本申請要求2014年1月8日提交的美國臨時專利申請第61/924,735號和2014年7月15日提交的美國臨時專利申請第62/024,642號的優(yōu)先權，所述專利申請通過引用全文納入本文以用于所有目的。背景基因驅動一般稱為使天然優(yōu)勢傾斜以有利于它們被遺傳并通過后代傳遞的遺傳元件。示例包括將自身復制到缺少它們的染色體中的尋靶核酸內(nèi)切酶基因、有絲分裂期間破壞競爭染色體的分離畸變、將自身拷貝插入基因組中其他位置的轉座子、消除沒有遺傳Medea元件的競爭同胞的Medea元件、和母體可遺傳的微生物如誘導胞質不相容以有利于感染個體傳播的沃爾巴克氏體(Wolbachia)。由于它們繞開了自然選擇的正常規(guī)律，所有這些元件被認為是能夠通過昆蟲媒介傳播工程改造修飾以阻斷疾病傳播的潛在“基因驅動”系統(tǒng)。已經(jīng)提出基于尋靶核酸內(nèi)切酶的基因驅動是一種遺傳控制瘧蚊種群的手段。參見Windbichler等，Nature，doi：10.1038/nature09937(2011)。已經(jīng)提出位點特異性自私基因是天然種群的控制和遺傳工程改造的工具。參見Burt，Proc.R.Soc.Lond.B(2003)270，921-928(2003)。然而，這種提出的基因驅動受限于它們的位點特異性或者難以在各種生物體中表達。在此需要開發(fā)可靶向任意需要基因并且可在廣譜生物體之間使用的基因驅動。發(fā)明概述本發(fā)明的方面涉及RNA引導的基因驅動，并且具體地，涉及穩(wěn)定地導入所需生物體的種系細胞(germlinecell)的外來核酸序列。本文所述術語外來核酸序列和術語RNA引導的基因驅動可在本文中互換使用?？蓮姆N系細胞中開發(fā)所得的轉基因生物體。然后，所得的轉基因生物體可導入野生種群中，并且通過轉基因生物體與野生型生物體的交配，外來核酸序列被傳遞至所得的后代或子代。由此，本發(fā)明的方法涉及生產(chǎn)具有來自原始轉基因生物體和野生型生物體的所需性狀的轉基因生物體種群。當轉基因生物體被導入野生種群中并與野生型生物體交配時，所得的子代可被稱為改變的野生型種群。由于外來核酸序列穩(wěn)定地進入轉基因后代或轉基因子代的基因組中，轉基因后代或轉基因子代可具有由外來核酸的表達所產(chǎn)生的一種或多種所需性狀。根據(jù)某些方面，本文所述的方法可用于產(chǎn)生轉基因生物體的改變的野生種群，其中轉基因生物體顯示出由外來核酸表達所產(chǎn)生的一種或多種所需性狀。根據(jù)某些方面，外來核酸序列編碼至少RNA引導的DNA結合蛋白，如以下的一種或多種：RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶、RNA引導的DNA結合蛋白缺刻酶或無核酸酶的RNA引導的DNA結合蛋白、和多種引導RNA(核糖核酸)中的一種或多種。引導RNA與DNA(脫氧核糖核酸)，如種系細胞的基因組中的靶DNA互補。外來核酸序列也編碼至少一個或多個啟動子，使得種系細胞可表達RNA引導的DNA結合蛋白和引導RNA或任何其他核酸序列或基因，其可以在外來核酸序列中?；诒景l(fā)明和特定種系細胞，本領域技術人員能易于鑒定合適的啟動子。外來核酸序列也可包括本領域技術人員已知的由種系細胞表達外來核酸序列所需的任意其他核酸序列。外來核酸序列也可包括需要被種系細胞表達的任意其他基因序列。這種基因序列可被稱為“貨物DNA”。應理解，本領域技術人員能易于根據(jù)技術人員希望由種系細胞或由該種系細胞發(fā)展出的生物體在該細胞表達外來核酸序列時所顯示的所需性狀來鑒定一種或多種基因序列。外來核酸序列也編碼至少2種側接序列，其側接至少RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶以及一種或多種引導RNA。如本領域技術人員所知，側接序列至于特定核酸序列的相反末端，使得特定核酸序列位于側接序列之間。根據(jù)一個方面，側接序列至少包括與選擇的染色體上的對應序列相同的序列。根據(jù)一個方面，這類側接序列使得能使用熟知機制，如同源重組或非同源末端連接在細胞的基因組DNA中的切割處插入外來核酸序列。根據(jù)某些方面，當由種系細胞表達外來核酸序列時，產(chǎn)生一種或多種RNA引導的DNA結合蛋白以及一種或多種或幾種引導RNA。RNA引導的DNA結合蛋白和引導RNA產(chǎn)生RNA引導的DNA結合蛋白、引導RNA和雙鏈DNA靶序列的復合物。在這一方面，RNA據(jù)說將DNA結合蛋白引導至雙鏈DNA靶序列以與之結合。本發(fā)明的這一方面可被稱為RNA和DNA結合蛋白共定位至雙鏈DNA或與雙鏈DNA共定位。本發(fā)明范圍內(nèi)的DNA結合蛋白可包括產(chǎn)生雙鏈斷裂的那些(其可被稱為DNA結合蛋白核酸酶)，產(chǎn)生單鏈斷裂的那些(稱為DNA結合蛋白缺刻酶)或沒有核酸酶活性但另外結合至靶DNA的那些(稱為無核酸酶的DNA結合蛋白)。通過這種方式，可使用DNA結合蛋白-引導DNA復合物以在靶DNA位點處產(chǎn)生雙鏈斷裂，以在靶DNA位點處產(chǎn)生單鏈斷裂、或使可由細胞表達的轉錄調控子蛋白或結構域在靶DNA位點處定位以調控靶DNA的表達。根據(jù)某些方面，外來核酸序列可編碼一種或多種DNA結合蛋白核酸酶、DNA結合蛋白缺刻酶或無核酸酶DNA結合蛋白。外來核酸序列也可編碼一種或多種轉錄調控蛋白或結構域或者一種或多種供體核酸序列，其旨在被插入基因組DNA。根據(jù)一個方面，編碼RNA引導的無核酸酶的DNA結合蛋白的外來核酸序列還編碼與RNA引導的無核酸酶的DNA結合蛋白融合的轉錄調控子蛋白或結構域。根據(jù)一個方面，編碼一種或多種RNA的外來核酸序列還編碼RNA-結合結構域的靶標，并且編碼轉錄調控子蛋白或結構域的外來核酸還編碼與轉錄調控子蛋白或結構域融合的RNA-結合結構域。因此，種系細胞表達外來核酸序列可導致雙鏈斷裂、單鏈斷裂和/或基因組DNA的轉錄活化或抑制。供體DNA可通過細胞機制如同源重組或非同源末端連接在斷裂位點處插入。應理解，本文所述的外來核酸序列的表達可在靶基因組DNA，根據(jù)需要，包括一個或多個或幾個基因序列上的多個位置導致多個雙鏈斷裂或單鏈斷裂。本發(fā)明的方面涉及使用外來核酸序列作為基因驅動?；蝌寗拥母拍顬楸绢I域技術人員所知并且指代外來核酸序列，其在表達時能夠將自身插入其已經(jīng)引入的細胞的基因組中?；蝌寗拥母拍钤赪indbichler等，Nature，doi：10.1038/nature09937(2011)和Burt，Proc.R.Soc.Lond.B(2003)270，921-928(2003)中提供，其各自通過引用全文納入本文。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本文所述的外來核酸序列在導入種系細胞時作用是基因驅動。在一個方面中，種系細胞表達外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導的DNA結合蛋白和引導RNA。引導RNA與染色體上的靶DNA序列互補。RNA引導的DNA結合蛋白和引導RNA共定位至靶DNA，并且以位點特異性的方式切割靶DNA。靶DNA可以是在染色體對的一個或兩個染色體上的靶DNA位點。然后，例如，通過同源重組將外來核酸序列在靶DNA切割位點處插入基因組DNA。如果各染色體已經(jīng)以位點特異性的方式被RNA引導的DNA結合蛋白切割，則外來核酸序列可在染色體對的一個或兩個染色體處插入基因組DNA。如果插入染色體對的2個染色體，則種系細胞對于外來核酸序列而言是純合的。在另一個實施方式中，將外來核酸序列插入染色體對的第一染色體中。插入的外來核酸序列然后由細胞表達并且RNA引導的DNA結合蛋白以及引導RNA共定位于或共定位至染色體對的第二染色體，其然后以位點特異性的方式被切割，如第一染色體那樣。第二染色體中的切割的靶DNA然后被修復，例如沒通過同源重組，使用第一染色體作為模板。通過這種方式，第二染色體經(jīng)修復包含外來核酸序列，產(chǎn)生對外來核酸序列純合的種系細胞，即，外來核酸序列同時存在于染色體對的第一染色體和第二染色體中。細胞修復被破壞、切割或剪切的基因組DNA的機制為本領域所熟知。本發(fā)明的方面利用這些細胞機制與DNA結合蛋白核酸酶或缺刻酶組合以產(chǎn)生具有插入細胞的基因組DNA的所需外來遺傳物質的基因驅動，其中該細胞變?yōu)閷ν鈦磉z傳物質而言純合。然后外來遺傳物質傳到子代以產(chǎn)生具有一個或多個所需性狀的轉基因生物體。使用本文所述的外來核酸序列的概念作為基因驅動(genedrive)，提供了將外來基因物質納入生物體的野生種群的方法。提供了制備對外來遺傳物質而言純合的細胞的方法。提供了將遺傳修飾在生物體的野生種群中擴散的方法。提供了將人為設計的遺傳修飾在生物體的野生種群中擴散的方法。提供了通過將人為設計的遺傳修飾在生物體的野生種群中擴散來進行全基因組工程改造的方法。提供了編輯野生物種基因組的方法。提供了編輯生物體基因組DNA的多個基因座的方法。提供了對基因組基因座進行多重編輯的方法。提供了可逆編輯生物體基因組DNA的一個或多個基因座的方法。基于本文所述的基因驅動的所需功能，提供了控制基因流通過生物體的野生種群的方法。提供了抑制生物體的靶種群擴張的方法。提供了減少或清除生物體的靶種群的方法。提供了增加生物體的靶種群的方法。提供了降低或清除通過媒介傳播的疾病，如瘧疾的方法。提供了降低由靶生物體，如昆蟲媒介種群傳播疾病的方法。提供了破壞負責由靶生物體傳播疾病的基因的方法。提供了破壞種系細胞中Y染色體的方法。提供了破壞種系細胞中X染色體的方法。提供了控制入侵害蟲的方法。提供了保護受到生態(tài)變化威脅的物種的方法。根據(jù)某些方面，提供了阻斷基因從經(jīng)工程改造的生物體向野生種群的流動的方法，其包括1)在編碼野生型拷貝的同一染色體的遠端區(qū)中插入基因的重編碼拷貝，該基因的表型在被破壞時是顯性陰性致死的，和2)插入自私遺傳元件，即本文所述的RNA引導的基因驅動，并且如本領域技術人員所理解的術語基因驅動，其在同一基因的野生型形式中復制自己，使得在自私遺傳元件替換野生型拷貝之后，來自經(jīng)工程改造的生物體和經(jīng)工程改造的生物體的任意后代含有重編碼的基因的2個功能性拷貝，而來自經(jīng)工程改造的生物體和野生型生物體的后代僅含有重編碼的基因的單個拷貝，并且無法將重編碼的基因拷貝到野生型染色體上。根據(jù)某些方面，提供了阻斷含獨特序列的亞群和其余種群之間的基因流動的方法，包括1)釋放第一自私遺傳元件，其使用獨特序列排他性地擴散并且插入基因的部分，在基因組的其他地方，該基因的表型在被破壞時是顯性陰性的，2)釋放第二自私遺傳元件，其使用部分基因序列排他性地擴散并且插入基因的重編碼形式同時破壞基因的野生型拷貝，使得1)來自含第一自私遺傳元件的生物體與含第二遺傳元件的生物體之間交配產(chǎn)生的所有后代都含有第二自私遺傳元件，其中基因的2個野生型拷貝都被破壞但被基因組中其他地方的重編碼拷貝所替換，并且2)含第二自私遺傳元件的生物體與野生型生物體之間的任意雜交不會產(chǎn)生后代，因為基因的野生型拷貝丟失并且不會被重編碼拷貝所替換。根據(jù)某些方面，提供了使后代的性別比例偏移的方法，包括使用一種或多種染色體，其一起1)編碼在減數(shù)分裂前期間排他性表達的RNA引導的核酸酶并且2)表達使核酸酶靶向以切割在性染色體之一上發(fā)現(xiàn)的獨特序列的引導RNA，使得與未修飾的生物體的一般情況相比，活配子含有較少概率的靶染色體。根據(jù)某些方面，提供了使種群的性別比例偏移的方法，包括使用編碼RNA-引導的核酸酶并且也編碼引導RNA的性染色體，該RNA-引導的核酸酶在減數(shù)分裂前期間排他性地表達，并且，該引導RNA使核酸酶靶向以切割相對性染色體上發(fā)現(xiàn)的獨特序列，使得活配子主要含有編碼RNA-引導的核酸酶的性染色體。根據(jù)某些方面，提供了使后代的性別比例向異配性別(例如XY)偏移的方法，包括使用由通常在X染色體上存在的必要基因拷貝和自私遺傳元件工程改造的染色體，該自私遺傳元件將本身拷貝到X染色體上的野生型必要基因的位置上，使得雌性子代由于缺少必要基因而沒有發(fā)育活力，而雄性子代由于經(jīng)工程改造的染色體上的拷貝而存活。根據(jù)某些方面，提供了使種群的性別比例向異配性別(例如XY)偏移的方法，包括使用由通常在X染色體上存在的必要基因拷貝和自私遺傳元件工程改造的Y染色體，該自私遺傳元件將本身拷貝到X染色體上的野生型必要基因的位置上，使得雌性子代由于缺少必要基因而沒有發(fā)育活力，而雄性子代由于經(jīng)工程改造的染色體Y上的拷貝而存活。根據(jù)某些方面，使后代的性別比例向同配性別(例如哺乳動物中的XX)偏移的方法包括使用一個或多個染色體，其一起1)編碼RNA-引導的核酸酶并且2)表達使核酸酶靶向以切割在異配性染色體(例如，哺乳動物中的XY)中發(fā)現(xiàn)的獨特序列的引導RNA，使得任何通常將發(fā)育成異配性別(例如，哺乳動物中的雄性)的后代的異配性染色體被破壞。根據(jù)某些方面，使種群的性別比例向同配性別(例如哺乳動物中的XX)偏移的方法包括使用同配性染色體，其1)編碼RNA-引導的核酸酶并且2)表達使核酸酶靶向以切割在異配性染色體(例如，哺乳動物中的XY)中發(fā)現(xiàn)的獨特序列的引導RNA，使得任何通常將發(fā)育成異配性別(例如，動物中的雄性)的后代的異配性染色體被破壞。根據(jù)某些方面，使種群的性別比例向雄性偏移的方法包括釋放經(jīng)工程改造的雄性，其編碼自私遺傳元件，其在雌性生育所需的基因位置上拷貝自身。根據(jù)一個方面，在Y染色體上編碼自私遺傳元件。根據(jù)一個方面，Y染色體也編碼靶向X染色體上存在的必要基因的自私遺傳元件。根據(jù)某些方面，提供了種群控制的方法，包括向待去除的種群中釋放含有Y染色體的經(jīng)工程改造的雄性生物體，該Y染色體編碼1)在雌性生育所需的基因位置上拷貝自身的自私遺傳元件，和2)在X染色體上的必要基因的位置上拷貝自身的第二自私遺傳元件，使得雌性子代無法存活，并且向待保護的種群釋放編碼第三自私遺傳元件的生物體，該第三自私遺傳元件改變X染色體上必要基因的序列，使得在含有第一和第二自私遺傳元件的雄性與含有第三自私遺傳元件的雌性之間交配的后代產(chǎn)生有生育力的雄性，然而無生育力的雌性后代。