本發(fā)明涉及棉纖維的化學(xué)反應(yīng)性的修飾。具體而言，本發(fā)明提供了包括帶正電的寡糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纖維。由于氨基基團，這些纖維具有修飾的反應(yīng)性，該修飾的反應(yīng)性可以用于將其他物質(zhì)附著至纖維以改變纖維的特征。此類物質(zhì)可以例如是反應(yīng)性染料或其他反應(yīng)物，例如阻燃劑、防水劑、防油劑和防污劑、抗皺劑、軟化劑、抗靜電劑、熒光增白劑等。

本發(fā)明提供了用于增加在棉花植物細(xì)胞例如纖維細(xì)胞中葡糖胺寡聚物的產(chǎn)生效率的方法和手段。

發(fā)明背景

棉纖維是世界范圍內(nèi)唯一最重要的紡織原料。全球每年收獲約八千萬英畝棉花。按英畝土地面積生產(chǎn)量而言，棉花是美國第五大作物，在2006年至2008年平均種植一千零三十萬英畝。世界范圍內(nèi)種植的棉花中大約90％是陸地棉(Gossypium hirsutum L.)，而海島棉(Gossypium barbadense)占大約8％。

然而，像其他包含天然纖維素的纖維一樣，棉纖維不具有合成性纖維的化學(xué)多功能性，這是由于纖維素中β-1-4連接的葡萄糖單體的相對惰性性質(zhì)。這種相對惰性性質(zhì)例如在棉纖維和織物的染色工藝期間是明顯的。

大體上兩種類型的染料用于為棉花著色：直接染料和纖維反應(yīng)性染料，兩者均是陰離子型分子。棉花本身在水中產(chǎn)生陰離子電荷，使得在沒有特殊處理的情況下，由纖維或織物來攝取染料是相當(dāng)費力的。直接染料與纖維素聚合物產(chǎn)生相對弱的氫鍵，形成半永久性附著。與纖維反應(yīng)性染料相比，直接染料更易于使用并且不太昂貴，但不耐受良好的洗滌。纖維反應(yīng)性染料是組合了生色團與反應(yīng)性基團的分子，該反應(yīng)性基團通過與羥基基團反應(yīng)與纖維形成強共價鍵。這些共價鍵為經(jīng)染色的纖維提供了良好的抗洗滌抗性。不褪色性可以使用陽離子固定劑來改進。

在使用反應(yīng)性染料的染色工藝期間，需要大量的電解質(zhì)來隔離陰離子染料與陰離子纖維電荷。未反應(yīng)的染料(高達40％)需要通過洗滌步驟來去除，產(chǎn)生大量的還包含上述電解質(zhì)的廢水。

例如通過摻入帶正電的化合物如帶正電的多糖來提供具有正電荷的纖維素纖維，可以因此改進天然纖維素纖維的可染性，并且改進經(jīng)修飾的纖維素纖維與帶負(fù)電的化合物的任何化學(xué)反應(yīng)。這還使得酸性染料的使用成為可能。

若干公開物已經(jīng)描述了向纖維素纖維中摻入或包覆殼聚糖寡聚物以制備殼聚糖/纖維素共混物、紗線或織物。殼聚糖是帶正電的葡糖胺聚合物，它可以通過幾丁質(zhì)的脫乙酰作用(例如通過堿處理)來獲得。幾丁質(zhì)本身是1-4連接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的聚合物?；跉ぞ厶窃谝种评缙つw真菌中的生理學(xué)功能，許多功能衣物、織物和纖維采用纖維素-殼聚糖共混纖維、纖維素纖維-殼聚糖綴合物以及用含殼聚糖樹脂包覆的織物。

美國專利申請US 2003/0134120描述了用殼聚糖來包覆天然纖維。

劉(Liu)等人(碳水化合物聚合物(Carbohydrate Polymers)44(2003)233-238)描述了一種用于用殼聚糖包覆棉纖維的方法，其是通過在60℃于水中用高碘酸鉀氧化棉線并且隨后用殼聚糖于水性乙酸中的溶液進行處理。通過用殼聚糖包覆，棉纖維表面變得在生理學(xué)和生物學(xué)上有活性。由于氨基基團比纖維素單體的羥基基團的化學(xué)反應(yīng)性大，纖維具有更大的進行進一步化學(xué)修飾的潛力。此外，棉纖維的光滑表面變得粗糙，表明用于藥物吸收和其控制釋放的更大的潛力。

WO 2006/136351提供了用于通過將帶正電的寡糖或多糖包含到細(xì)胞壁中來修飾植物細(xì)胞壁(特別是可見于產(chǎn)纖維植物的天然纖維中的細(xì)胞壁)的反應(yīng)性的方法和手段。這可以便利地通過表達嵌合基因來實現(xiàn)，該嵌合基因編碼N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，具體地為能夠靶向于植物細(xì)胞中高爾基體膜的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。這些應(yīng)用之一是增加的可染性。

WO 2011/089021提供了用于修飾植物次生細(xì)胞壁(特別是在發(fā)現(xiàn)于棉纖維中的棉花細(xì)胞壁中的)的反應(yīng)性的方法和手段。這可以便利地通過在棉花植物中表達對同絲水霉(Saprolegnia monoica)幾丁質(zhì)合酶進行編碼的嵌合基因來實現(xiàn)。

WO 2012/048807提供了用以在植物細(xì)胞壁中產(chǎn)生帶正電的寡糖的可替代方法和手段，其是通過向所述植物細(xì)胞中引入與異源高爾基體信號錨定序列融合的結(jié)瘤C(NOD C)蛋白。

多糖幾丁質(zhì)是從N-乙酰葡糖胺殘基構(gòu)建的。它合成自UDP-N-乙酰葡糖胺，UDP-N-乙酰葡糖胺是在植物中也有活性的己糖胺生物合成途徑的終產(chǎn)物(邁爾(Mayer)等人1968，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)43，1097-1107)。這個途徑的第一個且限速的步驟是谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為葡糖胺-6-磷酸，該轉(zhuǎn)化是由谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)催化的。

WO 2007/039314描述了具有透明質(zhì)酸合酶活性并且另外具有增加的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)活性的轉(zhuǎn)基因植物。與僅具有透明質(zhì)酸合酶活性的植物相比，這些植物合成增加量的透明質(zhì)酸。像幾丁質(zhì)一樣，透明質(zhì)酸合成自UDP-N-乙酰葡糖胺。

