本發(fā)明涉及生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，且特別涉及一種熒光檢測(cè)物質(zhì)及其制備方法。
背景技術(shù)：
：巰基(-sh)是細(xì)胞中化學(xué)活性較高的基團(tuán)。在蛋白質(zhì)中，巰基部分是與酶活性有關(guān)的最具有反應(yīng)性的官能團(tuán)。隨著巰基官能團(tuán)在生物體系中的重要作用逐漸被認(rèn)識(shí)，鑒別和定量測(cè)定生物巰基化合物的方法日益受到關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有硝普鹽法、碘量法、電流分析法、分光光度法、比色法等，但這些方法靈敏度低，不能適應(yīng)有些生物樣品中巰基化合物的測(cè)定，因此需要合成一些高靈敏度的分析檢測(cè)試劑。熒光檢測(cè)技術(shù)具有高度的靈敏性和極寬的動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍，已廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等各個(gè)方面。熒光測(cè)定法由于其成本低，可重復(fù)性好，測(cè)定靈敏，選擇性高，并且能夠?qū)崿F(xiàn)可視化觀測(cè)，是一種非常好的測(cè)定手段。因此，新型的巰基熒光檢測(cè)試劑成為研究的焦點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種熒光檢測(cè)物質(zhì)，該熒光檢測(cè)物質(zhì)具有抗干擾、選擇性好、專一性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的快速檢測(cè)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種熒光檢測(cè)物質(zhì)的制備方法，以母體與2,4-二硝基苯磺酰氯反應(yīng)制備熒光檢測(cè)物質(zhì)。該方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、合成簡(jiǎn)單、產(chǎn)物易分離純化，可廣泛應(yīng)用于巰基類物質(zhì)的檢測(cè)。本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提出一種熒光檢測(cè)物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)式為：其中，r1表示甲氧基、羧基、硝基、氫基、甲基中任一種，r2表示甲氧基、羧基、硝基、氫基、羥甲基、氨基中任一種，r1、r2的結(jié)合位點(diǎn)分別獨(dú)立地為苯環(huán)上剩余的4個(gè)未結(jié)合位點(diǎn)中的任一個(gè)。本發(fā)明提出一種如式(i)所示的熒光檢測(cè)物質(zhì)的制備方法，制備方法包括使如式(i)所示的母體與2,4-二硝基苯磺酰氯反應(yīng)；(i)，r1表示甲氧基、羧基、硝基、氫基、甲基中任一種，r2表示甲氧基、羧基、硝基、氫基、羥甲基、氨基中任一種，r1、r2的結(jié)合位點(diǎn)分別獨(dú)立地為苯環(huán)上剩余的4個(gè)未結(jié)合位點(diǎn)中的任一個(gè)。本發(fā)明實(shí)施例的一種熒光檢測(cè)物質(zhì)及其制備方法的有益效果是：本發(fā)明以母體與2,4-二硝基苯磺酰氯反應(yīng)制備了新型的熒光檢測(cè)物質(zhì)。該熒光檢測(cè)物質(zhì)將可產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(excited-stateintramolecularprotontransfer，esipt)機(jī)理的羥基官能團(tuán)用2,4-二硝基苯磺酰氯封閉，使母體熒光關(guān)閉。在巰基類物質(zhì)作用下，可以使熒光打開，起到檢測(cè)效果。具有抗干擾、選擇性好、專一性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的快速檢測(cè)。該制備方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、合成簡(jiǎn)單、產(chǎn)物易分離純化，可廣泛應(yīng)用于巰基類物質(zhì)的檢測(cè)。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明實(shí)施例4的母體及實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)的質(zhì)譜驗(yàn)證圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)對(duì)不同巰基類物質(zhì)的熒光光譜圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的熒光檢測(cè)物質(zhì)及其制備方法進(jìn)行具體說明。