根據(jù)某些方面，提供了改變真核生物體種系細胞的方法，包括將編碼RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶和一種或多種引導RNA，并且包括相應的啟動子序列和第一側接序列以及第二側接序列的第一外來核酸序列導入種系細胞，其中一種或多種引導RNA與種系細胞的染色體對的第一染色體和第二染色體的遺傳DNA上的一個或多個靶位置互補，其中編碼RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶的核酸序列和編碼一種或多種引導RNA的核酸序列在第一側接序列和第二側接序列之間，其中，所述第一側接序列包含與基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，其中所述第二側接序列包含與基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，其中被切割并被外來核酸序列替換的位于第一側接序列和第二側接序列之間的序列的至少一個拷貝是生物體存活或產(chǎn)生活后代所需的，表達第一外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶和一種或多種RNA，其中RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶和相關的引導RNA共定位至基因組DNA的第一染色體和基因組DNA的第二染色體上的相關靶位置，并且RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶以切割位點特異性的方式在靶位置上切割基因組DNA的第一染色體，并以切割位點特異性的方式在靶位置上切割基因組DNA的第二染色體，將第一外來核酸序列在可切割位點處插入基因組DNA的染色體對的第一染色體中，并且將第一外來核酸序列在可切割位點處插入基因組DNA的染色體對的第二染色體中以賦予種系細胞對外來核酸序列而言的純合，并且在發(fā)育階段進行上述表達和插入步驟，在該階段中位于第一側接序列和第二側接序列之間的被切割并被外來核酸序列替換以產(chǎn)生遺傳負荷的序列不再是該生物體存活或產(chǎn)生有生育力的后代所需要的。根據(jù)某些方面，按照本文所述的方法來進行靶向種群抑制或滅絕的方法包括向靶向種群中釋放RNA-引導的遺傳負荷驅動。本文所用術語遺傳負荷可指種群中理論最優(yōu)基因型的適應性(fitness)與種群中觀察到的平均基因型的適應性之間的差異。術語遺傳負荷也可指，與最大適應性相比種群平均適應性的降低。本發(fā)明的某些實施方式的其他特征和優(yōu)勢將在權利要求中以及以下附圖和實施方式的說明下更為顯而易見。附圖的簡要說明本專利或申請文件包含至少一幅有色附圖。本專利或專利申請公開與彩色附圖的副本將根據(jù)要求，在支付所需的費用之后由政府機關提供。結合附圖，通過以下示例性實施方式的詳述能夠更清楚地理解本發(fā)明的上述和其他特征和其他優(yōu)點，其中：圖1A是標準RNA-引導的Cas9基因驅動的示意圖，顯示Cas9和引導RNA的表達，共定位，切割靶基因以產(chǎn)生斷裂并且將RNA引導的Cas9基因驅動通過同源重組在切割位點處插入靶基因。圖1B顯示了基因驅動遺傳的染色體視圖。圖1C顯示了阻止Cas9和引導RNA的共定位以阻止靶DNA的切割和基因驅動插入的突變。圖1D顯示了使用多種引導RNA和切割位點以避免突變阻止基因驅動的插入。圖1E顯示了NHEJ刪除了所有識別位點以產(chǎn)生抗驅動等位基因。圖1F顯示NHEJ產(chǎn)生了不利地破壞必要基因的抗驅動等位基因。圖2A顯示通過包含合適的引導RNA使用單個驅動來編輯多個遠端位點。圖2B顯示使用后續(xù)驅動來更新由第一驅動產(chǎn)生的變化。圖2C顯示使用恢復性驅動以使所有變化回到野生型，僅留下Cas9基因和引導RNA。圖3顯示使用采用不同引導RNA靶向相同必要基因的2個基因驅動，其在雜交時由于都是2個拷貝而變得不相容。向種群中釋放該類型的驅動將會使其人工分裂成有多少驅動就有多少物種。圖4A顯示使用減數(shù)分裂基因驅動來在減數(shù)分裂期間消除競爭性染色體，產(chǎn)生偏移的配子集合。驅動表達限于減數(shù)分裂前以防止驅動致死。圖4B顯示可使用2種正交Cas9核酸酶來避免減數(shù)分裂性染色體沉默。Cas9A導致編碼Cas9B的盒在發(fā)育早期從性染色體拷貝到常染色體，在那里其無法在減數(shù)分裂期間消除競爭性染色體。圖4C顯示合子X-驅動可靶向Y染色體來在受精卵中進行破壞，產(chǎn)生排他性的雌性子代。圖4D顯示合子Y-驅動可編碼通常在X染色體上發(fā)現(xiàn)的必要基因并且使用基因驅動盒來消除來自X的基因。該驅動將其本身從父系X拷貝到母系X，留下沒有任何必要基因拷貝的雌性受精卵。圖5A顯示使用雙功能Y-驅動的種群抑制，其中還含有無生育力的雌性子代能力的AY-驅動(Y-驅動-SD)作用為野生種群中的合子驅動，其可導致滅絕。圖5B顯示在遇到重編碼的必要基因的標準驅動之后，Y-驅動-SD將不再驅動。無生育力雌性子代效果將防止突變驅動入侵直至入侵種群瓦解。圖6A顯示了控制低遷移性和高遷移性入侵物種的方法，其中入侵棲息地如密西西比河中釋放的Y-驅動雄性亞洲鯉魚可用于根除亞洲鯉魚種群。在有意人為運輸Y-驅動雄性的事件中，可用保護性重編碼驅動來保護亞洲種群。圖6B顯示在入侵大鼠種群中釋放Y-驅動-SD雄性大鼠將引發(fā)局部根除，而標準驅動保護性地重編碼歐亞大陸的天然大鼠種群。Y-驅動-SD構建體將從大多數(shù)島嶼和許多大陸區(qū)域中去除入侵大鼠。偷渡介導的基因流動將受到重編碼的種群中Y-驅動-SD的無生育力雌性子代的限制。一旦偷渡者成功入侵無大鼠棲息地，可用新驅動重復該過程。圖7顯示驅動介導的內(nèi)源性基因調控，其中RNA-引導的轉錄調控子可調節(jié)遠端基因的活性而不編輯它們的序列。在驅動的壽命期間，調控將在進化上是穩(wěn)定的，如果驅動核酸酶需要調控子來進行合適表達。圖8顯示了來自未修飾的野生種群的誘導形態(tài)。靶向含有獨特等位基因(顯示為獨特基因)的亞群的2個連續(xù)基因驅動可誘導與其余野生種群的遺傳不相容。第一驅動使用獨特等位基因擴散并且重編碼在破壞時顯示顯性致死表型的基因。第二驅動使用重編碼的基因擴散并且消除第一驅動。與野生型生物體的任意交配將導致第二驅動破壞野生型拷貝，導致所有后代死亡。圖9顯示本文所述的方法，其中驅動1重編碼Y染色體上的雄性必要基因(如果存在)和X染色體上的隱性必要基因，同時將其自身插入鄰接獨特基因(即，Cas9和引導RNA表達后，通過細胞機制如同源重組插入，并且Cas9和引導RNA定位至靶核酸序列)。驅動2在修飾的X染色體上擴散，從常染色體上消除驅動1，并且可跳入修飾的Y染色體(如果存在)。在與野生型生物體交配后，驅動2從X或Y染色體中消除必要基因。唯一活的后代是雜合雌性，其在X染色體上保留隱性必要基因的單個重編碼拷貝。這些可與已經(jīng)用驅動2修飾的雄性自由交配，使野生型基因擴散到經(jīng)工程改造的種群中。與野生型雄性交配近產(chǎn)生更多的雜合雌性，防止基因流回野生種群。圖10顯示制備本文所述的合子Y-驅動的方法。圖11A顯示制備清除了雌性生育所需基因的無生育力雌性子代Y染色體的方法。Y染色體(Y-SD)不適真正驅動，但是納入優(yōu)先的基因驅動機制，其用驅動替換雌性生育的必要基因。圖11B顯示在Y-SD雄性的雌性子代中，驅動類似替換雌性生育基因的母系拷貝，導致無生育力。如果雌性生育特異性基因都不是已知的，兩種性別所需的生育基因可被靶向并且與Y染色體上其他地方的額外拷貝互補。圖12A顯示制備包括無生育力雌性子代能力的Y-驅動(Y-驅動-SD)的方法((Y-驅動+無生育力雌性子代Y染色體)。在與野生型雌性交配后，Y-驅動-SD替換或破壞必要基因和雌性生育基因。雄性由于在Y-驅動-SD上的額外拷貝的互補而存活。如圖12B所示，在雄性后代中，驅動類似地替換母系拷貝，留下胚胎期不能存活的雌性子代。因此，Y-驅動-SD顯示驅動。如圖12C所示，用保護性驅動修飾的雌性具有側接重編碼的必要基因的位點。Y-驅動-SD可僅替換生育基因。如圖12D所示，雌性后代仍然活著，但是缺少任何生育基因拷貝并且因此無生育力。因為雄性沒有從缺少雌性同胞中獲得任何適應性益處，Y-驅動-SD將不會在受保護的種群中驅動。然而，其唯一的適應性代價是由驅動本身引起，使得其僅緩慢地從種群中去除。雌性生育產(chǎn)出的缺失將導致有力的種群抑制。因此，受保護的個體將發(fā)現(xiàn)難以入侵其中Y-驅動-SD常見的種群。類似地，Y-驅動-SD將不能入侵受保護的種群。圖13A是顯示在釀酒酵母(S.cerevisiae)中易于觀察到偏移的ADE2遺傳。由于紅色顏料形成，ADE2的突變在腺嘌呤限制培養(yǎng)基上生成紅色表型。將紅色突變單倍體與野生型單倍體交配產(chǎn)生米色的二倍體，其在孢子形成后產(chǎn)生50％紅色和50％米色后代。在釀酒酵母(S.cerevisiae)中易于觀察到偏移的ADE2遺傳。圖13B是顯示當具有靶向ADE2的基因驅動的二倍體與野生型二倍體在Cas9存在下交配時，ADE2的切割和后續(xù)替換或破壞將產(chǎn)生紅色二倍體，其產(chǎn)生排他性的紅色后代。圖13C是釀酒酵母集落的圖像。通過在沒有Cas9的情況下使野生型和ADE2：：sgRNA基因驅動二倍體交配產(chǎn)生的二倍體產(chǎn)生米色集落或者當通過重編碼去除靶位點時，只有兩者都存在時有均勻的紅色集落，證明野生型ADE2拷貝的Cas9-依賴性破壞。圖13D是來自15個多裂四分體的孢子的圖像，其在腺嘌呤限制的平板上產(chǎn)生均勻的紅色集落，確認從野生型患者遺傳的ADE2基因的破壞。在沒有靶位點或Cas9的情況下，觀察到正常的2∶2分離。圖14A是顯示ADE2-靶向基因驅動經(jīng)修飾攜帶作為貨物基因的URA3的示意圖。圖14B是通過將野生型URA3-二倍體酵母與編碼攜帶URA3的基因驅動的二倍體交配產(chǎn)生的二倍體的圖像，其形成配子并且四分體裂化成從單個孢子產(chǎn)生的分離集落。所有這些在復制物接種到缺少尿嘧啶的平板上時生長，證明該驅動成功地在所有二倍體中拷貝URA3。圖14C是顯示ABD1-靶向基因驅動切割并重編碼必要ABD1基因的尾末端的示意圖?；蝌寗雍拓浳锘蛟诳截惡蟊３滞暾⑶铱赏ㄟ^同時靶向非必要和必要基因來擴散。圖15A是顯示基因驅動監(jiān)測所選擇的野生型菌株之間關系的進化樹。經(jīng)準許，改變于麥克米倫出版公司(MacmillanPublishersLtd)：Nature458：337-341，版權2009。圖15B顯示在多個酵母菌株中遺傳偏移程度的定量PCR結果，表明從攜帶基因驅動的SK1二倍體與多個野生型二倍體株之間交配產(chǎn)生的二倍體中野生型和含驅動等位基因的相對豐度。“無Cas9”和“無靶標”是指在沒有Cas9的情況下與野生型二倍體交配的含ADE2驅動元件的二倍體細胞，或在防止切割的靶序列中有突變的野生株?！暗诙笔侵篙^早交配的二倍體后代。發(fā)明詳述本發(fā)明的實施方式是基于使用RNA引導的DNA結合蛋白與引導RNA在靶DNA位點處共定位并發(fā)揮基因驅動的作用。本領域技術人員易于知道這類DNA結合蛋白結合DNA用于各種目的。這種DNA結合蛋白可以是天然產(chǎn)生的。本發(fā)明范圍內(nèi)包括的DNA結合蛋白包括由RNA引導的那些，在本文中稱為引導RNA。根據(jù)一個方面，引導RNA在約10至約500個核苷酸之間。根據(jù)一個方面，該RNA在約20至約100個核苷酸之間。根據(jù)該方面，引導RNA和RNA引導的DNA結合蛋白在DNA處形成共定位復合物。具有核酸酶活性的DNA結合蛋白為本領域技術人員所知，并且包括具有核酸酶活性的天然產(chǎn)生的DNA結合蛋白，例如在II型CRISPR系統(tǒng)中存在的Cas9蛋白。這種Cas9蛋白和II型CRISPR系統(tǒng)在本領域中充分記載。參見Makarova等，NatureReviews，Microbiology，第9卷，2011年6月，第467-477頁，包括所有補充信息，通過引用全文納入本文。細菌和古細菌CRISPR-Cas系統(tǒng)依賴于與Cas蛋白負荷的短引導RNA以引導入侵外來核酸內(nèi)存在的互補序列的直接降解。參見Deltcheva，E.等，通過反式編碼小RNA和宿主因子RNA酶III的CRISPRRNA突變(CRISPRRNAmaturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRNaseIII).Nature471，602-607(2011)；Gasiunas，G.，Barrangou，R.，Horvath，P.和Siksnys，V.Cas9-crRNA核蛋白蛋白復合物介導細菌的獲得性免疫的特異性DNA切割(Cas9-crRNAribonucleoproteincomplexmediatesspecificDNAcleavageforadaptiveimmunityinbacteria).ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica109，E2579-2586(2012)；Jinek，M.等，獲得性細菌免疫中可編程的雙RNA-引導的DNA內(nèi)切核酸酶(Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity).Science337，816-821(2012)；Sapranauskas，R.等，嗜熱鏈球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)提供大腸桿菌中的免疫(TheStreptococcusthermophilusCRISPR/CassystemprovidesimmunityinEscherichiacoli).Nucleicacidsresearch39，9275-9282(2011)；和Bhaya，D.，Davison，M.和Barrangou，R.細菌和古細菌中的CRISPR-Cas系統(tǒng)：獲得性防御和調節(jié)的通用小RNA(CRISPR-Cassystemsinbacteriaandarchaea：versatilesmallRNAsforadaptivedefenseandregulation).Annualreviewofgenetics45，273-297(2011)。最近的釀膿鏈球菌(S.pyogenes)II型CRISPR系統(tǒng)的體外重建證明與正常反式編碼tracrRNA融合的crRNA(“CRISPRRNA”)(“反式-作用CRISPRRNA”)足夠引導Cas9蛋白序列特異性切割匹配cdRNA的靶DNA序列。表達與靶位點同源的gRNA導致Cas9招募以及靶DNA降解。參見H.Deveau等，對嗜熱鏈球菌中CRISPR編碼的抗性的噬菌體響應(PhageresponsetoCRISPR-encodedresistanceinStreptococcusthermophilus).JournalofBacteriology190，1390(2008年2月)。三類CRISPR系統(tǒng)一般已知并且稱為I類、II類或III類。根據(jù)一個方面，II型所共有的本發(fā)明特別有用的切割dsDNA的酶是單一效應酶Cas9。參見K.S.Makarova等，CRISPR-Cas系統(tǒng)的進化和分類(EvolutionandclassificationoftheCRISPR-Cassystems).Naturereviews.Microbiology9.467(2011年6月)，通過引用全文納入本文。