WO 2011/089021披露了包括在棉花選擇性啟動子的控制之下的嵌合幾丁質(zhì)合酶基因和嵌合谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)基因棉花植物。來自這些轉(zhuǎn)基因棉花植物的纖維具有遍及細(xì)胞壁均勻分布的增加量的N-乙酰葡糖胺聚合物。

然而對于改進的用以產(chǎn)生包括增加水平的帶正電的多糖(例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺)的棉纖維的方法和手段仍存在需要。這些和其他問題如在下文概述、詳細(xì)實施例、實例、附圖和權(quán)利要求書中所描述的來解決。

發(fā)明概述

本發(fā)明示出包括以下項的嵌合基因在植物細(xì)胞例如棉花植物細(xì)胞中的表達

(a)根據(jù)SEQ ID 1的核苷酸序列，或

(b)其變體，該變體與SEQ ID 1的不同之處在于一個或多個核苷酸，其條件是總計它與SEQ ID 1的不同之處在于不超過20個核苷酸，(其編碼根據(jù)SEQ ID 2的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)多肽)出乎意料地導(dǎo)致細(xì)胞的葡糖胺含量增加。

在第二實施例中，本發(fā)明提供了嵌合基因，該嵌合基因包括以下可操作地連接的DNA區(qū)域：

(a)植物表達型啟動子，例如纖維優(yōu)先型啟動子，

(b)編碼GFAT多肽的DNA區(qū)域，其中所述GFAT是由根據(jù)SEQ ID 1的核苷酸序列或其所述變體編碼，以及

(c)任選地在轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化中涉及的DNA區(qū)域。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供了棉花植物細(xì)胞，該棉花植物細(xì)胞包括嵌合基因，該嵌合基因包括以下可操作地連接的DNA區(qū)域：

(a)植物表達型啟動子，例如纖維優(yōu)先型啟動子，

(b)編碼GFAT多肽的DNA區(qū)域，其中所述GFAT是由根據(jù)SEQ ID 1的核苷酸序列或其所述變體編碼，以及

(c)任選地在轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化中涉及的DNA區(qū)域。

在一些實施例中，本發(fā)明提供了植物細(xì)胞，該植物細(xì)胞除了所述第一嵌合基因之外還包括第二嵌合基因，該第二嵌合基因包括以下可操作地連接的DNA區(qū)域：

(a)植物表達型啟動子，例如纖維優(yōu)先型啟動子，

(b)編碼幾丁質(zhì)合酶多肽的DNA序列，以及

(c)任選地在轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化中涉及的DNA區(qū)域。

在又另一個實施例中，本發(fā)明提供了由如在此描述的植物細(xì)胞組成的棉花植物。

本發(fā)明還提供了可以獲得自如在此描述的植物的纖維，例如棉纖維。另外，提供了由這些纖維制成的紗線或織物。

在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種產(chǎn)生具有帶正電的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纖維的方法，該方法包括以下步驟

i)在棉花植物細(xì)胞中表達嵌合基因，該嵌合基因包括根據(jù)本發(fā)明的GFAT編碼核苷酸序列，

ii)從步驟i)的棉花植物細(xì)胞再生棉花植物，并且

iii)任選地從所述棉花植物分離纖維。

在本發(fā)明的又另一個實施例中，所述的產(chǎn)生具有帶正電的多糖的棉纖維的方法包括以下步驟

i)表達第一嵌合基因和第二嵌合基因，該第一嵌合基因包括如在此前描述的GFAT編碼核苷酸序列，該第二嵌合基因包括編碼幾丁質(zhì)合酶的核苷酸序列，

ii)從步驟i)的棉花植物細(xì)胞再生棉花植物，并且

iii)任選地從所述棉花植物分離纖維。

本發(fā)明進一步涉及如在此描述的核酸分子用以產(chǎn)生在纖維中具有帶正電的多糖的棉花植物的用途。

本發(fā)明還涉及如在此描述的核酸分子用以增加棉纖維中帶正電的多糖的量的用途。

附圖說明

圖1：合成的核酸分子的核苷酸序列(SEQ ID 1)，其編碼大腸桿菌的根據(jù)SEQ ID 2的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)。

圖2：大腸桿菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(SEQ ID 2)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明是基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)：在植物細(xì)胞中，具體地在棉花植物的棉花植物細(xì)胞中，對谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)進行編碼的根據(jù)SEQ ID 1的核苷酸序列的表達導(dǎo)致在植物細(xì)胞或此類植物的纖維(例如棉纖維)中，相比于在不包括GFAT蛋白的植物細(xì)胞或纖維中或者相比于在表達本領(lǐng)域已知的、并未針對在棉花植物細(xì)胞中的表達進行優(yōu)化的GFAT編碼基因的植物細(xì)胞中，產(chǎn)生增加量的帶正電的多糖，例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺。

這個出乎意料的發(fā)現(xiàn)還可以通過在植物細(xì)胞中，具體地在棉花植物細(xì)胞中表達SEQ ID 1的變體來實現(xiàn)，該變體編碼根據(jù)SEQ ID 2的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶，其中所述變體與SEQ ID 1的不同之處在于一個或多個核苷酸，其條件是總計它與SEQ ID 1的不同之處在于不超過20個核苷酸。

因此，在第一實施例中，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，該分離的核酸分子包括

i)根據(jù)SEQ ID 1的核苷酸序列，

ii)或其變體，其中一個或多個核苷酸不同于SEQ ID 1的核苷酸序列，其條件是所述變體與SEQ ID 1的不同之處在于不超過20個核苷酸，其編碼根據(jù)SEQ ID 2的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)

iii)或i)或ii)的互補序列。

SEQ ID 1編碼來自大腸桿菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶。該蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸序列描述于SEQ ID 2中。這種酶催化果糖-6-磷酸和谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為葡糖胺-6-磷酸和作為副產(chǎn)物的谷氨酸鹽。這已經(jīng)描述于WO2007/039314中用于在植物中產(chǎn)生透明質(zhì)酸。在己糖胺途徑期間，葡糖胺-6-磷酸被進一步轉(zhuǎn)化為UDP-N-乙酰葡糖胺，UDP-N-乙酰葡糖胺進而充當(dāng)用于合成糖胺聚糖(例如透明質(zhì)酸或幾丁質(zhì))的起始材料，如果適當(dāng)?shù)拿复嬖诘脑挕?/p>

