本發(fā)明涉及為了賦予4-羥基苯甲酸或其鹽(以下，有時簡稱為“4-HBA”)的生產(chǎn)能力而實施了特定的基因操作的棒狀細菌的轉(zhuǎn)化體、以及使用該轉(zhuǎn)化體的高效的4-HBA的制造方法。
背景技術(shù)：
：在全球變暖和石化資源枯竭問題的背景下，人們認識并關(guān)注到以可再生資源為原料的化學(xué)品的制造與生物燃料一并作為新產(chǎn)業(yè)生物煉制技術(shù)而成為實現(xiàn)低碳社會的重要策略。4-羥基苯甲酸為除了被用作抗菌劑的對羥基苯甲酸酯的合成原料以外，還被用作液晶的聚合物原料的有用的化學(xué)物質(zhì)。目前，4-HBA以原油為原料用化學(xué)手段來生產(chǎn)。作為化學(xué)手段的4-HBA制造方法，例如存在使用苯酚、氫氧化鉀和二氧化碳在高壓條件下反應(yīng)的方法等。這種方法不僅作為起始物質(zhì)的苯酚依賴于化石原料，而且是在反應(yīng)工藝中需要高溫高壓條件的、典型性的化學(xué)工業(yè)的高能耗型制造工藝。因此，希望開發(fā)能夠一種節(jié)能型的、由可再生資源制造的、廢棄物排放低的環(huán)境和諧型工藝、即希望確立利用生物法的4-HBA制造技術(shù)。但是，以往的利用以可再生資源為原料的生物法的4-HBA的生產(chǎn)與利用生物法的乳酸、乙醇的生產(chǎn)相比較，由于作為原料的糖的代謝反應(yīng)階段非常多，因此生產(chǎn)率低。另外，存在作為產(chǎn)物的4-HBA造成的細菌的增殖抑制、細胞毒性等難點。因此，無法實現(xiàn)工業(yè)性的生產(chǎn)。使用大腸桿菌能夠明確4-HBA由分支酸-丙酮酸裂解酶合成，所述分支酸-丙酮酸裂解酶從作為芳香族氨基酸等的合成相關(guān)的莽草酸途徑的中間體的分支酸被ubiC編碼(非專利文件1、2、專利文件1、2)。迄今為止，報告了嘗試將大腸桿菌來源的分支酸-丙酮酸裂解酶基因(ubiC)導(dǎo)入作為其他種類微生物的克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)來生成4-HBA(非專利文件3)。另外，報告了增強了莽草酸途徑的大腸桿菌中的4-HBA的發(fā)酵生產(chǎn)(非專利文件4)。進而，為了嘗試4-HBA造成的增殖抑制、毒性回避，雖然報告了4-HBA抗性品系選育、離子交換樹脂添加培養(yǎng)，但是4-HBA的生產(chǎn)率在實用上并不充分。另一方面，本發(fā)明人等報告了對棒狀細菌導(dǎo)入分支酸-丙酮酸裂解酶并由葡萄糖生成苯酚，但是并沒有作為中間物質(zhì)的4-HBA的生成相關(guān)的記載、分支酸-丙酮酸裂解酶的酶活性相關(guān)的描述(專利文件3)。另外，關(guān)于大腸桿菌以外的ubiC，報告了類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)來源的物質(zhì)，但以大腸桿菌為宿主使該基因高表達的轉(zhuǎn)化體和以類球紅細菌為宿主使該基因高表達的轉(zhuǎn)化體均僅能以低濃度生產(chǎn)4-HBA，實用上并不能滿足(專利文件4)。已知對大腸桿菌來源的UbiC酶詳細進行了酶學(xué)性的解析，其被作為產(chǎn)物的4-HBA強烈抑制。因此，為了構(gòu)建工業(yè)上可使用的4-HBA高生產(chǎn)株，高活性的UbiC的獲取、對于4-HBA造成的產(chǎn)物抑制具有抗性的UbiC的獲取、以及對于4-HBA具有抗性的宿主的選擇極為重要。專利文件1：美國專利6030819專利文件2：美國專利6114157專利文件3：國際公開2012/063862專利文件4：日本特開2013-183048非專利文件1：J.Bacteriol.,174,5309-5316(1992)非專利文件2：Microbiology,140,897-904(1994)非專利文件3：Appl.Microbiol.Biotechnol.,43,985-988(1995)非專利文件4：Biotechnol.Bioeng.,76,376-390(2001)技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的課題在于提供能夠以糖類、通過代謝生成并得到分支酸的化合物或分支酸為原料，高效地制造4-HBA的微生物、以及使用該微生物高效地制造4-HBA的方法。為了解決上述課題，本發(fā)明人等反復(fù)進行了研究，發(fā)現(xiàn)了對棒狀細菌導(dǎo)入了由分支酸催化4-HBA的生成反應(yīng)的分支酸-丙酮酸裂解酶(chorismatepyruvate-lyase)基因的轉(zhuǎn)化體由葡萄糖等高效地生成4-HBA。另外，發(fā)現(xiàn)了該轉(zhuǎn)化體在好氧且實質(zhì)性地不增殖的條件下反應(yīng)時，4-HBA的生產(chǎn)效率特別高。另外，發(fā)現(xiàn)了迄今為止關(guān)于報告了4-HBA的生產(chǎn)的幾個轉(zhuǎn)化體的宿主，4-HBA對它們的增殖造成的影響進行比較的結(jié)果是，在大腸桿菌、類球紅細菌、谷氨酸棒狀桿菌和被報告作為溶劑抗性菌的惡臭假單胞菌之中，谷氨酸棒狀桿菌的4-HBA抗性最高。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的，提供以下的轉(zhuǎn)化體及4-HBA的制造方法。第1項.一種具有4-羥基苯甲酸或其鹽的生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體，其通過將編碼具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因?qū)胨拗靼魻罴毦玫健５?項.根據(jù)第1項所述的轉(zhuǎn)化體，其中，編碼具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因為泛菌(Pantoea)屬來源的基因、普羅威登斯菌(Providencia)屬來源的基因、埃希氏菌(Escherichia)屬來源的基因、假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)屬來源的基因、克羅諾桿菌(Cronobacter)屬來源的基因、檸檬酸桿菌(Citrobacter)屬來源的基因、腸桿菌(Enterobacter)屬來源的基因、假單胞菌(Pseudomonas)屬來源的基因、摩根氏菌(Morganella)屬來源的基因、固氮細菌(Azotobacter)屬來源的基因、希瓦氏菌(Shewanella)屬來源的基因或貪銅菌(Cupriavidus)屬來源的基因。第3項.根據(jù)第1項所述的轉(zhuǎn)化體，其中，編碼具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因為菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)來源的基因、拉氏普羅威登斯菌(Providenciarustigianii)來源的基因、斯氏普羅威登斯菌(Providenciastuartii)來源的基因、斯尼比普羅威登斯菌(Providenciasneebia)來源的基因、雷極普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)來源的基因、產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)來源的基因、布氏普羅威登斯菌(Providenciaburhodogranariea)來源的基因、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)來源的基因、費格森埃希菌(Escherichiafergusonii)來源的基因、殺魚假交替單胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)來源的基因、游海假交替單胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)來源的基因、阪崎腸桿菌(Cronobactersakazakii)來源的基因、楊氏檸檬酸桿菌(Citrobacteryoungae)來源的基因、克氏檸檬酸桿菌(Citrobacterkoseri)來源的基因、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)來源的基因、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)來源的基因、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)來源的基因、摩根氏菌(Morganellamorganii)來源的基因、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)來源的基因、腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)來源的基因或臺灣貪銅菌(Cupriavidustaiwanensis)來源的基因。第4項.根據(jù)第1項所述的轉(zhuǎn)化體，其中，編碼具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因為下述(a)或(b)的DNA，(a)由序列號1～21中的任一個堿基序列構(gòu)成的DNA(b)與由(a)中任一個堿基序列的互補堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴格的條件下雜交且編碼具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA，或者與(a)中任一個堿基序列具有90％以上的同一性的堿基序列構(gòu)成且編碼具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。第5項.根據(jù)第1～4項中任一項所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主棒狀細菌為棒狀桿菌屬細菌。第6項.根據(jù)第5項所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主棒狀桿菌屬細菌為谷氨酸棒狀桿菌。第7項.根據(jù)第6項所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主谷氨酸棒狀桿菌為棒狀桿菌R(FERMBP-18976)、ATCC13032或ATCC13869。第8項.一種谷氨酸棒狀桿菌HBA-2(保藏編號：NITEBP-01838)轉(zhuǎn)化體。第9項.一種4-羥基苯甲酸或其鹽的制造方法，其中，包括：在反應(yīng)液中培養(yǎng)第1～8項中任一項所述的轉(zhuǎn)化體的工序，所述反應(yīng)液包括選自由糖類、轉(zhuǎn)化體通過代謝生成分支酸的化合物和分支酸、以及它們的鹽組成的組中的至少一種原料化合物；以及回收反應(yīng)液中的4-羥基苯甲酸或其鹽的工序。第10項.根據(jù)第9項所述的方法，在好氧且轉(zhuǎn)化體不增殖的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。通過使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，從而能夠由葡萄糖等糖類、分支酸、喹酸、莽草酸等以高效率制造4-HBA。一般而言，微生物會因4-HBA這種芳香族化合物的細胞毒性而抑制增殖，因此難以使用微生物來制造4-HBA。另外，微生物具有的分支酸-丙酮酸裂解酶的活性一般很弱，而且分支酸-丙酮酸裂解酶受到4-HBA的強烈的產(chǎn)物抑制，因此難以充分生產(chǎn)4-HBA。但是，根據(jù)本發(fā)明，使用對于4-HBA抗性優(yōu)異的微生物，能夠在實用上充分且高效地制造4-HBA。附圖說明圖1是表示4-羥基苯甲酸對四種微生物(谷氨酸棒狀桿菌R、大腸埃希氏菌JM109、惡臭假單細胞S12ATCC700801和類球紅細菌NBRC12203)的增殖造成的影響的圖。具體實施方式下面，對本發(fā)明進行詳細說明。(1)具有4-HBA生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體本發(fā)明的具有4-HBA生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體是將編碼具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因?qū)胨拗靼魻罴毦霓D(zhuǎn)化體。宿主棒狀細菌是指伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊[BargeysManualofDeterminativeBacteriology,Vol.8,599(1974)]中定義的一組微生物，只要是在通常的好氧條件下增殖的棒狀細菌則沒有特別限定。如果列舉具體例，可以列舉棒狀桿菌屬菌、短桿菌屬菌、節(jié)桿菌屬菌、分枝桿菌屬菌、微球菌屬菌等。棒狀細菌中，優(yōu)選棒狀桿菌屬菌。