本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在水相中測定蛋白質(zhì)的熒光探針及其合成方法和檢測方法，具體涉及一種雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子，是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體內(nèi)一切組織的基礎(chǔ)物質(zhì)，約占人體的18％，具有修補組織、維持機體正常新陳代謝及各類物質(zhì)在體內(nèi)的輸送等諸多功能，與各種形式的生命活動有著密切的聯(lián)系，在生物體內(nèi)具有特殊的地位。因此，對蛋白質(zhì)的特異性識別和定量分析有助于推動蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物診斷以及病原檢測等方面的發(fā)展，這對于人類探索生命奧秘起著重要的作用。

定量分析痕量蛋白質(zhì)的方法有分光光度法、熒光光度法、共振瑞利散射光譜法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法、等離子體共振法、納米粒子法、過渡金屬羰基碎片法等。而利用熒光傳感器實現(xiàn)對蛋白質(zhì)檢測的方法備受關(guān)注，主要是因為熒光傳感器具有選擇性好、靈敏度高、動態(tài)響應(yīng)范圍寬、可實時在線檢測、能夠成像和輸出信號豐富等優(yōu)點。然而現(xiàn)有的可檢測蛋白質(zhì)的熒光探針分子對分子合成技術(shù)有著較高的依賴，且大多疏水性較強，限制了其在水溶液中的應(yīng)用以及對生物檢測對象的傳感。另外，蛋白質(zhì)種類繁多，對蛋白質(zhì)的區(qū)分識別則更具有重要意義。然而，目前已發(fā)展的幾種可對蛋白質(zhì)區(qū)分識別的熒光傳感器多為陣列型傳感器，即利用多個熒光探針組合而成的傳感器陣列，通過采集不同傳感器的熒光響應(yīng)信號，形成針對特定蛋白的指紋識別圖譜，從而實現(xiàn)對各種蛋白質(zhì)的區(qū)分識別。陣列型傳感存在樣品消耗量大、數(shù)據(jù)采集復(fù)雜等問題。因此，發(fā)展能夠有效區(qū)分識別蛋白質(zhì)的單一型熒光傳感器就顯得非常具有挑戰(zhàn)性和優(yōu)越性。

目前，基于苝酰亞胺衍生物聚集體構(gòu)象調(diào)控的熒光傳感器對蛋白質(zhì)進行區(qū)分檢測方面的報道很少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針及其合成方法和應(yīng)用，該熒光探針靈敏度高、區(qū)分性好、測試范圍廣、樣品消耗量小、數(shù)據(jù)采集簡單；該合成方法操作簡便，成本低，對設(shè)備要求簡單；該熒光探針能夠應(yīng)用于蛋白質(zhì)的檢測和區(qū)分識別工作中。

為了達到上述目的，本發(fā)明熒光探針采用以下技術(shù)方案：

該熒光探針的結(jié)構(gòu)式如下：

式中，n＝2、3或4。

本發(fā)明合成方法采用以下技術(shù)方案：包括以下步驟：

1)首先在保護氣氛下，將芘磺?；苌锏腘-甲基吡咯烷酮溶液加入到苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入無水醋酸鋅，得到混合溶液；其中芘磺酰基衍生物和苝酐的摩爾比為(2～4):1；

2)步驟1)得到的混合溶液在攪拌條件下并在150～200℃下加熱回流10～15h，待加熱回流得到的反應(yīng)液冷卻到室溫后，過濾得濾液；濾液經(jīng)酸洗出現(xiàn)沉淀，抽濾得到濾餅，將濾餅洗滌干燥后，得到雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針。

進一步地，芘磺酰基衍生物的制備步驟具體包括：

a)在保護氣氛及冰浴條件下，將芘磺酰氯的三氯甲烷溶液滴加到二氨基含氧烷烴的三氯甲烷溶液中，滴加完畢后，室溫攪拌反應(yīng)2～8h；

b)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液洗滌并干燥，再依次酸洗、堿洗和萃取，得到有機層，旋干，制得結(jié)構(gòu)式如下的芘磺酰基衍生物：

式中，n＝2、3或4。

進一步地，步驟a)中芘磺酰氯與二氨基含氧烷烴的摩爾比為1:(5～10)，二氨基含氧烷烴為1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷、3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二胺或3,6,9,12-四氧雜十六烷-1,16-二胺；步驟b)中的洗滌是用飽和食鹽水洗6～7次，干燥是用無水硫酸鈉干燥過夜，酸洗是采用1mol/L鹽酸洗滌，堿洗是采用3mol/L氫氧化鈉水溶液進行洗滌。