WO 2007/039314披露了GFAT核苷酸序列，該核苷酸序列是衍生自編碼GFAT的大腸桿菌基因但針對在植物細(xì)胞中密碼子的使用進行了適配。在本申請中披露為SEQ ID 1的核苷酸序列與在WO 2007/039314中描述的核苷酸序列有約25％的不同。當(dāng)在WO 2007/039314中披露的序列被總體上針對在植物細(xì)胞中的表達進行優(yōu)化時，包括根據(jù)SEQ ID 1的核苷酸序列的嵌合基因的表達導(dǎo)致在棉花細(xì)胞中特別好的結(jié)果。包括根據(jù)SEQ ID 1的植物表達型核苷酸序列或其變體(該變體編碼根據(jù)SEQ ID 2的來自大腸桿菌的GFAT蛋白，并且與SEQ ID 1的不同之處在于一個或多個核苷酸，其條件是總計它與SEQ ID 1的不同之處在于不超過20個核苷酸)的棉花細(xì)胞，或者由此類棉花植物細(xì)胞構(gòu)成的棉花植物，與表達如在WO 2007/039314中披露的核苷酸序列的棉花細(xì)胞或由此類棉花細(xì)胞構(gòu)成的植物相比，產(chǎn)生增加量的葡糖胺(參見實驗數(shù)據(jù))。

如在此使用的，“與SEQ ID 1具有不超過20個核苷酸的差異”意指例如與SEQ ID 1具有20nt、19nt、18nt、17nt、16nt、15nt、14nt、13nt、12nt、11nt、10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3nt、2nt或1nt的差異，同時仍編碼根據(jù)SEQ ID 2的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)。

核酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。核酸可以化學(xué)合成或通過體外或甚至體內(nèi)的生物表達而產(chǎn)生。可以使用適當(dāng)受保護的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀來用化學(xué)方法合成核酸。與本披露的嵌合基因相關(guān)，DNA包括cDNA和基因組DNA。

在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了嵌合基因，該嵌合基因包括為可操作地連接的DNA區(qū)域

(a)植物表達型啟動子，例如纖維優(yōu)先型啟動子，

(b)編碼GFAT多肽的DNA區(qū)域，其中所述GFAT是由如在此上文所述的核苷酸序列編碼，以及

(c)任選地在轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化中涉及的DNA區(qū)域。

如在此使用的，術(shù)語“植物表達型啟動子”意為能夠控制(啟動)植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的DNA序列。這包括植物來源的任何啟動子，但還有任何非植物來源的能夠在植物細(xì)胞中引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動子，即病毒或細(xì)菌來源的某些啟動子，例如CaMV35S、地三葉草病毒啟動子4號或7號(WO 9606932)或T-DNA基因啟動子等。

在本發(fā)明的一個實施例中，該啟動子可以是并非天然地與它可操作地連接的DNA區(qū)域相關(guān)聯(lián)的異源啟動子。

應(yīng)清楚的是組成型的植物表達型啟動子可以適于本發(fā)明。組成型啟動子的實例包括來自肌動蛋白基因的啟動子(麥克爾羅伊(McElroy)等人(1990)植物細(xì)胞(Plant Cell)2:163-171)，CaMV35S啟動子(奧德爾(Odell)等人(1985)自然(Nature)313:810-812)，CaMV19S啟動子(尼爾森(Nilsson)等人(1997)生理學(xué)植物(Physiol.Plant.)100:456-462)，GOS2啟動子(德佩特(de Pater)等人(1992)植物雜志(Plant.J.)2(6):837-44)，來自泛素基因的啟動子(克里斯坦森(Christensen)等人(1992)植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)18:675-689)，來自水稻親環(huán)蛋白基因的啟動子(巴克霍爾茲(Buchholz)等人(1994)植物分子生物學(xué)(Plant.Mol.Biol.)25(5):837-43)，來自玉米H3組蛋白基因的啟動子(勒珀蒂(Lepetit)等人(1992)分子基因與遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)231:276-285)或來自肌動蛋白2基因的啟動子(安(An)等人(1996)植物雜志(Plant J.)10(1):107-121)。

還應(yīng)清楚的是可以根據(jù)本發(fā)明使用誘導(dǎo)型啟動子，例如溫度誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子或者響應(yīng)于發(fā)育線索的啟動子。還可以使用組織選擇性啟動子。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，嵌合基因包括纖維優(yōu)先型或纖維選擇性啟動子。相對于基因表達而言或相對于啟動子而言，術(shù)語“纖維優(yōu)先型”或“纖維選擇性”是指出于實踐目的，在植物例如棉花植物的纖維細(xì)胞中基因的高度特異性表達或由啟動子引導(dǎo)的表達。換言之，在不同于纖維細(xì)胞的組織中DNA的轉(zhuǎn)錄水平低于檢測限或者非常低(小于約0,2皮克/微克總RNA)。

相對于根據(jù)本發(fā)明的DNA的表達而言，術(shù)語“纖維優(yōu)先型”或“纖維細(xì)胞優(yōu)先型”是指這樣的表達模式，DNA借此表達模式占優(yōu)勢地表達于纖維細(xì)胞或纖維中，但表達可以在植物的其他組織中鑒定到。優(yōu)選地，在纖維細(xì)胞中的表達比在其他組織中高約2至約10倍。

此類啟動子(全部通過引用結(jié)合在此)包括來自棉花中的纖維特異性ch prom的啟動子(如在WO 0210377中所述)，來自棉花中的纖維特異性肌動蛋白基因的啟動子(如在WO 0210413中所述)，來自棉花中的纖維特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因的啟動子(如在US 5792933中所述)，來自棉花中的擴張蛋白基因的啟動子(WO 9830698)，或者來自棉花中的幾丁質(zhì)酶基因的啟動子(US 2003106097)，或者描述于US 6259003或US 6166294中的纖維特異性基因的啟動子，或者如披露于US 6096950中的衍生自E6家族的啟動子。如描述于WO 08/083969(來自棉花葡聚糖酶基因)、WO 12/093032(來自棉花FS18或SCW-PRP基因)或US 2013/0081154(來自棉花FB8樣基因)中的纖維選擇性啟動子也是適合的植物表達型啟動子。還適用于本發(fā)明的是披露于EP 13172094中的啟動子，該啟動子包括如在其中描述的SEQ ID No.5的從核苷酸位置4208到核苷酸位置5615的核苷酸序列，或者具有SEQ ID No.5的從核苷酸位置75至1482的核苷酸序列。

