乙醇溶液中不能溶解，而三醇皂苷則溶解，應(yīng)用該方法可以可進(jìn)一步純化人參二醇皂苷；本發(fā)明采用的色譜樹(shù)脂填料價(jià)格較低，通常200-400元/公斤，且具有一定c-18色譜柱分離功能，其上柱量大、吸附量大、分離度高；使用低級(jí)醇可以獲得高純度的人參二醇皂苷，hplc測(cè)定人參二醇皂苷含量大于95%；還可以洗脫分離開(kāi)單體rb1、rd，得到高純的單體化合物，rd單體含量大于98%，單體rb1含量大于90%，填料可反復(fù)使用，從某種程度上來(lái)說(shuō)該方法能使植物單體分離走向低成本工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

通過(guò)本發(fā)明方法的實(shí)施可克服現(xiàn)有技術(shù)收率低、生產(chǎn)成本高、純度低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等弊端，獲得高純度的人參二醇皂苷或者二醇型皂苷單體，且本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易操作，成本低，適于工業(yè)化生產(chǎn)，環(huán)保無(wú)污染。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。

實(shí)施例1：本人參二醇皂苷的制備方法如下：

（1）以西洋參為原料粉碎至60目后，在原料中添加生藥質(zhì)量7倍質(zhì)量百分比濃度60%的乙醇溶液在室溫下冷浸提取12h，過(guò)濾后在濾渣添加生藥質(zhì)量5倍質(zhì)量百分比濃度60%的乙醇溶液提取12h，過(guò)濾后在濾渣添加生藥質(zhì)量3倍質(zhì)量百分比濃度60%的乙醇溶液提取12h；合并3次提取液60℃減壓濃縮回收溶劑，濃縮液用純凈水稀釋到5倍生藥量后硅藻土過(guò)濾，收集濾液；

（2）將步驟（1）濾液過(guò)50-60μm孔徑大孔吸附樹(shù)脂（zgcad45）柱吸附人參三醇皂苷，收集上柱流出液，濃縮干燥得人參二醇皂苷粗品，其中大孔吸附樹(shù)脂用量為生藥量的1.5倍，上柱流速為2.5柱體積/h；

（3）向步驟（2）人參二醇皂苷粗品中加入其質(zhì)量3倍的質(zhì)量百分比濃度95%的甲醇溶液溶解，過(guò)濾去除不溶物，在過(guò)濾后溶液中添加其質(zhì)量4倍乙酸乙酯，攪拌混勻后靜置2小時(shí)，收集沉淀，將沉淀用其質(zhì)量4倍的純凈水溶解，60℃減壓濃縮去除有機(jī)溶劑，備用；

（4）將步驟（3）人參二醇皂苷水溶液濕法上色譜樹(shù)脂柱（r型樹(shù)脂chroma-r204，400目），色譜樹(shù)脂用量為步驟（3）沉淀質(zhì)量的6倍，上樣完后靜置半小時(shí)，然后用質(zhì)量百分比濃度45%的乙醇溶液解析雜質(zhì)，tlc鑒別到無(wú)人參三醇類雜質(zhì)停止解析，更換質(zhì)量百分比濃度70%的乙醇溶液解析，收集解析液即得人參二醇皂苷溶液；

（5）將步驟（4）人參二醇皂苷溶液進(jìn)行60℃減壓濃縮回收有機(jī)溶劑，得人參二醇皂苷流浸膏，冷凍干燥得人參二醇皂苷，收率92%，人參二醇皂苷純度98%（以rb1、rd計(jì)）。

實(shí)施例2：本人參二醇皂苷的制備方法如下：

（1）以人參為原料粉碎至60目后，在原料中添加生藥質(zhì)量8倍質(zhì)量百分比濃度70%的乙醇溶液在室溫下冷浸提取12h，過(guò)濾后在濾渣添加生藥質(zhì)量6倍質(zhì)量百分比濃度70%的乙醇溶液提取12h，過(guò)濾后在濾渣添加生藥質(zhì)量4倍質(zhì)量百分比濃度70%的乙醇溶液提取12h；合并3次提取液60℃減壓濃縮回收溶劑，濃縮液用純凈水稀釋到4倍生藥量后硅藻土過(guò)濾，收集濾液；

（2）將步驟（1）濾液過(guò)50-65μm孔徑大孔吸附樹(shù)脂（iiz-803）柱吸附人參三醇皂苷，收集上柱流出液，濃縮干燥得人參二醇皂苷粗品，其中大孔吸附樹(shù)脂用量為生藥量的2倍，上柱流速為3柱體積/h；

（3）向步驟（2）人參二醇皂苷粗品中加入其質(zhì)量4倍的質(zhì)量百分比濃度100%的乙醇溶解，過(guò)濾去除不溶物，在過(guò)濾后溶液中添加其質(zhì)量5倍乙腈，攪拌混勻后靜置3小時(shí)，收集沉淀，將沉淀用其質(zhì)量5倍的純凈水溶解，60℃減壓濃縮去除有機(jī)溶劑，備用；

（4）將步驟（3）人參二醇皂苷水溶液濕法上色譜樹(shù)脂柱（prp-512b、400目），色譜樹(shù)脂用量為步驟（3）沉淀質(zhì)量的7倍，上樣完后靜置半小時(shí)，然后用質(zhì)量百分比濃度43%的乙醇溶液解析雜質(zhì)，tlc鑒別到無(wú)人參三醇類雜質(zhì)停止解析，更換質(zhì)量百分比濃度65%的甲醇溶液解析，收集解析液即得人參二醇皂苷溶液；

（5）將步驟（4）人參二醇皂苷溶液進(jìn)行60℃減壓濃縮回收有機(jī)溶劑，得人參二醇皂苷流浸膏，冷凍干燥得人參二醇皂苷，收率95%，人參二醇皂苷純度95%（以rb1、rd計(jì)）。