作為棒狀桿菌屬菌，可以列舉谷氨酸棒狀桿菌、有效棒狀桿菌(Corynebacteriumefficiens)、產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)、耐鹽棒狀桿菌(Corynebacteriumhalotolerance)、解烷棒狀桿菌(Corynebacteriumalkanolyticum)等。其中，從安全且4-HBA生產(chǎn)率高的觀點出發(fā)，優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。作為優(yōu)選的菌株，可以列舉：谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)R株(FERMP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41(FERMBP-1498)等。這些菌株在布達佩斯條約下被國際保藏，是公眾能夠利用的。其中，優(yōu)選R株(FERMP18976)、ATCC13032株、ATCC13869株。此外，根據(jù)分子生物學(xué)的分類，黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)、散枝短桿菌(Brevibacteriumdivaricatum)、百合棒桿菌(Corynebacteriumlilium)等棒狀細菌的菌名也統(tǒng)一在谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)中[Liebl,W.etal.,TransferofBrevibacteriumdivaricatumDSM20297T,“Brevibacteriumflavum”DSM20411,“Brevibacteriumlactofermentum”DSM20412andDSM1412,andCorynebacteriumglutamicumandtheirdistinctionbyrRNAgenerestrictionpatterns.IntJSystBacteriol.41:255260.(1991)，駒形和男ら,コリネフォルム細菌の分類,発酵と工業(yè),45:944963(1987)]。作為短桿菌屬菌，可以列舉產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)(例如ATCC6872株)等。作為節(jié)桿菌屬菌，可以列舉球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)(例如ATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株)等。作為分枝桿菌屬菌，可以列舉牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)(例如ATCC19210株、ATCC27289株)等。作為微球菌屬菌，可以列舉弗氏微球菌(Micrococcusfreudenreichii)(例如No.239株(FERMP13221))、藤黃微球菌(Micrococcusleuteus)(例如No.240株(FERMP13222))、脲微球菌(Micrococcusureae)(例如IAM1010株)、玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(例如IFO3764株)等。另外，除了野生株以外，棒狀細菌也可以是其突變株或人工的基因重組體。例如，可以列舉乳酸脫氫酶(乳酸脫氫酶，LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvatecarboxylase)、蘋果酸脫氫酶(malatedehydrogenase)等的基因的破壞株。其中，優(yōu)選乳酸脫氫酶基因的破壞株。該基因破壞株中，乳酸脫氫酶基因被破壞，由此使丙酮酸至乳酸的代謝途徑被阻斷。其中，優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌的、特別是R(FERMP18976)株的乳酸脫氫酶基因的破壞株。這種基因破壞株可以通過基因工程的方法按照常規(guī)方法來制作。例如，在WO2005/010182A1中記載了乳酸脫氫酶破壞株及其制作方法。如圖1所示，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)棒狀細菌與其他細菌相比，對于4-HBA的抗性極高。從這點來看，棒狀細菌適于利用本發(fā)明方法的4-HBA制造。分支酸-丙酮酸裂解酶酶基因分支酸-丙酮酸裂解酶是催化由分支酸產(chǎn)生4-HBA和丙酮酸的反應(yīng)的酶。編碼具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的酶的基因的來源沒有特別限定，可以列舉泛菌(Pantoea)屬、普羅威登斯菌(Providencia)屬、埃希氏菌(Escherichia)屬、假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)屬、克羅諾桿菌(Cronobacter)屬、檸檬酸桿菌(Citrobacter)屬、腸桿菌(Enterobacter)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、摩根氏菌(Morganella)屬、固氮細菌(Azotobacter)屬、希瓦氏菌(Shewanella)屬或貪銅菌(Cupriavidus)屬微生物來源的基因。從酶的比活力高這點來看，優(yōu)選泛菌屬、普羅威登斯菌屬、埃希氏菌屬、假交替單胞菌屬、克羅諾桿菌屬、檸檬酸桿菌屬或腸桿菌屬微生物來源的基因，從難以受到4-HBA造成的產(chǎn)物抑制這點來看，優(yōu)選普羅威登斯菌屬、腸桿菌屬、希瓦氏菌屬或貪銅菌屬微生物來源的基因，從轉(zhuǎn)化體的4-HBA生產(chǎn)率良好這點來看，優(yōu)選泛菌屬、普羅威登斯菌屬、埃希氏菌屬或克羅諾桿菌屬微生物來源的基因。綜合來看，更優(yōu)選普羅威登斯菌屬或克羅諾桿菌屬來源的基因。具體而言，可以列舉菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)、拉氏普羅威登斯菌(Providenciarustigianii)、斯氏普羅威登斯菌(Providenciastuartii)、斯尼比普羅威登斯菌(Providenciasneebia)、雷極普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)、產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、布氏普羅威登斯菌(Providenciaburhodogranariea)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、費格森埃希菌(Escherichiafergusonii)、殺魚假交替單胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)、游海假交替單胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、阪崎腸桿菌(Cronobactersakazakii)、楊氏檸檬酸桿菌(Citrobacteryoungae)、克氏檸檬酸桿菌(Citrobacterkoseri)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、摩根氏菌(Morganellamorganii)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)或臺灣貪銅菌(Cupriavidustaiwanensis)來源的基因。作為菠蘿泛菌來源的基因，可以列舉由序列號1的堿基序列構(gòu)成的基因，作為拉氏普羅威登斯菌來源的基因，可以列舉由序列號2的堿基序列構(gòu)成的基因，作為斯氏普羅威登斯菌來源的基因，可以列舉由序列號3的堿基序列構(gòu)成的基因，作為斯尼比普羅威登斯菌來源的基因，可以列舉由序列號4的堿基序列構(gòu)成的基因，作為雷極普羅威登斯菌來源的基因，可以列舉由序列號5的堿基序列構(gòu)成的基因，作為產(chǎn)堿普羅威登斯菌來源的基因，可以列舉由序列號6的堿基序列構(gòu)成的基因，作為布氏普羅威登斯菌(Providenciaburhodogranariea)來源的基因，可以列舉由序列號7的堿基序列構(gòu)成的基因，作為大腸埃希氏菌來源的基因，可以列舉由序列號8的堿基序列構(gòu)成的基因，作為費格森埃希菌來源的基因，可以列舉由序列號9的堿基序列構(gòu)成的基因，作為殺魚假交替單胞菌來源的基因，可以列舉由序列號10的堿基序列構(gòu)成的基因，作為游海假交替單胞菌來源的基因，可以列舉由序列號11的堿基序列構(gòu)成的基因，作為阪崎腸桿菌來源的基因，可以列舉由序列號12的堿基序列構(gòu)成的基因，作為楊氏檸檬酸桿菌來源的基因，可以列舉由序列號13的堿基序列構(gòu)成的基因，作為克氏檸檬酸桿菌來源的基因，可以列舉由序列號14的堿基序列構(gòu)成的基因，作為產(chǎn)氣腸桿菌來源的基因，可以列舉由序列號15的堿基序列構(gòu)成的基因，作為陰溝腸桿菌來源的基因，可以列舉由序列號16的堿基序列構(gòu)成的基因，作為惡臭假單胞菌來源的基因，可以列舉由序列號17的堿基序列構(gòu)成的基因，作為摩根氏菌來源的基因，可以列舉由序列號18的堿基序列構(gòu)成的基因，作為棕色固氮菌來源的基因，可以列舉由序列號19的堿基序列構(gòu)成的基因，作為腐敗希瓦氏菌來源的基因，可以列舉由序列號20的堿基序列構(gòu)成的基因，作為臺灣貪銅菌來源的基因，可以列舉由序列號21的堿基序列構(gòu)成的基因。另外，還可以使用與堿基序列1～21中任一個堿基序列的互補堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴格的條件下雜交的DNA、且編碼具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA(同源物)。在本發(fā)明中，“嚴格的條件”是指在6×SSC的鹽濃度的雜交溶液中，在50～60℃的溫度條件下，進行16小時雜交，在0.1×SSC的鹽濃度的溶液中進行清洗的條件。另外，還可以使用與堿基序列1～21中任一個堿基序列具有90％以上、其中95％以上、其中98％以上的同一性的堿基序列構(gòu)成的DNA、且編碼具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA(同源物)。在本發(fā)明中，堿基序列的同一性是利用GENETYXver.8(GENETYX株式會社ゼネティックス制造)計算出的值。分支酸-丙酮酸裂解酶活性可以改變“Microbiology,140,897-904(1994)”中記載的方法來測定。簡單來說，向試驗用液中添加被測酶，使其含有50mMTris-HCl(pH7.5)，0.5mM分支酸鋇鹽，0.2mMNADH，0.2MNaCl，5Unit乳酸脫氫酶，在33℃進行反應(yīng)，通過追蹤來源于NADH的340nm的吸光度的減少從而測定反應(yīng)初速度。對于不添加分支酸鋇鹽的體系也同樣進行反應(yīng)，作為背景值。將兩個測定值的差作為分支酸-丙酮酸裂解酶活性，當確認到依賴于酶和基質(zhì)的添加的NADH來源的340nm的隨時間變化的、線性的吸光度減少時，判定為具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性。酶活性的1unit定義為每1分鐘產(chǎn)生1微摩爾的4-HBA的酶量，根據(jù)酶反應(yīng)的初速度計算出。由堿基序列1～21中任一個堿基序列構(gòu)成的DNA的同源物例如可以通過使用基于這些堿基序列按照常規(guī)方法設(shè)計的引物或探針的PCR或雜交，從其他生物種的DNA文庫中選擇，由此以高概率得到編碼具有分支酸-丙酮酸裂解酶活性的多肽的DNA。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選4-羥基苯甲酸脫羧酶基因未被導(dǎo)入。4-羥基苯甲酸脫羧酶為將4-HBA轉(zhuǎn)換為苯酚的酶。由于棒狀細菌不具有內(nèi)源性4-羥基苯甲酸脫羧酶基因，因此不導(dǎo)入外源性的4-羥基苯甲酸脫羧酶基因時，棒狀細菌不進行從4-HBA向苯酚的轉(zhuǎn)換。另一方面，在分支酸-丙酮酸裂解酶基因的基礎(chǔ)上還導(dǎo)入4-羥基苯甲酸脫羧酶基因時，轉(zhuǎn)化體由葡萄糖等糖類經(jīng)由4-HBA生產(chǎn)苯酚。但是，一般而言，苯酚比4-HBA對于酶的抑制力格外強，因此欲由糖類經(jīng)過多階段的反應(yīng)制造苯酚時，苯酚會抑制很多酶，因此苯酚制造效率惡化。另一方面，使用導(dǎo)入了分支酸-丙酮酸裂解酶基因而未導(dǎo)入4-羥基苯甲酸脫羧酶基因的轉(zhuǎn)化體，由糖類一度制造毒性比較低的4-HBA，另行使用導(dǎo)入了4-羥基苯甲酸脫羧酶基因的轉(zhuǎn)化體或4-羥基苯甲酸脫羧酶基因自身由4-HBA制造苯酚時，由于受到苯酚影響的酶僅為4-羥基苯甲酸脫羧酶，因此苯酚制造效率比較良好。另外，一般而言，苯酚比4-HBA的細胞毒性也格外強。