在細菌內(nèi)，II型效應系統(tǒng)由從含間隔子的CRISPR基因座轉錄的長前-crRNA、多功能Cas9蛋白、和對于gRNA處理而言重要的tracrRNA組成。tracrRNA與分隔前-crRNA的間隔子的重復區(qū)雜交，引發(fā)內(nèi)源性RNA酶III的dsRNA切割，之后通過Cas9在各間隔子內(nèi)的第二切割事件，產(chǎn)生保持與tracrRNA和Cas9結合的成熟crRNA。根據(jù)一個方面，本發(fā)明的酶，如Cas9展開DNA雙鏈體并且檢索與cdRNA匹配的序列以切割。靶識別在檢測靶DNA中的“原型間隔子(protospacer)”序列與crRNA中的剩余間隔子序列之間的互補性之后出現(xiàn)。重要的是，Cas9僅在正確的原型間隔子-相鄰基序(PAM)也在3’末端處存在的情況下切割DNA。根據(jù)某些方面，可使用不同的原型間隔子-相鄰基序。例如，釀膿鏈球菌(S.pyogenes)系統(tǒng)需要NGG序列，其中N可以是任意核苷酸。嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)II型系統(tǒng)分別需要NGGNG(參見P.Horvath，R.Barrangou，CRISPR/Cas，細菌和古細菌的免疫系統(tǒng)(theimmunesystemofbacteriaandarchaea).Science327，167(2010年1月8日)，通過引用全文納入本文，和NNAGAAW(參見H.Deveau等，針對嗜熱鏈球菌中CRISPR-編碼的抗性的噬菌體響應(PhageresponsetoCRISPR-encodedresistanceinStreptococcusthermophilus).Journalofbacteriology190，1390(2008年2月)，通過引用全文納入本文)，同時不同的變形鏈球菌(S.mutans)系統(tǒng)耐受NGG或NAAR(參見J.R.vanderPloeg，變形鏈球菌中CRISPR的分析表明針對M102-樣噬菌體的感染的獲得性免疫的出現(xiàn)頻率(AnalysisofCRISPRinStreptococcusmutanssuggestsfrequentoccurrenceofacquiredimmunityagainstinfectionbyM102-likebacteriophages).Microbiology155，1966(2009年6月)，通過引用全文納入本文。生物信息學分析已經(jīng)在多種細菌中生成CRISPR基因座的廣泛數(shù)據(jù)庫，其也可用于鑒定其他有用的PAM并擴展CRISPR-可靶向序列組(參見M.Rho，Y.W.Wu，H.Tang，T.G.Doak，Y.Ye，人類微生物中進化的不同CRISPR(DiverseCRISPRsevolvinginhumanmicrobiomes).PLoSgenetics8，e1002441(2012)和D.T.Pride等，對來自人唾液的鏈球菌CRISPR的分析顯示對象內(nèi)和對象之間隨時間的顯著序列多樣性(AnalysisofstreptococcalCRISPRsfromhumansalivarevealssubstantialsequencediversitywithinandbetweensubjectsovertime).Genomeresearch21，126(2011年1月))，各自通過引用全文納入本文。具有核酸酶活性的示例性DNA結合蛋白的功能是切開或切割雙鏈DNA。這種核酸酶活性可來自具有顯示核酸酶活性的一個或多個多肽序列的DNA結合蛋白。這類示例性DNA結合蛋白可具有2個分開的核酸酶結構域，各結構域負責切割或切開雙鏈DNA的特定鏈。本領域技術人員已知的具有核酸酶活性的示例性多肽序列包括McrA-HNH核酸酶相關結構域和RuvC-樣核酸酶結構域。因此，示例性的DNA結合蛋白是天然含有一個或多個McrA-HNH核酸酶相關結構域和RuvC-樣核酸酶結構域的那些。在釀膿鏈球菌(S.pyogenes)中，Cas9通過由蛋白質中的以下2個催化結構域介導的過程在原型間隔子-相鄰基序(PAM)上游3bp處生成鈍末端雙鏈斷裂：切割DNA的互補鏈的HNH結構域和切割非互補鏈的RuvC-樣結構域。參見Jinke等，Science337，816-821(2012)，通過引用全文納入本文。已知Cas9蛋白存在于許多II型CRISPR系統(tǒng)，包括Makarova等，NatureReviews，Microbiology，卷9，2011年6月，第467-477頁的補充信息中所鑒定的以下系統(tǒng)：海沼甲烷球菌(Methanococcusmaripaludis)C7；白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)；高效棒桿菌(Corynebacteriumefficiens)YS-314；谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032Kitasato；谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032Bielefeld；谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)R；果聚糖棒桿菌(Corynebacteriumkroppenstedtii)DSM44385；膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus)ATCC19977；皮諾卡氏菌(Nocardiafarcinica)IFM10152；紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)PR4；紅球菌(Rhodococcusjostii)RHA1；混濁紅球菌(Rhodococcusopacus)B4uid36573；解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)11B；氯酚節(jié)桿菌(Arthrobacterchlorophenolicus)A6；黃克里布所菌(Kribbellaflavida)DSM17836uid43465；彎曲熱單孢菌(Thermomonosporacurvata)DSM43183；齒雙歧桿菌(Bifidobacteriumdentium)Bd1；長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)DJO10A；還原天芥菜堿斯奈克氏菌(Slackiaheliotrinireducens)DSM20476；海皮爾氏菌(Persephonellamarina)EXH1；脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9434；黃褐二氧化碳嗜纖維菌(Capnocytophagaochracea)DSM7271；嗜冷黃桿菌(Flavobacteriumpsychrophilum)JIP0286；黏液阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)ATCCBAA835；卡氏玫瑰彎菌(Roseiflexuscastenholzii)DSM13941；玫瑰彎菌(Roseiflexus)RS1；集胞藍細菌(Synechocystis)PCC6803；小迷蹤菌(Elusimicrobiumminutum)Pei191；未培白蟻1組細菌種系RsD17；產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)S85；蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)ATCC10987；無害利斯特氏菌(Listeriainnocua)；干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)；鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)GG；唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)UCC118；無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)A909；無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)NEM316；無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)2603；停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiaeequisimilis)GGS124；馬鏈球菌(Streptococcusequizooepidemicus)MGCS10565；雞鏈球菌(Streptococcusgallolyticus)UCN34uid46061；格氏鏈球菌(Streptococcusgordonii)ChallissubstCH1；變異鏈球菌(Streptococcusmutans)NN2025uid46353；變異鏈球菌(Streptococcusmutans)；釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)M1GAS；釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)MGAS5005；釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)MGAS2096；釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)MGAS9429；釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)MGAS10270；釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)MGAS6180；釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)MGAS315；釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)SSI-1；釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)MGAS10750；釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)NZ131；嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles)CNRZ1066；嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles)LMD-9；嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles)LMG18311；肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)A3LochMaree；肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)BEklund17B；肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)Ba4657；肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)FLangeland；解纖維梭菌(Clostridiumcellulolyticum)H10；微小微單胞菌(Finegoldiamagna)ATCC29328；直腸假桿菌(Eubacteriumrectale)ATCC33656；雞敗血枝原體(Mycoplasmagallisepticum)；運動枝原體(Mycoplasmamobile)163K；穿透枝原體(Mycoplasmapenetrans)；關節(jié)液枝原體(Mycoplasmasynoviae)53；念珠狀鏈桿菌(Streptobacillusmoniliformis)DSM12112；慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)BTAi1；漢堡硝化桿菌(Nitrobacterhamburgensis)X14；血色紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)BisB18；血色紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)BisB5；食清潔劑細小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)DS-1；恒雄芝氏溝鞭玫瑰桿屬(Dinoroseobactershibae)DFL12；固氮葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)Pal5FAPERJ；固氮葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)Pal5JGI；固氮螺菌(Azospirillum)B510uid46085；深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)ATCC11170；絮凝劑產(chǎn)生菌(Diaphorobacter)TPSYuid29975；蚯蚓蟲腎桿菌(Verminephrobactereiseniae)EF01-2；腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)053442；腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)alpha14；腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)Z2491；需鹽脫硫弧菌(Desulfovibriosalexigens)DSM2638；空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejunidoylei)26997；空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)81116；空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)；紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacterlari)RM2100；肝螺桿菌(Helicobacterhepaticus)；產(chǎn)琥珀酸沃林氏菌(Wolinellasuccinogenes)；甲苯單胞(Tolumonasauensis)DSM9187；交替假單胞菌(Pseudoalteromonasatlantica)T6c；希瓦氏菌(Shewanellapealeana)ATCC700345；嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)Paris；產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)130Z；多殺巴斯德菌(Pasteurellamultocida)；新兇手弗朗西絲氏菌(Francisellatularensisnovicida)U112；土拉熱弗朗西絲氏菌全北區(qū)亞種(Francisellatularensisholarctica)；土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisellatularensis)FSC198；土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisellatularensis)；土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisellatularensis)WY96-3418；和齒垢密螺旋體(Treponemadenticola)ATCC35405。