如在此描述的嵌合基因任選地包括在轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化中涉及的DNA區(qū)域。在植物中有功能的在轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化中涉及的多種DNA區(qū)域是本領(lǐng)域中已知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉可以適合于進行在此描述的方法的終止子和多腺苷酸化序列。多腺苷酸化區(qū)域可以衍生自天然基因、多種其他植物基因、T-DNA基因或甚至植物病毒基因組。待添加的3’端序列可以衍生自例如胭脂氨酸合酶或章魚堿合酶基因，或可替代地衍生自其他植物基因，或衍生自任何其他真核生物基因。

在本發(fā)明的具體實施例中，提供了包括嵌合基因的棉花植物細(xì)胞，該嵌合基因包括為可操作地連接的DNA區(qū)域

(a)植物表達型啟動子，例如纖維優(yōu)先型啟動子，

(b)編碼GFAT多肽的DNA區(qū)域，其中所述GFAT是由如在此所述的核苷酸序列編碼，以及

(c)任選地在轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化中涉及的DNA區(qū)域。

可以通過本領(lǐng)域中熟知的方法將該嵌合基因引入植物細(xì)胞中。與本申請有關(guān)的“引入”涉及通過人工手段將遺傳信息置于植物細(xì)胞或植物中。這可以通過本領(lǐng)域已知的用于將RNA或DNA引入植物細(xì)胞、組織、原生質(zhì)體或完整植物中的任何方法來實現(xiàn)。

術(shù)語“引入”可以指代通過轉(zhuǎn)化將外源DNA分子引入到植物細(xì)胞中，任選地隨后從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物。該術(shù)語還可以指代通過以下方式引入重組DNA分子：使包括重組DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物和另一植物進行雜交，并且選擇已經(jīng)遺傳了重組DNA分子或轉(zhuǎn)基因的后代植物。提供的又另一種可替代的意義指代通過例如原生質(zhì)體融合的技術(shù)引入重組DNA分子，任選地隨后從經(jīng)融合的原生質(zhì)體再生植物。

應(yīng)清楚的是使用的轉(zhuǎn)化方法與本發(fā)明具有較小相關(guān)性?，F(xiàn)在植物的轉(zhuǎn)化是常規(guī)技術(shù)。有利地，若干轉(zhuǎn)化方法中的任一種都可以用于將感興趣的核酸/基因引入適合的祖先細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體，電穿孔，增加游離DNA攝取的化學(xué)品，直接將DNA注射到植物中，粒子槍轟擊，使用病毒或花粉進行轉(zhuǎn)化，以及顯微噴射。方法可以選自針對原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇法(克倫(Krens)等人(1982)自然(Nature)296:72-74；內(nèi)格羅蒂(Negrutiu)等人(1987)植物分子生物學(xué)(Plant.Mol.Biol.)8:363-373)；原生質(zhì)體的電穿孔(希利托(Shillito)等人(1985)生物/技術(shù)(Bio/Technol.)3:1099-1102)；顯微注射進植物材料中(克洛斯威(Crossway)等人(1986)分子基因與遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)202:179-185)；DNA或RNA包覆的粒子轟擊(克萊因(Klein)等人(1987)自然(Nature)327:70)，用(非整合性)病毒感染等。

用于轉(zhuǎn)化棉花植物的方法也是本領(lǐng)域中熟知的。例如在美國專利5.004.863或美國專利6.483.013中已經(jīng)描述了棉花的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，并且通過粒子轟擊的棉花轉(zhuǎn)化報道于例如WO 92/15675中。其他適合的棉花轉(zhuǎn)化方法披露于例如WO 00071733和US 5.159.135中，這些披露通過引用如同完全闡述的結(jié)合在此。

根據(jù)本發(fā)明的重組DNA分子可以按穩(wěn)定方式或以瞬時方式使用本領(lǐng)域中熟知的方法引入植物中。嵌合基因可以引入植物中，或可以在植物細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生，如例如在EP 1339859中所述的。

在又另一個實施例中，本發(fā)明提供了如在此上文描述的棉花植物細(xì)胞，其中所述棉花植物細(xì)胞另外地包括第二嵌合基因，該第二嵌合基因包括以下可操作地連接的DNA區(qū)域：

(a)植物表達型啟動子，例如纖維優(yōu)先型啟動子，

(b)編碼幾丁質(zhì)合酶多肽的DNA序列，以及

(c)任選地在轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化中涉及的DNA區(qū)域。

關(guān)于由術(shù)語“植物表達型啟動子”意指的若干實施例和說明在上文給出，并且同樣適用于包括編碼幾丁質(zhì)合酶的DNA區(qū)域的第二嵌合基因。對于上文給出的關(guān)于在轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化中涉及的DNA區(qū)域的說明以及還有用以提供具有嵌合基因的植物細(xì)胞的方法和手段同樣如此。

可以將第一嵌合基因和第二嵌合基因單獨地以任何順序或同時引入植物細(xì)胞中。可以將它們引入在相同的載體或分開的載體上。

幾丁質(zhì)合酶可以是具有幾丁質(zhì)合酶(EC 2.4.1.16)的酶活性(即將UDP-N-乙?；?D-葡糖胺轉(zhuǎn)化為幾丁質(zhì)和UDP)的任何蛋白。幾丁質(zhì)合酶催化反應(yīng)：UDP-N-乙?；?α-D-葡糖胺+(1,4-(N-乙?；?β-D-葡糖胺基))(n)<＝>UDP+(1,4-(N-乙?；?β-D-葡糖胺基))(n+1)。適用于本發(fā)明的是衍生自任何生物的任何幾丁質(zhì)合酶。適合的幾丁質(zhì)合酶的實例是例如來自同絲水霉的幾丁質(zhì)合酶(WO 2011/089021)，或者如描述于WO 2006/136351中或WO2012/048807中的NOD C類型的幾丁質(zhì)合酶。

在本發(fā)明的具體實施例中，如前所述的在所述棉花植物細(xì)胞中的幾丁質(zhì)合酶是NOD C類型的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。如果所述幾丁質(zhì)合酶多肽包括高爾基體定位信號，則實現(xiàn)特別好的結(jié)果。