使用微生物由糖類制造苯酚時，由于經(jīng)過多階段的反應(yīng)，因此苯酚制造會耗費時間。因此，微生物被長時間暴露于生成的苯酚中并受到毒性的影響，苯酚制造效率惡化。另一方面，如果使用導(dǎo)入了分支酸-丙酮酸裂解酶基因而未導(dǎo)入4-羥基苯甲酸脫羧酶基因的轉(zhuǎn)化體，由糖類生成細胞毒性比較低的4-HBA，則即使經(jīng)過多階段的反應(yīng)而需要長時間，轉(zhuǎn)化體受到的損害也少。進而，另行通過使用導(dǎo)入了4-羥基苯甲酸脫羧酶基因的轉(zhuǎn)化體或4-羥基苯甲酸脫羧酶基因自身由4-HBA制造苯酚時，能夠由糖類高效地制造苯酚。用于轉(zhuǎn)化體的載體的構(gòu)建將通過PCR擴增得到的編碼分支酸-丙酮酸裂解酶的DNA分別克隆到能夠在宿主中擴增的適當?shù)妮d體中即可。作為質(zhì)粒載體，只要是包含在棒狀細菌內(nèi)擔負自主復(fù)制功能的基因的質(zhì)粒載體即可。作為其具體例，可以列舉：乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)2256來源的pAM330[日本特開昭58-67699號公報]、[Miwa,K.etal.,Crypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:29012903(1984)]和[Yamaguchi,R.etal.,DeterminationofthecompletenucleotidesequenceofttheBrevibacteriumlactofermentumplasmidpAM330andtheanalysisofitsgeneticinformation.NucleicAcidsSymp.Ser.16:265267(1985)]、谷氨酸棒狀桿菌ATCC13058來源的pHM1519[Miwa,K.etal.,Crypticplasmidsinglutamicacidproducingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:29012903(1984)]和pCRY30[Kurusu,Y.etal.,Identificationofplasmidpartitionfunctionincoryneformbacteria.Appl.Environ.Microbiol.57:759764(1991)]、谷氨酸棒狀桿菌T250來源的pCG4[日本特開昭57-183799號公報]、[Katsumata,R.etal.,ProtoplasttransformationofglutamateproducingbacteriawithplasmidDNA.J.Bacteriol.、159:306311(1984)]、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50[日本特開昭62-166890]、pEK0、pEC5、pEKEx1[Eikmanns，B.J.etal.,AfamilyofCorynebacteriumglutamicum/Escherichiacolishuttlevectorsforcloning,controlledgeneexpression，andpromoterprobing.Gene，102:9398(1991)]等。作為優(yōu)選的啟動子，可以列舉谷氨酸棒狀桿菌R來源的甘油醛3-磷酸脫氫酶A基因(gapA)的啟動子PgapA、蘋果酸脫氫酶基因(mdh)的啟動子Pmdh、乳酸脫氫酶A基因(ldhA)的啟動子PldhA等，其中，優(yōu)選PgapA。作為優(yōu)選的終止子，可以列舉大腸桿菌rRNA操縱子的rrnBT1T2終止子、大腸桿菌的trpA終止子、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)的trp終止子等，其中，優(yōu)選rrnBT1T2終止子。轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化方法可以沒有限制地使用公知的方法。作為這樣的公知的方法，可以列舉例如氯化鈣/氯化銣法、磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔法等。其中，對于棒狀細菌優(yōu)選電脈沖法，電脈沖法可以通過公知的方法進行[Kurusu，Y.etal.，ElectroporationtransformationsystemforCoryneformbacteriabyauxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.54:443447(1990)]。轉(zhuǎn)化體使用微生物的培養(yǎng)中通常使用的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)即可。作為該培養(yǎng)基，通?？梢允褂煤刑荚?、氮源、無機鹽類及其他營養(yǎng)物質(zhì)等的天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基。作為碳源，可以列舉：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖質(zhì)或糖醇；乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、馬來酸或葡糖酸等有機酸；乙醇、丙醇等醇。碳源可以單獨使用一種或者兩種以上混合使用。培養(yǎng)基中的這些碳源的濃度通常設(shè)定為約0.1～10(w/v％)即可。作為氮源，可以列舉：氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨等無機或有機銨化合物、尿素、氨水、硝酸鈉、硝酸鉀等。另外，還可以利用玉米漿、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白質(zhì)水解物、氨基酸等含氮有機化合物等。氮源可以單獨使用一種或者兩種以上混合使用。培養(yǎng)基中的氮源濃度因使用的氮化合物而異，通常設(shè)定為10(w/v％)即可。作為無機鹽類，可以列舉例如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鈷或碳酸鈣等。這些無機鹽可以單獨使用一種或者兩種以上混合使用。培養(yǎng)基中的無機鹽類濃度因使用的無機鹽而異，通常設(shè)定為約0.1～1(w/v％)即可。作為營養(yǎng)物質(zhì)，例如可以得到肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米漿、脫脂奶粉、脫脂大豆鹽酸水解物或者動植物或微生物菌體的提取物或它們的分解物等，通常設(shè)定為約0.1～10(w/v％)即可。進而，還可以根據(jù)需要添加維生素類。作為維生素類，例如可以列舉生物素、硫胺素、吡哆醇、泛酸、肌醇、尼克酸等。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選約6～8。作為優(yōu)選的微生物培養(yǎng)培養(yǎng)基，可以列舉A培養(yǎng)基[Inui，M.etal.，MetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182196(2004)]、BT培養(yǎng)基[Omumasaba，C.A.etal.,Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite，ATPdependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91103(2004)]等。培養(yǎng)溫度設(shè)定為約15℃～45℃即可，培養(yǎng)時間設(shè)定為約1～7天即可。宿主染色體基因的破壞或缺失宿主棒狀細菌中，優(yōu)選存在于其染色體上的4-羥基苯甲酸羥化酶基因被破壞或發(fā)生缺失。通過破壞4-羥基苯甲酸羥化酶導(dǎo)致生成的4-HBA的代謝被抑制，4-HBA的生產(chǎn)率提高的同時副產(chǎn)物減少。制作以使基因的部分序列缺失而不產(chǎn)生正常發(fā)揮功能的酶蛋白的方式進行改變后的缺失型基因，利用包含該基因的DNA轉(zhuǎn)化細菌，在缺失型基因與染色體上的基因之間引起同源重組，由此能夠?qū)⑷旧w上的基因置換成缺失型或破壞型的基因。由缺失型或破壞型的基因編碼的酶蛋白即使生成也具有與野生型酶蛋白不同的立體結(jié)構(gòu)，功能降低或消失。由這種利用同源重組的基因置換所致的基因缺失或破壞方法已經(jīng)確立，有使用包含溫度敏感性復(fù)制起點的質(zhì)粒、能夠進行接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的方法、利用在宿主內(nèi)不具有復(fù)制起點的自殺載體的方法等(美國專利第6303383號、日本特開平05-007491號)。(2)4-HBA的制造方法可以通過包括：在反應(yīng)液中培養(yǎng)上述說明的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的工序，所述反應(yīng)液含有選自由糖類、轉(zhuǎn)化體通過代謝生成并得到分支酸的化合物和分支酸、以及它們的鹽組成的組中的至少一種原料化合物；以及回收反應(yīng)液中的4-HBA的工序的方法來制造4-HBA。原料化合物為需要使轉(zhuǎn)化體進入細胞內(nèi)的化合物，另外，優(yōu)選在植物中大量包含等、工業(yè)上易于利用的原料化合物。作為糖類，優(yōu)選葡萄糖，但是還可以使用通過代謝生成并得到葡萄糖的糖類。在這樣的糖類中包含具有葡萄糖單位的低聚糖或多糖類。作為這樣的糖類，可以列舉果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖等單糖類；纖維二糖，蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、木二糖等二糖類；糊精或可溶性淀粉等多糖類等。另外，作為通過代謝生成并得到分支酸的化合物，可以列舉喹酸、莽草酸等。另外，作為例如包括這些原料化合物的原料，還可以使用糖蜜。另外，還可以使用將秸稈(水稻秸稈、大麥秸稈、小麥秸稈、黑麥秸稈、燕麥秸稈等)、甘蔗渣、玉米秸稈等非可食農(nóng)產(chǎn)品廢棄物、柳枝稷、象草、芒草等能源作物、木屑、廢紙等通過糖化酶等糖化的、包含葡萄糖等多種糖的糖化液。其中，作為原料化合物，優(yōu)選葡萄糖、分支酸、喹酸、莽草酸。微生物的增殖在反應(yīng)之前，優(yōu)選將轉(zhuǎn)化體在好氧條件下、在溫度約25℃～38℃下培養(yǎng)約12～48小時而使其增殖。培養(yǎng)用培養(yǎng)基反應(yīng)之前的轉(zhuǎn)化體的好氧培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基，可以使用含有碳源、氮源、無機鹽類及其他營養(yǎng)物質(zhì)等的天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基。作為碳源，還可以使用糖類(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等單糖；蔗糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等)；甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、馬來酸、葡糖酸等有機酸；乙醇、丙醇等醇；正鏈烷烴等烴等。碳源可以單獨使用一種或者兩種以上混合使用。作為氮源，可以使用氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨等無機或有機銨化合物、尿素、氨水、硝酸鈉、硝酸鉀等。另外，還可以使用玉米漿、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白質(zhì)水解物、氨基酸等含氮有機化合物等。氮源可以單獨使用一種或者兩種以上混合使用。氮源在培養(yǎng)基中的濃度因使用的氮化合物而異，通常設(shè)定為約0.1～10(w/v％)即可。作為無機鹽類，可以列舉例如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鈷、碳酸鈣等。無機鹽可以單獨使用一種或者兩種以上混合使用。無機鹽在培養(yǎng)基中的濃度因使用的無機鹽而異，通常設(shè)定為約0.01～1(w/v％)即可。作為營養(yǎng)物質(zhì)，可以列舉肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米漿、脫脂奶粉、脫脂大豆鹽酸水解物、動植物或微生物菌體的提取物或它們的分解物等。營養(yǎng)物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度因使用的營養(yǎng)物質(zhì)而異，通常設(shè)定為約0.1～10(w/v％)即可。進而，還可以根據(jù)需要添加維生素類。