在文獻中，本領域技術人員可將Cas9蛋白稱為Csn1。示例性的釀膿鏈球菌Cas9蛋白序列如下所示。參見Deltcheva等，Nature471，602-607(2011)，通過引用全文納入本文。MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKUFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD根據(jù)一個方面，gRNA-引導的Cas9切割的特異性用作基因組工程改造的機制和驅動基因。根據(jù)一個方面，對于該酶識別gRNA/DNA雜合體并影像切割而言，gRNA的雜交不必是100％。可出現(xiàn)一些脫靶活性。例如，釀膿鏈球菌系統(tǒng)在體外耐受20bp的成熟間隔子序列的前6個堿基中的錯配。根據(jù)一個方面，當潛在脫靶位點錯配(最后的14bp)NGG存在于gRNA的人參照基因組中時，更大的嚴謹性在體內(nèi)有益。根據(jù)某些方面，可改善特異性。當gRNA-DNA雜合體的熔點對干擾敏感時，富AT的靶序列可能有較少的脫靶位點。小心選擇靶位點以避免在基因組其他地方的至少14bp個錯配序列的假位點可改善特異性。使用需要更長的PAM序列的Cas9變體可降低脫靶位點的頻率。定向進化可改善Cas9的特異性至足夠完全排除脫靶活性的水平，理想地需要與最小PAM的完美20bp的gRNA匹配。因此，Cas9蛋白的修飾是本發(fā)明的代表性實施方式?？捎糜诒景l(fā)明的CRISPR系統(tǒng)描述于R.Barrangou，P.HorVath，CRISPR：噬菌體抗性和菌株鑒定中的新視界(CRISPR：newhorizonsinphageresistanceandstrainidentincation).Annualreviewoffoodscienceandtechnology3，143(2012)和B.Wiedenheft，S.H.Sternberg，J.A.Doudna，細菌和古細菌中RNA-引導的遺傳沉默系統(tǒng)(RNA-guidedgeneticsilencingsystemsinbacteriaandarchaea).Nature482，331(Feb16，2012)，其各自通過引用全文納入本文。根據(jù)某些方面，DNA結合蛋白經(jīng)改變或修飾以使得核酸酶活性滅活。這類改變或修飾包括改變一個或多個氨基酸以使核酸酶活性或核酸酶結構域滅活。這類修飾包括去除顯示出核酸酶活性的一個或多個多肽序列，即核酸酶結構域，使得DNA結合蛋白上沒有顯示出核酸酶活性的一個或多個多肽序列，即核酸酶結構域?；诒景l(fā)明，滅活核酸酶活性的其他修飾將對于本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，無核酸酶的DNA結合蛋白包括經(jīng)修飾以滅活核酸酶活性或去除一個或多個多肽序列以滅活核酸酶活性的多肽序列。無核酸酶DNA結合蛋白保留了結合至DNA的能力，即使核酸酶活性已經(jīng)被滅活。因此，DNA結合蛋白包括DNA結合所需的一個或多個多肽序列，但是可缺少顯示核酸酶活性的一個或多個或全部核酸酶序列。因此，DNA結合蛋白包括DNA結合所需的一個或多個多肽序列，但是可具有顯示滅活的核酸酶活性的一個或多個或全部核酸酶序列。根據(jù)一個方面，具有2個或更多個核酸酶結構域的DNA結合蛋白可經(jīng)修飾或改變以使除了核酸酶結構域之一以外的全部核酸酶結構域滅活。這種經(jīng)修飾或改變的DNA結合蛋白被稱為DNA結合蛋白缺刻酶，該DNA結合蛋白僅切割或切開雙鏈DNA的一條鏈。當由RNA引導至DNA時，DNA結合蛋白缺刻酶被稱為RNA引導的DNA結合蛋白缺刻酶。示例性的DNA結合蛋白是II型CRISPR系統(tǒng)的RNA引導的DNA結合蛋白酶，如Cas9蛋白或修飾的Cas9或者Cs9的同源物。示例性的DNA結合蛋白是Cas9蛋白缺刻酶。示例性的DNA結合蛋白是II型CRISPR系統(tǒng)的RNA引導的DNA結合蛋白，其缺少核酸酶活性。示例性的DNA結合蛋白是無核酸酶的Cas9蛋白。根據(jù)本文所述的RNA引導的基因組調控方法的某些方面，改變Cas9來降低、顯著降低或消除核酸酶活性。根據(jù)一個方面，通過改變RuvC核酸酶結構域或HNH核酸酶結構域來降低、顯著降低或消除Cas9核酸酶活性。根據(jù)一個方面，滅活RuvC核酸酶結構域。根據(jù)一個方面，滅活HNH核酸酶結構域。根據(jù)一個方面滅活RuvC核酸酶結構域和HNH核酸酶結構域。根據(jù)另一個方面，提供了Cas9蛋白，其中滅活RuvC核酸酶結構域和HNH核酸酶結構域。根據(jù)另一個方面，提供了無核酸酶的Cas9蛋白，其中滅活RuvC核酸酶結構域和HNH核酸酶結構域。根據(jù)另一個方面，提供Cas9缺刻酶，其中滅活RuvC核酸酶結構域或HNH核酸酶結構域，從而保留其余核酸酶結構域的核酸酶活性。通過這種方式，僅雙鏈DNA的一條鏈被切割或切開。根據(jù)另一個方面，提供了無核酸酶的Cas9蛋白，其中Cas9中的一個或多個氨基酸被改變或者去除以提供無核酸酶的Cas9蛋白。根據(jù)一個方面，氨基酸包括D10和H840。參見Jinke等，Science337：816-821(2012)。根據(jù)另一個方面，氨基酸包括D839和N863。根據(jù)一個方面，D10、H840、D839和H863中的一個或多個或全部被氨基酸取代，該氨基酸降低、顯著降低或消除核酸酶活性。根據(jù)一個方面，D10、H840、D839和H863中的一個或多個或全部被丙氨酸取代。根據(jù)一個方面，D10、H840、D839和H863中的一個或多個或全部被降低、顯著降低或消除核酸酶活性的氨基酸如丙氨酸取代的Cas9蛋白被稱為無核酸酶Cas9或Cas9N并且顯示出降低的或消除的核酸酶活性，或者在檢測水平內(nèi)沒有或基本沒有核酸酶活性。根據(jù)該方面，使用已知試驗可能無法檢測到Cas9N的核酸酶活性，即低于已知試驗的檢測水平以下。根據(jù)一個方面，Cas9蛋白、Cas9蛋白缺刻酶或無核酸酶Cas9包括其同源物和直向同源物，其保留蛋白結合至DNA并且受RNA引導的能力。根據(jù)一個方面，Cas9蛋白包括天然產(chǎn)生的來自釀膿鏈球菌的Cas9所述的序列和與之具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％同源性的蛋白質序列，并且是DNA結合蛋白，如RNA引導的DNA結合蛋白。根據(jù)一個方面，提供了經(jīng)工程改造的Cas9-gRNA系統(tǒng)，其使得能夠通過將轉錄活性結構域系連至無核酸酶的Cas9或引導RNA在細胞中進行RNA-引導的基因組調控。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，一個或多個轉錄調控蛋白或結構域(這類術語互換使用)接合或連接至核酸酶缺陷型Cas9或者一種或多種引導RNA(gRNA)。轉錄調控結構域對應于靶向基因座。因此，本發(fā)明的方面包括通過將這類結構域融合、連接或接合至Cas9N或gRNA來將轉錄調控結構域定位至靶向基因座的方法和材料。根據(jù)某些方面，提供了使用Cas9N、一個或多個gRNA以及轉錄調控蛋白或結構域調控內(nèi)源性基因的方法。根據(jù)一個方面，內(nèi)源性基因可以是任何所需基因，在本文中稱為靶基因。根據(jù)一個方面，提供了能夠進行轉錄活化的Cas9N-融合蛋白。根據(jù)一個方面，VP64活化結構域(Zhang等，NatureBiotechnology29，149-153(2011)，通過引用全文納入本文)接合、融合、連接或系連至Cas9N的C末端。根據(jù)一個方法，通過Cas9N蛋白向靶基因組DNA的位點提供轉錄調控結構域。根據(jù)一個方法，提供了在細胞內(nèi)與轉錄調控結構域融合的Cas9N，其伴隨一種或多種引導RNA。具有與之融合的轉錄調控結構域的Cas9N在靶基因組DNA處或附近結合。一種或多種引導RNA在靶基因組DNA處或附近結合。轉錄調控結構域調控靶基因的表達。根據(jù)一個具體方面，Cas9N-VP64融合在與啟動子附近的gRNA靶向序列結合時激活報告構建體的轉錄，從而顯示RNA-引導的轉錄活化。根據(jù)一個方面，提供了能夠進行轉錄活化的gRNA-融合蛋白。根據(jù)一個方面，VP64活化結構域接合、融合、連接或系連至gRNA。根據(jù)一個方法，通過gRNA向靶基因組DNA的位點提供轉錄調控結構域。根據(jù)一個方法，在細胞內(nèi)提供了與轉錄調控結構域融合的gRNA與Cas9N蛋白。Cas9N在靶基因組DNA處或附近結合。具有與之融合的轉錄調控結構域的一種或多種引導RNA在靶基因組DNA處或附近結合。轉錄調控結構域調控靶基因的表達。根據(jù)一個具體方面，與轉錄調控結構域融合的Cas9N蛋白和gRNA激活報告構建體的轉錄，從而顯示RNA-引導的轉錄活化。根據(jù)一個方面，轉錄調控子蛋白或結構域是轉錄活化物。根據(jù)一個方面，轉錄調控子蛋白或結構域上調靶核酸的表達。根據(jù)一個方面，轉錄調控子蛋白或結構域是轉錄抑制物。根據(jù)一個方面，轉錄調控子蛋白或結構域下調靶核酸的表達?；诒景l(fā)明，本領域技術人員可容易地鑒定轉錄活化物和轉錄抑制物。根據(jù)一個方面，外來核酸序列編碼2個或更多個引導RNA，各RNA與DNA靶核酸中的相鄰位點互補并且還編碼至少一個RNA引導的DNA結合蛋白缺刻酶并受2個或更多個RNA的引導，其中2個或更多個RNA以及至少一個RNA引導的DNA結合蛋白缺刻酶被表達并且其中至少一個RNA引導的DNA結合蛋白缺刻酶與2個或更多個RNA共定位至DNA靶核酸并且切開DNA靶核酸產(chǎn)生2個或更多個相鄰切口。根據(jù)某些方面，2個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的同一條鏈上。根據(jù)一個方面，2個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的同一條鏈上并且導致同源重組。根據(jù)一個方面，2個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上。根據(jù)一個方面，2個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上并且產(chǎn)生雙鏈斷裂。根據(jù)一個方面，2個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上并且產(chǎn)生雙鏈斷裂，導致非同源末端接合。根據(jù)一個方面，2個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上并且互相補償。根據(jù)一個方面，2個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上并且互相補償并產(chǎn)生雙鏈斷裂。根據(jù)一個方面，2個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上并且互相補償并產(chǎn)生雙鏈斷裂，導致非同源末端接合。根據(jù)一個方面，2個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上并產(chǎn)生雙鏈斷裂，導致靶核酸的片段化，從而防止靶核酸表達。根據(jù)某些方面，可根據(jù)本文所述的方法增加RNA引導的DNA接合蛋白的結合特異性。根據(jù)一個方面，在基因組編輯的方法中使用補償切口。大部分的切口很少導致NHEJ事件(參見Certo等，NatureMethods8，671-676(2011)，通過引用全文納入本文)，因此使脫靶切口的影響最小化。相反，誘導補償切口以生成雙鏈斷裂(DSB)在誘導基因破壞上是高度有效的。根據(jù)某些方面，與3’突出端相反，5’突出端生成更明顯的NHEJ事件。類似地，3’突出端相比NHEJ更傾向HR事件，雖然HR事件的綜述明顯低于生成5’突出端時。因此，提供了使用切口進行同源重組并且使用補償切口生成雙鏈斷裂以最小化脫靶Cas9-gRNA活性效果的方法。本發(fā)明的種系細胞包括其中可如本文所述導入并表達外來核酸的任何種系細胞。應理解，本文所述的本發(fā)明的基本概念并不受到細胞類型的限制。本發(fā)明的種系細胞包括真核種系細胞、原核種系細胞、動物種系細胞、哺乳動物種系細胞、植物種系細胞、昆蟲種系細胞、真菌種系細胞、古細菌種系細胞、真細菌種系細胞等。此外，種系細胞包括其中有益或需要導入本文所述的外來核酸序列的任意細胞。靶核酸包括可使用本文所述的共定位復合物來切割、切開或調控的任意核酸序列。靶核酸包括基因。出于本發(fā)明的目的，DNA，如雙鏈DNA可包括靶核酸并且共定位復合物可結合至或以DNA共定位在靶核酸處或與之相鄰或其附近，并且是以共定位復合物對靶核酸具有所需效果的方式。這類靶核酸可包括內(nèi)源性(或天然產(chǎn)生)核酸和外源性(或外來)核酸?