本發(fā)明涉及使用由靶分子控制的核酸聚合酶活性檢測(cè)和量化生物分子的方法，且更具體地涉及用于檢測(cè)或量化生物分子的方法，其可以高靈敏性檢測(cè)和量化核酸、蛋白、小分子物質(zhì)、生理活性物質(zhì)(酶活性)等，所述檢測(cè)或量化以由特異性核酸的特異性結(jié)合引起的dna聚合酶活性的變化為基礎(chǔ)，所述特異性核酸與所制備的dna適體(aptamer)形成復(fù)合物適體以包含特異性識(shí)別所述特異性核酸的單鏈dna。
背景技術(shù)：
：基于核酸的檢測(cè)技術(shù)在疾病診斷、藥物檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和刑事調(diào)查中起重要的作用，且對(duì)于具有出色靈敏性和特異性并便于使用的新型檢測(cè)技術(shù)存在持續(xù)的需求。已在現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)使用的基于核酸的檢測(cè)技術(shù)基于為u形dna探針的分子信標(biāo)(molecularbeacon)，所述u形dna探針用熒光團(tuán)和淬滅劑標(biāo)記。該技術(shù)包括確認(rèn)熒光信號(hào)是否由分子信標(biāo)的構(gòu)象變化產(chǎn)生，所述分子信標(biāo)的構(gòu)象變化由靶核酸的存在導(dǎo)致(tyagietal.,naturebiotechnology,14:303-308,1996；masukoetal.,nucleicacidsresearch,26:5409-5416,1998)。由于該技術(shù)可迅速分析靶核酸而無(wú)需分離核酸，其被廣泛使用，且已開(kāi)發(fā)了多種類型的基于分子信標(biāo)的核酸分析技術(shù)(songetal.,angewandtechemie-internationaledition,48:8670-8674,2009；wuetal.,biosensors&bioelectronics,26:3870-3875,2011；yehetal.,nanoletters,10:3870-3875,2011)。然而，上述基于分子信標(biāo)的分析技術(shù)具有的不足在于，由于靶核酸和分子信標(biāo)以1:1的比率反應(yīng)以生成熒光信號(hào)，難以實(shí)現(xiàn)較高的靈敏性。近年來(lái)，出于克服該問(wèn)題并開(kāi)發(fā)具有出色靈敏性的檢測(cè)傳感器的目的，已對(duì)使用酶作為工具用于信號(hào)放大做出了嘗試。典型的實(shí)例包括其中酶以檢測(cè)探針標(biāo)記用于檢測(cè)靶核酸的系統(tǒng)，且其中引入了抑制劑(gianneschietal.,angewandtechemie-internationaledition,46:3955-3958,2007；saghatelianetal.,journaloftheamericanchemicalsociety,125:344-345,2003；pavlovetal.,journaloftheamericanchemicalsociety,127:6522-6523,2005；niemeyeretal.,angewandtechemie-internationaledition,49:1200-1216,2010)。在該系統(tǒng)中，通過(guò)與檢測(cè)探針的雜交，靶核酸的存在阻斷抑制劑的抑制功能，且恢復(fù)的酶活性生成高熒光信號(hào)。然而，該技術(shù)具有的不足在于，其需要使用抑制劑標(biāo)記酶的步驟，耗時(shí)長(zhǎng)且需要很多技巧。此外，其不足還在于標(biāo)記操作本身可能引起酶構(gòu)象的變化從而降低酶的活性。此外，該技術(shù)具有的局限在于，其難以用作用于檢測(cè)多種靶核酸的通用技術(shù)，這是由于其需要為每種靶核酸制備酶-抑制劑復(fù)合物。因此，需要開(kāi)發(fā)無(wú)標(biāo)記的基于酶的技術(shù)用于檢測(cè)多種靶核酸。因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出大量的努力以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題并建立了高度靈敏的基于酶的檢測(cè)和量化系統(tǒng)，其無(wú)需使用抑制劑標(biāo)記且其可普遍用于檢測(cè)和量化多種靶核酸。結(jié)果是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了使用包含特異性識(shí)別靶核酸的單鏈dna的dna適體以選擇性和精確的方式實(shí)現(xiàn)了下述：(1)以關(guān)閉(switch-off)模式檢測(cè)和量化靶核酸；(2)以開(kāi)啟(switch-on)模式檢測(cè)和量化靶核酸；(3)以開(kāi)啟模式檢測(cè)和量化靶分子；(4)以開(kāi)啟模式檢測(cè)和量化靶ber酶的活性；和(5)以開(kāi)啟模式檢測(cè)和量化靶核酸酶，由此完成本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的主要目的是提供使用dna適體檢測(cè)和量化靶核酸的方法，所述dna適體包含特異性識(shí)別靶核酸的單鏈dna。本發(fā)明的另一目的是提供使用適體檢測(cè)和量化靶核酸的方法，所述適體包含與阻斷劑核酸(blockernucleicacid)互補(bǔ)的單鏈dna，所述阻斷劑核酸具有與靶核酸互補(bǔ)的序列。本發(fā)明的另一目的是提供使用適體檢測(cè)和量化靶分子的方法，所述適體包含與阻斷劑dna(blockerdna)互補(bǔ)的單鏈dna，所述阻斷劑dna特異性地識(shí)別靶分子且具有與靶分子結(jié)合的序列。本發(fā)明的另一目的是提供使用適體檢測(cè)和量化靶ber(堿基切除修復(fù)(baseexcisionrepair))酶活性的方法，所述適體包含與阻斷劑核酸互補(bǔ)的單鏈dna，所述阻斷劑核酸具有特異性針對(duì)靶ber(堿基切除修復(fù))酶的核苷酸序列。本發(fā)明的另一目的是提供使用適體檢測(cè)和量化靶核酸酶活性的方法，所述適體包含與阻斷劑核酸互補(bǔ)的單鏈dna，所述阻斷劑核酸具有特異性針對(duì)靶核酸酶的核苷酸序列。技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以關(guān)閉模式檢測(cè)或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶至包含適體和檢測(cè)樣品的混合物，并使所述核酸聚合酶與所述混合物反應(yīng)以由此使核酸聚合酶與適體-靶核酸復(fù)合物結(jié)合，所述適體含有特異性識(shí)別所述靶核酸的單鏈核酸，且所述檢測(cè)樣品推測(cè)可能(suppose)包含所述靶核酸，(b)將包含引物和信號(hào)生成物質(zhì)的混合物與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合，隨后進(jìn)行引物延伸(primerextension)反應(yīng)；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應(yīng)以由此檢測(cè)或量化所述靶核酸。本發(fā)明還提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測(cè)可能(presume)包含所述靶核酸的檢測(cè)樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測(cè)樣品與所述混合物反應(yīng)以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復(fù)合物結(jié)合，所述阻斷劑核酸具有與所述靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號(hào)生成物質(zhì)的混合物與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合，隨后進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應(yīng)以由此檢測(cè)或量化所述靶核酸。本發(fā)明還提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化所述靶分子的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測(cè)可能包含所述靶分子的檢測(cè)樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測(cè)樣品與所述混合物反應(yīng)以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復(fù)合物結(jié)合，所述阻斷劑核酸具有特異性識(shí)別并與結(jié)合所述靶分子的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號(hào)生成物質(zhì)的混合物與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合，隨后進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應(yīng)以由此檢測(cè)或量化所述靶分子。本發(fā)明還提供使用由ber(堿基切除修復(fù))酶控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化靶ber(堿基切除修復(fù))酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測(cè)可能包含所述靶ber酶的檢測(cè)樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測(cè)樣品與所述混合物反應(yīng)以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復(fù)合物結(jié)合，所述阻斷劑核酸具有特異性針對(duì)靶ber酶的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號(hào)生成物質(zhì)的混合物與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合，隨后進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；和c)分析步驟(b)的引物延伸反應(yīng)以由此檢測(cè)或量化所述靶ber(堿基切除修復(fù))酶的活性。