作為維生素類，可以列舉生物素、硫胺素(維生素B1)、吡哆醇(維生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選約6～8。作為具體的優(yōu)選的棒狀細菌用培養(yǎng)基，可以列舉A培養(yǎng)基[Inui,M.etal.,MetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182196(2004)]、BT培養(yǎng)基[Omumasaba,C.A.etal.,Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite,ATPdependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91103(2004)]等。這些培養(yǎng)基中，使糖類濃度在上述范圍內(nèi)來使用即可。反應(yīng)液作為反應(yīng)液，可以使用含有碳源、氮源、無機鹽類等的天然反應(yīng)液或合成反應(yīng)液。作為碳源，使用上述說明的原料化合物或包含該原料化合物的糖蜜、糖化液等即可。作為碳源，除了糖類以外，還可以使用甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、馬來酸、葡糖酸等有機酸；乙醇、丙醇等醇；正鏈烷烴等烴等。碳源可以單獨使用一種或者兩種以上混合使用。反應(yīng)液中的原料化合物的濃度優(yōu)選約1～20(w/v％)，更優(yōu)選約2～10(w/v％)，進一步優(yōu)選約2～5(w/v％)。另外，包括原料化合物的全部碳源的濃度設(shè)定為約2～5(w/v％)即可。作為氮源，可以使用氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨等無機或有機銨化合物、尿素、氨水、硝酸鈉、硝酸鉀等。另外，還可以使用玉米漿、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白質(zhì)水解物、氨基酸等含氮有機化合物等。氮源可以單獨使用一種或者兩種以上混合使用。氮源在反應(yīng)液中的濃度因使用的氮化合物而異，通常設(shè)定為約0.1～10(w/v％)即可。作為無機鹽類，可以列舉例如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鈷、碳酸鈣等。無機鹽可以單獨使用一種或者兩種以上混合使用。無機鹽在反應(yīng)液中的濃度因使用的無機鹽而異，通常設(shè)定為約0.01～1(w/v％)即可。進而，還可以根據(jù)需要添加維生素類。作為維生素類，可以列舉生物素、硫胺素(維生素B1)、吡哆醇(維生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。反應(yīng)液的pH優(yōu)選約6～8。作為具體的優(yōu)選的棒狀細菌用反應(yīng)液，可以列舉前述的BT培養(yǎng)基等。這些培養(yǎng)基中，使糖類濃度在上述范圍內(nèi)來使用即可。反應(yīng)條件反應(yīng)溫度即轉(zhuǎn)化體的存活溫度優(yōu)選約20℃～50℃，更優(yōu)選約25℃～47℃。如果為上述溫度范圍，則能夠高效地制造4-HBA。另外，反應(yīng)時間優(yōu)選約1～7天，更優(yōu)選約1～3天。培養(yǎng)可以是分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)中的任何一種。其中，優(yōu)選分批培養(yǎng)。反應(yīng)可以在好氧條件下進行，也可以在還原條件下進行。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體自身的4-HBA生產(chǎn)能力在好氧條件下更高。但是，由于在好氧條件下轉(zhuǎn)化體增殖，因此原料化合物因增殖而消耗，導(dǎo)致4-HBA制造效率下降。因此，優(yōu)選在好氧且轉(zhuǎn)化體不增殖的條件下進行反應(yīng)。本發(fā)明中的不增殖包括實質(zhì)上不增殖或幾乎不增殖。例如，通過使用使作為微生物的增殖所必須的化合物的生物素、硫胺素等維生素類等、氮源等的一種以上缺失或限制的反應(yīng)液，從而能夠回避或抑制轉(zhuǎn)化體的增殖。另外，在還原條件下，由于棒狀細菌實質(zhì)上不增殖，原料化合物不因增殖而被消耗，因此4-HBA制造效率提高。還原條件由反應(yīng)液的氧化還原電位規(guī)定。反應(yīng)液的氧化還原電位優(yōu)選約200mV～500mV，更優(yōu)選約150mV～500mV。反應(yīng)液的還原狀態(tài)可以簡單地利用刃天青指示劑(在還原狀態(tài)下由藍色脫色為無色)推測，使用氧化還原電位差計(例如，BROADLEYJAMES公司制造，ORPElectrodes)能夠準確地測定。處于還原條件下的反應(yīng)液的制備方法可以沒有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反應(yīng)液用水溶液代替蒸餾水等作為反應(yīng)液的液體介質(zhì)，反應(yīng)液用水溶液的制備方法例如參考硫酸還原微生物等絕對厭氧性微生物用的培養(yǎng)液制備方法(Pfennig,Net.al.(1981):Thedissimilatorysulfatereducingbacteria,InTheProkaryotes,AHandbookonHabitats,IsolationandIdentificationofBacteria,Ed.byStarr,M.P.et.al.p.926940,Berlin,SpringerVerlag.)或“農(nóng)蕓化學(xué)実験書第三巻、京都大學(xué)農(nóng)學(xué)部農(nóng)蕓化學(xué)教室編、1990年第26刷、産業(yè)図書株式會社出版(農(nóng)藝化學(xué)實驗書第三卷、京都大學(xué)農(nóng)學(xué)部農(nóng)藝化學(xué)教室編、1990年第26次印刷、產(chǎn)業(yè)圖書株式會社出版)”等，能夠得到期望的還原條件下的水溶液。具體而言，可以通過對蒸餾水等進行加熱處理或減壓處理將溶解氣體除去而得到還原條件的反應(yīng)液用水溶液。在這種情況下，可以通過在約10mmHg以下、優(yōu)選約5mmHg以下、更優(yōu)選約3mmHg以下的減壓條件下，將蒸餾水等處理約1～60分鐘、優(yōu)選約5～40分鐘來將溶解氣體、特別是溶解氧除去而得到還原條件下的反應(yīng)液用水溶液。另外，也可以添加適當?shù)倪€原劑(例如，硫代乙醇酸、抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、巰基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化鈉等)來制備還原條件的反應(yīng)液用水溶液。將上述方法適當組合而成的方法也是有效的還原條件的反應(yīng)液用水溶液的制備方法。在還原條件下使其反應(yīng)時，反應(yīng)中也優(yōu)選將反應(yīng)液維持于還原條件。為了維持反應(yīng)過程中的還原條件，優(yōu)選盡可能地防止從反應(yīng)體系外混入氧，具體而言，可以列舉將反應(yīng)體系用氮氣等惰性氣體或二氧化碳等密封的方法。作為更有效地防止氧混入的方法，為了在反應(yīng)過程中使本發(fā)明的好氧性細菌的菌體內(nèi)的代謝功能高效地發(fā)揮作用，有時也需要添加維持反應(yīng)體系的pH調(diào)節(jié)液或適當添加各種營養(yǎng)素溶解液，在這種情況下，預(yù)先從添加溶液中除去氧是有效的。4-HBA的回收通過以上述方式進行培養(yǎng)，在反應(yīng)液中生產(chǎn)出4-HBA?？梢酝ㄟ^回收反應(yīng)液來回收4-HBA，也可以進一步利用公知的方法從反應(yīng)液中分離出4-HBA。作為這種公知的方法，可以列舉離子交換樹脂法、濃縮法、晶析法、膜分離法、有機溶劑提取法、各種吸附法等。實施例14-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的克隆和表達(1)從微生物中提取染色體DNA從菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)LMG20103中提取染色體DNA的操作如下進行：向LMGBacteriaCultureMediumNo.1培養(yǎng)基[將1g的牛肉提取物、2g的酵母提取物、5g的蛋白胨、5g的NaCl溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為7.4]中使用白金環(huán)接種后，在28℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從拉氏普羅威登斯菌(Providenciarustigianii)JCM3953中提取染色體DNA的操作如下進行：向JCMMediumNo.12培養(yǎng)基[將5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為7.0]中使用白金環(huán)接種后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從斯氏普羅威登斯菌(Providenciastuartii)ATCC25827中提取染色體DNA的操作如下進行：向ATCCMediumNo.3培養(yǎng)基[將5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為6.8]中使用白金環(huán)接種后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從斯尼比普羅威登斯菌(Providenciasneebia)JCM16941中提取染色體DNA的操作如下進行：向JCMMediumNo.27培養(yǎng)基[將15g的蛋白胨、5g的大豆蛋白胨、5g的氯化鈉溶解在1L蒸餾水中]中使用白金環(huán)接種后，在28℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從雷氏普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)JCM1675中提取染色體DNA的操作如下進行：向JCMMediumNo.12培養(yǎng)基[將5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為7.0]中使用白金環(huán)接種后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)JCM1673中提取染色體DNA的操作如下進行：向JCMMediumNo.12培養(yǎng)基[將5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為7.0]中使用白金環(huán)接種后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從布氏普羅威登斯菌(Providenciaburhodogranariea)JCM16940中提取染色體DNA的操作如下進行：向JCMMediumNo.27培養(yǎng)基[將15g的蛋白胨、5g的大豆蛋白胨、5g的氯化鈉溶解在1L蒸餾水中]中使用白金環(huán)接種后，在28℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)K12MG1655中提取染色體DNA的操作如下進行：向LB培養(yǎng)基[將10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸餾水中]中使用白金環(huán)接種后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從費格森埃希菌(Escherichiafergusonii)NBRC102419中提取染色體DNA的操作如下進行：向NBRCMediumNo.802培養(yǎng)基[將10g的多蛋白胨、2g的酵母提取物、1g的MgSO4·7H2O溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為7.0]中使用白金環(huán)接種后，在30℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從殺魚假交替單胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)JCM20779中提取染色體DNA的操作如下進行：向JCMMediumNo.118培養(yǎng)基[將37.4g的MARINEBROTH-2216(碧迪公司制造)溶解在1L蒸餾水中]中使用白金環(huán)接種后，在30℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從游海假交替單胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)NBRC102225中提取