本發(fā)明實(shí)施例提供一種熒光檢測(cè)物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)式為：其中，r1表示甲氧基、羧基、硝基、氫基、甲基中任一種，r2表示甲氧基、羧基、硝基、氫基、羥甲基、氨基中任一種，r1、r2的結(jié)合位點(diǎn)分別獨(dú)立地為苯環(huán)上剩余的4個(gè)未結(jié)合位點(diǎn)中的任一個(gè)。進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，r1、r2相同，且均為甲氧基、羧基、硝基、氫基中的任一種。進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，r1、r2均為氫基。進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，r1、r2不同，且r1為甲氧基、羧基、硝基中任一種，r2為羧基、硝基、氫基、羥甲基、氨基中的任一種。本發(fā)明的熒光檢測(cè)物質(zhì)主要檢測(cè)巰基類物質(zhì)，目前的巰基類物質(zhì)的熒光探針有碘乙酰胺類、馬來酰亞胺類、活性鹵素類、芳香鄰二醛類等。本發(fā)明的熒光檢測(cè)物質(zhì)是將母體中可產(chǎn)生esipt機(jī)理的羥基光能團(tuán)用2,4-二硝基苯磺酰氯封閉，使母體熒光關(guān)閉。在檢測(cè)物質(zhì)的作用下，使熒光打開，起到檢測(cè)的效果。esipt為激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移，是一類質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)制。該類探針分子一般包含一個(gè)氫鍵給體和一個(gè)氫鍵手提。這兩個(gè)部分可以通過分子內(nèi)氫鍵形成一個(gè)五元/六元環(huán)。在激發(fā)態(tài)時(shí)，質(zhì)子氫發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致分子的共軛體系發(fā)生變化，光譜發(fā)生紅移。一種熒光檢測(cè)物質(zhì)的制備方法，該制備方法包括使如式(i)所示的母體與2,4-二硝基苯磺酰氯反應(yīng)；r1表示甲氧基、羧基、硝基、氫基、甲基中任一種，r2表示甲氧基、羧基、硝基、氫基、羥甲基、氨基中任一種，r1、r2的結(jié)合位點(diǎn)分別獨(dú)立地為苯環(huán)上剩余的4個(gè)未結(jié)合位點(diǎn)中的任一個(gè)。具體地，當(dāng)r1、r2均為氫基時(shí)，本發(fā)明的熒光檢測(cè)物質(zhì)的合成路線為：在本發(fā)明實(shí)施例中，作為母體的2-(2-羥基苯基)苯并咪唑可以通過直接購買獲得，也可以通過實(shí)驗(yàn)制備獲得。實(shí)驗(yàn)制備的方法如下：將水楊醛溶于一定量的乙醇溶劑中，加入亞硫酸氫鈉后，為了溶解的充分，磁力攪拌1.5～2.5h；再加入溶有鄰苯二胺的乙醇溶劑，升溫加熱至回流后，繼續(xù)反應(yīng)3～5h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物置于冰水浴中，靜置3～5h待無固體繼續(xù)析出后，過濾得固體，該固體為粗產(chǎn)品；為了得到純度較高的物質(zhì)，將過濾后的固體真空干燥，以體積比為1:4～6的乙酸乙酯和石油醚作為淋洗劑，進(jìn)行柱層析提純，產(chǎn)物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑，計(jì)算產(chǎn)率為84％。其中，水楊醛、乙醇、亞硫酸氫鈉、鄰苯二胺的用量比為1mmol:15～35ml:1～1.5mmol:1～1.5mmol。在本發(fā)明實(shí)施例中，制得2-(2-羥基苯基)苯并咪唑后，作為母體的2-(2-羥基苯基)苯并咪唑與2,4-二硝基苯磺酰氯的反應(yīng)包括：在冰水浴條件下，將母體充分溶于二氯甲烷中即得第一溶液；以三乙胺作為縛酸劑，將三乙胺加入第一溶液中；為了讓反應(yīng)更加充分，在磁力攪拌的條件下，逐滴滴加2,4-二硝基苯磺酰氯。較優(yōu)的，先將2,4-二硝基苯磺酰氯溶于二氯甲烷中得第二溶液，再向加入了三乙胺的第一溶液中逐滴滴加第二溶液；在冰水浴中反應(yīng)12～16h，反應(yīng)結(jié)束后，通過減壓蒸餾得粗產(chǎn)品，再通過柱層析提純產(chǎn)物。提純過程中，以乙酸乙酯和石油醚的混合液作為淋洗劑，乙酸乙酯與石油醚的體積比優(yōu)選為1:2～4。其中，母體、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的摩爾比為1:1～2:1～2。該范圍值是發(fā)明人經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)并結(jié)合自身經(jīng)驗(yàn)得到的優(yōu)選值，該反應(yīng)的產(chǎn)率為86％。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1本實(shí)施例提供了一種母體，通過以下步驟制得：將水楊醛溶于乙醇溶劑中，加入亞硫酸氫鈉，再加入溶有鄰苯二胺的乙醇溶劑，升溫加熱反應(yīng)3h；其中，水楊醛、乙醇、亞硫酸氫鈉、鄰苯二胺的用量比為1mmol:15ml:1mmol:1mmol；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物置于冰水浴中，靜置3h過濾得固體；將過濾后的固體真空干燥，以體積比為1:4的乙酸乙酯和石油醚作為淋洗劑，進(jìn)行柱層析提純，產(chǎn)物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。