進一步地，步驟a)中，調(diào)節(jié)滴加速度為5～8s/滴。

進一步地，保護氣氛采用氮氣、氬氣或氖氣，保護氣氛的流速為0.5～0.8mL/s。

進一步地，步驟1)中，無水醋酸鋅的添加量為苝酐摩爾量的0.65～2倍。

進一步地，步驟2)中，酸洗是將濾液滴加到2mol/L的鹽酸溶液中，產(chǎn)生沉淀。

進一步地，酸洗后抽濾得到的濾餅依次用甲醇及二次水淋洗；濾餅洗滌干燥后經(jīng)過洗脫劑進行過柱分離純化，其中洗脫劑采用二氯甲烷、甲醇和三乙胺按體積比為(20～60):1:1配成的混合溶劑。

本發(fā)明熒光探針在檢測蛋白質(zhì)中的應(yīng)用，所述的蛋白質(zhì)包括胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細胞色素c。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明公開了一種雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI，該探針以對微環(huán)境敏感、熒光量子產(chǎn)率高、熒光輸出信號豐富的芘以及具有良好的光化學(xué)穩(wěn)定性、高的熱穩(wěn)定性、寬的吸收波長范圍的苝酰亞胺為雙報告基團，通過引入寡聚乙氧基的親水性連接臂，制備了具有多個發(fā)射帶的熒光衍生物。該探針分子中的芘基團可在480-500nm發(fā)射激基締合物峰，與苝酰亞胺分子的吸收峰可以很好的重合，使得芘和苝酰亞胺基團形成一對很好的能量供體和受體，實現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，有望賦予該熒光探針分子在單一激發(fā)波長下具有多個發(fā)射和檢測信號，從而使得傳感體系具有多波長交互響應(yīng)的識別性能，為創(chuàng)建新型的表面活性劑調(diào)控的熒光傳感器提供了可能。該雙芘修飾苝酰亞胺衍生物作為熒光探針，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性好、快的響應(yīng)速度和優(yōu)異的識別性能。

本發(fā)明公開的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針的合成方法中采用雙芘修飾苝酰亞胺分子，苝酰亞胺分子具有寬的波長吸收范圍、較高的熒光量子產(chǎn)率以及好的光化學(xué)穩(wěn)定性，并且由于其強的π-π堆積作用，使其在水溶液中具有特殊的自組裝能力，可形成特定的非共價超分子聚集體；芘同樣具有良好的熒光發(fā)射性能和較高的熒光量子產(chǎn)量，其所形成的激基締合物可作為苝酐的能量供體，與苝酐進行能量轉(zhuǎn)移，合成雙芘修飾的苝酐衍生物可具有芘的單體發(fā)射、激基締合物發(fā)射和苝酐發(fā)射的多發(fā)射帶光譜，且光譜形狀與探針分子的聚集狀態(tài)密切相關(guān)，從而賦予熒光探針分子多個響應(yīng)信號，使得傳感體系具有多波長交互響應(yīng)的識別性能，創(chuàng)建新型的表面活性劑調(diào)控的熒光傳感體系，從而實現(xiàn)對多種蛋白質(zhì)的區(qū)分傳感；通過本發(fā)明構(gòu)建的熒光化學(xué)傳感體系具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、區(qū)分性好、樣品消耗量小、數(shù)據(jù)采集簡單等優(yōu)點；本發(fā)明合成方法操作簡便，區(qū)分性好，成本低，對設(shè)備要求簡單。

本發(fā)明中的熒光探針具有多個檢測信號，可實現(xiàn)對非金屬蛋白中的胃蛋白酶(PS)、牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(O-egg)和β-乳球蛋白(BLG)的區(qū)分識別，以及金屬蛋白中的鐵蛋白(Ferr)、肌紅蛋白(Myo)、血紅蛋白(Hb)和細胞色素c(Cyt-c)的區(qū)分識別。熒光探針PEPBI對四種非金屬蛋白胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白和β-乳球蛋白的檢出限分別可達到0.61μmol/L(21.1μg/mL)、0.26μmol/L(17.3μg/mL)、0.46μmol/L(20.4μg/mL)和0.61μmol/L(21.4μg/mL)。熒光探針PEPBI對四種金屬蛋白鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細胞色素c的檢出限分別可達到61.8nmol/L(27.2μg/mL)、0.13μmol/L(2.2μg/mL)、41.6nmol/L(2.7μg/mL)和1.14μmol/L(14.1μg/mL)。