實(shí)施例3：人參二醇型皂苷單體的制備方法如下：

（1）以三七為原料粉碎至60目后，在原料中添加生藥質(zhì)量7.5倍質(zhì)量百分比濃度75%的乙醇溶液在室溫下冷浸提取12h，過(guò)濾后在濾渣添加生藥質(zhì)量5.5倍質(zhì)量百分比濃度75%的乙醇溶液提取12h，過(guò)濾后在濾渣添加生藥質(zhì)量3.5倍質(zhì)量百分比濃度75%的乙醇溶液提取12h；合并3次提取液減壓濃縮回收溶劑，濃縮液用純凈水稀釋到5倍生藥量后硅藻土過(guò)濾，收集濾液；

（2）將步驟（1）濾液過(guò)65-70μm孔徑大孔吸附樹(shù)脂（d4006）柱吸附人參三醇皂苷，收集上柱流出液，濃縮干燥得人參二醇皂苷粗品；其中大孔吸附樹(shù)脂用量為生藥量的1.8倍，上柱流速為2.6柱體積/h；

（3）向步驟（2）人參二醇皂苷粗品中加入其質(zhì)量3倍的質(zhì)量百分比濃度100%的甲醇溶解，過(guò)濾去除不溶物，在過(guò)濾后溶液中添加其質(zhì)量5倍乙腈，攪拌混勻后靜置4小時(shí)，收集沉淀，將沉淀用其質(zhì)量4倍的純凈水溶解，60℃減壓濃縮去除有機(jī)溶劑，備用；

（4）將步驟（3）人參二醇皂苷水溶液濕法上色譜樹(shù)脂柱（prp-0831、600目），色譜樹(shù)脂用量為步驟（3）沉淀質(zhì)量的7倍，上樣完后靜置半小時(shí)，然后用質(zhì)量百分比濃度40%的乙醇溶液解析雜質(zhì)，tlc鑒別到無(wú)人參三醇類雜質(zhì)停止解析，更換質(zhì)量百分比濃度50%乙醇溶液解析，收集解析液，解析液為人參皂苷rb1單體解析液，rb1洗脫完后，更換質(zhì)量百分比濃度60%的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液為人參皂苷rd單體解析液；

（5）將步驟（4）所得人參皂苷rb1單體解析液、人參皂苷rd單體解析液分別進(jìn)行60℃低溫減壓濃縮回收有機(jī)溶劑，得人參皂苷rb1濃縮液和人參皂苷rd濃縮液，將rb1濃縮液進(jìn)行丙酮水（丙酮:水體積比=5:1）重結(jié)晶，取結(jié)晶體冷凍干燥得人參皂苷rb1粉末，收率91%%，純度92%；將人參皂苷rd濃縮液進(jìn)行真空減壓干燥得人參皂苷rd粉末，收率95%，純度98%。

實(shí)施例4：人參二醇型皂苷單體的制備方法如下：

（1）以人參為原料粉碎至60目后，在原料中添加生藥質(zhì)量7倍質(zhì)量百分比濃度80%的乙醇溶液在室溫下冷浸提取12h，過(guò)濾后在濾渣添加生藥質(zhì)量5倍質(zhì)量百分比濃度80%的乙醇溶液提取12h，過(guò)濾后在濾渣添加生藥質(zhì)量3倍質(zhì)量百分比濃度80%的乙醇溶液提取12h；合并3次提取液減壓濃縮回收溶劑，濃縮液用純凈水稀釋到5倍生藥量后硅藻土過(guò)濾，收集濾液；

（2）將步驟（1）濾液過(guò)50-60μm孔徑均粒大孔吸附樹(shù)脂（zgcad45）柱吸附人參三醇皂苷，收集上柱流出液，濃縮干燥得人參二醇皂苷粗品；其中大孔吸附樹(shù)脂用量為生藥量的2倍，上柱流速為2.5柱體積/h；

（3）向步驟（2）人參二醇皂苷粗品中加入其質(zhì)量4倍的質(zhì)量百分比濃度95%的乙醇溶液溶解，過(guò)濾去除不溶物，在過(guò)濾后溶液中添加其質(zhì)量4倍乙腈，攪拌混勻后靜置2小時(shí)，收集沉淀，將沉淀用其質(zhì)量4倍的純凈水溶解，60℃減壓濃縮去除有機(jī)溶劑，備用；

（4）將步驟（3）人參二醇皂苷水溶液濕法上色譜樹(shù)脂柱（prp512a、400目），色譜樹(shù)脂用量為步驟（3）沉淀質(zhì)量的6倍，上樣完后靜置半小時(shí)，然后用質(zhì)量百分比濃度45%的乙醇溶液解析雜質(zhì)，tlc鑒別到無(wú)人參三醇類雜質(zhì)停止解析，更換質(zhì)量百分比濃度55%甲醇溶液解析，收集解析液，解析液為人參皂苷rb1單體解析液，rb1洗脫完后，更換質(zhì)量百分比濃度65%的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液為人參皂苷rd單體解析液；

（5）將步驟（4）所得人參皂苷rb1單體解析液、人參皂苷rd單體解析液分別進(jìn)行60℃低溫減壓濃縮回收有機(jī)溶劑，得人參皂苷rb1濃縮液和人參皂苷rd濃縮液，將rb1濃縮液進(jìn)行丙酮甲醇（丙酮:甲醇體積比=4:1）重結(jié)晶，取結(jié)晶體冷凍干燥得人參皂苷rb1粉末，收率90%，純度91%；將人參皂苷rd濃縮液進(jìn)行真空減壓干燥得人參皂苷rd粉末，收率95%，純度98%。