；诒景l(fā)明，本領域技術人員將能易于鑒定或涉及引導RNA和Cas9蛋白，其共定位至包括靶核酸的DNA。本領域技術人員還能夠鑒定轉錄調控子蛋白或結構域，其類似地共定位至包括靶核酸的DNA。DNA包括基因組DNA、線粒體DNA、病毒DNA或外源性DNA。外來核酸(即，不是細胞的天然核酸組成的那些)可使用本領域技術人員已知的用于這種導入的任何方法導入細胞。這類方法包括轉染、轉導、病毒轉導、微注射、脂質轉染、核轉染、納米顆粒轟擊、轉化、偶聯(lián)等。使用易于鑒定的文獻來源，本領域技術人員將易于理解和接受這類方法。基于本發(fā)明和特定種系細胞，本領域技術人員可易于鑒定作為轉錄活化物或轉錄抑制物的轉錄調控子蛋白或結構域。以下實施例是本發(fā)明的代表。這些實施例并不構成對本發(fā)明范圍的限制，因為這些和其他等價實施方式將對于本發(fā)明、附圖和所附權利要求而言是顯而易見的。實施例1Cas9基因驅動圖1A是顯示引導RNA和Cas9核酸酶共定位至靶DNA的示意圖。靶DNA位點包括“原型間隔子”序列，其與引導RNA的“間隔子”和Cas9結合所需的短原型間隔子-相鄰基序(PAM)匹配。圖1A所示的示例性Cas9基因驅動是本文所述的外來核酸序列(其可被稱為“盒”，因為該術語為本領域技術人員所知)，其編碼至少RNA引導的Cas9核酸酶、一種或多種與一個或多個靶DNA位點互補的引導RNA(如在相鄰必要基因內(nèi))、以及側接序列。該盒也可包含任何貨物遺傳物質，如其中待插入貨物遺傳物質的由種系細胞表達或由該細胞的后代表達的一種或多種基因。表達Cas9基因驅動來產(chǎn)生Cas9和一種或多種然后共定位在染色體對的第一染色體上的一個或多個靶DNA位點處的引導RNA并且其中Cas9然后以位點特異性的方式切割第一染色體上的靶DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂。Cas9-誘導的雙鏈斷裂的同源導向修復然后在切割位點處將Cas9基因驅動插入第一染色體。根據(jù)某些方面，然后表達插入的Cas9基因驅動來產(chǎn)生Cas9和一種或多種然后共定位在染色體對的第二染色體上的一個或多個靶DNA位點處的引導RNA，并且然后以位點特異性的方式切割靶DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂。Cas9-誘導的雙鏈斷裂的同源導向修復使用完成的含Cas9驅動的染色體作為模板從而將Cas9驅動插入染色體對的第二染色體中以產(chǎn)生對Cas9基因驅動而言純合的染色體對。這顯示于圖1B中。圖1C顯示在靶DNA位點處的突變可能阻止單個Cas9蛋白的切割。因此，圖1D所示的本發(fā)明的方面提供了針對多個靶DNA位點的多個引導RNA。通過這種方式，RNA-引導的基因驅動能通過靶向多個相鄰序列使得沒有單一突變能賦予抗性來克服抗性等位基因。靶位點將不會由于突變而切割的概率極大降低，因為靶DNA位點將可能被切割成多個位置，從而提供其中可插入RNA引導的基因驅動的切割位點。如圖1E所示，使用交替非同源末端接合(NHEJ)途徑修復可刪除所有的識別位點，產(chǎn)生勝過該驅動的驅動抗性等位基因。圖1F顯示破壞必要基因的NHEJ事件是高度有害的并且將以與有利于驅動對立的方式被選擇。選擇必要基因內(nèi)的靶位點確保了不正確的修復事件不能通過刪除所有靶向序列來產(chǎn)生抗性等位基因。非同源性末端接合可在修復的連接處產(chǎn)生小的插入或刪除，其可防止引導RNA和Cas9結合至修復位點。結果，RNA引導的基因驅動可能不能被插入染色體上的該位點，如果只有針對在RNA引導的基因驅動中編碼的該位點的單個引導RNA。然而，使RNA引導的基因驅動編碼靶向多個位點并因此產(chǎn)生多個切割位點的多個引導RNA將增加RNA引導的基因驅動將被插入染色體的幾率。此外，本發(fā)明的方面涉及靶向必要基因內(nèi)的Cas9的多個位點作為改善將RNA引導的基因驅動插入染色體的效率的方法。實施例2編輯和調控多個內(nèi)源性基因座根據(jù)本發(fā)明的某些方面，RNA-引導的基因驅動可通過納入靶向相應野生型等位基因的引導RNA編輯驅動本身遠端的多個內(nèi)源性等位基因。如圖2A所示，提供了針對多個基因序列的多個引導RNA，即，基因AWT、基因BWT和必要基因WT。多個引導RNA和Cas9蛋白的表達導致由Cas9來修飾各基因。根據(jù)一個方面，Cas9驅動也可包括一個或多個正交無核酸酶Cas9蛋白和相關引導RNA以及轉錄調控子，其可定位于靶DNA位點使得轉錄調控子可調控基因。參見圖7。如圖2B所示，可使用其他后續(xù)Cas9驅動來更新之前已經(jīng)由在先的Cas9驅動造成的變化。例如，如果特定驅動導致意料之外的副作用，釋放作為更新的第二驅動可重寫由第一驅動編碼的一個或多個修飾。根據(jù)該方面，可設計第二驅動來去除現(xiàn)有插入驅動，然后將其自身插入染色體中。另外，已由在先RNA引導的基因驅動修飾的一個或多個基因可被去除或被所需的基因替換。類似地，如圖2C所示，除了存在擴散恢復性驅動所需的Cas9基因和引導RNA以外，第三恢復性驅動可在所有基因組位置上恢復野生型序列。通過這種方式，種群可經(jīng)修飾來將其恢復回野生型。因此，本發(fā)明的方面涉及通過使用本文所述的方法將第二RNA引導的Cas9基因驅動導入之前修飾的細胞來對之前插入的RNA引導的Cas9基因驅動進行修飾或替換。第二基因驅動經(jīng)設計產(chǎn)生超過由第一基因驅動產(chǎn)生的修飾的其他修飾或消除由第一基因驅動產(chǎn)生的修飾。實施例3控制擴散根據(jù)某些方面，RNA-引導的基因驅動的擴散可通過靶向獨特基因與單一靶物質或亞群相關的序列多態(tài)性限制到單一靶物質甚至亞群。因為驅動可僅切割獨特序列，其并不在非靶種群中擴散。因此，本發(fā)明的方面涉及設計并使用RNA引導的基因驅動的方法，該基因驅動對于獨特基因序列或序列多態(tài)性而言是特異性的。通過這種方式，一種或多種引導RNA經(jīng)設計與獨特基因序列或序列多態(tài)性互補。通過這種方式，DNA結合蛋白被限制為定位于獨特基因序列或序列多態(tài)性。實施例4誘導人工形態(tài)根據(jù)某些方面，提供了使用RNA-引導的基因驅動通過導致2個種群之間的遺傳不相容來阻斷基因流動的方法。根據(jù)這一方面并且如圖3所示，使用不同引導RNA靶向相同必要基因內(nèi)的不同序列的2個基因驅動在2個種群中釋放。這2個種群由于各種群中缺少必要基因的各拷貝而變得不相容。向種群中釋放該類型的驅動將種群人工分裂成與驅動一樣多的種類。如示例性的圖3所示，驅動A切割必要基因X內(nèi)的序列1、2、3和4。隨著驅動A的擴散，其用具有經(jīng)重編碼使其不能被切割的序列1、2、3和4的形式替換基因X。驅動B切割基因X內(nèi)的序列5、6、7和8，并且基因X的形式具有經(jīng)重編碼使其不能被切割的這些序列。具有驅動A的雄性與具有驅動B的雌性交配產(chǎn)生遺傳一個具有驅動A和重編碼1/2/3/4的基因X的染色體，以及一個具有驅動B和重編碼5/6/7/8的基因X的染色體的后代。驅動A在位點1/2/3/4處切割基因X的第二拷貝，因為第二拷貝并沒有在這些位點處重編碼，其僅僅重編碼5/6/7/8。類似地，驅動B在位點5/6/7/8處切割基因X的第一拷貝，因為第一拷貝并沒有在這些位點處重編碼，其僅僅重編碼1/2/3/4。該生物體隨著基因X的2個拷貝都被切割而終結。因為基因X是必要的并且該生物體缺少完整拷貝的基因X來修復它們，該生物體死亡。因此，驅動A和驅動B是不相容的。根據(jù)這一方面，各驅動編碼不同形式的必要基因-第一外來核酸序列和第二外來核酸序列-其各自保留了該基因所編碼的必要蛋白的氨基酸序列，但是具有不同的重編碼的靶位置組-第一驅動具有與引導1/2/3/4不互補的重編碼位點1/2/3/4，而第二驅動具有與引導5/6/7/8不互補的重編碼位點5/6/7/8。當驅動雜交時，第一驅動在1/2/3/4處切割必要基因的第二驅動拷貝，因為其在這些位點沒有重編碼，而第二驅動在5/6/7/8處切割必要基因的第一驅動拷貝，因為其在這些位點沒有重編碼。更復雜的基因驅動可阻斷經(jīng)工程改造的亞群和野生種群之間的基因流動而不修飾后者(參見圖8)。該障礙甚至可以是單向的，使得經(jīng)工程改造的種群接受但不向野生種群貢獻遺傳物質(參見圖9)?？墒褂眠@些或相關的設計來阻止其他基因驅動或遺傳修飾擴散到相同或相關物種的未修飾成員。根據(jù)這一方面，2個種群中僅一個被修飾并且使用2個分開的RNA引導的基因驅動。第一驅動產(chǎn)生了供于第二驅動的插入位點。第二驅動1)包括必要基因的拷貝，使得其在擴散時將基因拷貝到由第一驅動產(chǎn)生的插入位點中，和2)殺死必要基因的野生型拷貝。當具有第二驅動的生物體與具有第一驅動的生物體交配時，第二驅動被拷貝到由第一驅動產(chǎn)生的插入位點中，加入必要基因拷貝并去除野生型拷貝。必要基因的凈變化為0，因此細胞是活的。當具有第二驅動的生物體與野生型生物體交配時，不能將該驅動及其必要基因插入野生型染色體，因為其缺少插入位點。然而，第二驅動仍然殺死野生型拷貝。必要基因的凈變化為-1，因此細胞死亡。因此，含有第二驅動的生物體與野生型生物體之間的任意交配不產(chǎn)生后代。本發(fā)明的這一方面提供產(chǎn)生與野生種群不相容的轉基因生物體以阻止轉基因擴散的方法。實施例5種群抑制和滅絕根據(jù)某些方面，RNA-引導的核酸酶和產(chǎn)生幾種不同形式的性別偏移的基因驅動，其可用于種群控制。如圖4A所示，在雄性減數(shù)分裂期間排他性地表達Cas9和靶向X染色體的引導RNA將產(chǎn)生與自然中發(fā)現(xiàn)的那些類似的典型的“減數(shù)分裂”Y-驅動。減數(shù)分裂驅動在減數(shù)分裂期間消除了競爭性性染色體，產(chǎn)生了偏移的配子集合。驅動表達必須嚴格限制在減數(shù)分裂前，或者該驅動將是致死的。這種類型的驅動將使得采用XY、ZW的生物體的配子偏移，并且在較低程度上使XO性別決定系統(tǒng)產(chǎn)生有利于任意性別的偏移。還參考圖4A，將RNA引導的基因驅動導入精母細胞的Y染色體中。RNA引導的基因驅動包括多個與X染色體上的靶序列互補的引導RNA。當表達RNA引導的基因驅動時，引導RNA和Cas9核酸酶定位于X染色體處，其中Cas9核酸酶產(chǎn)生使X染色體無用的雙鏈斷裂。減數(shù)分裂后，僅具有Y染色體的精子將存活。重要的是，正交Cas9核酸酶應該能夠避免減數(shù)分裂染色體沉默。本發(fā)明的方面涉及在Y染色體上使用本文所述的第一RNA引導的基因驅動以在生成精子之前用合適的引導RNA表達Cas9，其中表達的Cas9和合適的引導RNA切割常染色體并且編碼第二Cas9和合適的引導RNA的第二RNA引導的基因驅動被插入常染色體中。在精子發(fā)生期間，常染色體中第二RNA引導的基因驅動經(jīng)表達并且表達的第二Cas9和合適的引導RNA切割X染色體，從而使其無用。該方法能夠真實在精子發(fā)生期間不表達X和Y染色體的物種中切割X染色體。如圖4B所示，Cas9導致編碼Cas9B的盒在發(fā)育早期從性染色體拷貝到常染色體，在那里其無法在減數(shù)分裂期間消除競爭性染色體。根據(jù)一個方面，在使該種群偏向的性染色體上提供針對特定性別偏移的RNA引導的基因驅動。例如，哺乳動物中的雄性具有Y染色體，因此使種群偏向雄性的驅動必須在Y染色體上，使其然后輔助Y染色體產(chǎn)生更多的自身拷貝。由于哺乳動物性染色體并不在減數(shù)分裂(形成精子和卵)期間表達，可使用Cas9的2個拷貝來促進驅動恰當?shù)夭迦肴旧w中，其在表達時將產(chǎn)生會切割性染色體的Cas9。第一Cas9在發(fā)育早期，剛好在精子形成之前發(fā)揮作用，并且其切割常染色體(沒有在減數(shù)分裂期間不被沉默的性染色體)，從而使得編碼第二Cas9的RNA引導的基因驅動插入常染色體。第二Cas9在精子形成期間從常染色體表達并切割X染色體，從而確保最有活力的精子含有Y染色體。上述方法因此使用2個RNA引導的基因驅動，在性染色體不能在減數(shù)分裂期間表達基因的情況下，其中一個插入可表達的常染色體以使種群偏向雄性。如圖4C所示，“受精卵的”性別偏移驅動在受精或受精后階段期間消除了相反性別的同胞(參見Rice和Friberg2008，其通過引用全文納入本文)。重要的是，它們并不需要高度特異性的表達特征來發(fā)揮功能。X-驅動通過簡單靶向Y染色體上的位點來消除雄性受精卵(圖4C)。在Y-驅動中，基因驅動盒在X染色體上的必要基因處拷貝自身，其缺失在雄性中通過在驅動的Y染色體上的其他位置上插入拷貝來補償(圖4D)?？赡苄枰{節(jié)移植的必要基因的表達來解決一些物種中的劑量補償。參考圖4C，野生型精母細胞產(chǎn)生具有X染色體的野生型精子和具有Y染色體的野生型精子。提供具有RNA引導的基因驅動的卵母細胞，該驅動具有一種或多種與Y染色體互補的引導RNA，其被稱為“X驅動卵母細胞”。當具有Y染色體的野生型精子與卵母細胞結合時，表達RNA引導的基因驅動，引導RNA和Cas9核酸酶共定位至Y染色體，其中Cas9核酸酶在Y染色體中產(chǎn)生雙鏈斷裂，使Y染色體無用并因此產(chǎn)生無用的受精卵。相反，當具有X染色體的野生型精子與卵母細胞結合時，表達RNA引導的基因驅動，與X染色體和Cas9核酸酶互補的引導RNA共定位至X染色體，其中Cas9核酸酶在X染色體中產(chǎn)生雙鏈斷裂，其通過同源重組修復，從而將RNA引導的基因驅動插入X染色體，賦予受精卵對X染色體的純合性。X染色體的這一拷貝保持存活，因為雙鏈斷裂在RNA引導的基因驅動被拷貝時修復。所得的后代都是雌性，因為雄性由于缺失Y染色體而沒有存活。這些雌性比不編碼RNA引導的基因驅動其他雌性有優(yōu)勢，因為它們不必與雄性同胞競爭資源。因此，具有RNA引導的基因驅動的X染色體具有適應性優(yōu)勢。參考圖4D，合子Y-驅動編碼通常在X染色體上發(fā)現(xiàn)的必要基因并且使用基因驅動盒來消除來自X的必要基因。Y驅動從父系X染色體拷貝到母系X染色體，留下沒有任何必要基因拷貝的雌性受精卵。具體地，提供了具有來自X染色體的必要基因和編碼與X染色體上的必要基因互補的一種或多種引導RNA的RNA引導的基因驅動的Y染色體的精母細胞。精母細胞的X染色體還包括相同的RNA引導的基因驅動。精母細胞產(chǎn)生具有Y染色體的精子和具有X染色體的精子。具有Y染色體的精子與具有帶必要基因的X染色體的野生型卵母細胞結合。當表達RNA引導的基因驅動時，一種或多種引導RNA將Cas9核酸酶共定位至X染色體，其中Cas9核酸酶從X染色體上切去必要基因。然而，由于來自X染色體的必要基因存在于Y染色體上，該受精卵將存活。相反，當具有包含RNA引導的基因驅動的X染色體的精子與具有X染色體的野生型卵母細胞結合時，表達的一種或多種引導RNA與Cas9核酸酶共定位至X染色體，其中Cas9核酸酶從X染色體上切去必要基因。由于必要基因不再存在于卵母細胞中，卵母細胞不會存活。