【附圖說明】

圖1是本發(fā)明實施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測胃蛋白酶溶液的熒光強度變化曲線圖。

圖2是本發(fā)明實施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測牛血清蛋白溶液的熒光強度變化曲線圖。

圖3是本發(fā)明實施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測卵清蛋白溶液的熒光強度變化曲線圖。

圖4是本發(fā)明實施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測β-乳球蛋白溶液的熒光強度變化曲線圖。

圖5是本發(fā)明實施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測細胞色素c溶液的熒光強度變化曲線圖。

圖6是本發(fā)明實施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測鐵蛋白溶液的熒光強度變化曲線圖。

圖7是本發(fā)明實施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測血紅蛋白溶液的熒光強度變化曲線圖。

圖8是本發(fā)明實施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測肌紅蛋白溶液的熒光強度變化曲線圖。

圖9是熒光探針PEPBI在不同波長處(380、400、421、480、544、577nm)對四種非金屬蛋白質(zhì)(濃度為10μM)的熒光變化log(I/I₀)值的柱狀圖。

圖10是熒光探針PEPBI在不同波長處(380、400、421、480、544、577nm)對四種金屬蛋白質(zhì)(濃度為1.0μM)的熒光變化log(I/I₀)值的柱狀圖。

【具體實施方式】

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明公開了一種雙芘修飾苝酰亞胺衍生物的熒光探針，該熒光探針的結(jié)構(gòu)式如下：

式中，n為2或3或4。

上述基于雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針的合成方法包括下述步驟：

1)合成芘磺酰基衍生物

在流速為0.5～0.8mL/s的保護氣氛保護和冰浴條件下，將芘磺酰氯的三氯甲烷溶液以5～8s/滴的滴加速度滴加到二氨基含氧烷烴的三氯甲烷溶液中，其中保護氣氛采用氮氣、氬氣或氖氣等其他惰性氣體，芘磺酰氯與二氨基含氧烷烴的摩爾比為1:(5～10)；滴加完后室溫攪拌2～8h，將反應(yīng)液用飽和食鹽水洗6～7次，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，用1mol/L鹽酸進行洗滌，再用3mol/L氫氧化鈉水溶液進行中和，使pH值在7～8之間。用三氯甲烷萃取，收集萃取后的有機層，旋干，得到式Ⅰ所示的芘磺酰基衍生物，其反應(yīng)方程式如下：

上述的二氨基含氧烷烴為1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷、3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二胺或3,6,9,12-四氧雜十六烷-1,16-二胺中的任意一種。

2)合成雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針

在流速為0.5～0.8mL/s的氮氣氣氛保護下，將芘磺?；苌锏腘-甲基吡咯烷酮溶液加入到苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入催化劑量的無水醋酸鋅，芘磺?；苌锖推p酐的摩爾比為(2～4):1，無水醋酸鋅的添加量約為苝酐摩爾量的0.65～2倍；磁力攪拌器攪拌，在150～200℃下加熱回流10～15h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，過濾，收集濾液。再將濾液滴加到2mol/L的鹽酸溶液中，出現(xiàn)沉淀，攪拌，過夜。抽濾得到濾餅，依次用二次水及甲醇對濾餅進行多次淋洗，收集濾餅。然后再用二氯甲烷、甲醇和三乙胺按體積比為(20～60):1:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物。之后，干燥，得到式Ⅱ所示的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針，其反應(yīng)方程式如下：

上述的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在檢測蛋白質(zhì)中的用途，所述的蛋白質(zhì)為胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細胞色素c，其檢測方法如下：

1、配制溶液

準確稱取一定量的CTAB，溶于HEPES緩沖液(10mmol/L，pH 7.4)中，配制成20mmol/L的CTAB溶液。將此溶液稀釋成濃度為1.5mmol/L的溶液備用。量取25mL 1.5mmol/L的CTAB溶液，加入100μL濃度為2.5×10^-4mol/L雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI的二甲亞砜溶液，配制成熒光探針濃度為1μmol/L、表面活性劑CTAB濃度為1.5mmol/L的傳感體系，即PEPBI/CTAB體系，分別對非金屬蛋白中的胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白以及金屬蛋白中的鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細胞色素c進行區(qū)分檢測。