雖然已經(jīng)用包括除了GFAT活性之外的幾丁質(zhì)合酶活性的植物細(xì)胞實現(xiàn)了好的結(jié)果，如通過在本發(fā)明中描述的手段獲得的GFAT活性還可以有益地與導(dǎo)致從GFAT產(chǎn)物葡糖胺-6-磷酸或從UDP-N-乙酰葡糖胺產(chǎn)生糖胺聚糖的任何酶活性組合。如在引言中所描述的，在植物中葡糖胺-6-磷酸被進一步經(jīng)由己糖胺途徑轉(zhuǎn)化為UDP-N-乙酰葡糖胺。一種這樣的將UDP-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)化為不同于幾丁質(zhì)的糖胺聚糖的酶活性是透明質(zhì)酸合酶的酶活性。因此還可以使用透明質(zhì)酸合酶來代替幾丁質(zhì)合酶。

在另一個具體實施例中，本發(fā)明提供了一種基本上由包括在此前述的嵌合基因的植物細(xì)胞組成的植物。該嵌合基因可以是包含GFAT編碼區(qū)的第一嵌合基因，或如前所述的第一和第二嵌合基因。在具體實施例中，該植物是棉花植物。

如在此使用的“棉花”或“棉花植物”可以是有用于培育棉花的任何品種。最常用的棉花品種是海島棉、陸地棉(G.hirsutum)、亞洲棉(G.arboreum)和草棉(G.herbaceum)。另外的品種包括阿非利加棉(G.africanum)和雷蒙德氏棉(G.raimondii)。還包括的是來自前述任一物種與其他物種雜交或這類物種之間雜交的后代。

棉花植物細(xì)胞可以是基本上包含對定義棉花植物必要的遺傳信息的任何細(xì)胞，其中除在此披露的嵌合基因之外，該細(xì)胞可以由一個或多個其他轉(zhuǎn)基因補充。細(xì)胞可以衍生自形成棉花植物的不同器官和/或組織，包括但不限于果實、種子、胚、繁殖組織、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、花、維管組織、配子體、孢子體、花粉和小孢子。

盡管根據(jù)本發(fā)明的某些植物細(xì)胞可以能夠再生成完整植物，但在一些實施例中，所述植物細(xì)胞不能進一步發(fā)育或再生成完整植物。在本發(fā)明的一個實施例中，纖維細(xì)胞就是這樣。成熟纖維細(xì)胞是死細(xì)胞。

本發(fā)明還針對包括根據(jù)本發(fā)明的一種或多種重組構(gòu)建體的產(chǎn)纖維植物。雖然編碼GFAT蛋白的核苷酸序列已經(jīng)針對在棉花植物中的表達進行了優(yōu)化，但認(rèn)為編碼區(qū)也可以有益地用于其他產(chǎn)纖維植物中，例如大麻、黃麻、亞麻和木本植物，包括但不限于松屬物種(Pinus spp.)、楊屬物種(Populus spp.)、云杉屬物種(Picea spp.)、桉屬物種(Eucalyptus spp.)等。該植物細(xì)胞可以衍生自任何產(chǎn)毛狀體植物。

根據(jù)本發(fā)明的植物可以用于常規(guī)的育種方案中，以產(chǎn)生更多的具有相同特征的植物，或者以在相同或相關(guān)植物物種的其他品種中或在雜交植物中引入根據(jù)本發(fā)明的嵌合基因。從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物獲得的種子包含作為穩(wěn)定基因組插入物的本發(fā)明的嵌合基因，并且也被本發(fā)明所涵蓋。

如在此使用的術(shù)語“植物”涵蓋完整植物、植物的祖先和后代以及植物部分，這些植物部分包括種子、芽、莖、葉、根(包括塊莖)、花、纖維和組織和器官，其中上述每一者都包括感興趣的基因/核酸。術(shù)語“植物”還涵蓋植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉以及小孢子，再者其中前述每一者都包括感興趣基因/核酸。

在具體實施例中，本發(fā)明提供了可獲得自根據(jù)本發(fā)明的棉花植物的棉纖維。

根據(jù)本發(fā)明的棉纖維可以與天然存在的棉纖維(即從并不包括根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的等基因系獲得的棉纖維)通過增加含量的帶正電的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺來相區(qū)分?？梢灾苯訖z測GlcNAc聚合物或寡聚葡糖胺?？商娲?，在棉纖維中帶正電的多糖可以通過在用三氟乙酸(TFA)處理以水解多糖之后測量葡糖胺含量來檢測。根據(jù)本發(fā)明的棉纖維還可以通過其增加的氮含量來區(qū)分。由于在葡糖胺聚合物內(nèi)的含氮基團的反應(yīng)性，根據(jù)本發(fā)明的棉纖維表征為，與從并不包括如在此所述的編碼GFAT多肽的核酸區(qū)域的棉花植物獲得的纖維相比，具有改變的化學(xué)反應(yīng)性。根據(jù)本發(fā)明的纖維具有提高的經(jīng)由含氮基團而與染料或其他適合的化學(xué)品反應(yīng)的能力。

根據(jù)本發(fā)明的棉纖維表征為增加含量的帶正電的多糖，例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺?！霸黾拥暮俊币庵复嬖谟谥参锛?xì)胞或纖維中的帶正電的多糖的量比在并不包括GFAT蛋白的植物細(xì)胞或纖維中的量要高，或者與表達本領(lǐng)域中已知的、并未針對在棉花植物細(xì)胞中的表達進行優(yōu)化的GFAT編碼基因的植物細(xì)胞或纖維相比而言要高。在一個實施例中，葡糖胺(GlcN)的含量是來自不表達人工引入的基因構(gòu)建體的植物的細(xì)胞或纖維的葡糖胺含量的至少兩倍。觀察到這種背景水平是總纖維重量的大約0,010％至0,015％GlcN。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的纖維包含總纖維重量的超過0,03％GlcN。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的纖維的GlcN含量是總纖維重量的超過0,06％，甚至更優(yōu)選超過0,08％，最優(yōu)選超過0,10％GlcN。在另一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的植物細(xì)胞或棉纖維的GlcN含量是來自不表達人工引入的基因構(gòu)建體的植物的細(xì)胞或纖維的GlcN含量的至少四倍。在本發(fā)明的特別適合的實施例中，植物細(xì)胞或纖維具有的GlcN含量是來自不表達人工引入的基因構(gòu)建體的植物的細(xì)胞或纖維的GlcN含量的至少五倍，優(yōu)選至少七倍，并且最優(yōu)選十倍。