受精卵驅動的適應性益處將根據(jù)同胞競爭的程度、后代中的親代投入、和成人中的交配動態(tài)而變化。所有的合子Y-驅動應該產(chǎn)生與競爭性野生型Y染色體至少一樣(如果沒有更多)的雄性子代，并且這些子代都不必與雌性同胞競爭。與其他驅動類型不同，可通過確保與特定風險相關物種或非靶向亞群的交配無生育力來限制合子Y-驅動的宿主范圍。這可通過納入切割X染色體上的獨特序列以消除雜合雄性的引導RNA來完成。如果能夠阻斷驅動的突變不在X染色體或常染色體之一上迅速產(chǎn)生，則釋放Y-驅動將使當?shù)胤N群滅絕。該驅動可停止并最終通過釋放含有對切割免疫的性染色體的生物體來消除。密切監(jiān)視和控制可防止完全滅絕。RNA-引導的核酸酶也可產(chǎn)生侵略性較低的“無生育力雌性子代”Y染色體，其可抑制種群但不像驅動那樣擴散(圖10A)。靶向雌性生育力而非生存必要的X連鎖基因的Y染色體上的Cas9拷貝將消除雌性后代的繁殖潛力，但不會給雄性子代帶來優(yōu)勢。由于Cas9活性的較低代價，無生育力雌性子代Y將最終被野生型Y染色體戰(zhàn)勝，但是不會在導致嚴重的種群抑制之前，如果以足夠大量導入。該方法與雌性特異性致死密切相關并且正在開發(fā)去生育力方法以控制昆蟲和魚類種群，但由于其位于Y上，其構建可能更直接并且在進化上更穩(wěn)定。用于種群控制的雜交方法可能將Y-驅動與無生育力雌性子代方法的優(yōu)點結合(圖5A-B)。例如，同時靶向必要基因和雌性生育基因的Y染色體將迅速在種群中快速驅動本身，因為其是Y驅動。然而，其將在遇到隨后釋放的X染色體上重編碼必要基因，而不是雌性生育基因的標準基因驅動后喪失其適應性優(yōu)勢。雜合雌性將長成無生育力的而不是在胚胎期死亡，導致持續(xù)抑制而沒有滅絕。與種群控制相關的方法使用RNA-引導的基因驅動來破壞一個或多個基因，其1)為生育或存活所需，但2)一個完整拷貝很大程度上滿足該功能。在需要靶基因功能之后的任何時間，這種驅動可能會切割并替換生物體的種系細胞中的靶基因，該生物體在遺傳驅動的一個拷貝和野生型基因的一個拷貝。例如，可剛好在減數(shù)分裂之前用RNA引導的基因驅動切割并替換性腺發(fā)育和后續(xù)生育所需的基因。因為僅遺傳一個拷貝的生物體將已經(jīng)經(jīng)過正確的性腺發(fā)育(由于野生型拷貝滿足這一目的)，其通常有正常生育能力。然而，大多數(shù)或所有后代將由于剛好在精子和/或卵產(chǎn)生之前的驅動拷貝而遺傳驅動。這種設計使得驅動在稀少時在種群中擴散，因為大多數(shù)交配事件將產(chǎn)生更多遺傳一個拷貝驅動和一個拷貝野生型的個體。之后，2個攜帶驅動的個體之間的交配將產(chǎn)生無生育力的后代，導致種群銳減。這種情形已經(jīng)被廣泛建模，如以下所述：Burt，A.位點特異性自私基因作為天然種群的控制和遺傳工程改造的工具(Site-specificselfishgenesastoolsforthecontrolandgeneticengineeringofnaturalpopulations).Proc.Biol.Sci.270，921-928(2003).Deredec，A.，Burt，A.和Godfray，H.C.J.在媒介和害蟲管理中使用尋靶核酸內(nèi)切酶基因的種群基因組學(Thepopulationgeneticsofusinghomingendonucleasegenesinvectorandpestmanagement).Genetics179，2013-2026(2008).North，A.，Burt，A.&Godfray，H.C.J.對尋靶核酸內(nèi)切酶基因在蚊子種群中空間擴散的建模(Modellingthespatialspreadofahomingendonucleasegeneinamosquitopopulation).J.Appl.Ecol.50，1216-1225(2013)，其各自通過引用全文納入本文。將基因表達限于種系細胞和/或將時間限于減數(shù)分裂之前的方法是本領域技術人員已知的。實施例6應用本文所述的基因驅動在根除傳染性疾病和控制入侵物種中有特別的實用性。這類RNA引導的Cas9基因驅動可用于在受威脅或瀕臨威脅的物種如兩棲動物中快速擴散保護性等位基因。這類RNA引導的Cas9基因驅動也可通過用由驅動攜帶的外來物種RNAi機制靶向RNA病毒和用Cas9靶向dsRNA病毒來免疫通常用作人類病毒儲庫的野生種群。疾病媒介可經(jīng)工程改造而無法獲取病原體或可使用本文所述的Y驅動來清除，即，RNA引導的Cas9基因驅動，其抑制X染色體增殖。類似地，可使用Y-驅動局部控制或清除入侵和破壞生態(tài)的害蟲?？煞乐辜茵B(yǎng)動物向控制的相關的野生型物種和未馴服種群提供基因以最小化生態(tài)破壞并降低對收容和救助機構的需要。類似地，可將轉基因作物和動物與它們未經(jīng)修飾的同族物種在遺傳上分離，如瀕危物種由較高豐度或入侵親緣物種的遺傳稀釋而瀕臨滅絕那樣。最后，基因驅動可用于直接檢驗關于自然環(huán)境中的形態(tài)、性別比、以及基因的進化和生態(tài)重要性的假設。本文所述的基因驅動對于通過媒介傳播的疾病有特別的實用性。由于媒介傳播的傳染性疾病的死亡人數(shù)是驚人的。僅瘧疾每年就殺死650000人，大多數(shù)是兒童，同時由于虛弱發(fā)燒而影響超過2億人，對他們的社會造成經(jīng)濟破壞。登革熱、黃熱病、錐蟲病、利什曼病、美洲錐蟲病、和萊姆病是由其他使用媒介傳播的病原體所引起。所有這些可通過驅動媒介中的阻止傳播的變化而減少或甚至清除?？茖W家已經(jīng)鑒定到了干擾瘧疾(Ito等，Nature2002，PMID：12024215；Dong等，PloSPathogens2012，PMID：22216006；Isaacs等，PNAS2012，PMID：22689959)和其他充分研究的疾病(Franz等，PNAS2006，PMID：16537508)傳播的幾種候選基因破壞或插入基因，但對于許多其他病原體則沒有。因此，本發(fā)明的方面涉及直接用Y-驅動清除媒介物種。在瘧疾的情況中，該策略針對出現(xiàn)的蚊子媒介是特別有希望的，蚊子喜歡在室外叮咬和休息，這些行為對于現(xiàn)有的聚焦于在室內(nèi)周圍噴灑殺蟲劑和蚊帳的控制策略而言是高度抗性的。雖然所有的媒介物種必定在給定區(qū)域內(nèi)被靶向以停止傳播，但是如果剛空出的生態(tài)環(huán)境被競爭性的非媒介物種所充滿，則將永久性地清除該疾病。很明顯，這種策略需要少量或不需要對媒介的分子生物學的理解，但是不可避免地需要局部或可能全球性地消滅媒介物種。本文所述的基因驅動對于控制入侵物種有特別的實用性。全球經(jīng)濟活動中最有環(huán)境危險性的結果之一是入侵生物的運輸，其通常導致生態(tài)破壞和天然物種滅絕。隔離的生態(tài)系統(tǒng)，如小島上的那些是特別脆弱的。Cas9Y-驅動具有通過在單個小島或者可能整個大陸上控制或者甚至清除這些物種來促進生物多樣性的巨大潛力。設計對于入侵物種而言獨特的驅動序列、納入將降解風險近親的X染色體的引導RNA、并使用形態(tài)驅動來賦予靶物種與其近親的遺傳不相容性將該驅動靶向所選物種并且降低跨物種轉移的風險，而不直接修飾所有相關物種?？赏ㄟ^釋放重編碼Y-驅動功能所需位點的物種特異性標準基因驅動來保護相關物種。Y-驅動可從入侵種群擴散回到天然棲息地的風險對于僅通過故意人類活性入侵的物種，如淡水魚或蔗蟾蜍而言是可忽略的，但是Y-驅動傳播對于大鼠和其他入侵的偷渡者而言是幾乎是一定的。天然種群總可通過釋放X-重編碼驅動或者甚至抗性X染色體受保護免于滅絕。例如，低遷移性物種的入侵種群如亞洲鯉魚是通過Y-驅動直接清除的出色候選物。(圖6A)因為基因流動將需要有意的人類引導，局部清除可能是永久性且可實現(xiàn)的，而不用強制重編碼天然種群。相反，除非物種完全滅絕，大鼠和其他高遷移性入侵物種不能被永久性地清除。然而，他們可通過定期在天然種群中釋放標準重編碼驅動和在入侵種群中具有無生育力雌性子代效果的Y-驅動(Y-驅動-SD)來控制(圖6B)。實施例7農(nóng)業(yè)安全和可持續(xù)性本發(fā)明的方面涉及使用本文所述的Cas9方法來控制、減少或清除與農(nóng)業(yè)相關的雜草和害蟲。害蟲一般是指對人或農(nóng)業(yè)或家畜生產(chǎn)的人類企業(yè)有害的植物或動物。術語害蟲可包括任何活的生物體，其對植物或動物、人或人類企業(yè)、家畜、人結構、野生生態(tài)等是入侵性的或眾多的、有害的、制造麻煩的、有毒的、有破壞性的。術語害蟲也可包括害獸、雜草、植物和動物寄生蟲以及病原體。本發(fā)明的雜草可以指在特定情況中認為不需要的植物。廣義上，雜草可被認為是害蟲(植物)。常見的示例是在人類控制的環(huán)境，如農(nóng)場、花園、草坪和公園中不想要的植物。術語“雜草”也可包括在其天然棲息地以外瘋狂生長或繁殖，或有入侵性的任意植物。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，可使用Cas9方法來將一種或多種RNA-引導的“敏化驅動”插入雜草或害蟲的種系細胞的基因組中。敏化驅動是本文所述的基因驅動并且也可稱為“敏化基因驅動”。因此，“敏化驅動”是插入基因組DNA并被傳至后代并賦予后代對外來刺激的敏感性的基因驅動。根據(jù)一個方面，RNA-引導的“敏化驅動”通過納入基因組DNA賦予雜草或害蟲對化合物或化學物的有害敏感性，如毒性。通過這種方式，可通過使雜草或害蟲接觸通常對雜草或害蟲無毒的化合物或化學物或條件來控制雜草或害蟲的生長和繁殖。通過這種方式，由于將基因驅動插入種系細胞并傳至后代，已經(jīng)通過敏化基因驅動改變了雜草或害蟲的表型。通過這種方式，雜草或害蟲的參考可能是指由在種系細胞中初始插入敏化基因驅動并與野生種群交配產(chǎn)生的種群。所得的種群可被稱為改變的種群或敏化種群或遺傳改變的種群。根據(jù)本發(fā)明，術語“敏感性”在涉及雜草或害蟲時表示對于雜草或害蟲所接觸的化合物或化學物或條件的有害反應，如毒性。敏化驅動是本文所述的基因驅動，其改變基因組DNA以響應雜草或害蟲所接觸的化合物、化學物或條件產(chǎn)生有害反應，如毒性。在化學物、化合物或條件由于基因組中存在敏化驅動或毒性驅動而對雜草或害蟲而言有毒性的情況下，“敏化驅動”在本文中還可稱為“毒性驅動”或“毒性基因驅動”。根據(jù)一個方面，向種系生物體外源性地加入敏化驅動或毒性驅動。通過這種方式，敏化基因驅動或毒性基因驅動是外來核酸，雖然，根據(jù)某些應用，其可包括對雜草或害蟲物種而言天然但在其所引入的種系細胞中不存在的序列。根據(jù)一個方面，敏化驅動或毒性驅動是外來核酸，其使用本文所述的RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶和相關引導RNA外源性地加入種系生物體。根據(jù)一個方面，雜草或害蟲可對特定的除草劑或殺蟲劑有抗性，或者雜草或害蟲可隨時間發(fā)展出對特定除草劑或殺蟲劑的抗性。雜草或害蟲相對于除草劑或殺蟲劑的進化是農(nóng)業(yè)上的主要問題。本文所述的方法使用RNA引導的“敏化驅動”來賦予生物體對之前對該生物體無毒或低毒性的化學物、化合物或條件的敏感性，使得該生物體的后代將對該化學物、化合物或條件敏感，并且該生物體將死于毒性或繁殖將被減少，或者該生物體將失去生育能力使其無法繁殖。通過這種方式，敏化基因驅動內(nèi)的核酸序列由該生物體，如雜草或害蟲表達，并且核酸的表達改變了生物體的表型，使其對化學物、化合物或條件易感。根據(jù)另一個方面，使用一種或多種敏化驅動來用原始(或非突變)等位基因替換他們的抗性等位基因(如具有抗性突變的那些)以恢復敏感性。因此，已經(jīng)通過等位基因的突變發(fā)展出對除草劑或殺蟲劑的抗性的生物體可通過去除具有抗性的突變體形式的等位基因并用具有敏感性的非突變體形式將其替換來賦予對除草劑或殺蟲劑的敏感性。通過這種方式，非突變體形式的等位基因對于生物體或生物體種群而言是外來的，因為其包括突變體形式的等位基因。因此，敏化基因驅動可逆轉賦予對現(xiàn)有殺蟲劑或除草劑的抗性的已知突變?？墒褂肦NA-引導的驅動來逆轉已經(jīng)在生物體種群中擴散的基因組改變。根據(jù)這一方面，釋放第二驅動可重寫由第一驅動產(chǎn)生的一個或所有變化，如本文所述。通過這種方式，通過第一基因驅動和賦予表型如毒性的第一核酸序列來表征生物體種群，其被首先引入種系細胞以在后代中產(chǎn)生該表型并且然后傳至后代。然而，通過突變或其他手段，該表型丟失。在這種情況下，具有賦予相同表型的第二核酸序列的第二基因驅動被導入第一核酸去除或未去除的種系細胞中，并且第二核酸序列被攜帶到后代中。通過這種方式，由第二基因驅動核酸重寫第一基因驅動核酸，例如，以通過逆轉突變產(chǎn)生的抗性來產(chǎn)生毒性。根據(jù)另一個方面，敏化驅動可攜帶前藥轉化酶，其可賦予前藥分子對表達該酶的生物體的毒性。通過這種方式，產(chǎn)生酶并且如果該生物體與前藥接觸，該酶將前藥轉化成對生物體如雜草或害蟲有毒性的化合物或化學物?；诒景l(fā)明，各種前藥/酶的組合對于本領域技術人員而言將是顯而易見的。根據(jù)另一個方面，敏化驅動可將必要基因替換為受特定小分子強烈抑制的形式。因此，基因的表達將受抑制或者基因的表達產(chǎn)物將受抑制。這種抑制可導致生物體死亡或更低的繁殖。因為，在一些實施方式中，敏化驅動在沒有其相關分子的情況下將無效-并且在一些情況中反之亦然-它們可以最小的生態(tài)風險獲得地理和種群抑制程度上非常精細的控制。根據(jù)一個示例性方面，使用敏化驅動來逆轉突變使玉米根葉甲抗Bt毒素(參見Gassman等，PNAS，卷111，14期，第5141-5146頁，doi：10.1073/pnas.1317179111(2014)，通過引用全文納入本文)或大乍蓬和藜抗除草劑草甘膦(參見Gaines，T.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.107，1029-1034(2010)和Ge，X.，d’Avignon，D.A.，Ackerman，J.J.和Sammons，R.D.PestManag.Sci.66，345-348(2010)，各自通過引用全文納入本文)，一種現(xiàn)在對環(huán)境可持續(xù)免耕農(nóng)業(yè)必要的除草劑。根據(jù)這一方面，向野生種群中釋放具有敏化驅動的生物體，其單個生物體可能有或沒有抗性，并且敏化驅動被攜帶到后代中，結果是降低后代種群的抗性(其中野生種群中存在抗性)并增加后代種群對特定除草劑或殺蟲劑的抗性(其中，抗性存在于野生種群中)。應理解野生種群中只有一些成員具有抗性，但是敏化驅動在野生種群的敏感和抗性成員中同時擴散，產(chǎn)生具有敏化驅動的后代種群。根據(jù)一個方面，包含一個或多個敏化驅動的生物體將釋放到不用除草劑或殺蟲劑處理的區(qū)域中，從而產(chǎn)生敏化驅動的儲庫，其可擴散到用除草劑或殺蟲劑處理的相鄰區(qū)域中。