分別稱取一定質(zhì)量的胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細胞色素c溶于10mmol/L HEPES緩沖溶液中，配制成2.5mmol/L胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、細胞色素c溶液以及0.25mmol/L鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白溶液。

2、繪制標準分類圖譜

分別量取2.5mL的PEPBI/CTAB(1μmol/L/1.5mmol/L)熒光探針溶液于比色皿中，向其中分別滴加2.5mmol/L胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、細胞色素c溶液以及0.25mmol/L鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白溶液，用毛細管攪拌使其混合均勻，所得到的溶液中胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、細胞色素c的濃度均為0～20μmol/L，鐵蛋白、血紅蛋白濃度均為0～1μmol/L，肌紅蛋白的濃度為0～2μmol/L。熒光光譜的測試均在單光子熒光光譜儀(FS5，Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發(fā)波長為352nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫分別為3.5和2.7nm。待溶液達到平衡后，分別繪制熒光強度隨胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細胞色素c濃度變化的熒光光譜圖，并通過采集雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI在380nm、400nm、421nm、480nm、544nm、577nm處的熒光強度，算得四種非金屬蛋白質(zhì)濃度為10μmol/L時傳感體系的log(I/I₀)值以及四種金屬蛋白質(zhì)濃度為1.0μmol/L時傳感體系的log(I/I₀)值，分別繪制非金屬蛋白濃度為10μmol/L、金屬蛋白濃度為1.0μmol/L時不同波長處log(I/I₀)值的標準柱狀圖。

本發(fā)明合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針的化學(xué)穩(wěn)定性好、響應(yīng)速度快、區(qū)分性好、樣品消耗量小、數(shù)據(jù)采集簡單，可直接進行檢測，如FS5、FLS920型單光子計數(shù)時間分辨熒光光譜儀或其他類似的光學(xué)檢測器，分別實現(xiàn)對胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白和β-乳球蛋白以及對鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細胞色素c的區(qū)分檢測。

實施例1

合成結(jié)構(gòu)式如下的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針：

其合成方法包括如下步驟：

1)合成芘磺?；苌?/p>

在流速為0.6mL/s的氮氣保護和冰浴攪拌條件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口燒瓶中加入9.97mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后將0.997mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按6s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯與1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩爾比為1:10。滴加完后室溫攪拌2小時，停止反應(yīng)后，將反應(yīng)液用飽和食鹽水洗6～7次，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，再用1mol/L鹽酸進行洗滌，再用3mol/L氫氧化鈉水溶液進行中和，使溶液pH值在7，之后用三氯甲烷萃取，收集有機層，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺?；苌?，其反應(yīng)方程式如下：

2)合成雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針

在流速為0.6mL/s的氮氣氣氛保護下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺?；苌?.64mmol，將其加入到12mL溶有0.32mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入催化劑量的無水醋酸鋅0.208mmol，此時，芘磺?；苌锖推p酐的摩爾比為2:1，無水醋酸鋅的添加量約為苝酐摩爾量的0.65倍；然后用磁力攪拌器攪拌，在180℃下加熱回流15h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，過濾，收集濾液。然后再將其滴到300mL的2mol/L鹽酸溶液中，攪拌過夜，抽濾，依次用二次水及甲醇對濾餅進行多次淋洗。收集濾餅，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按體積比為40:1:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物。之后，得到式I所示的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針，其反應(yīng)方程式如下：

上述結(jié)構(gòu)式I的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針的核磁數(shù)據(jù)為：¹H NMR(CDCl₃/Me₄Si,600MHz),δ(ppm):8.88(d,1H,pyrene),8.35(d,1H,pyrene),8.16(s,1H,pyrene),8.14(s,1H,perylene),8.03(d,1H,perylene),7.97(d,1H,pyrene),7.87(d,1H,perylene),7.80(s,1H,perylene),7.65(t,3H,pyrene),5.95(s,1H,-NH-),3.26-4.44(m,12H,-CH₂NH-and-CH₂O-).