本發(fā)明還提供使用由靶核酸酶控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化靶核酸酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測(cè)可能包含所述靶核酸酶的檢測(cè)樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測(cè)樣品與所述混合物反應(yīng)以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復(fù)合物結(jié)合，所述阻斷劑核酸具有特異性針對(duì)所述靶核酸酶的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號(hào)生成物質(zhì)的混合物與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合，隨后進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應(yīng)以由此檢測(cè)或量化所述靶核酸酶活性。附圖簡(jiǎn)述圖1是顯示靶dna誘導(dǎo)的dna聚合酶活性開(kāi)關(guān)和使用taqman探針?lè)治鏊鲩_(kāi)關(guān)的原理的示意圖。具體地，圖1是顯示基于dna適體檢測(cè)和量化靶核酸的原理的示意圖，所述dna適體特異性地與taqdna聚合酶結(jié)合以抑制酶的活性。圖2顯示了測(cè)試靶dna誘導(dǎo)的dna聚合酶活性開(kāi)關(guān)可行性的結(jié)果。具體地，圖2顯示了表明經(jīng)設(shè)計(jì)以包含多種單鏈核苷酸序列的dna適配體通過(guò)與互補(bǔ)的靶核酸結(jié)合抑制聚合酶活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(a)在引物延伸反應(yīng)過(guò)程中taqman探針熒光強(qiáng)度的變化。(b)引物延伸反應(yīng)200分鐘后熒光信號(hào)的變化。此處，f200和f0分別代表引物延伸反應(yīng)200分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強(qiáng)度。nc：無(wú)聚合酶的樣品，pc：包含聚合酶的樣品，(1)：通過(guò)將作為陽(yáng)性對(duì)照的原始dna適體添加至pc獲得的樣品，(#,a)：通過(guò)僅將適體添加至pc而無(wú)靶核酸獲得的樣品，和(#,p)：通過(guò)將靶核酸和適體添加至pc獲得的樣品。在該實(shí)驗(yàn)中使用的聚合酶、dna適體和靶核酸的終濃度分別為5.5nm、100nm和100nm。圖3顯示通過(guò)應(yīng)用由靶核酸(示于圖2中)對(duì)聚合酶活性的控制用于檢測(cè)和量化脲(解脲脲原體(ureaplasmaurealyticum)，一種引起性傳播疾病的病原體)獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(a)引物延伸反應(yīng)過(guò)程中taqman探針熒光強(qiáng)度的變化。(b)引物延伸反應(yīng)50分鐘后熒光信號(hào)的變化。此處，f50和f0分別代表引物延伸反應(yīng)50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強(qiáng)度。(c)page(聚丙烯酰胺凝膠電泳)圖像，nc：無(wú)聚合酶的樣品，pc：包含聚合酶的樣品，(1)：通過(guò)僅將脲特異性適體添加至pc而無(wú)互補(bǔ)的脲靶核酸獲得的樣品，(2)：通過(guò)將互補(bǔ)的脲靶核酸和脲特異性適體添加至pc獲得的樣品，和(3)：通過(guò)將非互補(bǔ)的衣原體靶核酸和脲特異性適體添加至pc獲得的樣品。該實(shí)驗(yàn)中使用的聚合酶、dna適體和靶核酸的終濃度分別為5.5nm、200nm和100nm。圖4顯示測(cè)量本發(fā)明用于檢測(cè)和量化脲靶dna的系統(tǒng)的靈敏性的結(jié)果。具體地，圖4顯示測(cè)量基于通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件添加不同濃度的脲dna時(shí)發(fā)生的熒光信號(hào)的結(jié)果。(a)引物延伸反應(yīng)過(guò)程中taqman探針熒光強(qiáng)度的變化。不同濃度的脲靶dna存在下將脲特異性適體添加至包含聚合酶的樣品。(b)不同濃度的脲靶dna存在下引物延伸反應(yīng)50分鐘后熒光信號(hào)的變化。f50和f0分別代表引物延伸反應(yīng)50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強(qiáng)度。(b)中的插圖：顯示在脲靶dna的濃度(0-10nm)引物延伸反應(yīng)50分鐘后熒光強(qiáng)度的變化的線形圖。該實(shí)驗(yàn)中使用的聚合酶和dna適體的終濃度分別為5.5nm和200nm。圖5顯示測(cè)量本發(fā)明用于檢測(cè)和量化衣原體靶dna的系統(tǒng)的靈敏性的結(jié)果。具體地，圖5顯示表明用于檢測(cè)和量化靶dna的新開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)可普遍用于檢測(cè)和量化多種靶dna的結(jié)果。(a)引物延伸反應(yīng)過(guò)程中taqman探針熒光強(qiáng)度的變化。不同濃度的衣原體靶dna存在下，將衣原體特異性適體添加至包含聚合酶的樣品。(b)不同濃度的衣原體靶dna存在下引物延伸反應(yīng)50分鐘后熒光信號(hào)的變化。此處，f50和f0分別代表引物延伸反應(yīng)50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強(qiáng)度。(b)中的插圖：顯示在衣原體靶dna的濃度(0-10nm)引物延伸反應(yīng)50分鐘后熒光強(qiáng)度的變化的線形圖。該實(shí)驗(yàn)中使用的聚合酶和dna適體的終濃度分別為5.5nm和200nm。圖6是顯示靶dna誘導(dǎo)的聚合酶活性開(kāi)關(guān)和使用taqman探針?lè)治鏊鲩_(kāi)關(guān)的原理的示意圖。具體地，圖6是顯示通過(guò)引入阻斷劑dna檢測(cè)和量化靶dna的原理的示意圖，從而除了如上文所述實(shí)施的關(guān)閉模式(信號(hào)關(guān)閉模式)之外，實(shí)施了以開(kāi)啟模式(信號(hào)開(kāi)啟模式)操作的本發(fā)明。圖7顯示了使用開(kāi)啟系統(tǒng)檢測(cè)和量化脲靶dna的結(jié)果。具體地，圖7顯示了在經(jīng)設(shè)計(jì)以開(kāi)啟模式(信號(hào)開(kāi)啟模式)操作的靶dna檢測(cè)和量化系統(tǒng)中由靶dna控制聚合酶活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(a)將不同濃度的脲特異性阻斷劑dna添加至包含聚合酶和dna適體的樣品。(b)將下述添加至包含dna聚合酶的樣品：游離的dna適體(1)、或脲特異性阻斷劑dna存在下的dna適體(2)、或具有互補(bǔ)的脲靶dna的脲特異性阻斷劑dna存在下的dna適體(3)、或具有非互補(bǔ)的衣原體靶dna的脲特異性阻斷劑dna存在下的dna適體(4)。(c)引物延伸反應(yīng)過(guò)程中taqman探針熒光強(qiáng)度的變化。將不同濃度的脲靶dna添加至包含dna聚合酶和dna適體的樣品，所述dna適體與脲特異性阻斷劑dna結(jié)合。(d)不同濃度的脲靶dna存在下引物延伸反應(yīng)50分鐘后熒光信號(hào)的變化。(d)中的插圖：顯示在脲靶dna的濃度(0-20nm)引物延伸反應(yīng)50分鐘后熒光強(qiáng)度的變化的線形圖。該實(shí)驗(yàn)中使用的聚合酶、dna適體和脲特異性阻斷劑dna的終濃度分別為5.5nm、200nm和20nm。圖8是顯示靶分子誘導(dǎo)的dna聚合酶活性開(kāi)關(guān)和使用taqman探針?lè)治鏊鲩_(kāi)關(guān)的原理的示意圖。圖9是顯示udg靶標(biāo)酶誘導(dǎo)的dna聚合酶活性開(kāi)關(guān)和使用taqman探針?lè)治鏊鲩_(kāi)關(guān)的原理的示意圖。圖10顯示了測(cè)試udg靶標(biāo)酶誘導(dǎo)的dna聚合酶活性開(kāi)關(guān)可行性的結(jié)果。具體地，圖10顯示了使用經(jīng)設(shè)計(jì)以特異性響應(yīng)udg的dna適體測(cè)試udg對(duì)dna聚合酶活性的影響的結(jié)果適體。(a)引物延伸反應(yīng)過(guò)程中taqman探針熒光強(qiáng)度的變化。(b)引物延伸反應(yīng)50分鐘后熒光信號(hào)的變化。此處，f50和f0分別代表引物延伸反應(yīng)50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強(qiáng)度。將dna聚合酶添加至包含下述的樣品：udg適體(1)，或udg阻斷劑存在下的udg適體(2)，或具有udg的udg阻斷劑存在下的udg適體(3)，或?qū)φ誹dg阻斷劑存在下的udg適體(4)，或具有udg的對(duì)照udg阻斷劑存在下的udg適體(5)。在該實(shí)驗(yàn)中使用的聚合酶、udg適體、udg阻斷劑和udg的終濃度分別為5.5nm、200nm、10nm和0.5u/ml。圖11顯示了測(cè)量本發(fā)明用于檢測(cè)和量化udg靶標(biāo)酶的系統(tǒng)的靈敏性的結(jié)果。具體地，圖10顯示了測(cè)量基于通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件添加不同濃度的udg時(shí)發(fā)生的熒光信號(hào)的結(jié)果。(a)引物延伸反應(yīng)過(guò)程中taqman探針熒光強(qiáng)度的變化。將不同濃度的udg添加至包含udg適體和udg阻斷劑的udg檢測(cè)探針樣品。(b)不同濃度的udg存在下引物延伸反應(yīng)50分鐘后熒光信號(hào)的變化。此處，f50和f0分別代表引物延伸反應(yīng)50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強(qiáng)度。(b)中的插圖：顯示在udg的濃度(0-0.3u/ml)引物延伸反應(yīng)50分鐘后熒光強(qiáng)度的變化的線形圖。該實(shí)驗(yàn)中使用的聚合酶、udg適體和udg阻斷劑的終濃度分別為5.5nm、200nm、10nm和10nm。圖12顯示了測(cè)試本發(fā)明用于檢測(cè)和量化udg靶標(biāo)酶的系統(tǒng)的特異性的結(jié)果。(b)引物延伸反應(yīng)50分鐘后熒光信號(hào)的變化。此處，f50和f0分別代表引物延伸反應(yīng)50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強(qiáng)度。將dna聚合酶添加至包含下述的樣品：空白(1)、udg(2)、haag(3)、hogg1(4)、fpg(5)、bamhi(6)、exoi(7)和λ核酸外切酶(8)。該實(shí)驗(yàn)中使用的聚合酶、udg適體、udg阻斷劑、udg和另一種酶的終濃度分別為5.5nm、200nm、10nm、0.5u/ml和5u/ml。用于實(shí)施本發(fā)明的最佳模式在本發(fā)明中，建立了高度靈敏的基于酶的檢測(cè)和量化系統(tǒng)，其無(wú)需使用抑制劑標(biāo)記且可普遍用于檢測(cè)和量化多種靶dna。在本發(fā)明中，引入了實(shí)施dna延伸反應(yīng)的taqdna聚合酶和與taqdna聚合酶特異性結(jié)合以抑制dna聚合酶活性的dna適體(dangetal.,journalofmolecularbiology,264:268-278,1996；linetal.,journalofmolecularbiology,271:100-111,1997；yakimovichetal.,biochemistry-moscow,68:228-235,2003)。具體地，設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)和量化靶核酸的dna適體以包含特異性識(shí)別靶核酸的單鏈dna，且可以看到的是，僅當(dāng)所述單鏈dna通過(guò)與靶核酸結(jié)合穩(wěn)定化時(shí)，其可與taqdna聚合酶結(jié)合以抑制dna聚合酶活性。此外，還開(kāi)發(fā)了通過(guò)與阻斷劑dna結(jié)合抑制聚合酶活性的dna適體系統(tǒng)。由于設(shè)計(jì)了阻斷劑dna以具有與靶核酸互補(bǔ)的序列，靶核酸的存在從dna適體分離阻斷劑dna。結(jié)果是，dna適體不再抑制聚合酶活性，且因此聚合酶的特征性活性恢復(fù)。通過(guò)核酸酶和dna適體之間的相互作用的這種聚合酶活性的變化可通過(guò)實(shí)時(shí)測(cè)量在基于taqman探針的引物延伸反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生的熒光信號(hào)進(jìn)行分析。本發(fā)明具有超越常規(guī)基于核酸的檢測(cè)技術(shù)(hutteretal.,trendsinpharmacologicalsciences,34:497-507,2013)的優(yōu)勢(shì)在于，由于識(shí)別靶核酸的部分和信號(hào)檢測(cè)部分彼此分離，可基于dna適體的單鏈核苷酸序列的變化分析多種靶核酸，所述dna適體是識(shí)別靶核酸的部分，同時(shí)保持信號(hào)檢測(cè)部分而無(wú)變化。此外，本發(fā)明還具有通過(guò)使用適體序列以高靈敏性檢測(cè)和量化除靶核酸之外的多種生物分子和化學(xué)物質(zhì)的能力，所述適體序列作為阻斷劑dna特異性識(shí)別細(xì)胞、蛋白、小分子物質(zhì)等。在本發(fā)明中使用的基于taqman探針的信號(hào)生成技術(shù)可容易地用顯色和電化學(xué)技術(shù)等替換。在本發(fā)明中，已發(fā)現(xiàn)僅當(dāng)dna適體(其特異性識(shí)別taqdna聚合酶以抑制聚合酶活性)被修飾從而其將通過(guò)與靶核酸結(jié)合形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)時(shí)，其可抑制聚合酶活性?；谠摪l(fā)現(xiàn)，開(kāi)發(fā)了可普遍用于檢測(cè)和量化多種靶核酸的新方法。目前尚未報(bào)道通過(guò)靶核酸誘導(dǎo)嘗試的聚合酶活性控制和基于其開(kāi)發(fā)的檢測(cè)和量化系統(tǒng)，且本發(fā)明的系統(tǒng)具有的超越常規(guī)基于核酸的檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于，其可僅基于在dna適體的單鏈核苷酸序列的變化檢測(cè)和量化多種靶核酸，且在于可以簡(jiǎn)單的方式實(shí)施檢測(cè)和量化而無(wú)需使用抑制劑標(biāo)記酶。此外，本發(fā)明不僅可基于靶標(biāo)控制的聚合酶活性用于檢測(cè)和量化靶核酸，還可檢測(cè)和量化其他生物分子和化學(xué)物質(zhì)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)"核酸"意為單鏈或雙鏈dna、rna和及其任何化學(xué)修飾物，且這樣的修飾包括但不限于：骨架(backbone)修飾、甲基化、異常的堿基配對(duì)組合、5-溴-尿嘧啶的取代等，條件僅是所述修飾不干擾所選核酸的擴(kuò)增。如本文使用的術(shù)語(yǔ)"適體"指可以高親和力特異性識(shí)別其靶分子的小的單鏈寡核苷酸。本發(fā)明中的適體一般可具有約15至約200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，但不限于此。例如，適體的長(zhǎng)度可低于約100個(gè)核苷酸，且優(yōu)選低于約80個(gè)核苷酸。可在本發(fā)明中使用的適體的長(zhǎng)度不受具體限制，但可以是約96個(gè)核苷酸，且可通過(guò)后selex過(guò)程(post-selexprocess)修飾以具有20-30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。如果核苷酸總數(shù)小，則化學(xué)合成和大量生產(chǎn)得以改進(jìn)，且成本效益提高。此外，提供了對(duì)于在活體上應(yīng)用的較高穩(wěn)定性和較低毒性。本發(fā)明的適體可通過(guò)說(shuō)明書(shū)的公開(kāi)內(nèi)容和本領(lǐng)域本身已知的方法化學(xué)合成。適體通?？墒褂胹elex方法或其改進(jìn)的版本制備[例如ellingtonetal.,nature,346:818-822,1990；tuerketal.,science,249:505-510,1990]。selex方法指鑒別特異性針對(duì)每種分子的dna序列的方法，其通過(guò)選擇和擴(kuò)增對(duì)于來(lái)自隨機(jī)合成的dna或rna的集合的特定分子具有高特異性的dna或rna實(shí)現(xiàn)(j.w.parketal.,chemicalcommunications,48(15):2071-2073,2012)。在selex方法中，濃縮對(duì)于靶分子具有較強(qiáng)結(jié)合親和力的適體并通過(guò)增加輪數(shù)或使用競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)選擇。因此，通過(guò)調(diào)整selex的輪數(shù)和/或改變競(jìng)爭(zhēng)性條件，在一些情況中可獲得具有不同結(jié)合親和力的適體、具體不同結(jié)合模式的適體，或具有相同結(jié)合親和力或結(jié)合模式但具有不同核苷酸序列的適體。包含在本發(fā)明適體中的每種相同或不同的核苷酸可以是在核糖(即嘧啶核苷酸的核糖)的2′位置包含羥基基團(tuán)的核苷酸(即未經(jīng)取代的核苷酸)或具有在核糖2’位置由任何原子或基團(tuán)取代的羥基基團(tuán)的核苷酸。由任何原子或基團(tuán)取代的這種核苷酸的實(shí)例包括由氫原子、氟原子或-o-烷基(例如-o-me基團(tuán))、-o-酰基(例如-o-cho基團(tuán))或氨基(例如-nh2基團(tuán))取代的核苷酸。本發(fā)明的適體還可以是其中在核糖的2'位置至少一個(gè)(例如1、2、3或4個(gè))核苷酸包含羥基或任何上述原子或基團(tuán)的核苷酸，例如包含至少兩個(gè)(例如2、3或4個(gè))選自下組的基團(tuán)：氫原子、氟原子、羥基和甲氧基。本發(fā)明的適體還可以是其中全部核苷酸在核糖的2’位置相同地包含羥基或任何上述原子或基團(tuán)，例如，選自下組的相同的基團(tuán)：氫原子、氟原子、羥基和-o-me基。本發(fā)明的適體可以是其中每個(gè)核苷酸的糖殘基(例如核糖或脫氧核糖)已經(jīng)修飾以增加適體對(duì)于靶分子或靶核酸的親和力、適體的穩(wěn)定性等的一種。作為在糖殘基中可修飾的位點(diǎn)的實(shí)例，可提到在2′-位置、3′-位置和/或4′-位置具有的氧原子由另一原子等替換的一些糖殘基。作為修飾的實(shí)例，可提到氟化作用、o-烷基化(例如o-甲基化、o-乙基化)、o-芳基化、s-烷基化(例如s-甲基化、s-乙基化)、s-芳基化和氨基化(例如-nh2)。糖殘基中這樣的改變可通過(guò)本身已知的方法實(shí)施(參加例如sproatetal.,nucle.acid.res.19:733-738,1991；cottonetal.,nucl.acid.res.19:2629-2635,1991；hobbsetal.,biochemistry,12:5138-5145,1973)。本發(fā)明的適體還可具有改變(例如化學(xué)取代)的核酸堿基(例如嘌呤或嘧啶)以增加其對(duì)于靶分子或靶核酸的親和力。這種改變的實(shí)例包括在5-位置的嘧啶改變、在6-和/或8-位置的嘌呤改變、具有外環(huán)胺的改變、用4-硫代尿苷取代和用5-溴或5-碘-尿嘧啶取代。此外，包含在本發(fā)明適體內(nèi)的磷酸基團(tuán)可經(jīng)改變以賦予對(duì)核酸酶和水解的抗性。例如，p(o)o基團(tuán)可用p(o)s(硫酯)、p(s)s(二硫代酯)、p(o)nr2(酰胺酯(amidate))、p(o)r、r(o)or’、co或ch2(甲縮醛)或3’-胺(-nh-ch2-ch2-)替換，其中r或r’的每個(gè)單元獨(dú)立地為h或取代或未取代的烷基(例如甲基、乙基)。連接基團(tuán)為例如-o-、-n-或-s-，且核苷酸可與相鄰的核苷酸經(jīng)由連接基團(tuán)結(jié)合。本發(fā)明中的改變還可包括如在3'和5'帽化(capping)的改變。改變可進(jìn)一步通過(guò)對(duì)末端添加聚乙二醇、氨基酸、肽、反向dt、核酸、核苷、肉豆蔻?；⑹懰嵊突?、二十二烷基、月桂?；?、硬脂?；?、棕櫚?；?、油酰基、亞油?；?、其他脂質(zhì)、類固醇、膽固醇、咖啡因、維生素、色素、熒光物質(zhì)、抗癌劑、毒素、酶、放射性物質(zhì)、生物素等(參見(jiàn)美國(guó)專利第5,660,985和5,756,703號(hào))。適體與靶分子以廣泛的多種結(jié)合模式結(jié)合，諸如基于磷酸基團(tuán)負(fù)電荷的離子鍵、基于核糖的疏水鍵和氫鍵及基于核酸堿基的氫鍵和堆疊相互作用。具體地，以與組成性核苷酸的數(shù)目相同數(shù)目存在的基于磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷的離子鍵強(qiáng)，且與存在于蛋白正電荷表面上的賴氨酸和精氨酸結(jié)合。由于該原因，未參與與靶分子的直接結(jié)合的核酸堿基可被取代。具體而言，由于莖(stem)結(jié)構(gòu)區(qū)已形成堿基對(duì)并面向雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)，核酸堿基不大可能直接與靶分子結(jié)合。因此，即使當(dāng)堿基對(duì)用另一堿基對(duì)替換時(shí)，適體的活性通常并不降低。在其中未形成堿基對(duì)的結(jié)構(gòu)中，諸如環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)，條件是核酸堿基未參與與靶分子的直接結(jié)合，則堿基取代是可能的。對(duì)于核糖2′-位置的修飾，在核糖2′-位置的官能團(tuán)很少直接與分子相互作用，但在多種情況中，這并無(wú)相關(guān)性，且可由另一經(jīng)修飾的分子取代。因此，適體經(jīng)常保持其活性，除非參與與靶分子直接結(jié)合的官能團(tuán)被取代或缺失。在本發(fā)明的實(shí)例中，作為以關(guān)閉模式用于檢測(cè)和量化靶dna的方法，實(shí)施了實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)經(jīng)設(shè)計(jì)以便包含多種單鏈核苷酸序列的dna適體與互補(bǔ)的靶核酸結(jié)合以抑制聚合酶活性。如圖2(a)和2(b)中所示，可以看到僅當(dāng)與dna適體的單鏈核苷酸序列互補(bǔ)的靶核酸存在下，dna適體抑制聚合酶的活性，且因此出現(xiàn)低熒光信號(hào)。此外，可以看到靶核酸存在下dna適體抑制聚合酶活性的程度與原始78聚體dna適體抑制聚合酶的程度相似。在本發(fā)明的另一實(shí)例中，在實(shí)施的實(shí)驗(yàn)中，將靶核酸誘導(dǎo)的聚合酶活性用于檢測(cè)和量化脲(解脲脲原體(ureaplasmaurealyticum)，一種引起性傳播疾病的病原體)。如圖3(a)、3(b)和3(c)中所示，可以看到僅在作為靶核酸的脲dna存在下，經(jīng)設(shè)計(jì)以與脲dna特異性結(jié)合的dna適體抑制聚合酶的活性。然而，當(dāng)添加不與dna適體相互作用的陰性對(duì)照衣原體(沙眼衣原體(chlamydiatrachomatis))dna時(shí)，可以看到dna聚合酶活性未受抑制并出現(xiàn)固有的高聚合酶活性。在本發(fā)明的另一實(shí)例中，實(shí)施了實(shí)驗(yàn)以測(cè)量基于優(yōu)化的條件在不同濃度添加脲dna時(shí)存在的熒光信號(hào)。結(jié)果是，可以看到，隨脲dna的濃度增加，聚合酶活性受到抑制，且因此發(fā)生熒光信號(hào)的減少。此外，可以看到的是，在0-10nm的脲dna濃度范圍熒光信號(hào)線性減少且檢測(cè)極限為0.91nm。在本發(fā)明的另一實(shí)例中，實(shí)施的實(shí)驗(yàn)中將以關(guān)閉模式用于檢測(cè)和量化靶dna的方法普遍用于檢測(cè)和量化多種靶核酸。因此，在該實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)了包含與衣原體dna特異性結(jié)合的單鏈dna的dna適體并與不同濃度的衣原體dna溫育。如圖5中所見(jiàn)，隨衣原體dna的濃度增加，聚合酶活性受到抑制，且結(jié)果是，發(fā)生熒光信號(hào)的減少?？梢钥吹降氖牵?-10nm的衣原體dna濃度范圍熒光信號(hào)線性減少且檢測(cè)極限為1.47nm。在本發(fā)明中使用的適體如下(下劃線：保守區(qū)(seqidno:21))：原始的dna適體:5'-ttctcggttggtctctggcggagcaagaccagacaatgtacagtattggcctgatcttgtgtatgattcgcttttccc-3'(seqidno:1)t20-適體:5'-ttttttttttttttttttttcaatgtacagtattg-3'(seqidno:2)隨機(jī)1-適體:5'-agtcagtcagtcagtcagtccaatgtacagtattg-3'(seqidno:4)隨機(jī)2-適體:5'-actgactgactgactgactgcaatgtacagtattg-3'(seqidno:6)t20-適體(反向):5'-caatgtacagtattgtttttttttttttttttttt-3'(seqidno:8)脲特異性適體1:5'-taggacggtcaccagtatttttaatcaatgtacagtattg-3'(seqidno:9)衣原體特異性適體:5'-tacaagctgcaatcccttttaagatcaatgtacagtattg-3'(seqidno:12)脲特異性適體2:5'-aaatactggtgaccgtcctacaatgtacagtattg-3'(seqidno:14)udg適體:5'-ttttaattttaattttcaatgtacagtattg-3'(seqidno:18)因此，第一方面，本發(fā)明涉及使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以關(guān)閉模式檢測(cè)或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶至包含適體和檢測(cè)樣品的混合物，并使所述核酸聚合酶與所述混合物反應(yīng)以由此使核酸聚合酶與適體-靶核酸復(fù)合物結(jié)合，所述適體含有特異性識(shí)別所述靶核酸的單鏈核酸，且所述檢測(cè)樣品推測(cè)可能包含所述靶核酸，(b)將包含引物和信號(hào)生成物質(zhì)的混合物與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合，隨后進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應(yīng)以由此檢測(cè)或量化所述靶核酸。在本發(fā)明中，所述適體的單鏈具有與所述靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列。此外，當(dāng)其與所述靶核酸結(jié)合時(shí)所述適體形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，且隨后與所述核酸聚合酶結(jié)合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述適體在其5’末端或3’末端具有seqidno:21所示的保守區(qū)。此外，所述適體具有選自下組的核苷酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8、seqidno:9和seqidno:12。在本發(fā)明中，所述靶核酸可選自下組：a20-靶標(biāo)、隨機(jī)1-靶標(biāo)、隨機(jī)2-靶標(biāo)、互補(bǔ)的脲-靶標(biāo)1、非互補(bǔ)的衣原體-靶標(biāo)1和互補(bǔ)的衣原體-靶標(biāo)2，且所述核酸聚合酶可以是taqdna聚合酶。在本發(fā)明中，將步驟(a)的混合物在約90℃加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約25℃，隨后向其添加所述核酸聚合酶并進(jìn)行反應(yīng)。更具體地，將步驟(a)的混合物在90℃加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，并在25℃溫育30分鐘，隨后向其添加核酸聚合酶并反應(yīng)20分鐘以由此使核酸聚合酶與適體-靶核酸復(fù)合物結(jié)合。在本發(fā)明中，包含所述信號(hào)生成物質(zhì)的混合物可進(jìn)一步包含模板核酸和taqman探針。在本發(fā)明中，將步驟(b)中使用的包含所述信號(hào)生成物質(zhì)的混合物在約90°加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約25℃，隨后使其進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)使所述引物和taqman探針與模板核酸結(jié)合，且隨后與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合。更具體地，將步驟(b)中使用的包含所述信號(hào)生成物質(zhì)的混合物在90°加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，隨后使其進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)使所述引物和taqman探針與模板核酸結(jié)合，且隨后進(jìn)行使所述引物和taqman探針與模板核酸結(jié)合的反應(yīng)達(dá)60分鐘，且隨后與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合。在本發(fā)明中，步驟(c)可包括檢測(cè)或量化源自步驟(b)的引物延伸反應(yīng)的信號(hào)以由此確定所述靶核酸的存在或不存在。此外，所述引物延伸反應(yīng)在20-30℃的溫度實(shí)施，且所述信號(hào)生成物質(zhì)用選自下組的物質(zhì)標(biāo)記：放射性同位素、熒光物質(zhì)、染料、納米顆粒、酶、酶底物、發(fā)光物質(zhì)和包含電化學(xué)官能團(tuán)的物質(zhì)。如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明使用靶核酸控制的核酸聚合酶活性以關(guān)閉模式檢測(cè)或量化靶核酸的方法是使用如下特性檢測(cè)和量化靶核酸的方法：當(dāng)其與靶核酸結(jié)合時(shí)包含單鏈核酸的適體形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，且隨后與核酸聚合酶結(jié)合以降低聚合酶的活性。如本文使用的術(shù)語(yǔ)"樣品"指包含或推測(cè)可能包含靶核酸或靶分子的且將對(duì)其進(jìn)行分析的組合物。樣品可以是收集自下述一種或多種的樣品：包括但不限于液體、土壤、空氣、食品、廢物、動(dòng)物腸道和動(dòng)物組織。此處，液體的實(shí)例可以是血清、血液、尿液、水、淚液、汗液、唾液、血液、血清、血漿、痰液、淋巴液和腦脊液。水的實(shí)例包括河水、海水、湖水和雨水。廢物的實(shí)例包括污水、廢水等。動(dòng)物包括人體。此外，動(dòng)物和植物組織的實(shí)例包括粘膜、皮膚、皮質(zhì)、毛發(fā)、鱗屑、眼睛、舌頭、臉頰、蹄、喙、鼻、腳、手、嘴、乳頭、耳朵、鼻等。在本發(fā)明的另一實(shí)例中，在靶核酸檢測(cè)和量化系統(tǒng)(其經(jīng)設(shè)計(jì)以便操作以開(kāi)啟模式檢測(cè)和量化靶dna的方法)中，實(shí)施了用于靶核酸控制的聚合酶活性的實(shí)驗(yàn)(圖7)。具體地，設(shè)計(jì)了特異性識(shí)別脲dna的阻斷劑dna，并構(gòu)建了適于所述阻斷劑dna的dna適體以實(shí)施實(shí)驗(yàn)。可以看到的是，隨阻斷劑dna的濃度增加，聚合酶活性受到抑制。使用實(shí)驗(yàn)中確定為最佳的20nm的阻斷劑dna濃度()，實(shí)施了脲dna的檢測(cè)和量化。如圖7(b)中所示，可以看到的是，僅當(dāng)靶核酸脲dna存在時(shí)(3)，聚合酶被活化，并出現(xiàn)高熒光信號(hào)。然而，當(dāng)陰性對(duì)照衣原體dna存在時(shí)(4)，聚合酶活性持續(xù)受到抑制，并出現(xiàn)低熒光信號(hào)。測(cè)量了在通過(guò)實(shí)驗(yàn)所選的條件下添加不同濃度的脲dna時(shí)出現(xiàn)的熒光信號(hào)。如圖7(c)和7(d)中所見(jiàn)，隨脲dna的濃度增加，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號(hào)。此外，可以看到的是，在0-20nm的脲dna濃度范圍中熒光信號(hào)線性增加且檢測(cè)極限為2.67nm。因此，第二方面，本發(fā)明涉及使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測(cè)可能包含所述靶核酸的檢測(cè)樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測(cè)樣品與所述混合物反應(yīng)以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復(fù)合物結(jié)合，所述阻斷劑核酸具有與所述靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號(hào)生成物質(zhì)的混合物與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合，隨后進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應(yīng)以由此檢測(cè)或量化所述靶核酸。在本發(fā)明中，所述適體的單鏈具有與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，且當(dāng)其與所述阻斷劑核酸結(jié)合時(shí)所述適體形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，且隨后與所述核酸聚合酶結(jié)合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述適體在其5’末端或3’末端具有seqidno:21所示的保守區(qū)，且所述適體具有seqidno:14所示的核苷酸序列。在本發(fā)明中，所述靶核酸可以是互補(bǔ)的脲-靶標(biāo)2或非互補(bǔ)的衣原體-靶標(biāo)2，且所述核酸聚合酶可以是taqdna聚合酶。所述引物延伸反應(yīng)可在20-30℃的溫度實(shí)施。在本發(fā)明中，步驟(a)的混合物在約90℃加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約25℃，隨后向其添加所述核酸聚合酶并進(jìn)行反應(yīng)。更具體地，步驟(a)的混合物在90℃加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，并在25℃溫育30分鐘，隨后向其添加核酸聚合酶并反應(yīng)20分鐘以由此使核酸聚合酶與適體-靶核酸復(fù)合物結(jié)合。在本發(fā)明中，包含所述信號(hào)生成物質(zhì)的混合物可進(jìn)一步包含模板核酸和taqman探針。在本發(fā)明中，將步驟(b)中使用的包含所述信號(hào)生成物質(zhì)的混合物在約90°加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約25℃，隨后使其進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)使所述引物和taqman探針與模板核酸結(jié)合，且隨后與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合。更具體地，將步驟(b)中使用的包含所述信號(hào)生成物質(zhì)的混合物在90°加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，隨后使其進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)使所述引物和taqman探針與模板核酸結(jié)合，且隨后進(jìn)行使所述引物和taqman探針與模板核酸結(jié)合的反應(yīng)達(dá)60分鐘，且隨后與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合。在本發(fā)明中，所述信號(hào)生成物質(zhì)可用選自下組的物質(zhì)標(biāo)記：放射性同位素、熒光物質(zhì)、染料、納米顆粒、酶、酶底物、發(fā)光物質(zhì)和包含電化學(xué)官能團(tuán)的物質(zhì)，且步驟(c)可包括檢測(cè)或量化源自步驟(b)的引物延伸反應(yīng)的信號(hào)以由此確定所述靶核酸的存在或不存在。在本發(fā)明中，所述阻斷劑核酸可以是阻斷劑dna或阻斷劑rna，且所述阻斷劑核酸是具有seqidno:15所示的核苷酸序列的脲特異性阻斷劑。如圖6中所示，根據(jù)本發(fā)明使用靶核酸控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化靶核酸的方法是使用如下特性檢測(cè)和量化靶核酸的方法：當(dāng)其與阻斷劑核酸結(jié)合時(shí)包含單鏈核酸的適體形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，且隨后與核酸聚合酶結(jié)合以降低聚合酶的活性。在本發(fā)明的另一實(shí)例中，在以開(kāi)啟模式檢測(cè)和量化udg的方法中，如可在圖10(a)和10(b)中所見(jiàn)，使用經(jīng)設(shè)計(jì)以對(duì)udg特異性響應(yīng)的dna適體檢測(cè)udg對(duì)聚合酶活性的影響的結(jié)果是，僅當(dāng)udg靶標(biāo)酶存在時(shí)，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號(hào)(3)。然而，當(dāng)實(shí)施其中將包含代替尿嘧啶核堿基的胸腺嘧啶的dna引入與dna適體的單鏈區(qū)互補(bǔ)的阻斷劑dna的實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以看到的是，聚合酶活性由dna適體抑制，而不論ugd存在或不存在(4和5)。這表明通過(guò)udg切割尿嘧啶核堿基在聚合酶活性的恢復(fù)中起重要的作用且udg酶活性可基于通過(guò)udg對(duì)尿嘧啶核堿基的切割檢測(cè)和量化。在本發(fā)明的另一實(shí)例中，實(shí)施了測(cè)量當(dāng)基于通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件以不同濃度添加udg時(shí)出現(xiàn)的熒光信號(hào)的實(shí)驗(yàn)(圖11)。結(jié)果是，可以看到，隨udg的濃度增加，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號(hào)。此外，可以看到的是，在0-0.3u/ml的udg濃度范圍內(nèi)熒光信號(hào)線性增加且檢測(cè)極限為0.024u/ml。在本發(fā)明的另一實(shí)例中，實(shí)施了測(cè)量新開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)對(duì)于分析本發(fā)明中的靶標(biāo)酶的特異性的實(shí)驗(yàn)(圖12)。從圖12中的結(jié)果可以看到的是，當(dāng)haag(人烷基腺嘌呤dna糖基化酶)(3)、hogg1(人8-氧基鳥(niǎo)嘌呤dna糖基化酶1)(4)、fpg(甲酰氨基嘧啶-dna糖基化酶)(5)、bamhi(6)、exoi(7)或λ核酸外切酶(8)存在時(shí)，受到dna適體抑制的聚合酶活性未恢復(fù)，且出現(xiàn)了低熒光信號(hào)。然而，當(dāng)存在靶酶udg時(shí)，dna適體轉(zhuǎn)化為包含通過(guò)尿嘧啶核堿基切割的單鏈的dna適體結(jié)構(gòu)，且因此聚合酶被活化并出現(xiàn)高熒光信號(hào)。在本發(fā)明中使用的"靶材料"可以是選自下組的任一種：核酸、糖、脂質(zhì)、蛋白、肽、適體、抗原、抗體、半抗原、低分子量材料、大分子復(fù)合物、細(xì)胞、藥劑、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物，但不限于此。此處，術(shù)語(yǔ)“低分子量材料”意為包括非極性低分子量化合物諸如雙酚a。因此，第三方面，本發(fā)明涉及使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化靶分子的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測(cè)可能包含所述靶分子的檢測(cè)樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測(cè)樣品與所述混合物反應(yīng)以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復(fù)合物結(jié)合，所述阻斷劑核酸具有特異性識(shí)別并結(jié)合靶分子的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號(hào)生成物質(zhì)的混合物與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合，隨后進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應(yīng)以由此檢測(cè)或量化所述靶分子。在本發(fā)明中，所述適體的單鏈可具有與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，且當(dāng)與所述阻斷劑核酸結(jié)合時(shí)所述適體形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，且隨后與所述核酸聚合酶結(jié)合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述適體在其5’末端或3’末端具有seqidno:21所示的保守區(qū)。在本發(fā)明中，所述阻斷劑核酸可以是特異性識(shí)別并結(jié)合靶分子的dna或rna。所述靶分子可以是選自下組的任一種：核酸、糖、脂質(zhì)、蛋白、肽、適體、抗原、抗體、半抗原、低分子量材料、大分子復(fù)合物、細(xì)胞、藥劑、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物。在本發(fā)明中，所述核酸聚合酶可以是taqdna聚合酶，且所述引物延伸反應(yīng)在20-30℃的溫度實(shí)施。所述信號(hào)生成物質(zhì)用選自下組的物質(zhì)標(biāo)記：放射性同位素、熒光物質(zhì)、染料、納米顆粒、酶、酶底物、發(fā)光物質(zhì)和包含電化學(xué)官能團(tuán)的物質(zhì)，且步驟(c)可包括檢測(cè)或量化源自步驟(b)的引物延伸反應(yīng)的信號(hào)以由此確定所述靶核酸的存在或不存在。包含所述信號(hào)生成物質(zhì)的混合物進(jìn)一步包含模板核酸和taqman探針。如圖8所示，根據(jù)本發(fā)明使用靶分子控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化靶分子的方法是使用如下特性檢測(cè)和量化靶核酸的方法：當(dāng)其與阻斷劑核酸結(jié)合時(shí)包含單鏈核酸的適體形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，且隨后與核酸聚合酶結(jié)合以降低聚合酶的活性。第四方面，本發(fā)明針對(duì)使用由ber(堿基切除修復(fù))酶控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化靶ber(堿基切除修復(fù))酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測(cè)可能包含所述靶ber酶的檢測(cè)樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測(cè)樣品與所述混合物反應(yīng)以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復(fù)合物結(jié)合，所述阻斷劑核酸具有特異性針對(duì)靶ber酶的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號(hào)生成物質(zhì)的混合物與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合，隨后進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應(yīng)以由此檢測(cè)或量化所述靶ber(堿基切除修復(fù))酶的活性。在本發(fā)明中，所述適體的單鏈具有與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，且當(dāng)其與所述阻斷劑核酸結(jié)合時(shí)所述適體形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，且隨后與所述核酸聚合酶結(jié)合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述適體在其5’末端或3’末端可具有seqidno:21所示的保守區(qū)。所述適體可具有seqidno:18所示的核苷酸序列。在本發(fā)明中，所述阻斷劑核酸可以是用作靶ber酶的底物的dna。所述阻斷劑核酸可以是具有seqidno:19所示的核苷酸序列的udg(尿嘧啶dna糖基化酶)阻斷劑，將其用作靶ber酶的底物，且所述靶ber酶可以是udg(尿嘧啶dna糖基化酶)。在本發(fā)明中，所述核酸聚合酶可以是taqdna聚合酶，且所述引物延伸反應(yīng)可在20-30℃的溫度實(shí)施。在本發(fā)明中，步驟(a)的混合物在約90℃加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約37℃，隨后向其添加推測(cè)可能包含所述靶ber(堿基切除修復(fù))酶的檢測(cè)樣品，并將獲得的混合物緩慢冷卻至約25℃，隨后向其添加靶核酸聚合酶并進(jìn)行反應(yīng)。更具體地，將步驟(a)的混合物在90℃加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至37℃，并在37℃溫育20分鐘，隨后向其添加推測(cè)可能包含所述靶ber(堿基切除修復(fù))酶的檢測(cè)樣品且隨后將獲得的混合物以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，并在25℃溫育5分鐘，隨后向其添加核酸聚合酶并在25℃反應(yīng)20分鐘以由此使核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復(fù)合物結(jié)合。在本發(fā)明中，包含所述信號(hào)生成物質(zhì)的混合物可進(jìn)一步包含模板核酸和taqman探針。在本發(fā)明中，將步驟(b)的包含所述信號(hào)生成物質(zhì)的混合物在約90°加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約25℃，隨后使其進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)使所述引物和taqman探針與模板核酸結(jié)合，且隨后與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合。更具體地，可將包含步驟(b)的信號(hào)生成物質(zhì)的混合物在90℃加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，隨后在25℃進(jìn)行使引物和taqman探針與模板結(jié)合的反應(yīng)達(dá)60分鐘且隨后與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合。在本發(fā)明中，所述信號(hào)生成物質(zhì)可用選自下組的物質(zhì)標(biāo)記：放射性同位素、熒光物質(zhì)、染料、納米顆粒、酶、酶底物、發(fā)光物質(zhì)和包含電化學(xué)官能團(tuán)的物質(zhì)，且步驟(c)可包括檢測(cè)或量化源自步驟(b)的引物延伸反應(yīng)的信號(hào)以由此分析所述靶ber(堿基切除修復(fù))酶的活性。如圖9中所示，根據(jù)本發(fā)明使用靶ber(堿基切除修復(fù))酶控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化靶ber(堿基切除修復(fù))酶的方法是使用如下特性檢測(cè)和量化靶核酸的方法：當(dāng)其與阻斷劑核酸結(jié)合時(shí)含有單鏈核酸的適體形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，且隨后與核酸聚合酶結(jié)合以降低靶ber(堿基切除修復(fù))酶的活性。第五方面，本發(fā)明涉及使用由靶核酸酶控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化靶核酸酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測(cè)可能包含所述靶核酸酶的檢測(cè)樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測(cè)樣品與所述混合物反應(yīng)以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復(fù)合物結(jié)合，所述阻斷劑核酸具有特異性針對(duì)所述靶核酸酶的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號(hào)生成物質(zhì)的混合物與步驟(a)的反應(yīng)產(chǎn)物混合，隨后進(jìn)行引物延伸反應(yīng)；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應(yīng)以由此檢測(cè)或量化所述靶核酸酶的活性。在本發(fā)明中，所述適體的單鏈可具有與所述阻斷劑核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，且當(dāng)其與所述阻斷劑核酸結(jié)合時(shí)所述適體形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，且隨后與所述核酸聚合酶結(jié)合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述適體在其5’末端或3’末端具有seqidno:21所示的保守區(qū)。在本發(fā)明中，所述阻斷劑核酸是用作靶核酸酶底物的dna或rna。在本發(fā)明中，所述核酸聚合酶可以是taqdna聚合酶，且所述引物延伸反應(yīng)在20-30℃的溫度實(shí)施。在本發(fā)明中，所述信號(hào)生成物質(zhì)用選自下組的物質(zhì)標(biāo)記：放射性同位素、熒光物質(zhì)、染料、納米顆粒、酶、酶底物、發(fā)光物質(zhì)和包含電化學(xué)官能團(tuán)的物質(zhì)，且步驟(c)可包括檢測(cè)或量化源自步驟(b)的引物延伸反應(yīng)的信號(hào)以由此分析所述靶核酸酶的活性。包含所述信號(hào)生成物質(zhì)的混合物可進(jìn)一步包含模板核酸和taqman探針。如圖9中所示，根據(jù)本發(fā)明使用靶核酸酶控制的核酸聚合酶活性以開(kāi)啟模式檢測(cè)或量化靶核酸酶的方法是使用如下特性檢測(cè)和量化靶核酸的方法：當(dāng)其與阻斷劑核酸結(jié)合時(shí)包含單鏈核酸的適體形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，且隨后與核酸聚合酶結(jié)合以降低靶核酸酶的活性。圖1是顯示靶核酸誘導(dǎo)的核酸聚合酶活性開(kāi)關(guān)和使用taqman探針?lè)治鏊鼍酆厦富钚缘脑淼氖疽鈭D。具體地，圖1是顯示基于dna適體檢測(cè)和量化靶核酸的原理的示意圖，所述dna適體特異性地與taqdna聚合酶結(jié)合以抑制酶的活性。如果待檢測(cè)和量化的靶核酸不存在，則經(jīng)設(shè)計(jì)以包含單鏈dna區(qū)的dna適體將不會(huì)識(shí)別聚合酶，且因此所述聚合酶將具有固有的高活性。然而，如果靶核酸存在，則其將與dna適體的單鏈dna區(qū)特異性結(jié)合，且由所述結(jié)合穩(wěn)定化的dna適體將與聚合酶結(jié)合以抑制所述聚合酶的活性(1，靶標(biāo)識(shí)別)。如上文所述的由靶核酸控制的聚合酶活性可通過(guò)基于taqman探針的引物延伸反應(yīng)進(jìn)行分析。如果靶核酸不存在，則taqman探針的切割將通過(guò)聚合酶的高活性誘導(dǎo)，且因此將出現(xiàn)高熒光信號(hào)。然而，如果靶核酸存在，則聚合酶的活性將由dna適體抑制，且因此從taqman探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)將減少。如上文所述，靶核酸可以容易地通過(guò)觀察dna適體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化(由靶核酸的結(jié)合引起)和聚合酶活性的抑制和生成的熒光信號(hào)的變化(由結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化引起)檢測(cè)和量化。此外，本發(fā)明具有的優(yōu)勢(shì)在于其可以成本有效和容易的方式分析多種靶核酸，上述方式通過(guò)僅改變dna適體的單鏈核苷酸序列(其為識(shí)別靶核苷酸的部分)同時(shí)保持信號(hào)檢測(cè)部分不變來(lái)實(shí)現(xiàn)，這是由于識(shí)別靶核酸的部分和信號(hào)檢測(cè)部分彼此分離。圖6是顯示通過(guò)引入阻斷劑dna檢測(cè)和量化靶核酸的原理的示意圖，從而除了如上文所述實(shí)施的關(guān)閉模式(信號(hào)關(guān)閉模式)之外，實(shí)施了以開(kāi)啟模式(信號(hào)開(kāi)啟模式)操作的本發(fā)明。如圖6所示，如果待檢測(cè)和量化的靶核酸不存在，則由阻斷劑dna穩(wěn)定化的dna適體將抑制聚合酶活性，且因此將出現(xiàn)低熒光信號(hào)。然而，如果靶核酸不存在，則阻斷劑dna將從dna適體分離從而dna適體將不再抑制聚合酶活性。結(jié)果是，聚合酶活性將增加，且將出現(xiàn)高熒光信號(hào)。圖8是顯示根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)和量化靶分子的原理的示意圖。如果使用可特異性識(shí)別細(xì)胞、蛋白、小分子物質(zhì)等的適體核苷酸序列設(shè)計(jì)本發(fā)明中的阻斷劑dna，則靶分子的存在將從dna適體分離阻斷劑dna，且聚合酶可通過(guò)其酶活性產(chǎn)生高熒光信號(hào)。結(jié)果是，不僅靶核酸，靶細(xì)胞、靶蛋白、靶小分子物質(zhì)等也可通過(guò)控制本發(fā)明系統(tǒng)中阻斷劑dna的核苷酸序列進(jìn)行分析。圖9是顯示本發(fā)明可用于分析靶標(biāo)酶活性的示意圖。多種靶標(biāo)酶中，將udg(尿嘧啶dna糖基化酶)選作實(shí)例，設(shè)計(jì)與包含在dna適體中的單鏈dna結(jié)合的互補(bǔ)阻斷劑dna以包含尿嘧啶核堿基。因此，僅當(dāng)待檢測(cè)和量化的靶標(biāo)酶(udg)存在時(shí)，將出現(xiàn)尿嘧啶核堿基的切割，且包含(缺乏)尿嘧啶核堿基的阻斷劑dna將從dna適體的單鏈區(qū)分離。獲得的不穩(wěn)定的dna適體將不再抑制聚合酶，且因此聚合酶活性將增加。通過(guò)基于taqman探針的引物延伸反應(yīng)觀察增加的聚合酶活性。如上文所述嘗試的靶標(biāo)酶誘導(dǎo)的聚合酶活性控制和在其基礎(chǔ)上的檢測(cè)和量化系統(tǒng)，通過(guò)僅變化dna適體的單鏈區(qū)同時(shí)保持讀取基于taqman探針的信號(hào)而無(wú)變化的過(guò)程，可有利地應(yīng)用至用于分析多種靶標(biāo)酶的系統(tǒng)。實(shí)施例在下文中，將參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳述。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，這些實(shí)施例僅出于闡述目的而不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:以關(guān)閉模式檢測(cè)和量化靶dna的方法反應(yīng)混合物作為部分a和部分b分別制備。部分a(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應(yīng)緩沖液(10mmtris-hcl,ph8.3,50mmkcl,4mmmgcl2)、500μmdntp、400nmdna適體和不同濃度的互補(bǔ)的靶dna，將部分a在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育30分鐘。隨后將taqdna聚合酶(11nm)添加至各溶液并溫育20分鐘。部分b(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應(yīng)緩沖液、600nm模板、600nm引物和500nmtaqman探針，將部分b在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育60分鐘。將部分a和部分b彼此混合，并在c1000tm熱循環(huán)儀(bio-rad,ca,usa)上測(cè)量熒光信號(hào)。以2分鐘的時(shí)間間隔在25℃監(jiān)測(cè)引物延伸反應(yīng)過(guò)程中從taqman探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)。根據(jù)實(shí)施例1的方法實(shí)施了下述實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1-4。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1圖2顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)設(shè)計(jì)以包含多種單鏈核苷酸序列的dna適體通過(guò)與互補(bǔ)的靶核酸結(jié)合抑制酶活性。下表1顯示了在實(shí)驗(yàn)中使用的dna核苷酸序列(下劃線：保守區(qū))。在圖2(a)和2(b)中可以看到，僅當(dāng)與dna適體的單鏈核苷酸序列互補(bǔ)的靶核酸存在時(shí)，dna適體抑制聚合酶活性，且因此出現(xiàn)低熒光信號(hào)(2-5)。此外，可以看到的是，靶核酸存在下dna適體抑制聚合酶活性的程度與原始的78聚體dna適體抑制聚合酶活性的程度相似。表1實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2圖3顯示通過(guò)應(yīng)用圖2中所示的靶核酸對(duì)聚合酶活性的控制用于檢測(cè)和量化脲(解脲脲原體，一種引起性傳播疾病的病原體)獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下表2顯示了在實(shí)驗(yàn)中使用的dna核苷酸序列(下劃線：保守區(qū))。如圖3(a)、3(b)和3(c)中所見(jiàn)，僅當(dāng)作為靶核酸的脲dna存在時(shí)，經(jīng)設(shè)計(jì)以與脲dna特異性結(jié)合的dna適體抑制了聚合酶活性(2)。然而，可以看到的是，當(dāng)添加不與dna適體相互作用的陰性對(duì)照衣原體(沙眼衣原體)時(shí)，dna聚合酶活性未受到抑制，且出現(xiàn)了固有的高活性(3)。表2實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3圖4顯示了測(cè)量基于由實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件添加不同濃度的脲dna時(shí)出現(xiàn)的熒光信號(hào)的結(jié)果?？梢钥吹降氖?，隨脲dna濃度增加，聚合酶活性受到抑制，且因此發(fā)生熒光信號(hào)的減少。此外，可以看到的是，在0-10nm的脲dna濃度范圍熒光信號(hào)線性減少且檢測(cè)極限為0.91nm。上表2顯示了在實(shí)驗(yàn)中使用的dna序列。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4圖5顯示的結(jié)果表明以關(guān)閉模式檢測(cè)和量化靶dna的方法可普遍用于檢測(cè)和量化多種靶核酸。在該實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)了包含與衣原體dna特異性結(jié)合的單鏈dna的dna適體并允許其與不同濃度的衣原體dna反應(yīng)。下表3顯示在該實(shí)驗(yàn)中使用的dna序列(下劃線：保守區(qū))。如圖5中所見(jiàn)，隨衣原體dna的濃度增加，聚合酶活性受到抑制，且因此發(fā)生熒光信號(hào)的減少。此外，可以看到的是，在0-10nm的衣原體dna濃度范圍中熒光信號(hào)線性減少且檢測(cè)極限為1.47nm。表3實(shí)施例2:以開(kāi)啟模式檢測(cè)和量化靶dna的方法反應(yīng)混合物分別作為部分a和部分b制備。部分a(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應(yīng)緩沖液(10mmtris-hcl,ph8.3,50mmkcl,4mmmgcl2)、500μmdntp、400nmdna適體、40nm阻斷劑dna和不同濃度的互補(bǔ)的靶dna，將部分a在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育30分鐘。隨后將taqdna聚合酶(11nm)添加至各溶液并溫育20分鐘。部分b(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應(yīng)緩沖液、600nm模板、600nm引物和500nmtaqman探針，將部分b在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育60分鐘。將部分a和部分b彼此混合，并在c1000tm熱循環(huán)儀(bio-rad,ca,usa)上測(cè)量熒光信號(hào)。以2分鐘的時(shí)間間隔在20-30℃(優(yōu)選25℃)的聚合反應(yīng)溫度監(jiān)測(cè)引物延伸反應(yīng)過(guò)程中從taqman探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)。根據(jù)實(shí)施例2的方法實(shí)施了下述實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5圖7顯示了使用開(kāi)啟系統(tǒng)檢測(cè)和量化脲靶dna的結(jié)果。具體地，圖7顯示了在經(jīng)設(shè)計(jì)以便以開(kāi)啟模式(信號(hào)開(kāi)啟模式)操作的靶dna檢測(cè)和量化系統(tǒng)中通過(guò)靶dna控制聚合酶活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在該實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)了特異性識(shí)別脲dna的阻斷劑dna，并構(gòu)建了適于阻斷劑dna的dna適體以實(shí)施實(shí)驗(yàn)。下表4顯示了在該實(shí)驗(yàn)中使用的dna序列(下劃線：保守區(qū))。圖7(a)顯示了優(yōu)化引入的阻斷劑dna的濃度的結(jié)果?？梢钥吹降氖?，隨阻斷劑dna的濃度增加，聚合酶活性降低。使用實(shí)驗(yàn)中確定為最佳的20nm的阻斷劑dna濃度，實(shí)施了脲dna的檢測(cè)和量化。如在圖7(b)中所見(jiàn)，僅當(dāng)作為靶核酸的脲dna存在時(shí)(3)，可以看到的是，聚合酶被活化，且出現(xiàn)高熒光信號(hào)。然而，當(dāng)作為陰性對(duì)照的衣原體dna存在時(shí)(4)，可以看到的是，聚合酶活性持續(xù)受到抑制，且出現(xiàn)低熒光信號(hào)。測(cè)量了在通過(guò)實(shí)驗(yàn)所選的條件下當(dāng)添加不同濃度的脲dna時(shí)出現(xiàn)的熒光信號(hào)。如圖7(c)和7(d)中所見(jiàn)，隨脲dna的濃度增加，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號(hào)。此外，可以看到的是，在0-20nm的脲dna濃度范圍中熒光信號(hào)線性增加且檢測(cè)極限為2.67nm。表4實(shí)施例3:以開(kāi)啟模式檢測(cè)和量化udg的方法反應(yīng)混合物分別作為部分a和部分b制備。部分a(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應(yīng)緩沖液(10mmtris-hcl,ph8.3,50mmkcl,4mmmgcl2)、500μmdntp、400nmudg適體和40nmudg阻斷劑，將部分a在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至37℃(0.1℃/秒)并在37℃溫育20分鐘。隨后，將不同濃度的udg或其他酶(包括haag、hogg1、fpg、bamhi、exoi和λ核酸外切酶)添加至各溶液并在37℃溫育30分鐘。將如上文所述溫育的溶液緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育5分鐘。隨后將taqdna聚合酶(11nm)添加至各溶液并溫育20分鐘。部分b(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應(yīng)緩沖液、600nm模板、600nm引物和500nmtaqman探針，將部分b在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育60分鐘。將部分a和部分b彼此混合，并在c1000tm熱循環(huán)儀上測(cè)量熒光信號(hào)。以2分鐘的時(shí)間間隔在20-30℃(優(yōu)選25℃)的聚合反應(yīng)溫度監(jiān)測(cè)引物延伸反應(yīng)過(guò)程中從taqman探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)。根據(jù)實(shí)施例3的方法實(shí)施了下述實(shí)驗(yàn)實(shí)施例6-8。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例6圖10顯示了使用經(jīng)設(shè)計(jì)以對(duì)udg特異性響應(yīng)的dna適體測(cè)試udg對(duì)聚合酶活性的影響的結(jié)果。下表5顯示了在該實(shí)驗(yàn)中使用的dna序列。如圖10(a)和10(b)中所見(jiàn)，僅當(dāng)udg靶標(biāo)酶存在時(shí)，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號(hào)(3)。然而，當(dāng)實(shí)施其中將包含代替尿嘧啶核堿基的胸腺嘧啶的dna引入與dna適體的單鏈區(qū)互補(bǔ)的阻斷劑dna的實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以看到的是，聚合酶活性由dna適體抑制，而不論udg的存在或不存在(4和5)。這表明通過(guò)udg切割尿嘧啶核堿基在聚合酶活性的恢復(fù)中起重要的作用且udg酶活性可基于通過(guò)udg對(duì)尿嘧啶核堿基的切割檢測(cè)和量化。表5鏈名稱dna序列(5′→3′)seqidnoudg適體ttttaattttaattttcaatgtacagtattgseqidno：18udg阻斷劑aaaauuaaaauuaaaaseqidno：19對(duì)照udg阻斷劑aaaattaaaattaaaaseqidno：2o實(shí)驗(yàn)實(shí)施例7圖11顯示測(cè)量基于通過(guò)如圖10中所示的實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件添加不同濃度的udg時(shí)出現(xiàn)的熒光信號(hào)的結(jié)果。上表5顯示了在該實(shí)驗(yàn)中使用的dna序列(下劃線：保守區(qū))?？梢钥吹降氖牵Sudg的濃度增加，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號(hào)。此外，可以看到的是，在0-0.3u/ml的udg濃度范圍中熒光信號(hào)線性增加且檢測(cè)極限為0.024u/ml。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例8圖12顯示了測(cè)試用于分析靶標(biāo)酶的新開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)的特異性的結(jié)果。上表5顯示了在該實(shí)驗(yàn)中使用的dna序列(下劃線：保守區(qū))。如圖12中的結(jié)果所見(jiàn)，當(dāng)haag(人烷基腺嘌呤dna糖基化酶)(3),hogg1(人8-氧代鳥(niǎo)嘌呤dna糖基化酶1)(4)、fpg(甲酰氨基嘧啶-dna糖基化酶)(5)、bamhi(6)、exoi(7)或λ核酸外切酶(8)存在時(shí)，由dna適體抑制的聚合酶活性未恢復(fù)，且出現(xiàn)低熒光信號(hào)。然而，當(dāng)靶標(biāo)酶udg存在時(shí)，dna適體轉(zhuǎn)化為包含由尿嘧啶核堿基切割的單鏈的dna適體結(jié)構(gòu)，且因此聚合酶被活化且出現(xiàn)高熒光信號(hào)。工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明可提供用于診斷生物分子的方法，其可以無(wú)標(biāo)記和靈敏的方式檢測(cè)和量化靶核酸、靶蛋白、靶小分子物質(zhì)、靶酶活性等，所述檢測(cè)和量化由通過(guò)靶分子誘導(dǎo)的dna適體的構(gòu)象變化來(lái)控制聚合酶的活性實(shí)現(xiàn)。盡管已參照具體特征對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，本說(shuō)明書(shū)僅針對(duì)優(yōu)選的實(shí)施方案且并不限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將通過(guò)所附權(quán)利要求及其等同內(nèi)容限定。序列表<110>韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院<120>通過(guò)使用由靶材料調(diào)節(jié)的核酸聚合酶的活性用于檢測(cè)和量化生物材料的方法<130>pf-b1867-cn<140>pct/kr2015/011817<141>2015-11-04<150>10-2014-0152468<151>2014-11-04<160>21<170>patentinversion3.5<210>1<211>78<212>dna<213>人工序列<220><223>原始的dna適體<400>1ttctcggttggtctctggcggagcaagaccagacaatgtacagtattggcctgatcttgt60gtatgattcgcttttccc78<210>2<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>t20-適體<400>2ttttttttttttttttttttcaatgtacagtattg35<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>a20-靶標(biāo)<400>3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa20<210>4<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>隨機(jī)1-適體<400>4agtcagtcagtcagtcagtccaatgtacagtattg35<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>隨機(jī)1-靶標(biāo)<400>5gactgactgactgactgact20<210>6<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>隨機(jī)2-適體<400>6actgactgactgactgactgcaatgtacagtattg35<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>隨機(jī)2-靶標(biāo)<400>7cagtcagtcagtcagtcagt20<210>8<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>t20-適體(反向)<400>8caatgtacagtattgtttttttttttttttttttt35<210>9<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>脲特異性適體1<400>9taggacggtcaccagtatttttaatcaatgtacagtattg40<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>互補(bǔ)的脲-靶標(biāo)1<400>10attaaaaatactggtgaccgtccta25<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>非互補(bǔ)的衣原體-靶標(biāo)1<400>11atcttaaaagggattgcagcttgta25<210>12<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>衣原體特異性適體<400>12tacaagctgcaatcccttttaagatcaatgtacagtattg40<210>13<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>互補(bǔ)的衣原體-靶標(biāo)<400>13atcttaaaagggattgcagcttgta25<210>14<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>脲特異性適體2<400>14aaatactggtgaccgtcctacaatgtacagtattg35<210>15<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>脲特異性阻斷劑<400>15taggacggtcaccagtatttttaatgctgattacttttgc40<210>16<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>互補(bǔ)的脲-靶標(biāo)<400>16gcaaaagtaatcagcattaaaaatactggtgaccgtccta40<210>17<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>非互補(bǔ)的衣原體-靶標(biāo)<400>17aaaagggattgcagcttgtagtcctgcttgagagaacgtg40<210>18<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>udg適體<400>18ttttaattttaattttcaatgtacagtattg31<210>19<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>udg阻斷劑<400>19aaaauuaaaauuaaaa16<210>20<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>對(duì)照udg阻斷劑<400>20aaaattaaaattaaaa16<210>21<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>適體的保守區(qū)<400>21caatgtacagtattg15當(dāng)前第1頁(yè)12