根據(jù)一個方面，提供了其中使用一個或多個敏化驅動來對抗導致抗性的突變的方法。根據(jù)這一方面，初始或隨著后續(xù)的時間段向由于一種或多種突變而發(fā)展出對殺蟲劑或除草劑的抗性的野生種群的基因組中導入這類敏化驅動逆轉了一種或多種突變提供抗性的效果并賦予種群殺蟲劑毒性或除草劑毒性。這類方法能夠無限使用任何給定的除草劑或殺蟲劑，因為賦予抗性的突變被阻止或替換，從而“擊退(rollback)”可能出現(xiàn)的任何抗性。根據(jù)另一個方面，可通過在其基因組(以及因此其后代)中包含一個或多個敏化驅動來賦予植物或動物對化學物或化合物或條件的易感性，該敏化驅動賦予化學物、化合物或條件對植物或動物，如雜草或害蟲的毒性。因此，可被認為對人類安全的化合物可能由于在植物或動物的基因組中包含一個或多個敏化驅動從而賦予化學物或化合物對植物或動物的毒性而對植物或動物是有毒的。根據(jù)這一方面，被認為安全和/或有效的現(xiàn)有化合物可針對現(xiàn)在對它們并不易感的生物體施加，如果敏化驅動是將敏化基因從受影響的物種或實驗室分離株遞送或用敏感基因替換對適應性而言重要的基因。根據(jù)另一個方面，提供了其中使用敏化驅動來賦予害蟲種群對分子、化合物或化學物的易感性的方法，該分子、化合物或化學物對其他生命形式無害。而現(xiàn)有的殺蟲劑和除草劑-甚至以“有機”命名的那些-根據(jù)它們對害蟲和雜草的毒性選擇，它們通常傷害非害蟲物種或者甚至人類，因為受影響的通路在物種間是保守的。根據(jù)本發(fā)明，提供了其中遞送一個或多個賦予生物體對正常無害分子的敏感性的基因的方法。導入敏感基因驅動有效地將該分子轉化成對由該驅動修飾的特定害蟲或雜草有高度特異性的殺蟲劑或除草劑。驅動和分子的組合對生物體是致命的。一個示例性的實施方式是使用酶/前藥組合，其中酶導入生物體的基因組并表達。當生物體接觸前藥時，酶將前藥轉化成活性除草劑或殺蟲劑。證明本發(fā)明的這一方面原理的類似候選物是抗病毒或抗癌療法，其中局部產(chǎn)生的病毒或腫瘤特異性酶活化前藥。示例包括胞嘧啶脫氨酶/5-溴尿嘧啶對和硝基還原酶/CB1954對。在敏化驅動的情況中，可通過基因驅動向靶物種遞送酶，使前藥變成特異性殺蟲劑。另一個示例性的對包括經(jīng)改變受到特定化學物強烈抑制的原代代謝酶。例如，經(jīng)工程改造的轉化酶可能在大多數(shù)生物惰性的外源性化學物如三氯蔗糖或相關的鹵化多糖的存在下變得沒有功能。敏化驅動將用經(jīng)工程改造的形式替換生物體的天然轉化酶基因，賦予其對其他大多數(shù)惰性化合物的敏感性?；诒疚乃龅拿艋寗?，本領域技術人員能容易鑒定適用于該目的的可用酶/化學物對。本領域技術人員能容易鑒定本發(fā)明范圍內(nèi)的雜草包括對農(nóng)作物有害的那些雜草植物。在聯(lián)邦或州法律中，這類雜草可能或可能不命名為“有害雜草”。例如，大乍蓬和藜被認為是對農(nóng)作物有害的雜草，但可能不被稱為有害雜草。被USDA稱為有害雜草的示例性雜草包括以下。水生寄生拉丁名通用名Aeginetiaspp.物種間不同Alectraspp.物種間不同Cuscutaspp.(天然除外)菟絲子(Dodders)Orobanchespp.(天然除外)內(nèi)蓯蓉(Broomrapes)Strigaspp.獨腳金(Witchweeds)陸生本發(fā)明范圍內(nèi)的其他雜草包括榆錢草(Atriplex，Spreading)；毛三葉草(Beggarsticks，Nodding)；旱雀麥(Brome，Downy)；野胡蘿卜(Carrot，wild)；洋甘菊(Chamomile，scentless)；繁縷(Chickweed，common)；刺黃瓜(Cucumber，bur)；蒲公英(Dandelion)；加拿大飛蓬(Fleabane，Canada)；播娘蒿(Flixweed)；臭草(Grass，Stink)；畫眉草(Grass，Tuftedlove)；地櫻桃(Groundcherry，Smooth)；光葉水蘇(Hedge-nettle，Marsh)；水蘇(Horse-nettle)；馬尾(Horsetail，F(xiàn)ield)；刺生菜(Lettuce，Prickly)；三子山靛(Mercury，Three-seeded)；亂子草(Muhly，Wire-stemmed)；稻槎菜(Nipplewort)；小糠草(Redtop)；蒺藜草(Sandbur，Long-spined)；蕁麻(Smartweed，Swamp)；一年生苦苣菜(Sow-thistle，Annual)；多年生苦苣菜(Sow-thistle，Perennial)；直立婆婆納(Speedwell，Corn)；叢生草藤(Vetch，Tufted)；堇菜(Violet，F(xiàn)ield)；水麻(Waterhemp，Common)；酢漿草(Wood-sorrelspecies)；狗牙草(Bermudagrass)；旋花草(Bindweed)；大車前(Broadleafplantain)；牛蒡(Burdock)；灰菜(Commonlambsquarters)；錦葵(CreepingCharlie)；蒲公英(Dandelion)；一枝黃花(Goldenrod)；日本紫菀(JapaneseKnotweed)；野葛(Kudzu)；乳漿草(Leafyspurge)；水飛薊(Milkthistle)；毒葛(Poisonivy)；豚草(Ragweed)；酸模(Sorrel)；獨腳金(Striga)；金絲桃(StJohn′swort)；漆樹(Sumac)；臭椿(Treeofheaven)；野胡蘿卜(Wildcarrot)；酢漿草(Woodsorrel)和油莎草(Yellownutsedge)。由學名鑒定的其他雜草包括三子山靛(AcalypharhomboideaRaf.)；麥仙翁(AgrostisgiganteaRoth)；莧菜(AmaranthusrudisL.)；濱藜(AtriplexpatulaL.)；俯垂鬼針草(BidenscernuaL.)；早雀麥(BromustectorumL.)；蒺藜草(CenchruslongispinusHack.)；小白酒草(ConyzaCanadensis)；胡蘿卜(DaucuscarotaL.)；播娘蒿(DescurainiasophiaL.)；問荊(EquisetiumarvenseL.)；畫眉種(Eragrostisspp.)；萵苣(LactucascariolaL.)；歐洲稻槎菜(LapsanacommunisL.)；無味母菊(MatricariaperforataMerat.)；亂子草(MuhlenbergiafrondosaPoir.)；酢漿草(OxallisdilleniiJacq)；酸漿(PhysalisvirginianaMill.)；蓼(PolygonumcoccineumMuhl.)；刺黃瓜(SicyosangulatusL.)；茄(SolanumcarolinenseL)；苦荬菜(SonchusarvensisL.)；苦苣菜(SonchusoleraceusL.)；沼生水蘇(StachyspalustrisL.)；繁縷(Stellariamedia)；達邊蕨(TaraxacumofficinaleWeber.)；直立婆婆納(VeronicaavensisL.)；廣布野豌豆(ViciacraccaL.)；和耕地堇菜(ViolaavensisL)。應理解本發(fā)明范圍內(nèi)的其他雜草可通過本領域技術人員容易獲得的來源鑒定。雜草抗性或發(fā)展抗性針對的常用除草劑包括以下。基于本發(fā)明，本領域技術人員將能容易地鑒定針對特定雜草物種有毒性的除草劑。應理解本發(fā)明范圍內(nèi)的其他除草劑可通過本領域技術人員容易獲得的來源鑒定。本發(fā)明范圍內(nèi)與玉米相關的害蟲包括以下。本發(fā)明范圍內(nèi)與棉花相關的害蟲包括以下。本發(fā)明范圍內(nèi)與橡樹相關的害蟲包括以下。本發(fā)明范圍內(nèi)與松樹相關的害蟲包括以下。本發(fā)明范圍內(nèi)與小谷物相關的害蟲包括以下。本發(fā)明范圍內(nèi)與大豆相關的害蟲包括以下。本發(fā)明范圍內(nèi)與葡萄相關的害蟲包括以下。本發(fā)明范圍內(nèi)與棕櫚相關的害蟲包括以下。本發(fā)明范圍內(nèi)與茄科植物相關的害蟲包括以下。本發(fā)明范圍內(nèi)與核果相關的害蟲包括以下。其他農(nóng)業(yè)害蟲包括以下孢囊線蟲。其他農(nóng)業(yè)害蟲包括以下外來木材蛀蟲或樹皮甲蟲。其他農(nóng)業(yè)害蟲包括以下軟體動物。其他農(nóng)業(yè)害蟲包括以下蛾。應理解本發(fā)明范圍內(nèi)的其他害蟲可通過本領域技術人員容易獲得的來源鑒定。本發(fā)明范圍內(nèi)的一般常用殺蟲劑(害蟲可對其有抗性或發(fā)展抗性)包括：殺藻劑、抗污劑、抗微生物劑、引誘劑、生物殺蟲劑、殺生物劑、消毒劑、殺真菌劑、熏蒸劑、殺昆蟲劑、殺螨劑、微生物殺蟲劑、殺軟體動物劑、殺線蟲劑、信息素、驅蟲劑和滅鼠劑。以下殺蟲劑可用于本發(fā)明的范圍：草甘膦、莠去津、威百畝、甲氧毒草安-S、乙草胺、二氯丙烯、2，4-D、甲基溴、氯化苦、二甲靈(Pendimenthalin)、乙烯利、百菌清、威百畝鉀、毒死蜱、氫氧化銅、硫酸銅、西瑪津、氟樂靈、敵稗、代森錳鋅、涕滅威(Aldicarb)、乙酰甲胺磷(Acephate)、敵草隆(Diuron)、MCPA、百草枯、二甲噻草胺、甲萘威、MCPP、MSMA、除蟲菊酯、馬拉息昂、麥草畏、壬酸、磺酰氟、綠草定、對二氯苯、萘、毒死蜱、二溴磷、百治磷、亞胺硫磷、甲拌磷、二嗪農(nóng)、樂果、甲基谷硫磷、和N，N-二乙基-間-甲苯酰胺(昆蟲排斥)。本領域技術人員將易于使用公開的數(shù)據(jù)庫信息來鑒定其他殺蟲劑，例如，萬維網(wǎng)iaspub.epa.gov/apex/pesticides/f？p＝chemicalsearch：1上可得的注射殺蟲劑EPA列表，并參考EPA所編輯并在萬維網(wǎng)www.epa.gov/opp00001/pestsales/上可得的的美國農(nóng)業(yè)、家庭和庭院、工業(yè)、商業(yè)和政府市場部門中最常用的常規(guī)殺蟲劑活性成分?；诒景l(fā)明，本領域技術人員將能容易地鑒定針對特定害蟲物種有毒性的殺蟲劑。因此，本發(fā)明的方面涉及一種改變生物體的真核種系細胞的方法，包括向該種系細胞導入編碼RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶以及一種或多種引導RNA，并且包含相應的啟動子序列和第一側接序列以及第二側接序列，并且包含敏化核酸(其表達在該生物體接觸化學物、化合物或條件時對該生物體有害)的第一外來核酸序列，其中一種或多種引導RNA與種系細胞的染色體對的第一染色體和第二染色體的基因組DNA上的一個或多個靶位置互補，其中編碼RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼一種或多種引導RNA的核酸序列在第一側接序列和第二側接序列之間，其中第一側接序列包含與基因組DNA的第一染色體和第二染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，其中第二側接序列包含與基因組DNA的第一染色體和第二染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，表達該第一外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶以及一種或多種RNA，其中RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶和相關的引導RNA共定位于基因組DNA的第二染色體和基因組DNA的第一染色體上的相關靶位置，并且該RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶以切割位點特異性的方式在靶位置處切割基因組DNA的第一染色體并且以切割位點特異性的方式在靶位置處切割基因組DNA的第二染色體，將第一外來核酸序列在切割位點處插入基因組DNA的染色體對的第一染色體中，并且將第一外來核酸序列在切割位點處插入基因組DNA的染色體對的第二染色體中，以使該種系細胞對外來核酸序列純合，并且表達敏化核酸賦予所得生物體對化學物、化合物或條件的敏感性，使得所得的生物體在接觸該化學物、化合物或條件時死亡或者無生育力。根據(jù)一個方面，敏化核酸的表達增加了化學物、化合物或條件對生物體的毒性。根據(jù)一個方面，種系細胞生長成生物體并且敏化核酸被傳至后代以產(chǎn)生包含敏化核酸的生物體種群，其中敏化核酸增加了化學物、化合物或條件對生物體的毒性。根據(jù)一個方面，生物體是雜草或害蟲。根據(jù)一個方面，敏化核酸是替換現(xiàn)有基因的敏化基因。根據(jù)一個方面，敏化基因是野生種群中現(xiàn)有突變基因的精確或密碼子改變的祖先形式，使得現(xiàn)有的突變形式被祖先形式替換。根據(jù)一個方面，現(xiàn)有基因獲得了產(chǎn)生對殺蟲劑、除草劑或殺真菌劑的抗性的突變。根據(jù)一個方面，化學物或化合物是殺蟲劑、除草劑或殺真菌劑。根據(jù)一個方面，殺蟲劑、除草劑或殺真菌劑是以下之一：由Cry1A.105、CryIAb、CryIF、Cry2Ab、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、mCry3A或VIP產(chǎn)生的Bt毒素，2，4-D或草甘膦。根據(jù)一個方面，敏化基因替換現(xiàn)有基因，生物體存活或繁殖需要該現(xiàn)有基因的功能。根據(jù)一個方面，化學物是前藥并且敏化基因編碼相應的前藥-轉化酶。根據(jù)一個方面，酶/化學物對是胞嘧啶脫氨酶/5-溴尿嘧啶或硝基還原酶/CB1954。根據(jù)本發(fā)明的某些方面，提供了控制雜草或害蟲種群，包括在雜草或害蟲種群的基因組中包含敏感基因驅動，其中該敏感基因驅動使該雜草或害蟲種群在化學物、化合物或條件存在時對毒性易感的方法，其包括使雜草或害蟲種群接觸對于殺死雜草或害蟲、降低雜草或害蟲的繁殖、或使雜草或害蟲無生育力以抑制繁殖而言有效量的化學物、化合物或條件。根據(jù)一個方面，化學物或化合物是除草劑、殺蟲劑或殺真菌劑。