本發(fā)明涉及的是化學分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可以特異性識別半胱氨酸的新型熒光探針的制備方法以及該熒光探針在體外和活細胞內(nèi)檢測半胱氨酸方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生物硫醇是許多蛋白質(zhì)和小分子的重要組成部分，在細胞生命活動過程中具有重要作用。生物硫醇包括半胱氨酸(cysteine，cys)、同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)和谷胱甘肽(glutataione，gsh)等。半胱氨酸不僅是谷胱甘肽、乙酰輔酶和牛磺酸的前體，同時也是生物體硫鐵絡(luò)合物中硫配體的提供者，人體中缺少半胱氨酸會導(dǎo)致生長緩慢、毛發(fā)色素脫色、水腫、嗜睡、肝功能損傷、肌肉松弛、身體虛弱等癥狀。同型半胱氨酸和谷胱甘肽的濃度異常也可能會引起阿爾茲海默氏癥、心血管疾病、癌癥的發(fā)生。因此，它們在生物體內(nèi)含量變化可以作為這些疾病診斷的依據(jù)。目前已經(jīng)應(yīng)用的技術(shù)包括高效液相色譜法、毛細管電泳法、電化學檢測、光學分析和質(zhì)譜鑒定，這些方法可以在體外監(jiān)測半胱氨酸，不能實現(xiàn)在活細胞中的監(jiān)測。熒光探針由于其靈敏度高、檢測限低、選擇性好，而且能夠在活細胞中可視化檢測分析物，所以研究者們開始關(guān)注將熒光探針的這項技術(shù)應(yīng)用于對體外或者細胞內(nèi)的半胱氨酸進行監(jiān)測或者細胞熒光成像。目前已經(jīng)報導(dǎo)了多種基于化學反應(yīng)的該類探針，例如michael加成、醛環(huán)化反應(yīng)和裂解反應(yīng)。其檢測原理是在熒光分子內(nèi)引入熒光淬滅基團，導(dǎo)致熒光猝滅，在半胱氨酸誘導(dǎo)下發(fā)生反應(yīng)，熒光得以恢復(fù)，這是一種特別有效的方法。但是由于半胱氨酸和同型半胱氨酸在結(jié)構(gòu)上相似，這類熒光探針很難將半胱氨酸和同型半胱氨酸特異性區(qū)分，使其在生物樣品或者活體中的應(yīng)用受到了限制，因此開發(fā)細胞穿透性好、斯托克斯位移大、發(fā)射波長在近紅外的能夠特異性識別半胱氨酸探針是很有意義的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一是提供一種合成路線簡單、反應(yīng)條件溫和、成本較低的熒光探針合成方法；目的之二是提供一種靈敏度高、選擇性好，抗干擾能力強，斯托克斯位移大，發(fā)射波長在近紅外，能夠?qū)w外或者活細胞內(nèi)的半胱氨酸進行監(jiān)測或者細胞成像的熒光探針。

本發(fā)明解決問題采取的技術(shù)方案為，一種可以特異性識別半胱氨酸的新型熒光探針，其分子結(jié)構(gòu)式如下：合成路線如下：具體合成方法如下：(1)將1,4-二乙基-1,2,3,4-四氫喹喔啉水楊醛(0.1172g,0.5mmol)溶于5ml無水二氯甲烷中，再加入三乙胺(0.14ml,1.0mmol)和丙烯酰氯(0.1358g,1.5mmol)，氬氣保護，室溫攪拌下反應(yīng)1h，用蒸餾水猝滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去二氯甲烷，柱層析分離得到棕色油狀物。產(chǎn)量：0.1261g。收率：87.5％。(2)將上步所得產(chǎn)物(0.0864g,0.3mmol)溶于7ml無水二氯甲烷中，加入三乙胺(0.042ml,0.3mmol)，再加入丙二腈(0.0198g,0.3mmol)，氬氣保護，室溫攪拌0.5h，用蒸餾水猝滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋蒸溶劑，經(jīng)柱層析得到產(chǎn)物，真空干燥過夜，得到紅色固體。產(chǎn)量：0.0108g。收率：10％。

本發(fā)明的熒光探針測試方法如下，將探針分子溶解在含有20％乙腈、ph為7.4的pbs緩沖溶液中，室溫下進行測試。并且對低濃度的半胱氨酸可以進行定量檢測，具體實施方法在實施實例中詳細介紹。

本發(fā)明的熒光探針的作用機理如下，探針分子與半胱氨酸作用后，丙烯?；糠謴奶结樂肿由想x去，探針分子由無熒光變?yōu)楹軓姷臒晒?，從而實現(xiàn)了檢測半胱氨酸過程。探針分子的響應(yīng)過程：

本發(fā)明的熒光探針與半胱氨酸作用后的熒光發(fā)射峰在621nm處，熒光增強了62倍。

本發(fā)明所述的探針分子合成路線簡單，成本較低，對半胱氨酸的選擇性好、抗干擾能力強，斯托克位移大，發(fā)射波長在近紅外，該熒光探針在生物化學，環(huán)境科學等領(lǐng)域具有實際的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明熒光探針的選擇性，熒光探針(1.0×10^-5mol/l)在pbs緩沖溶液(10mm，v乙腈/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，與不同種類氨基酸作用后的熒光光譜，橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度。