染色體DNA的操作如下進行：向NBRCMediumNo.304培養(yǎng)基[將37.4g的MARINEBROTH-2216(碧迪公司制造)溶解在1L蒸餾水中]中使用白金環(huán)接種后，在25℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從阪崎腸桿菌(Cronobactersakazakii)JCM1233中提取染色體DNA的操作如下進行：向JCMMediumNo.12培養(yǎng)基[將5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為7.0]中使用白金環(huán)接種后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從楊氏檸檬酸桿菌(Citrobacteryoungae)ATCC29220中提取染色體DNA的操作如下進行：向ATCCMediumNo.3培養(yǎng)基[將5g的蛋白胨、3g的牛肉提取物溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為6.8]中使用白金環(huán)接種后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從克氏檸檬酸桿菌(Citrobacterkoseri)ATCCBAA-895中提取染色體DNA的操作如下進行：向ATCCMediumNo.18培養(yǎng)基[將15g的蛋白胨、5g的大豆蛋白胨、5g的氯化鈉溶解在1L蒸餾水中]中使用白金環(huán)接種后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)NBRC13534中提取染色體DNA的操作如下進行：向NBRCMediumNo.802培養(yǎng)基[將10g的多蛋白胨、2g的酵母提取物、1g的MgSO4·7H2O溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為7.0]中使用白金環(huán)接種后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)NBRC13535中提取染色體DNA的操作如下進行：向NBRCMediumNo.802培養(yǎng)基[將10g的多蛋白胨、2g的酵母提取物、1g的MgSO4·7H2O溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為7.0]中使用白金環(huán)接種后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ATCC47054中提取染色體DNA的操作如下進行：向ATCCMediumNo.1065培養(yǎng)基[將10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl溶解在1L蒸餾水中]中使用白金環(huán)接種后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從摩根氏菌(Morganellamorganii)NBRC3848中提取染色體DNA的操作如下進行：向NBRCMediumNo.802培養(yǎng)基[將10g的多蛋白胨、2g的酵母提取物、1g的MgSO4·7H2O溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為7.0]中使用白金環(huán)接種后，在30℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)ATCC9104中提取染色體DNA的操作如下進行：向NBRCMediumNo.805培養(yǎng)基[將1g的酵母提取物、5g的Mannitol,0.7g的K2HPO4、0.1g的KH2PO4、1g的MgSO4·7H2O溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為7.0-7.2]中使用白金環(huán)接種后，在26℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)JCM20190中提取染色體DNA的操作如下進行：向JCMMediumNo.22培養(yǎng)基[將10g的蛋白胨、10g的牛肉提取物,5g的NaCl溶解在1L蒸餾水中后，將pH調(diào)整為7.0-7.2]中使用白金環(huán)接種后，在25℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。從臺灣貪銅菌(Cupriavidustaiwanensis)LMG19424中提取染色體DNA的操作如下進行：向JCMMediumNo.27培養(yǎng)基[將15g的蛋白胨、5g的大豆蛋白胨、5g的氯化鈉溶解在1L蒸餾水中]中使用白金環(huán)接種后，在25℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)增殖期，收集菌體后，使用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit，安瑪西亞公司制造)，按照使用說明書從收集的菌體中回收染色體DNA。4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的克隆通過以下的PCR法對包括編碼4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的ubiC基因的DNA片段進行擴增。當PCR時，使用包含ubiC基因的基因序列克隆ubiC基因，針對序列號1(PantoeaananatisubiC基因)、序列號2(ProvidenciarustigianiiubiC基因)、序列號3(ProvidenciastuartiiubiC基因)、序列號4(ProvidenciasneebiaubiC基因)、序列號5(ProvidenciarettgeriubiC基因)、序列號6(ProvidenciaalcalifaciensubiC基因)、序列號7(ProvidenciaburhodogranarieaubiC基因)、序列號8(EscherichiacoliubiC基因)、序列號9(EscherichiafergusoniiubiC基因)、序列號10(PseudoalteromonaspiscicidaubiC基因)、序列號11(PseudoalteromonashaloplanktisubiC基因)、序列號12(CronobactersakazakiiubiC基因)、序列號13(CitrobacteryoungaeubiC基因)、序列號14(CitrobacterkoseriubiC基因)、序列號15(EnterobacteraerogenesubiC基因)、序列號16(EnterobactercloacaeubiC基因)、序列號17(PseudomonasputidaubiC基因)、序列號18(MorganellamorganiiubiC基因)、序列號19(AzotobactervinelandiiubiC基因)、序列號20(ShewanellaputrefaciensubiC基因)、序列號21(CupriavidustaiwanensisubiC基因)，分別合成下述一對引物來使用。PantoeaananatisubiC基因擴增用引物(a-1)；5’-CTCTCATATGACGCAAGACCCGCT-3’(序列號22)(b-1)；5’-CTCTCATATGTTAACCTTGATCACGATAGAGCG-3’(序列號23)另外，引物(a-1)和(b-1)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。ProvidenciarustigianiiubiC基因擴增用引物(a-2)；5’-CTCTCATATGCATGAAACAATTTTTACCCATCATCC-3’(序列號24)(b-2)；5’-CTCTCATATGGATTATGTTAGATAGTTATCTATATGCAGGTG-3’(序列號25)另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。ProvidenciastuartiiubiC基因擴增用引物(a-3)；5’-CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTATCTCTCAC-3’(序列號26)(b-3)；5’-CTCTCATATGTCCCTCCATTTGTTGTGCTC-3’(序列號27)另外，引物(a-3)和(b-3)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。ProvidenciasneebiaubiC基因擴增用引物(a-4)；5’-CTCTCATATGGATGATACGCTTTTTACCTCTC-3’(序列號28)(b-4)；5’-CTCTCATATGCTTCCCTTCACTTGTCATGC-3’(序列號29)另外，引物(a-4)和(b-4)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。ProvidenciarettgeriubiC基因擴增用引物(a-5)；5’-CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTACTTCTCAG-3’(序列號30)(b-5)；5’-CTCTCATATGTTAACGATATGCAGGTGATTCAGG-3’(序列號31)另外，引物(a-5)和(b-5)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。ProvidenciaalcalifaciensubiC基因擴增用引物(a-6)；5’-CTCTCATATGCATGAAACGATTTTTACCTCTCATC-3’(序列號32)(b-6)；5’-CTCTCATATGGTTATCTATATGCAGGTGATTCAGG-3’(序列號33)另外，引物(a-6)和(b-6)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。ProvidenciaburhodogranarieaubiC基因擴增用引物(a-7)；5’-CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTACCTCTC-3’(序列號34)(b-7)；5’-CTCTCATATGATACTTCCCTCCACTTGTCG-3’(序列號35)另外，引物(a-7)和(b-7)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。EscherichiacoliubiC基因擴增用引物(a-8)；5’-CTCTCATATGTCACACCCCGCGTTAA-3’(序列號36)(b-8)；5’-CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGACGCC-3’(序列號37)另外，引物(a-8)和(b-8)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。EscherichiafergusoniiubiC基因擴增用引物(a-9)；5’-CTCTCATATGCTGATTTTGCAACAACTGGTG-3’(序列號38)(b-9)；5’-CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGATGCAGG-3’(序列號39)另外，引物(a-9)和(b-9)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。PseudoalteromonaspiscicidaubiC基因擴增用引物(a-10)；5’-CTCTCATATGCCTTTGCAATTACCCTTAGAG-3’(序列號40)(b-10)；5’-CTCTCATATGAAGCCTGCCATTTCTGGTGG-3’(序列號41)另外，引物(a-10)和(b-10)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。PseudoalteromonashaloplanktisubiC基因擴增用引物(a-11)；5’-CTCTCATATGATTACTTTCCCTGTTTCATTATCTGC-3’(序列號42)(b-11)；5’-CTCTCATATGTCATGAGTACAAATACGCTCCTG-3’(序列號43)另外，引物(a-11)和(b-11)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。CronobactersakazakiiubiC基因擴增用引物(a-12)；5’-CTCTCATATGTCCCATCCCGCGCTGAG-3’(序列號44)(b-12)；5’-CTCTCATATGTATTCTGCGTCAGGCTCCAC-3’(序列號45)另外，引物(a-12)和(b-12)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。