根據(jù)本發(fā)明的某些方面，提供了一種改變包含敏化基因驅動的生物體的真核種系細胞的方法，包括向該種系細胞導入編碼RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶以及一種或多種引導RNA，并且包含相應的啟動子序列和第一側接序列以及第二側接序列，并且包含第二敏化核酸序列(其表達在該生物體接觸化學物、化合物或條件時對該生物體有害)的第二外來核酸序列，其中一種或多種引導RNA與包含第一敏化基因驅動的種系細胞的染色體對的包含第一敏化基因驅動的第一染色體和第二染色體的基因組DNA上的一個或多個靶位置互補，其中編碼RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼一種或多種引導RNA的核酸序列在第一側接序列和第二側接序列之間，其中第一側接序列包含與基因組DNA的第一染色體和第二染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，其中第二側接序列包含與基因組DNA的第一染色體和第二染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，表達該第二外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶以及一種或多種RNA，其中RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶和相關的引導RNA共定位于基因組DNA的第二染色體和基因組DNA的第一染色體上的相關靶位置，并且該RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶以切割位點特異性的方式在靶位置處切割基因組DNA的第一染色體并且以切割位點特異性的方式在靶位置處切割基因組DNA的第二染色體，其中第一外來核酸序列被去除，將第二外來核酸序列在切割位點處插入基因組DNA的染色體對的第一染色體中，并且將第二外來核酸序列在切割位點處插入基因組DNA的染色體對的第二染色體中，以使該種系細胞對第二外來核酸序列純合，并且表達第二敏化核酸序列賦予所得生物體對化學物、化合物或條件的敏感性，使得所得的生物體在接觸該化學物、化合物或條件時死亡或者無生育力。根據(jù)一個方面，向野生種群中導入所得生物體，使得所得生物體與野生型生物體的后代包含第二敏化核酸序列。根據(jù)一個方面，生物體是雜草或害蟲。根據(jù)本發(fā)明的某些方面，提供了一種改變包含敏化基因驅動的生物體的真核種系細胞的方法，包括向該種系細胞導入編碼RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶以及一種或多種引導RNA，并且包含相應的啟動子序列和第一側接序列以及第二側接序列，并且包含第二敏化核酸序列(其表達在該生物體接觸化學物、化合物或條件時對該生物體有害)的第二外來核酸序列，其中一種或多種引導RNA與包含第一敏化基因驅動的種系細胞的染色體對的包含第一敏化基因驅動的第一染色體和第二染色體的基因組DNA上的一個或多個靶位置互補，其中編碼RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼一種或多種引導RNA的核酸序列在第一側接序列和第二側接序列之間，其中第一側接序列包含與基因組DNA的第一染色體和第二染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，其中第二側接序列包含與基因組DNA的第一染色體和第二染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，表達該第二外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶以及一種或多種RNA，其中RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶和相關的引導RNA共定位于基因組DNA的第二染色體和基因組DNA的第一染色體上的相關靶位置，并且該RNA引導的DNA結合蛋白核酸酶以切割位點特異性的方式在靶位置處切割基因組DNA的第一染色體并且以切割位點特異性的方式在靶位置處切割基因組DNA的第二染色體，將第二外來核酸序列在切割位點處插入基因組DNA的染色體對的第一染色體中，并且將第二外來核酸序列在切割位點處插入基因組DNA的染色體對的第二染色體中，以使該種系細胞對第二外來核酸序列純合，并且表達第二敏化核酸序列賦予所得生物體對化學物、化合物或條件的敏感性，使得所得的生物體在接觸該化學物、化合物或條件時死亡或者無生育力。根據(jù)某些方面，向野生種群中導入所得生物體，使得所得生物體與野生型生物體的后代包含第二敏化核酸序列。根據(jù)某些方面，生物體是雜草或害蟲。實施例1質粒和基因組盒從gBlocks(愛荷華州克拉威爾的集成DNA技術公司(IntegratedDNATechnologies)合成基因驅動盒，并如下通過Cas9-介導的基因組修飾插入SK1細胞。將各驅動的引導RNA克隆到含p416-Cas9的質粒中，通過SNR52啟動子驅動表達。參見DiCarlo，J.E.等，使用CRISPR-Cas系統(tǒng)在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中進行基因組工程改造(GenomeengineeringinSaccharomycescerevisiaeusingCRISPR-Cassystems)，NucleicAcidsRes.41，4336-4343(2013)。通過PCR向基因驅動盒的2個末端加入針對靶基因座的60個堿基對的同源臂并且用p416-Cas9-gRNA質粒共轉染5μg的PCR產(chǎn)物。通過測序驗證正確整合的基因驅動并且使用5-氟乳清酸(FOA)選擇來固化p416-Cas9-gRNA質粒。為了產(chǎn)生含URA3的ADE2基因驅動，將ADE2基因驅動克隆到pAG60中緊接白色念珠菌(Candidaalbicans)URA3。完整的URA3盒和基因驅動經(jīng)PCR擴增并使用Cas9-介導的基于泥足修飾插入單倍體SK1細胞的ADE2基因座。ABD1基因的重編碼C-末端和相應基因驅動按照gBlock合成以去除同源性并且通過同義變化在種子序列中生成突變。在TEF1終止子在重編碼ABD1基因的3’端在該基因和gRNA之間插入，使得ABD1與VHCl基因共用終止子。使用Cas9-介導的基因組修飾來將完整盒整合到單倍體SK1基因組中。p416-Cas9-gRNA質粒(賦予尿嘧啶原養(yǎng)型)是之前所述的p414-Cas9-gRNA質粒(賦予色氨酸原養(yǎng)型)的變體(參見DiCarlo，J.E.等，使用CRISPR-Cas系統(tǒng)在釀酒酵母中進行基因組工程改造(GenomeengineeringinSaccharomycescerevisiaeusingCRISPR-Cassystems).NucleicAcidsRes.41，4336-4343(2013))(Addgene#43802)。在各配對實驗中使用一個或另一個。將pRS413載體轉化到選擇細胞系中以賦予組氨酸原養(yǎng)型作為選擇二倍體細胞的標志物。菌株表型列于下表1。表1實施例2酵母配對實驗單倍體含驅動SK1酵母和相反配對型的單倍體野生型株在YPAD液體培養(yǎng)基中以等量混合，并孵育過夜。所得的二倍體在無菌水中洗滌并接種到針對2種親本表型的選擇性培養(yǎng)基中。下表2詳細顯示了具體雜交。表2實施例3孢子形成和四分體裂化在液體YPAD中配對和在選擇平板上選擇二倍體之后，將選擇平板刮擦到10mL選擇性培養(yǎng)基中并在30℃下過夜生長。然后接種到5mL的新鮮YPAD培養(yǎng)物中并且OD＝0.1并且在30℃下生長4-5小時。然后在10mL水中洗滌整個培養(yǎng)物2次，接種到2mL孢子形成培養(yǎng)基(1％乙酸鈉)中，并且在室溫下孵育3天或直到可看到孢子。形成孢子的細胞在50μL的裂解酶儲液(1M山梨醇中50μg/mL)中懸浮，并且在30℃下孵育5分鐘，轉移到冰上，用150μL冷H2O稀釋，使用蔡司四分體裂化顯微鏡進行微解剖，并分離的孢子在YPAD平板上生長。實施例4URA3功能選擇解剖的孢子在合成完全(SC)培養(yǎng)基上生長，然后在SC培養(yǎng)基以及不含尿嘧啶的SC培養(yǎng)基上點樣。為了增強紅色，所有用于平板圖像的SC固體培養(yǎng)基含0.5X硫酸腺嘌呤(終濃度0.08mM)。實施例5定量PCR涉及候選引物對來擴征針對各驅動有特異性的短區(qū)或被驅動替換的野生型序列，以及用作對照的ACT1基因。所有序列都包含在補充信息中。如Looke等，31所述使用方法A來提取基因組DNA。使用KAPASYBRFASTqPCR主混合物(2X)和25ng的基因組DNA一起進行qPCR反應。通過分別擴增來自野生型和驅動單倍體的基因組DNA的稀釋物來測量各引物對的擴增效率和相對特異性，并且選擇最佳實施和良好匹配的對來使用(參見下文所有使用的引物)。在從各親本單倍體以及從三個獨立交配事件中產(chǎn)生的二倍體分離的基因組DNA上進行定量PCR反應。在羅氏公司(Roche)的LightCycler96機上每個樣品進行三次反應(技術重復)。實施例6計算來自三個技術重復的結構針對計算取平均。為了直接計算PCR擴增之前等位基因比率，首先確定了不同引物對的效率。從對連續(xù)稀釋物(6個數(shù)量級)的qPCR輪次來計算效率：效率＝10-1/斜率R2值在除了一對(ade2：：URA3+sgRNA)以外的所有情況中都高于0.99。計算等位基因比率：xa.EaCt，a＝xb.EbCt，bxa/xb＝EbCt，b/EaCt，axa和xb是驅動和野生型DNA的初始濃度，Ea和Eb是相應引物對的效率，并且Ct，a和Ct，b是各樣品的Ct值。實施例7酵母中CRISPR/Cas9基因驅動的效率為了直接測量酵母中CRISPR/Cas9基因驅動的效率，使用在缺少ADE2基因的功能性拷貝的酵母中構成的紅色來開發(fā)系統(tǒng)。參見Chamberlain，N.，Cutts，N.S.和Rainbow，C.酵母形成染料和芳胺(Theformationofpigmentandarylaminebvyeasts).J.Gen.Microbiol.7，54-60(1952)。如圖13A所示，如果紅色ADE2-單倍體與米色野生型單倍體交配，所得的雜合二倍體遺傳了一個功能拷貝并且因此是米色的。當這些二倍體經(jīng)過減數(shù)分裂并通過形成孢子繁殖時，一半的所得單倍體遺傳了斷裂拷貝并因此是紅色的；另一半遺傳了完整拷貝并且是米色的(圖13A)。如圖13B所示，如果紅色單倍體編碼切割并替換從野生型親本中遺傳的完整ADE2基因座的功能性基因驅動，則它們的二倍體后代將是紅色的。因為這些紅色二倍體將具有2個ADE2的斷裂拷貝，它們所有形成孢子的單倍體后代將遺傳斷裂拷貝并且最終也將是紅色的。因此，可通過簡單地接種二倍體并計算紅色的比例來評價靶向并替換ADE2的基因驅動的切割效率。制備了靶向ADE2的基因驅動構建體。為了防止基因驅動意外逃逸到野外，Cas9和引導RNA分開以避免產(chǎn)生自身充分的遺傳偏移盒。因此，構建體編碼靶向ADE2的引導RNA，同時從附加體質粒中提供Cas9。在存在或不存在質粒的情況下，紅色單倍體與相反配對型的野生型酵母交配，并接種在針對二倍體選擇的培養(yǎng)基上。如圖13C所示，在質粒存在下，幾乎所有的集落都是紅色的，表明對從野生型親本遺傳的ADE2拷貝的切割是非常高效的。在沒有Cas9的情況中，沒有觀察到紅色二倍體集落，證明了該驅動僅可在提供其的實驗室酵母種群中擴散。為了衍生來自野生型親本的ADE2等位基因丟失，交配的二倍體形成孢子并且檢驗了它們所得的單倍體后代。如圖13D所示，在解剖18cas9+質粒后，觀察到紅色∶米色單倍體的完美4∶0比率，確認ADE2基因座的所有拷貝都被破壞。相反，18個米色cas9-二倍體產(chǎn)生2∶2的紅色∶米色比率，表明滅活的驅動和野生型等位基因的正常遺傳。為了證明紅色二倍體中ADE2破壞是否由通過同源重組的驅動元件的成功拷貝所致，對來自解剖的cas9+二倍體的72個單倍體進行測序。所有測序的集落含有完整的驅動而沒有其他突變，表明驅動移動是高效的并且以高保真率發(fā)生。ADE2基因驅動如圖14A所示進行修飾以含有順式URA3等位基因，其使得實驗室修飾的酵母株在沒有尿嘧啶補充的情況下生長。測試了該驅動元件在拷貝到靶基因座中時“攜帶”相關貨物元件的基因驅動穩(wěn)定性。含URA3驅動的二倍體與野生型二倍體在存在附加體Cas9質粒的情況下交配，二倍體經(jīng)選擇(其全部為紅色)并形成孢子，并且18個四分體裂化。如原始ADE2基因驅動的情況那樣，所有形成孢子的單倍體細胞形成紅色集落。如圖14B所示，當重復接種到尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基上時全都正常生長，表明該驅動高效拷貝URA3貨物元件。靶向并重編碼必要基因的基因驅動甚至在大種群中可避免驅動抗性，因為修飾靶位點的錯誤傾向修復事件將導致死亡?？深愃频鼐庉嫹潜匾匀恢匾幕?，因為由NHEJ事件產(chǎn)生的體變體將仍然比驅動本身適應度低。為了測試驅動插入期間的必要基因重編碼，構建了圖14C所示的靶向ABD1的第三基因驅動。參見Mao，X.，Schwer，B.和Shuman，S.釀酒酵母ABD1基因的突變分析：帽甲基轉移酶對細胞生長是必要的(MutationalanalysisoftheSaccharomycescerevisiaeABD1gene：capmethyltransferaseactivityisessentialforcellgrowth)，Mol.Cell.Biol.16，475-480(1996)。在靶向天然ABD1編碼序列的引導RNA上游的重編碼ABD1等位基因的單倍體株在Cas9存在下與野生型細胞交配。選擇二倍體，它們中的18個形成孢子。對72個隔離體進行測序。全部都含有重編碼ABD1基因座和引導RNA，從而證明基于必要基因重編碼的基因驅動。將基因驅動從實驗室株中拷貝到天然釀酒酵母株的不同群中。含ADE2驅動單倍體與6個系統(tǒng)發(fā)生和表型多樣性的單倍體釀酒酵母野生型株交配。參見Liti，G.等，家養(yǎng)和野生酵母的種群基因組(Populationgenomicsofdomesticandwildyeasts)，Nature458，337-341(2009)。也可參見圖15A。為了對各雜交的基因驅動拷貝的效率進行定量測量，使用針對驅動特異的一組引物和設計擴增野生型或NHEJ-破壞等位基因的另一組引物來進行定量PCR。如使用BoxPlot生成的圖15B所示(參見Spitzer，M.，Wildenhain，J.，Rappsilber，J.和Tyers，M.BoxPlotR：生成盒圖的網(wǎng)絡工具(awebtoolforgenerationofboxplots).Nat.Methods11，121-122(2014))，無論哪種野生型親本，含ADE2基因驅動的二倍體染色體的比例超過99％，證明在多樣性背景中使用驅動。添加URA3貨物基因沒有明顯改變這種效率。ABD1驅動以相等的速率拷貝。研究了驅動在后續(xù)拷貝事件中的穩(wěn)定性。如圖15B所示，第一輪ADE2基因驅動二倍體的幾個單倍體后代與含Cas9-表達質粒的野生型單倍體交配。所有第二代基因驅動構建體以相同的效率偏移遺傳，證明有性繁殖種群中在多代中的持續(xù)擴散能力。提供了以下基因組修飾引物和gBlock序列。當前第1頁1 2 3