“纖維”被植物學(xué)地定義為長的窄的尖端細(xì)的細(xì)胞，其在成熟時是無活力的且中空的、具有大部分由纖維素和通常的木質(zhì)素組成的硬的厚的細(xì)胞壁。在雙子葉莖(亞麻、黃麻、大麻、苧麻)的韌皮部(內(nèi)部樹皮)中發(fā)現(xiàn)軟纖維或韌皮纖維。在單子葉植物(劍麻、馬尼拉麻、菠蘿)的葉維管束中發(fā)現(xiàn)硬纖維或葉纖維。表面纖維由種子(棉花)、葉或果實(椰子纖維)的表面長成。

如在此使用的“棉纖維”是指種子毛狀體，更確切地為在開花期或正好在開花期之前從胚珠的外珠被的表皮開始的產(chǎn)纖維植物(例如棉花)的單個細(xì)胞。棉纖維的形態(tài)發(fā)育已經(jīng)被文獻良好地記錄(巴士拉(Basra)和馬利克(Malik)，1984，國際細(xì)胞學(xué)評論(Int Rev of Cytology)89:65-113；格雷夫斯(Graves)和斯圖爾特(Stewart)，1988，實驗植物學(xué)雜志(J.Exp.Bot.)39(1):59-69；拉姆齊(Ramsey)和柏林(Berlin)，1976，美國植物學(xué)雜志(American Journal of Botany)63(6):868-876；魯安(Ruan)和舒瑞(Chourey)，1998，植物生理學(xué)(Plant Physiology)118:399–406；魯安(Ruan)等人2000，澳大利亞植物生理學(xué)雜志(Aust.J.Plant Physiol.)27:795–800；斯圖爾特(Stewart)，1975，美國植物學(xué)雜志(Am.J.Bot.)62，723-730)。

因此本發(fā)明的另一個實施例是植物細(xì)胞壁，例如來自棉花細(xì)胞的細(xì)胞壁，這些細(xì)胞壁與來自未經(jīng)修飾的植物細(xì)胞或來自不表達如在此所述的GFAT編碼核苷酸序列的植物細(xì)胞的細(xì)胞壁相比，包括增加水平的帶正電的多糖，例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺。

本發(fā)明還涉及由根據(jù)本發(fā)明的纖維制成的紗線以及由這些紗線制成的織物。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生具有帶正電的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纖維的方法，該方法包括以下步驟

i)在棉花植物細(xì)胞中表達嵌合基因，該嵌合基因包括如上所述的GFAT編碼區(qū)，

ii)從步驟i)的棉花植物細(xì)胞再生棉花植物，并且

iii)任選地從所述棉花植物分離纖維。

在具體實施例中，提供了一種產(chǎn)生具有帶正電的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纖維的方法，該方法包括i)在棉花植物細(xì)胞中表達第一嵌合基因和第二嵌合基因，該第一嵌合基因包括根據(jù)本發(fā)明的GFAT編碼區(qū)，該第二嵌合基因包括幾丁質(zhì)合酶編碼區(qū)，ii)從所述棉花植物細(xì)胞再生棉花植物，并且iii)任選地從所述棉花植物分離纖維?？梢匀缟纤龅貙⑺龅谝缓偷诙逗匣蛲瑫r或分開地以任何順序引入植物細(xì)胞中。

在另一個實施例中，提供了一種產(chǎn)生具有增加含量的帶正電的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纖維的方法，該方法包括以下步驟：i)在棉花植物細(xì)胞中表達所述第一嵌合基因或表達所述第一和第二嵌合基因，ii)從所述棉花植物再生棉花植物，并且iii)任選地從所述棉花植物分離纖維。術(shù)語“增加的含量”應(yīng)按如上所述的來理解。

另外，提供了一種用于產(chǎn)生纖維具有改變的化學(xué)反應(yīng)性的棉纖維的方法，該方法包括以下步驟：i)在棉花植物細(xì)胞中表達包括根據(jù)本發(fā)明的GFAT編碼區(qū)的嵌合基因，ii)從所述棉花植物細(xì)胞再生棉花植物，并且iii)任選地從所述棉花植物分離纖維。

在又另一個實施例中，提供了一種用于產(chǎn)生纖維具有改變的化學(xué)反應(yīng)性的棉纖維的方法，該方法包括以下步驟：i)在棉花植物中表達第一嵌合基因和第二嵌合基因，該第一嵌合基因包括如上所述的GFAT編碼區(qū)，該第二嵌合基因包括幾丁質(zhì)合酶編碼區(qū)，ii)從所述棉花植物細(xì)胞再生棉花植物，并且iii)任選地從所述棉花植物分離纖維。

根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以用于產(chǎn)生在纖維中具有帶正電的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉花植物。具體而言，它可以用于增加纖維中帶正電的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的量。它還可以用于產(chǎn)生具有改變的化學(xué)反應(yīng)性的棉纖維。這可能允許對纖維進行便利的、容易的和/或有效的進一步整理。獲得自根據(jù)本發(fā)明的棉花植物的纖維可以例如用反應(yīng)性染料染色，這些反應(yīng)性染料經(jīng)由與多糖中葡糖胺殘基的氨基基團的共價鍵結(jié)合至纖維。可替代地，其他物質(zhì)可以經(jīng)由化學(xué)反應(yīng)附著至葡糖胺殘基的氨基基團。物質(zhì)也可以經(jīng)由與多糖的含N基團的靜電鍵合或離子鍵合而附著至根據(jù)本發(fā)明的纖維。其他物質(zhì)與棉纖維的附著可以有益于將特殊特性轉(zhuǎn)移到纖維上。此類整理可以是但不限于染色、附著阻燃劑、防水劑、防油劑和防污劑、抗皺劑、軟化劑、抗靜電劑、熒光增白劑或任何其他紡織品整理劑。

如在此使用的，“包括”應(yīng)解釋為指定所陳述的特征、整體、步驟或部件的存在，但不排除存在或增加一個或多個特征、整體、步驟、部件或其組。因此，例如包括核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白可以包括比引用的序列更多的核苷酸或氨基酸，即可以被包含在更大的核酸或蛋白中。包括功能上或結(jié)構(gòu)上定義的DNA區(qū)域的嵌合基因可以包括另外的DNA區(qū)域等。