實施例2

合成結(jié)構(gòu)式如下的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針：

其合成方法步驟如下：

在實施例1的合成芘磺?；苌锊襟E1中，將所用的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷用等摩爾質(zhì)量的3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二胺替換，其它步驟與相應(yīng)的實施例1相同。

實施例3

合成結(jié)構(gòu)式如下的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針：

其合成方法步驟如下：

在實施例1的合成芘磺酰基衍生物步驟1中，將所用的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷用等摩爾質(zhì)量的3,6,9,12-四氧雜十六烷-1,16-二胺替換，其它步驟與相應(yīng)的實施例1相同。

實施例4

1)合成芘磺酰基衍生物

在流速為0.5mL/s的氬氣保護和冰浴攪拌條件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口燒瓶中加入5mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后將1mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按5s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯與1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩爾比為1:5。滴加完后室溫攪拌3小時，停止反應(yīng)后，將反應(yīng)液用飽和食鹽水洗6～7次，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，再用1mol/L鹽酸進行洗滌，再用3mol/L氫氧化鈉水溶液進行中和，使溶液pH值在7.5，之后用三氯甲烷萃取，收集有機層，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺?；苌?，其反應(yīng)方程式如下：

2)合成雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針

在流速為0.5mL/s的氬氣氣氛保護下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺?；苌?.63mmol，將其加入到12mL溶有0.21mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入無水醋酸鋅0.168mmol，此時，芘磺酰基衍生物和苝酐的摩爾比為3:1，無水醋酸鋅的添加量約為苝酐摩爾量的0.8倍；然后用磁力攪拌器攪拌，在150℃下加熱回流10h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，過濾，收集濾液。然后再將其滴到300mL的2mol/L鹽酸溶液中，攪拌過夜，抽濾，依次用二次水及甲醇對濾餅進行多次淋洗。收集濾餅，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按體積比為30:1:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物。之后，得到式I所示的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針。

實施例5

1)合成芘磺?；苌?/p>

在流速為0.8mL/s的氖氣保護和冰浴攪拌條件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口燒瓶中加入8mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后將1mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按8s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯與1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩爾比為1:8。滴加完后室溫攪拌8小時，停止反應(yīng)后，將反應(yīng)液用飽和食鹽水洗6～7次，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，再用1mol/L鹽酸進行洗滌，再用3mol/L氫氧化鈉水溶液進行中和，使溶液pH值在7.5，之后用三氯甲烷萃取，收集有機層，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺?；苌?，其反應(yīng)方程式如下：

2)合成雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針

在流速為0.8mL/s的氖氣氣氛保護下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺酰基衍生物0.60mmol，將其加入到12mL溶有0.15mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入無水醋酸鋅0.3mmol，此時，芘磺酰基衍生物和苝酐的摩爾比為4:1，無水醋酸鋅的添加量約為苝酐摩爾量的2倍；然后用磁力攪拌器攪拌，在200℃下加熱回流12h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，過濾，收集濾液。然后再將其滴到300mL的2mol/L鹽酸溶液中，攪拌過夜，抽濾，依次用二次水及甲醇對濾餅進行多次淋洗。收集濾餅，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按體積比為60:1:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物。之后，得到式I所示的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針。

實施例6

1)合成芘磺?；苌?/p>

在流速為0.7mL/s的氮氣保護和冰浴攪拌條件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口燒瓶中加入7mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后將1mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按7s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯與1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩爾比為1:7。滴加完后室溫攪拌7小時，停止反應(yīng)后，將反應(yīng)液用飽和食鹽水洗6～7次，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，再用1mol/L鹽酸進行洗滌，再用3mol/L氫氧化鈉水溶液進行中和，使溶液pH值在8，之后用三氯甲烷萃取，收集有機層，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺酰基衍生物，其反應(yīng)方程式如下：

2)合成雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針

在流速為0.7mL/s的氮氣氣氛保護下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺?；苌?.50mmol，將其加入到12mL溶有0.2mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入無水醋酸鋅0.3mmol，此時，芘磺酰基衍生物和苝酐的摩爾比為2.5:1，無水醋酸鋅的添加量約為苝酐摩爾量的1.5倍；然后用磁力攪拌器攪拌，在160℃下加熱回流14h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，過濾，收集濾液。然后再將其滴到300mL的2mol/L鹽酸溶液中，攪拌過夜，抽濾，依次用二次水及甲醇對濾餅進行多次淋洗。收集濾餅，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按體積比為20:1:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物。之后，得到式I所示的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針。

實施例7

實施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測胃蛋白酶的用途，其使用方法如下：

1、配制溶液

向1.5mmol/L CTAB的HEPES緩沖溶液(10mmol/L，pH 7.4)中加入雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI，配制成1.0μmol/L熒光探針溶液。稱取一定質(zhì)量的胃蛋白酶溶于10mmol/L HEPES緩沖溶液中，配制成2.5mmol/L胃蛋白酶溶液。