CitrobacteryoungaeubiC基因擴增用引物(a-13)；5’-CTCTCATATGCCACACCCTGCGTTAA-3’(序列號46)(b-13)；5’-CTCTCATATGTCAGTACAACGGCGATGCA-3’(序列號47)另外，引物(a-13)和(b-13)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。CitrobacterkoseriubiC基因擴增用引物(a-14)；5’-CTCTCATATGTCACACCCTGCGTTAAC-3’(序列號48)(b-14)；5’-CTCTCATATGTTAATACAACGGTGATGCGGG-3’(序列號49)另外，引物(a-14)和(b-14)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。Enterobacteraerogenes,ubiC基因擴增用引物(a-15)；5’-CTCTCATATGCCACATCCTGCGCTTAC-3’(序列號50)(b-15)；5’-CTCTCATATGTTAATACAATGGCGATGCAGGC-3’(序列號51)另外，引物(a-15)和(b-15)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。EnterobactercloacaeubiC基因擴增用引物(a-16)；5’-CTCTCATATGTCACACCCTGCGCTAA-3’(序列號52)(b-16)；5’-CTCTCATATGTCAGTACAACGGCGATGC-3’(序列號53)另外，引物(a-16)和(b-16)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。PseudomonasputidaubiC基因擴增用引物(a-17)；5’-CTCTCATATGTCGTACGAATCCCCG-3’(序列號54)(b-17)；5’-CTCTCATATGTCAGCGGTTTTCCTCCTTG-3’(序列號55)另外，引物(a-17)和(b-17)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。MorganellamorganiiubiC基因擴增用引物(a-18)；5’-CTCTCATATGACACAAACAGTGATAACACCC-3’(序列號56)(b-18)；5’-CTCTCATATGCCACGTTATTCTTCTCCGAG-3’(序列號57)另外，引物(a-18)和(b-18)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。AzotobactervinelandiiubiC基因擴增用引物(a-19)；5’-CTCTCATATGACCGCTGCTCCCG-3’(序列號58)(b-19)；5’-CTCTCATATGTTATAGGGTGTCCGGGTC-3(序列號59)另外，引物(a-19)和(b-19)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。Shewanellaputrefaciens,ubiC基因擴增用引物(a-20)；5’-CTCTCATATGAATGTGACTAGCTTAAGCTTCC-3’(序列號60)(b-20)；5’-CTCTCATATGTCACTGGCAAATTGCTCGC-3’(序列號61)另外，引物(a-20)和(b-20)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。CupriavidustaiwanensisubiC基因擴增用引物(a-21)；5’-CTCTCATATGAGCGCGCAGTCCGTG-3’(序列號62)(b-21)；5’-CTCTCATATGCAGTTTCATCTCGTGGTCTC-3’(序列號63)另外，引物(a-21)和(b-21)上附加有NdeI限制性內(nèi)切酶位點。模板DNA使用從PantoeaananatisLMG20103、ProvidenciarustigianiiJCM3953、ProvidenciastuartiiATCC25827、ProvidenciasneebiaJCM16941、ProvidenciarettgeriJCM1675、ProvidenciaalcalifaciensJCM1673、ProvidenciaburhodogranarieaJCM16940、EscherichiacoliMG1655、EscherichiafergusoniiNBRC102419、PseudoalteromonaspiscicidaJCM20779、PseudoalteromonashaloplanktisNBRC102225、CronobactersakazakiiJCM1233、CitrobacteryoungaeATCC29220、CitrobacterkoseriATCCBAA-895、EnterobacteraerogenesNBRC13534、EnterobactercloacaeNBRC13535、PseudomonasputidaATCC47054、MorganellamorganiiNBRC3848、AzotobactervinelandiiATCC9104、ShewanellaputrefaciensJCM20190和CupriavidustaiwanensisLMG1942中提取的染色體DNA。*)菌株購入機關(guān)的簡稱如下所示。<機關(guān)簡稱>ATCC：AmericanTypeCultureCollectionJCM：JapanCollectionofMicroorganismsLMG：BelgianCo-ordinatedCollectionsofMicro-organisms/LaboratoryforMicrobiologyoftheFacultyofSciencesofGhentUniversity(BCCM/LMG)NBRC：NITEBiologicalResourceCenter實際的PCR使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造)，使用PrimeSTARGXLDNAPolymerase(寶生物工程株式會社制造)作為反應(yīng)試劑在下述的條件下進行。反應(yīng)液：將以上混合，將該50μl的反應(yīng)液加入PCR。*)擴增PantoeaananatisubiC基因時以引物(a-1)與(b-1)的組合，擴增ProvidenciarustigianiiubiC基因時以引物(a-2)與(b-2)的組合，擴增ProvidenciastuartiiubiC基因時以引物(a-3)與(b-3)的組合，擴增ProvidenciasneebiaubiC基因時以引物(a-4)與(b-4)的組合，擴增ProvidenciarettgeriubiC基因時以引物(a-5)與(b-5)的組合，擴增ProvidenciaalcalifaciensubiC基因時以引物(a-6)與(b-6)的組合，擴增ProvidenciaburhodogranarieaubiC基因時以引物(a-7)與(b-7)的組合，擴增EscherichiacoliubiC基因時以引物(a-8)與(b-8)的組合，擴增EscherichiafergusoniiubiC基因時以引物(a-9)與(b-9)的組合，擴增PseudoalteromonaspiscicidaubiC基因時以引物(a-10)與(b-10)的組合，擴增PseudoalteromonashaloplanktisubiC基因時以引物(a-11)與(b-11)的組合，擴增CronobactersakazakiiubiC基因時以引物(a-12)與(b-12)的組合，擴增CitrobacteryoungaeubiC基因時以引物(a-13)與(b-13)的組合，擴增CitrobacterkoseriubiC基因時以引物(a-14)與(b-14)的組合，擴增EnterobacteraerogenesubiC基因時以引物(a-15)與(b-15)的組合，擴增EnterobactercloacaeubiC基因時以引物(a-16)與(b-16)的組合，擴增PseudomonasputidaubiC基因時以引物(a-17)與(b-17)的組合，擴增MorganellamorganiiubiC基因時以引物(a-18)與(b-18)的組合，擴增AzotobactervinelandiiubiC基因時以引物(a-19)與(b-19)的組合，擴增ShewanellaputrefaciensubiC基因時以引物(a-20)與(b-20)的組合，擴增CupriavidustaiwanensisubiC基因時以引物(a-21)與(b-21)的組合進行。PCR循環(huán)：將以上過程作為一個循環(huán)，進行30個循環(huán)。利用0.8％的瓊脂糖凝膠對10μl上述生成的反應(yīng)液進行電泳，在Pantoeaananatis株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Providenciarustigianii株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Providenciastuartii株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Providenciasneebia株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Providenciarettgeri株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Providenciaalcalifaciens株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Providenciaburhodogranariea株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Escherichiacoli株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Escherichiafergusonii株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.7-kb的DNA片段，在Pseudoalteromonaspiscicida株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.6-kb的DNA片段，在Pseudoalteromonashaloplanktis株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Cronobactersakazakii株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.6-kb的DNA片段，在Citrobacteryoungae株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Citrobacterkoseri株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Enterobacteraerogenes株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Enterobactercloacae株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Pseudomonasputida株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.6-kb的DNA片段，在Morganellamorganii株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.5-kb的DNA片段，在Azotobactervinelandii株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.6-kb的DNA片段，在Shewanellaputrefaciens株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.6-kb的DNA片段，在Cupriavidustaiwanensis株來源ubiC基因的情況下能夠檢測到約0.7-kb的DNA片段。各DNA片段通過NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物工程株式會社制造)提純。