以下非限制性實例描述了具有增加含量的帶正電的多糖例如寡聚N-乙酰葡糖胺或寡聚葡糖胺的棉纖維的產(chǎn)生。

除非在實例中另外指出，所有的重組技術(shù)是根據(jù)如在“薩姆布魯克(Sambrook)J和拉塞爾(Russell)DW(編寫)(2001)分子克隆：實驗室手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第3版，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，紐約(New York)”和在“奧蘇貝爾(Ausubel)FA、布倫特(Brent)R、金斯頓(Kingston)RE、摩爾(Moore)DD、塞德曼(Seidman)JG、史密斯(Smith)JA和斯特魯爾(Struhl)K(編寫)(2006)當(dāng)前分子生物學(xué)方案(Current Protocols in Molecular Biology)約翰威立父子公司(John Wiley&Sons)，紐約”中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案來進行的。

標(biāo)準(zhǔn)材料和參考描述于“克羅伊(Croy)RDD(編寫)(1993)植物分子生物學(xué)LabFax(Plant Molecular Biology LabFax)，BIOS科學(xué)出版有限公司(BIOS Scientific Publishers Ltd.)，牛津和布萊克韋爾科學(xué)出版物(Oxford and Blackwell Scientific Publications)，牛津(Oxford)”以及“布朗(Brown)TA(1998)分子生物學(xué)LabFax(Molecular Biology LabFax)，第2版，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，圣地亞哥(San Diego)”中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的標(biāo)準(zhǔn)材料與方法可以發(fā)現(xiàn)于“麥弗遜森(McPherson)MJ和莫勒SG(2000)PCR(基礎(chǔ))，BIOS科學(xué)出版有限公司，牛津”和“PCR擴增手冊(PCR Applications Manual)，第3版(2006)，德國羅氏診斷有限公司(Roche Diagnostics GmbH)，曼海姆(Mannheim)或www.roche-applied-science.com”中。

序列說明

遍及本申請參考呈現(xiàn)于序列表中的以下序列，該序列表名稱為“BCS14-2002_ST25”，其為42kB(大小如Microsoft中所測量)，含有4個序列SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:4，一并經(jīng)由電子提交方式提交并且通過引用結(jié)合在此：

SEQ ID 1：對具有來自大腸桿菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)活性的蛋白質(zhì)進行編碼的合成核苷酸序列。該序列針對在棉花植物細(xì)胞中的表達進行了優(yōu)化。示出的核苷酸序列編碼具有SEQ ID 2的氨基酸序列的多肽。

SEQ ID 2：具有來自大腸桿菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)活性的多肽的氨基酸序列。示出的氨基酸序列可以衍生自SEQ ID 1。

SEQ ID 3：pTDBI 252的T-DNA。它包括根據(jù)SEQ ID 1的、在纖維選擇性SCW-PRP啟動子的控制下編碼來自大腸桿菌的GFAT多肽的核苷酸序列，在纖維選擇性SCW-PRP啟動子的控制下編碼NOD C幾丁質(zhì)合酶的DNA區(qū)域，以及作為選擇性標(biāo)記的epsps基因。

SEQ ID 4：pTDBI 250的T-DNA。它包括根據(jù)SEQ ID 1的、在纖維選擇性Fb8樣-1啟動子的控制下編碼來自大腸桿菌的GFAT多肽的核苷酸序列，在纖維選擇性Fb8樣-1啟動子的控制下編碼NOD C幾丁質(zhì)合酶的DNA區(qū)域，以及作為選擇性標(biāo)記的epsps基因。

實例

實例1：構(gòu)建編碼谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)蛋白的嵌合基因以用于在棉花植物中表達

由恩特力傳有限公司(Entelechon GmbH)合成具有根據(jù)SEQ ID 1的核酸序列的DNA分子。核苷酸序列被設(shè)計為i)編碼根據(jù)SEQ ID 2的多肽，并且ii)優(yōu)化核苷酸序列以便在棉花植物細(xì)胞中表達。出于此目的，考慮了多種因素例如密碼子使用、mRNA二級結(jié)構(gòu)、AT含量、隱蔽剪接位點或限制性位點。

如在SEQ ID 1中披露的所得核苷酸序列與公開的編碼來自大腸桿菌的GFAT蛋白的、被針對在植物中的密碼子使用適配的核苷酸序列(WO2007/039314)具有75％一致性(1830個中有1390個匹配堿基)。

使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，構(gòu)建了以下嵌合GFAT基因：嵌合的谷氨酰胺-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶基因，該嵌合基因包括以下可操作地連接的DNA區(qū)域：

i.根據(jù)從SEQ ID 3的核苷酸位置61至1499的序列的纖維選擇性SCW-PRP啟動子區(qū)域，

ii.對來自擬南芥的DNA木糖基轉(zhuǎn)移酶的、充當(dāng)高爾基體定位信號肽的35個N-末端氨基酸進行編碼的DNA片段，

iii.對與前述DNA片段一起克隆于框架中的莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodan)NOD C進行編碼的DNA片段，

iv.花椰菜花葉病毒的35S轉(zhuǎn)錄物的3′非翻譯序列，

v.根據(jù)從SEQ ID 3的核苷酸位置61至1499的序列的纖維選擇性SCW-PRP啟動子區(qū)域，

vi.具有根據(jù)SEQ ID 1的核苷酸序列的DNA區(qū)域，該核苷酸序列編碼根據(jù)SEQ ID 2的來自大腸桿菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶，

vii.擬南芥的組蛋白H4基因的3′非翻譯序列。

將這個嵌合基因連同來自玉蜀黍(玉米)的嵌合的雙突變5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)基因(該基因提供對N-(膦酰甲基)羥苯基甘氨酸的抗性，為選擇性標(biāo)記)一起引入到T-DNA載體的T-DNA邊界之間。所得T-DNA載體命名為pTDBI 252。此載體的T-DNA序列提供于SEQ ID 3中。此載體的T-DNA的基因元件呈現(xiàn)于表1中。

構(gòu)建包含以下可操作地連接的DNA區(qū)域的另一嵌合GFAT基因：

i.根據(jù)從SEQ ID 4的核苷酸位置60至1495的序列的纖維選擇性Fb8樣-1啟動子區(qū)域，

ii.對來自擬南芥的DNA木糖基轉(zhuǎn)移酶的、充當(dāng)高爾基體定位肽的35個N-末端氨基酸進行編碼的DNA片段，

iii.對與前述DNA片段一起克隆于框架中的莖瘤固氮根瘤菌NOD C進行編碼的DNA片段，

iv.花椰菜花葉病毒的35S轉(zhuǎn)錄物的3′非翻譯序列，

v.根據(jù)從SEQ ID 4的核苷酸位置60至1495的序列的纖維選擇性Fb8樣-1啟動子區(qū)域，

vi.具有根據(jù)SEQ ID 1的核苷酸序列的DNA區(qū)域，該核苷酸序列編碼根據(jù)SEQ ID 2的來自大腸桿菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸-氨基轉(zhuǎn)移酶，

vii.擬南芥的組蛋白H4基因的3′非翻譯序列。

將這個嵌合基因連同作為選擇性標(biāo)記的嵌合epsps基因一起引入到T-DNA載體的T-DNA邊界之間。所得T-DNA載體命名為pTDBI 250。此載體的T-DNA序列提供于SEQ ID 4中。T-DNA的基因元件呈現(xiàn)于表2中。

表1：pTDBI 252的T-DNA的元件

表2：pTDBI 250的元件

使用包含以下可操作地連接的DNA區(qū)域的嵌合基因作為對照：

i.根據(jù)從SEQ ID 3的核苷酸位置61至1499的序列的纖維選擇性SCW-PRP啟動子區(qū)域，

ii.對來自擬南芥的DNA木糖基轉(zhuǎn)移酶的35個N-末端氨基酸進行編碼的DNA片段，

iii.對與前述DNA片段一起克隆于框架中的莖瘤固氮根瘤菌NOD C進行編碼的DNA片段，

iv.花椰菜花葉病毒的35S轉(zhuǎn)錄物的3′非翻譯序列，

v.根據(jù)從SEQ ID 3的核苷酸位置61至1499的序列的纖維選擇性SCW-PRP啟動子區(qū)域，

vi.對來自大腸桿菌的谷氨酰胺:果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶進行編碼的DNA區(qū)域，其針對在植物中的密碼子使用進行了優(yōu)化，如在WO 2007/039314中在其中的SEQ ID 10下所述的，

vii.擬南芥的組蛋白H4基因的3′非翻譯序列。

將這個嵌合基因連同作為選擇性標(biāo)記的嵌合epsps基因一起引入到T-DNA載體的T-DNA邊界之間。所得T-DNA載體命名為pTGK 110。此載體除了GFAT編碼序列外與pTDBI252是相同的。

實例2：產(chǎn)生表達谷氨酰胺:果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因棉花植物

將T-DNA載體引入包含輔助Ti質(zhì)粒的根癌土壤桿菌菌株中，并且用于棉花轉(zhuǎn)化中，基本上如在WO 00/71733中描述的。將T0植物如在實例3中所述的進行進一步分析。

實例3：棉纖維的葡糖胺含量的確定

將來自轉(zhuǎn)基因棉花T0植物的纖維進行分離，用三氟乙酸(TFA)進行處理以水解葡糖胺聚合物，并且通過HPLC針對葡糖胺含量進行分析。遵循標(biāo)準(zhǔn)方案進行所有步驟。

未經(jīng)轉(zhuǎn)化的品系的纖維包含約0,01％的GlcN。從表達根據(jù)本發(fā)明的GFAT基因(在SCW-PRP啟動子的控制下)的不同T0植物(用pTDBI 252轉(zhuǎn)化)測量的棉纖維的葡糖胺含量的結(jié)果描繪于表3中。

表3：來自單獨的T0植物的棉纖維的GlcN含量

值代表總纖維重量的％GlcN；*：被認(rèn)為是背景

給出的數(shù)目代表總纖維重量的％GlcN。低于0,015的值被認(rèn)為是背景。表3還示出在來自單獨的T0棉花植物的纖維中發(fā)現(xiàn)的GlcN含量，所述單獨的T0棉花植物用對照載體pTGK 110轉(zhuǎn)化，該對照載體包括針對在植物中的密碼子使用進行優(yōu)化的并且在本領(lǐng)域中已知的GFAT編碼DNA區(qū)域。

表4示出從在SCW-PRP啟動子控制下或在Fb8樣-1啟動子控制下表達根據(jù)本發(fā)明的GFAT基因的T0植物衍生的棉纖維的平均和最大GlcN含量(以總纖維重量的％測量)。作為對照，給出表達WO 2007/039314中所述的植物優(yōu)化型GFAT基因的植物的值。在SCW-PRP啟動子控制下表達根據(jù)SEQ ID 1的GFAT基因序列的纖維的均值GlcN含量是背景水平的約四倍(0,061％對比0,015％)，并且是表達公開于WO 2007/039314中的植物優(yōu)化型GFAT基因序列的對照植物的幾乎兩倍(0,061％對比0,039％)。在SCW-PRP啟動子控制下表達根據(jù)本發(fā)明的GFAT基因的T0植物中測量的最大GlcN含量是來自不表達人工引入的基因構(gòu)建體的植物的纖維的背景水平的幾乎10倍(0,132％對比0,015％)。此外，它是表達WO 2007/039314中公開的植物優(yōu)化型GFAT基因序列的對照植物的幾乎兩倍(0,132％對比0,071％)。同樣，與不表達人工引入的基因構(gòu)建體的植物相比，在Fb8樣-1啟動子控制下表達根據(jù)SEQ ID 1的GFAT基因的植物在纖維的GlcN含量方面具有超過10倍的最大增加(0,178％對比0,015％)，并且在纖維的GlcN含量方面具有均值為2倍的增加(0,039％對比0,015％)。

表4：來自在不同纖維選擇性啟動子的控制下表達根據(jù)SEQ ID 1的GFAT基因的T0棉花植物的纖維的均值和平均GlcN含量

值代表總纖維重量的％GlcN

實例4：具有增加的反應(yīng)性的棉纖維

包括可操作地連接到纖維特異性啟動子上的嵌合GFA基因和嵌合NOD C基因的轉(zhuǎn)基因棉花植物(如實例1所概述)是如實例2中所述來產(chǎn)生的。將成熟棉纖維從這些植物收獲，并且可以用陰離子染料例如剛果紅進行染色，或可以與麥胚凝集素(WGA)偶聯(lián)的亞歷克薩熒光染料(Alexa fluor)555反應(yīng)。WGA特異性地結(jié)合至植物細(xì)胞中的N-乙酰葡糖胺上，并且因此可以用作N-乙酰葡糖胺的檢測試劑。另外，所得成熟棉纖維可以用包括棉花反應(yīng)性染料(例如，活性紅120、麗華實藍(Levafix Blue)CA)、酸性染料(酸性橙7、酸性藍281)和毛料反應(yīng)性染料(例如，活性紅116、麗雅倫琥珀色(Realan Amber)EHF)的商業(yè)染料進行染色。