2、繪制標準曲線

量取2.5mL 1.0μmol/L熒光探針的CTAB溶液(1.5mmol/L)于比色皿中，加入2.5mmol/L胃蛋白酶溶液，用毛細管攪拌使其混合均勻，使得混合溶液中胃蛋白酶的濃度分別為1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、10、15和20μmol/L。熒光光譜的測試均在單光子熒光光譜儀(FS5，Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發(fā)波長均為352nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫分別為3.5和2.7nm。待溶液達到平衡后，繪制熒光強度隨胃蛋白酶濃度變化的熒光光譜圖，實驗結(jié)果見圖1，由圖可見，隨著胃蛋白酶濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)比例型變化。

實施例8

實施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測牛血清蛋白的用途，其使用方法與實施例7相同。實驗結(jié)果見圖2，由圖可見，隨著牛血清蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)比例型變化。

實施例9

實施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測卵清蛋白的用途，其使用方法與實施例7相同。實驗結(jié)果見圖3，由圖可見，隨著卵清蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)比例型變化。

實施例10

實施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測β-乳球蛋白的用途，其使用方法與實施例7相同。實驗結(jié)果見圖4，由圖可見，隨著β-乳球蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)比例型變化。

實施例11

實施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測細胞色素c的用途，其使用方法與實施例7相同。實驗結(jié)果見圖5，由圖可見，隨著細胞色素c濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)猝滅型變化。

實施例12

實施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測鐵蛋白的用途，其使用方法如下：

1、配制溶液

向1.5mmol/L CTAB的緩沖溶液(10mmol/LHEPES，pH 7.4)中加入雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針，配制成1.0μmol/L熒光探針的CTAB溶液。稱取一定質(zhì)量的鐵蛋白溶于10mmol/L HEPES緩沖溶液中，配制成0.25mmol/L鐵蛋白溶液。

2、繪制標準曲線

量取2.5mL 1.0μmol/L熒光探針溶液于比色皿中，加入0.25mmol/L鐵蛋白溶液，用毛細管攪拌使其混合均勻，使得混合溶液中鐵蛋白的濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7和1.0μmol/L。熒光光譜的測試均在單光子熒光光譜儀(FS5，Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發(fā)波長均為352nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫分別為3.5和2.7nm。待測試完畢后，繪制熒光強度隨鐵蛋白濃度變化的熒光光譜圖，實驗結(jié)果見圖6，由圖可見，隨著鐵蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)猝滅型變化。

實施例13

實施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測血紅蛋白肌紅蛋白的用途，其使用方法與實施例12相同。實驗結(jié)果見圖7，由圖可見，隨著血紅蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)猝滅型變化。

實施例14

實施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測肌紅蛋白的用途(肌紅蛋白的濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5和2.0μmol/L)，其使用方法與實施例12相同。實驗結(jié)果見圖8，由圖可見，隨著肌紅蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)猝滅型變化。

實施例15

采集雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI在380nm、400nm、421nm、480nm、544nm、577nm處的熒光強度，繪制四種非金屬蛋白濃度為10μM時不同波長處log(I/I₀)值的標準柱狀圖，實驗結(jié)果見圖9，由圖可見，四種非金屬蛋白質(zhì)在同一濃度下有不同程度的響應(yīng)。

實施例16

采集雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI在380nm、400nm、421nm、480nm、544nm、577nm處的熒光強度，繪制四種金屬蛋白濃度為1.0μM時不同波長處log(I/I₀)值的標準柱狀圖，實驗結(jié)果見圖10，由圖可見，四種金屬蛋白質(zhì)在同一濃度下有不同程度的響應(yīng)。

通過以上實施例，可以得到，在本發(fā)明選定的傳感體系中，分別加入四種非金屬蛋白和四種金屬蛋白，體系可以實現(xiàn)對非金屬蛋白的比例型響應(yīng)以及對金屬蛋白的猝滅型響應(yīng)。并且，通過采集不同波長處的熒光強度，做出log(I/I₀)對蛋白質(zhì)濃度的柱狀圖，就可以分別實現(xiàn)對非金屬蛋白和金屬蛋白的指紋圖譜識別，從而實現(xiàn)對各種蛋白質(zhì)的區(qū)分識別。