提純，產(chǎn)物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。實(shí)施例2本實(shí)施例提供了一種母體，通過以下步驟制得：將水楊醛溶于乙醇溶劑中，加入亞硫酸氫鈉；再加入溶有鄰苯二胺的乙醇溶劑，升溫加熱至回流后，繼續(xù)反應(yīng)5h；其中，水楊醛、乙醇、亞硫酸氫鈉、鄰苯二胺的用量比為1mmol:35ml:1.5mmol:1.5mmol；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物置于冰水浴中，靜置5h過濾得固體；將過濾后的固體真空干燥，以體積比為1:6的乙酸乙酯和石油醚作為淋洗劑，進(jìn)行柱層析提純，產(chǎn)物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。提純，產(chǎn)物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。實(shí)施例3本實(shí)施例提供了一種母體，通過以下步驟制得：將水楊醛溶于乙醇溶劑中，加入亞硫酸氫鈉后，磁力攪拌1h；再加入溶有鄰苯二胺的乙醇溶劑，升溫加熱至回流后，繼續(xù)反應(yīng)4h；其中，水楊醛、乙醇、亞硫酸氫鈉、鄰苯二胺的用量比為1mmol:25ml:1.25mmol:1.25mmol；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物置于冰水浴中，靜置4h過濾得固體；將過濾后的固體真空干燥，以體積比為1:5的乙酸乙酯和石油醚作為淋洗劑，進(jìn)行柱層析提純，產(chǎn)物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。提純，產(chǎn)物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。實(shí)施例4本實(shí)施例提供了一種母體，通過以下步驟制得：將水楊醛溶于乙醇溶劑中，加入亞硫酸氫鈉后，磁力攪拌2h；再加入溶有鄰苯二胺的乙醇溶劑，升溫加熱至回流后，繼續(xù)反應(yīng)4h；其中，水楊醛、乙醇、亞硫酸氫鈉、鄰苯二胺的用量比為1mmol:25ml:1.2mmol:1.2mmol；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物置于冰水浴中，靜置4h過濾得固體；將過濾后的固體真空干燥，以體積比為1:5的乙酸乙酯和石油醚作為淋洗劑，進(jìn)行柱層析提純，產(chǎn)物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。提純，產(chǎn)物即為2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。實(shí)施例5本實(shí)施例提供了一種熒光檢測(cè)物質(zhì)，通過以下步驟制得：在冰水浴條件下，將實(shí)施例4的母體2-(2-羥基苯基)苯并咪唑充分溶于二氯甲烷中即得第一溶液；向第一溶液中加入三乙胺；將2,4-二硝基苯磺酰氯溶于二氯甲烷中得第二溶液，在磁力攪拌的條件下，逐滴滴加第二溶液；在冰水浴中反應(yīng)12h后，通過減壓蒸餾、柱層析提純產(chǎn)物。提純過程中，乙酸乙酯與石油醚的體積比為1:2。其中，母體、、二氯甲烷、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的用量比為1mmol:10ml:1mmol:1mmol。實(shí)施例6本實(shí)施例提供了一種熒光檢測(cè)物質(zhì)，通過以下步驟制得：在冰水浴條件下，將實(shí)施例4的母體2-(2-羥基苯基)苯并咪唑充分溶于二氯甲烷中即得第一溶液；向第一溶液中加入三乙胺；將2,4-二硝基苯磺酰氯溶于二氯甲烷中得第二溶液，在磁力攪拌的條件下，逐滴滴加第二溶液；在冰水浴中反應(yīng)16h后，通過減壓蒸餾、柱層析提純產(chǎn)物。提純過程中，乙酸乙酯與石油醚的體積比為1:4。其中，母體、二氯甲烷、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的用量比為1mmol:30ml:2mmol:2mmol。實(shí)施例7本實(shí)施例提供了一種熒光檢測(cè)物質(zhì)，通過以下步驟制得：在冰水浴條件下，將實(shí)施例4的母體2-(2-羥基苯基)苯并咪唑充分溶于二氯甲烷中即得第一溶液；向第一溶液中加入三乙胺；將2,4-二硝基苯磺酰氯溶于二氯甲烷中得第二溶液，在磁力攪拌的條件下，逐滴滴加第二溶液；在冰水浴中反應(yīng)14h后，通過減壓蒸餾、柱層析提純產(chǎn)物。提純過程中，乙酸乙酯與石油醚的體積比為1:3。其中，母體、二氯甲烷、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的摩爾比為1mmol:20ml:1.5mmol:1.5mmol。