(3)4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)的表達質(zhì)粒的構(gòu)建將通過上述項(2)所示的PCR擴增的10μl包括Pantoeaananatis株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Providenciarustigianii株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Providenciastuartii株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Providenciasneebia株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Providenciarettgeri株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Providenciaalcalifaciens株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Providenciaburhodogranariea株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Escherichiacoli株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Escherichiafergusonii株來源ubiC基因的約0.7-kb的DNA片段、包括Pseudoalteromonaspiscicida株來源ubiC基因的約0.6-kb的DNA片段、包括Pseudoalteromonashaloplanktis株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Cronobactersakazakii株來源ubiC基因的約0.6-kb的DNA片段、包括Citrobacteryoungae株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Citrobacterkoseri株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Enterobacteraerogenes株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Enterobactercloacae株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Pseudomonasputida株來源ubiC基因的約0.6-kb的DNA片段、包括Morganellamorganii株來源ubiC基因的約0.5-kb的DNA片段、包括Azotobactervinelandii株來源ubiC基因的約0.6-kb的DNA片段、包括Shewanellaputrefaciens株來源ubiC基因的約0.6-kb的DNA片段、包括Cupriavidustaiwanensis株來源ubiC基因的約0.7-kb的DNA片段和2μl的含有PgapA啟動子的克隆載體pCRB209[國際公開WO2012/033112]分別由限制性內(nèi)切酶NdeI切割，通過在70℃處理10分鐘而使限制性內(nèi)切酶失活后，將兩者混合，對其中添加1μl的T4DNA連接酶10×緩沖液、1unit的T4DNA連接酶(寶生物工程株式會社制造)的各成分，利用滅菌蒸餾水使其為10μl，在15℃使其反應(yīng)并鍵合。將其作為連接A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液、Q液、R液、S液、T液和U液。以得到的21種連接A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液、Q液、R液、S液、T液和U液分別利用氯化鈣法〔JournalofMolecularBiology,53,159(1970)〕轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌HST02，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉和1.5％瓊脂]上。通過常規(guī)方法對各個培養(yǎng)基上的增殖株進行液體培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中提取質(zhì)粒DNA，利用限制性內(nèi)切酶分別對該質(zhì)粒進行切割，確認插入片段。其結(jié)果是除了確認到質(zhì)粒pCRB209約5.1-kb的DNA片段以外，在Pantoeaananatis株來源ubiC基因(連接A液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Providenciarustigianii株來源ubiC基因(連接B液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Providenciastuartii株來源ubiC基因(連接C液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Providenciasneebia株來源ubiC基因(連接D液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Providenciarettgeri株來源ubiC基因(連接E液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Providenciaalcalifaciens株來源ubiC基因(連接F液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Providenciaburhodogranariea株來源ubiC基因(連接G液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Escherichiacoli株來源ubiC基因(連接H液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Escherichiafergusonii株來源ubiC基因(連接I液)的情況下，還確認到長度約0.7-kb的插入片段，在Pseudoalteromonaspiscicida株來源ubiC基因(連接J液)的情況下，還確認到長度約0.6-kb的插入片段，在Pseudoalteromonashaloplanktis株來源ubiC基因(連接K液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Cronobactersakazakii株來源ubiC基因(連接L液)的情況下，還確認到長度約0.6-kb的插入片段，在Citrobacteryoungae株來源ubiC基因(連接M液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Citrobacterkoseri株來源ubiC基因(連接N液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Enterobacteraerogenes株來源ubiC基因(連接O液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Enterobactercloacae株來源ubiC基因(連接P液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Pseudomonasputida株來源ubiC基因(連接Q液)的情況下，還確認到長度約0.6-kb的插入片段，在Morganellamorganii株來源ubiC基因(連接R液)的情況下，還確認到長度約0.5-kb的插入片段，在Azotobactervinelandii株來源ubiC基因(連接S液)的情況下，還確認到長度約0.6-kb的插入片段，在Shewanellaputrefaciens株來源ubiC基因(連接T液)的情況下，還確認到長度約0.6-kb的插入片段，在Cupriavidustaiwanensis株來源ubiC基因(連接U液)的情況下，還確認到長度約0.7-kb的插入片段。將包含Pantoeaananatis株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA1，將包含Providenciarustigianii株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA2，將包含Providenciastuartii株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA3，將包含Providenciasneebia株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA4，將包含Providenciarettgeri株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA5，將包含Providenciaalcalifaciens株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA6，將包含Providenciaburhodogranariea株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA7，將包含Escherichiacoli株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA8，將包含Escherichiafergusonii株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA9，將包含Pseudoalteromonaspiscicida株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA10，將包含Pseudoalteromonashaloplanktis株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA11，將包含Cronobactersakazakii株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA12，將包含Citrobacteryoungae株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA13，將包含Citrobacterkoseri株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA14，將包含Enterobacteraerogenes株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA15，將包含Enterobactercloacae株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA16，將包含Pseudomonasputida株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA17，將包含Morganellamorganii株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA18，將包含Azotobactervinelandii株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA19，將包含Shewanellaputrefaciens株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA20，將包含Cupriavidustaiwanensis株來源ubiC基因的質(zhì)粒命名為pHBA21(表1)。[表1]4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因表達質(zhì)粒與基因的來源質(zhì)粒名4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因的來源pHBA1PantoeaananatispHBA2ProvidenciarustigianiipHBA3ProvidenciastuartiipHBA4ProvidenciasneebiapHBA5ProvidenciarettgeripHBA6ProvidenciaalcalifacienspHBA7ProvidenciaburhodogranarieapHBA8EscherichiacolipHBA9EscherichiafergusoniipHBA10PseudoalteromonaspiscicidapHBA11PseudoalteromonashaloplanktispHBA12CronobactersakazakiipHBA13CitrobacteryoungaepHBA14CitrobacterkoseripHBA15EnterobacteraerogenespHBA16EnterobactercloacaepHBA17PseudomonasputidapHBA18MorganellamorganiipHBA19AzotobactervinelandiipHBA20ShewanellaputrefacienspHBA21Cupriavidustaiwanensis(4)4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因(分支酸-丙酮酸裂解酶基因)導(dǎo)入株的構(gòu)建使用上述的質(zhì)粒pHBA1～pHBA21，利用電脈沖法[Agric.Biol.Chem.