圖2為本發(fā)明熒光探針的抗干擾能力，半胱氨酸(cys)與其他氨基酸共存時，與熒光探針(1.0×10^-5mol/l)在pbs緩沖溶液(10mm，v乙腈/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中與半胱氨酸作用后的熒光強度比值(i/i0)柱狀圖。

圖3為本發(fā)明的熒光探針(1.0×10^-5mol/l)在pbs緩沖溶液(10mm，v乙腈/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，與不同濃度半胱氨酸(cys)作用后的熒光光譜變化，橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度。

圖4為本發(fā)明的熒光探針(1.0×10^-5mol/l)在pbs緩沖溶液(10mm，v乙腈/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，與半胱氨酸(cys)濃度的線性關(guān)系，橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度。

圖5為本發(fā)明的熒光探針(1.0×10^-5mol/l)在pbs緩沖溶液(10mm，v乙腈/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，與半胱氨酸(cys)、同型半胱氨酸(hcy)和谷胱甘肽(gsh)作用過程中熒光強度隨時間的變化，橫坐標為時間，縱坐標為熒光強度。

圖6為本發(fā)明的熒光探針(1.0×10^-5mol/l)在不同ph值緩沖溶液中，與半胱氨酸(cys)作用前后的熒光強度，橫坐標為ph，縱坐標為熒光強度。

圖7為本發(fā)明的熒光探針(1.0×10-5mol/l)在不同條件下的細胞(hela細胞)成像(a)探針在n-乙基順丁烯二酰亞胺溶液處理的細胞中熒光成像(b)探針和n-乙基順丁烯二酰亞胺溶液處理的細胞中明場成像，(c)探針在細胞中熒光成像(d)探針在細胞中明場成像，(e)探針在半胱氨酸溶液處理的細胞中熒光成像(f)探針在半胱氨酸溶液處理的細胞中明場成像。

具體實施實例

實施例1：中間產(chǎn)物的合成

將1,4-二乙基-1,2,3,4-四氫喹喔啉水楊醛(0.1172g,0.5mmol)溶于5ml無水二氯甲烷中，再加入三乙胺(0.14ml,1.0mmol)和丙烯酰氯(0.1358g,1.5mmol)，氬氣保護，室溫攪拌下反應(yīng)1h，用蒸餾水猝滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去二氯甲烷，柱層析分離得到棕色油狀物。產(chǎn)量：0.1261g。產(chǎn)率：87.5％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δh9.84(s,1h),6.97(s,1h),6.64(dd,j＝17.3,1.2hz,1h),6.37(dd,j＝17.3,10.5hz,2h),6.21(s,1h),6.08-6.01(m,1h),3.51(t,2h),3.40-3.35(m,4h),3.24(t,2h),1.22-1.17(m,6h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δc186.1,164.9,147.6,142.0,132.9,132.3,127.8,116.5,108.7,102.5,47.4,45.8,45.3,44.6,10.7,10.0.

實施例2：探針分子的合成

將上步所得產(chǎn)物(0.0864g,0.3mmol)溶于7ml無水二氯甲烷中，加入三乙胺(0.042ml,0.3mmol)，再加入丙二腈(0.0198g,0.3mmol)，氬氣保護，室溫攪拌0.5h，用蒸餾水猝滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋蒸溶劑，經(jīng)柱層析得到產(chǎn)物，真空干燥過夜，得到紅色固體。產(chǎn)量：0.0108g。收率：10％。探針分子的結(jié)構(gòu)表征如下：¹hnmr(500mhz,cdcl3)δh7.56(d,j＝2.6hz,2h),6.68(dd,j＝17.3,0.9hz,1h),6.38(dd,j＝17.3,10.5hz,1h),6.28(s,1h),6.14(dd,j＝10.5,0.9hz,1h),3.60(t,2h),3.44(q,j＝7.2,2h),3.39(q,j＝7.2,2h),3.29(t,2h),1.24(t,6h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δc164.2,149.8,146.7,143.4,134.0,132.6,127.1,116.6,115.1,112.2,106.8,102.5,70.9,47.7,46.0,45.6,44.4,10.9,9.8.

實施例3：本發(fā)明:熒光探針的應(yīng)用

將探針溶于緩沖溶液(v乙腈/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中配制成1.0×10^-5mol/l的溶液，向溶液中加入氨基酸(ala,val,try,phe,his,,iso,ser,asp,lys,arg,gly,met,tyr,glu,thr)沒有引起熒光的變化，加人氨基酸(cys,hcy,gsh)引起了熒光變化，該熒光探針對半胱氨酸表現(xiàn)出高靈敏度、高選擇性的識別。當半胱氨酸與干擾物質(zhì)(ala,val,try,phe,his,,iso,ser,asp,lys,arg,gly,met,tyr,glu,thr,hcy,gsh)共存時，探針不受干擾因素的影響，表現(xiàn)出來很強的抗干擾能力。該探針分子與半胱氨酸響應(yīng)速度快，1分鐘內(nèi)即可觀察到熒光的變化。探針分子在ph為7至11的范圍內(nèi)都可以對半胱氨酸選擇性識別，表現(xiàn)出了生物適應(yīng)的應(yīng)用范圍。