實(shí)施例8本實(shí)施例提供了一種熒光檢測(cè)物質(zhì)，通過以下步驟制得：在冰水浴條件下，將實(shí)施例4的母體2-(2-羥基苯基)苯并咪唑充分溶于二氯甲烷中即得第一溶液；向第一溶液中加入三乙胺；將2,4-二硝基苯磺酰氯溶于二氯甲烷中得第二溶液，在磁力攪拌的條件下，逐滴滴加第二溶液；在冰水浴中反應(yīng)14h后，通過減壓蒸餾、柱層析提純產(chǎn)物。提純過程中，乙酸乙酯與石油醚的體積比為1:3。其中，母體、二氯甲烷、三乙胺、2,4-二硝基苯磺酰氯的摩爾比為1mmol:20ml:1.2mmol:1.2mmol。試驗(yàn)例1選取實(shí)施例5～8的熒光檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行產(chǎn)率計(jì)算，結(jié)果如下：表1熒光檢測(cè)物質(zhì)的產(chǎn)率實(shí)施例5實(shí)施例6實(shí)施例7實(shí)施例8產(chǎn)率75％79％84％89％由表1可知，實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)產(chǎn)率最高。試驗(yàn)例2本試驗(yàn)例針對(duì)實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)試分析。圖1為實(shí)施例4的母體及實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)的質(zhì)譜驗(yàn)證圖。由圖1分析可知，實(shí)施例4的母體及實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)均為目標(biāo)產(chǎn)物。試驗(yàn)例3分別采用相同的溶劑將下述物質(zhì)配制為相同體積且溶質(zhì)濃度相同(50μm)的測(cè)試液。fluorescentprobe測(cè)試液：實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)；fluorescentprobe+aminophenol測(cè)試液：實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)與半胱氨酸、谷胱氨酸的混合物；fluorescentprobe+cys測(cè)試液：實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)與半胱氨酸(cysteine,cys)的混合物；fluorescentprobe+na2s測(cè)試液：實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)與na2s的混合物；fluorescentprobe+nahs測(cè)試液：實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)與nahs的混合物；hbi測(cè)試液：母體2-(2-羥基苯基)苯并咪唑。分別對(duì)上述測(cè)試樣品進(jìn)行熒光測(cè)試，結(jié)果如圖2。如圖2所示，上述測(cè)試樣品的測(cè)試曲線中，(a)曲線對(duì)應(yīng)fluorescentprobe測(cè)試液；(b)曲線對(duì)應(yīng)fluorescentprobe+aminophenol測(cè)試液，(c)曲線對(duì)應(yīng)fluorescentprobe+cys測(cè)試液，(d)曲線對(duì)應(yīng)fluorescentprobe+na2s測(cè)試液，(e)曲線對(duì)應(yīng)fluorescentprobe+nahs測(cè)試液，(f)曲線對(duì)應(yīng)hbi測(cè)試液。由圖2可知，只含有實(shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)的測(cè)試樣品(fluorescentprobe測(cè)試液)無特征發(fā)射峰，其他的測(cè)試樣品均在452nm處出現(xiàn)特征發(fā)射峰?？梢员砻鲗?shí)施例8的熒光檢測(cè)物質(zhì)可檢測(cè)巰基類物質(zhì)，且選擇型號(hào)、靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的快速檢測(cè)。綜上所述，本發(fā)明以母體與2,4-二硝基苯磺酰氯反應(yīng)制備了新型的熒光檢測(cè)物質(zhì)。該熒光檢測(cè)物質(zhì)將可產(chǎn)生esipt機(jī)理的羥基官能團(tuán)用2,4-二硝基苯磺酰氯封閉，使母體熒光關(guān)閉。在巰基類物質(zhì)作用下，可以使熒光打開，起到檢測(cè)效果。具有抗干擾、選擇性好、專一性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的快速檢測(cè)。該制備方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、合成簡(jiǎn)單、產(chǎn)物易分離純化，可廣泛應(yīng)用于巰基類物質(zhì)的檢測(cè)。以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁12