本發(fā)明涉及對低水平放射線反應的dna修復相關(guān)基因的檢測方法，更詳細而言，涉及對胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠照射低水平放射線，然后采集胸腺并檢測共同或單獨表達的dna修復相關(guān)基因，并進行擴增，然后測定表達量的方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有技術(shù)中，為了找出對低水平(0.7mgy/小時)放射線敏感的基因而利用了多種方法，但是沒有確認到分子性的蛋白質(zhì)水平，對于本發(fā)明中提出的基因，不僅確認了rna，還確認了蛋白質(zhì)水平的表達差異。并且，現(xiàn)有技術(shù)中，對于dna損傷和修復相關(guān)的基因，沒有對照射低水平放射線的健康的小鼠和發(fā)生癌癥的小鼠進行比較來確認，本發(fā)明中發(fā)掘出的基因并未在現(xiàn)有技術(shù)中被已知為對低水平放射線敏感的基因。對低水平放射線敏感的基因表達譜的發(fā)掘中的現(xiàn)有技術(shù)如下所示。i)對人骨髓性白血病細胞株照射2～50cgy放射線，然后確認cdkn1a、gadd45a、mdm2、btg2、phlda3等基因的表達(amundson等，2003)ii)為了用于放射線事故時的劑量評價，對人血液照射0.5、2、8gy，然后發(fā)現(xiàn)根據(jù)劑量反應的fdxr、cdkn1a、phpt1、bbc3、sesn1基因(paul和amundson，2008)iii)對c57bl/6j小鼠以0.032～13μgy/分鐘照射放射線485天，然后采集腎臟和睪丸，并通過微陣列(microarray)發(fā)現(xiàn)了對低水平放射線敏感的基因(taki等，2009)iv)對c57bl/6j雄性小鼠以17～20mgy/天、0.86～1.0mgy/天照射放射線401～485天(8gy、0.4gy或0.02gy)，然后采集肝并利用微陣列和逆轉(zhuǎn)錄核酸擴增法發(fā)現(xiàn)了對低水平放射線敏感的基因(uehara等，2010)v)利用微陣列和定量核酸擴增法在照射低水平放射線的黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)39個對低水平放射線敏感的基因(seong等，2011)vi)對人血液照射0、0.02、0.1、0.5、1、2、4gy放射線，然后通過微陣列發(fā)掘出共9個對低水平放射線敏感的基因，并且為了用于生物學劑量評估，按劑量進行照射后按時間選取表達量具有差異的基因組(knops等，2012)。vii)對斑馬魚(zebradanio)胚胎和成體照射0.1或1gy的放射線，然后利用肝的mrna實施微陣列和定量核酸擴增法，并發(fā)掘出對放射線敏感的基因(jaafar等，2013)viii)通過微陣列在照射5～500mgy的放射線的人血液中發(fā)掘出對低水平放射線敏感的基因(nosel等，2013)技術(shù)實現(xiàn)要素：要解決的技術(shù)問題本發(fā)明人在研究因放射線引起的癌癥時，通常利用細胞株的研究結(jié)果難以直接適用于人或動物來解釋，在實驗動物的情況下，一般利用最多的是小鼠，但由于癌發(fā)病率低，并且低水平放射線的影響直到表現(xiàn)為人體影響方面有很多限制，因此為了彌補這種缺點，利用胸腺癌模型akr/j小鼠和通常用在癌癥研究中的正常icr小鼠，并通過以下方法分析個體之間的差異，從而完成了本發(fā)明。1)對胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠照射低水平(0.7mgy/小時)放射線，然后在胸腺中發(fā)掘出對低水平放射線敏感的基因表達譜(profile)，然后，2)以dna修復相關(guān)基因為中心進行鑒定后對其功能進行分析。總結(jié)而言，本發(fā)明的目的在于提供對低水平放射線反應的dna修復相關(guān)基因的檢測方法，其包括以下步驟：(1)在低水平放射線環(huán)境中飼養(yǎng)胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠；(2)采集所述步驟(1)中飼養(yǎng)的胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠的胸腺；(3)對在所述步驟(2)中采集的胸腺的基因進行分析；(4)在所述步驟(3)中分析的基因中檢測胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠中共同或單獨表達的dna修復相關(guān)基因；以及(5)對所述步驟(4)中檢測出的基因進行擴增并測定表達量。技術(shù)方案為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供對低水平放射線反應的dna修復相關(guān)基因的檢測方法，其包括以下步驟：(1)在低水平放射線環(huán)境中飼養(yǎng)胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠；(2)采集所述步驟(1)中飼養(yǎng)的胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠的胸腺；(3)對在所述步驟(2)中采集的胸腺的基因進行分析；(4)在所述步驟(3)中分析的基因中檢測胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠中共同或單獨表達的dna修復相關(guān)基因；以及(5)對所述步驟(4)中檢測出的基因進行擴增并測定表達量。所述步驟(1)的特征在于，低水平放射線劑量為0.7mgy/小時。所述步驟(1)的特征在于，使在0.7mgy/小時的低水平放射線環(huán)境中的累計劑量達到1.7gy來進行飼養(yǎng)。所述步驟(5)的特征在于，用選自cyp11a1、ptgs2、rnd3、plxncl及cyp2el中的引物對dna修復相關(guān)基因進行擴增。所述步驟(5)的特征在于，通過維恩圖、定量核酸擴增法、特殊蛋白質(zhì)檢測檢查及統(tǒng)計程序sas測定表達量。發(fā)明效果根據(jù)如上所述的本發(fā)明提供包括以下步驟的對低水平放射線反應的dna修復相關(guān)基因的檢測方法：(1)在低水平放射線環(huán)境中飼養(yǎng)胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠；(2)采集所述步驟(1)中飼養(yǎng)的胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠的胸腺；(3)對在所述步驟(2)中采集的胸腺的基因進行分析；(4)在所述步驟(3)中分析的基因中檢測胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠中共同或單獨表達的dna修復相關(guān)基因；以及(5)對所述步驟(4)中檢測出的基因進行擴增并測定表達量。通過提供上述方法能夠帶來以下效果：能夠用作評價產(chǎn)業(yè)及醫(yī)療從事人員的放射線暴露與致癌之間的相關(guān)性的低水平放射線dna修復指標基因，并且不僅能夠用作評價癌癥患者的癌癥進展及治療程度的低水平放射線dna修復基因，而且還能夠用作評價放射線和致癌的因果關(guān)系的低水平dna修復指標。附圖說明圖1為對于在實驗例1的dna損傷/修復相關(guān)基因中對低水平放射線顯示種類特異性反應的基因，利用核酸擴增法確認相對表達量的圖表。圖2為示出實驗例2的照射低水平放射線的akr/j和jcr小鼠的胸腺蛋白質(zhì)的分析結(jié)果的圖表。((1)低水平放射線dna修復基因(cyp11a、rnd3、plxnc1)蛋白質(zhì)量，(2)加樣對照(loadingcontrol)，(3)特殊蛋白質(zhì)檢測法的定量分析，測定各條帶(band)的密度后用β-微管蛋白(tubulin)密度值來定量化)圖3為圖示化了低水平放射線照射所引起的小鼠胸腺的分子變化。具體實施方式下面，將詳細說明本發(fā)明。通常而言，已知高劑量放射線會引起dna損傷、產(chǎn)生癌癥，然而，另一方面，已知低劑量放射線會修復受損的dna、誘導細胞死亡、促進免疫活性和抗氧化功能，從而抑制癌癥。然而，未滿足聯(lián)合國原子輻射效應科學委員會(unscear，2000)提出的低劑量率放射線(6≥mgy/h)標準的情況較多。此外，利用細胞株而確保的研究結(jié)果難以直接適用于人體來解釋，即使是在利用實驗動物的情況下，對于低水平放射線對dna修復帶來的影響，在現(xiàn)有技術(shù)中也沒有確認到蛋白質(zhì)水平。本發(fā)明中，在低水平(0.7mgy/小時)放射線環(huán)境下飼養(yǎng)akr/j小鼠和正常小鼠(icr)，并在達到開始死亡的時期(100天)時，采集胸腺并分析了基因。此外，采集了在相同的條件下飼養(yǎng)的正常小鼠(icr)的胸腺，并分析了基因。最終，對兩種小鼠中共同或單獨表達的dna修復相關(guān)基因進行擴增，并通過蛋白質(zhì)檢測最終發(fā)掘出基因組(genome)、蛋白質(zhì)組(proteome)。下面，通過實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明。這些實施例僅用于例示本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不解釋為被限定于這些實施例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。實施例1本發(fā)明中，從日本靜岡縣實驗室(shizuokalaboratory)中心購入雌性(7周齡)akr/j和icr小鼠，并在附有特定病原菌的設施中飼養(yǎng)1周而使其穩(wěn)定化。各組利用5只小鼠并在低水平(0.7mgy/小時)放射線環(huán)境下飼養(yǎng)100天(累計劑量為共1.7gy)，然后采集胸腺并在液體氮中急速冷凍后實施了基因分析。比較照射低水平放射線的akr小鼠和icr小鼠的胸腺，并發(fā)掘出對低水平(0.7mgy/小時)放射線反應的dna修復相關(guān)基因并解釋了功能。利用維恩圖、定量核酸擴增法、特殊蛋白質(zhì)檢測檢查及統(tǒng)計程序sas(方差分析(anova)，t-檢驗(t-test))進行了分析。另外，為了對于在照射低水平(0.7mgy/小時)放射線的小鼠胸腺中產(chǎn)生敏感反應的dna修復相關(guān)基因的表達量進行測量，所使用的引物堿基序列如下述表1所示。表1基因號基因名稱正向(5'→3')反向(5'→3')nm_019779cyp11a1cctggaagaaagaccgaatctgcttgatgcgtctgtgtaanm_011198ptgs2agaacctgcagtttgctgtggctcctgcttgagtatgtcgnm_028810pnd3tatgacaacgtccgtccactcctggatttcacctttccacnm_018797plxnc1tcctcatcccatgaagaacacgctgctaagcactctgaacnm_021282cyp2eltctcttcaacaaacgcttcgccagggagtactcagcaggt實驗例1.dna損傷/修復相關(guān)基因的表達量測定對akr/j和icr小鼠照射低水平(0.7mgy/小時)放射線，然后在癌癥發(fā)生初期階段(100天)采集胸腺，然后利用核酸擴增法確認了在dna損傷/修復相關(guān)基因中對低水平放射線顯示種類特異性反應的基因的相對表達量。其結(jié)果如圖1所示，在照射低水平放射線的akr/j小鼠中，cyp11a1、ptgs2、rnd3、plxnc1等對低水平放射線產(chǎn)生了種類特異性的敏感反應，在icr小鼠中，cyp2e1等對低水平放射線產(chǎn)生了種類特異性的敏感反應。實施例2.照射低水平放射線的akr/j和icr小鼠胸腺的蛋白質(zhì)分析對于實施例1中的照射低水平放射線的情況下的蛋白質(zhì)和作為對照組的照射高水平放射線(0.8gy/分鐘，總劑量：4.5gy)的小鼠胸腺的蛋白質(zhì)進行了分析。其結(jié)果如圖2所示，鑒定了在照射低水平放射線的akr/j小鼠中cyp11a1、rnd3、plxnc1等對低水平放射線產(chǎn)生了種類特異性的敏感反應。以上，對本
發(fā)明內(nèi)容的特定部分進行了詳細記述，這些具體的記述只是優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的范圍并不限定于此，這對具有本領(lǐng)域常規(guī)知識的技術(shù)人員來說是明確的。因此，本發(fā)明的實質(zhì)范圍定義為附上的權(quán)利要求及其等價物。序列表自由文本(freetext)附上電子文件。當前第1頁12