、Vol.54、443-447(1990)和Res.Microbiol.、Vol.144、181-185(1993)]，轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌R，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A瓊脂培養(yǎng)基上。通過常規(guī)方法對該培養(yǎng)基上的增殖株進行液體培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中提取質(zhì)粒DNA，利用限制性內(nèi)切酶分別對該質(zhì)粒進行切割，確認插入質(zhì)粒。其結(jié)果是確認了上述制作的質(zhì)粒pHBA1～pHBA21的導(dǎo)入。將得到的菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)HBA-1～HBA-21。此外，本菌株的基因重組的概要在表2中匯總示出。谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)HBA-2在日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8(郵政編碼292-0818)的獨立行政法人產(chǎn)品評價技術(shù)基礎(chǔ)機構(gòu)專利微生物保藏中心保藏(國內(nèi)保藏的保藏日：2014年3月27日、基于布達佩斯條約的國際保藏的保藏日：2015年2月23日、保藏編號：NITEBP-01838)。該菌株在37CFR1.808規(guī)定的條件下可被公眾利用。[表2]4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因?qū)胫昃昝麑?dǎo)入質(zhì)粒名4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因的來源HBA-1pHBA1PantoeaananatisHBA-2pHBA2ProvidenciarustigianiiHBA-3pHBA3ProvidenciastuartiiHBA-4pHBA4ProvidenciasneebiaHBA-5pHBA5ProvidenciarettgeriHBA-6pHBA6ProvidenciaalcalifaciensHBA-7pHBA7ProvidenciaburhodogranarieaHBA-8pHBA8EscherichiacoliHBA-9pHBA9EscherichiafergusoniiHBA-10pHBA10PseudoalteromonaspiscicidaHBA-11pHBA11PseudoalteromonashaloplanktisHBA-12pHBA12CronobactersakazakiiHBA-13pHBA13CitrobacteryoungaeHBA-14pHBA14CitrobacterkoseriHBA-15pHBA15EnterobacteraerogenesHBA-16pHBA16EnterobactercloacaeHBA-17pHBA17PseudomonasputidaHBA-18pHBA18MorganellamorganiiHBA-19pHBA19AzotobactervinelandiiHBA-20pHBA20ShewanellaputrefaciensHBA-21pHBA21Cupriavidustaiwanensis實施例2谷氨酸棒狀桿菌4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因?qū)胫陙碓吹姆种?丙酮酸裂解酶活性比較將實施例1中制作的谷氨酸棒狀桿菌/4-HBA生產(chǎn)基因?qū)胫?參照表1)，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A瓊脂培養(yǎng)基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的維生素測定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖、15g的瓊脂懸濁于1L蒸餾水中]上，在33℃下于暗處靜置15小時。將一白金環(huán)的上述培養(yǎng)皿中增殖的谷氨酸棒狀桿菌/4-HBA生產(chǎn)基因?qū)胫辏臃N到裝有10ml的含有50μg/ml卡那霉素的A瓊脂培養(yǎng)基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的維生素測定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖溶解于1L蒸餾水中]的試管中，在33℃下在好氧條件下進行15小時的振蕩培養(yǎng)。將這樣培養(yǎng)增殖的各個菌體通過離心分離(4℃、8000rpm、10分鐘)進行回收。利用超聲波處理破碎菌體細胞后，將通過離心分離(4℃、15000rpm、20分鐘)得到的細胞破碎上清液用作粗酶液，通過以下的方法測定分支酸-丙酮酸裂解酶活性?；旌洗置敢?、50mMTris-HCl(pH7.5)、0.5mM分支酸鋇鹽、0.2mMNADH、0.2MNaCl、5Unit乳酸脫氫酶，在33℃下進行反應(yīng)，追蹤來源于NADH的340nm的吸光度減少，解析反應(yīng)初速度。根據(jù)反應(yīng)初速度與蛋白濃度計算出比活力(將每分鐘產(chǎn)生1微摩爾的4-HBA的酶量定義為1unit)。(此外，另行確認了將反應(yīng)液用過濾器過濾后，生成的4-HBA通過HPLC直接檢測出4-HBA的峰值(CosmosilC18ARII(Nacalaitesque)、層析20％甲醇、0.07％過氯酸)，利用兩種測定方法的定量性并無區(qū)別。)其結(jié)果是，關(guān)于HBA1～HBA21菌株，檢測出了表3所示的目標分支酸-丙酮酸裂解酶活性。示出特別高的活性的是Pantoeaananatis來源ubiC基因和Cronobactersakazakii來源ubiC基因。除此以外，關(guān)于Providenciarustigianii、Providenciastuartii、Providenciasneebia、Providenciarettgeri、Providenciaalcalifaciens、Providenciaburhodogranariea、Escherichiacoli、Escherichiafergusonii、Pseudoalteromonaspiscicida、Pseudoalteromonashaloplanktis、Cronobactersakazakii、Citrobacteryoungae、Citrobacterkoseri、Enterobacteraerogenes、Enterobactercloacae、Pseudomonasputida、Morganellamorganii、Azotobactervinelandii、Shewanellaputrefaciens、Cupriavidustaiwanensis來源的4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因，也檢測出分支酸-丙酮酸裂解酶活性。這里，對谷氨酸棒狀桿菌野生株(僅具有空載體)進行了同樣的實驗，結(jié)果是未確認到4-HBA生成。[表3]分支酸-丙酮酸裂解酶活性的比較實施例3對于谷氨酸棒狀桿菌4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因?qū)胫陙碓吹姆种?丙酮酸裂解酶活性的產(chǎn)物抑制的IC50的比較使用在實施例2中制備的、HBA-1～HBA-21株來源的細胞破碎上清液，研究了由作為產(chǎn)物的4-HBA造成的抑制。其結(jié)果是屬于Providencia屬的、Providenciarustigianii、Providenciastuartii、Providenciasneebia、Providenciarettgeri、Providenciaalcalifaciens、Providenciaburhodogranariea來源的分支酸-丙酮酸裂解酶與其他屬來源的相比較，對于4-HBA抑制性特別低(表4)。[表4]對于谷氨酸棒狀桿菌4-HBA生產(chǎn)基因?qū)胫甑姆种?丙酮酸裂解酶活性的產(chǎn)物抑制的IC50的比較實施例4谷氨酸棒狀桿菌4-羥基苯甲酸生產(chǎn)基因?qū)胫甑膩碜云咸烟堑?-羥基苯甲酸生成實驗將實施例1中制作的谷氨酸棒狀桿菌/4-HBA生產(chǎn)基因?qū)胫?參照表1)，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A瓊脂培養(yǎng)基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的維生素測定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖、15g的瓊脂懸濁于1L蒸餾水中]上，在33℃下于暗處靜置15小時。將一白金環(huán)的上述培養(yǎng)皿中增殖的谷氨酸棒狀桿菌/4-HBA生產(chǎn)基因?qū)胫辏臃N到裝有10ml進而裝有2％碳酸鈣的含有卡那霉素50μg/ml的A瓊脂培養(yǎng)基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的維生素測定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖溶解于1L蒸餾水中]的試管中，在33℃下在好氧條件下進行24小時的振蕩培養(yǎng)。將上述條件下增殖得到的培養(yǎng)液進行離心分離(4℃、15000rpm、10分鐘)，使用得到的上清液通過HPLC對4-HBA進行定量。其結(jié)果是谷氨酸棒狀桿菌HBA-1、HBA-2、HBA-3、HBA-8和HBA-12菌株生成表5所示的目標4-HBA。其中，Providenciarustigianii、Providenciastuartii或Cronobactersakazakii來源的4-HBA生成酶基因?qū)胫甑?-HBA生成能力比E.coli或Pantoeaananatis來源的4-HBA生成酶基因?qū)胫旮咔腋鼉?yōu)異。4-HBA生成能力最優(yōu)異的是Providenciarustigianii來源的4-HBA生成酶基因?qū)胫?。另外，對谷氨酸棒狀桿菌野生株(僅具有空載體的對照)進行同樣的實驗時，未確認到4-HBA生成。[表5]谷氨酸棒狀桿菌4-HBA生產(chǎn)基因?qū)胫甑膩碜云咸烟堑?-HBA生成實驗實施例5作為4-HBA生產(chǎn)宿主的合格性試驗(4-HBA對好氧增殖的影響)關(guān)于谷氨酸棒狀桿菌、大腸埃希氏菌、惡臭假單細胞和類球紅細菌，進行了好氧培養(yǎng)中的4-HBA的增殖抑制實驗。此外，在本試驗中使用的惡臭假單細胞S12作為溶劑抗性菌而被報告，迄今為止報告了酪氨酸途徑下的4-HBA的生成。將谷氨酸棒狀桿菌涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A瓊脂培養(yǎng)基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的維生素測定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖、15g的瓊脂懸濁于1L蒸餾水中]上，在33℃下于暗處靜置15小時。將一白金環(huán)的上述培養(yǎng)皿中增殖的谷氨酸棒狀桿菌R株接種到裝有10ml的含有50μg/ml卡那霉素的A瓊脂培養(yǎng)基[2g的(NH2)2CO、7g的(NH4)2SO4、0.5g的KH2PO4、0.5g的K2HPO4、0.5g的MgSO4·7H2O、1ml的0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O、1ml的0.02％(w/v)生物素溶液、2ml的0.01％(w/v)硫胺溶液、2g的酵母提取物、7g的維生素測定酪蛋白氨基酸、40g的葡萄糖溶解于1L蒸餾水中]的試管中，在33℃下在好氧條件下進行15小時的振蕩培養(yǎng)。將在上述條件下增殖的谷氨酸棒狀桿菌R株以初始菌體濃度OD610＝0.05來接種到10ml的A液體培養(yǎng)基中，同時以4-HBA變?yōu)樽罱K濃度0、100、200、250、300mM來進行添加，在33℃下在好氧條件下進行振蕩培養(yǎng)。菌體的增殖通過測定OD610的吸光度來進行。將大腸埃希氏菌JM109涂布到LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉和1.5％瓊脂]上，在37℃下于暗處靜置15小時。將在上述培養(yǎng)皿中增殖的大腸埃希氏菌JM109涂布到LB液體培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％氯化鈉]上，在37℃下在好氧條件下進行13小時的振蕩培養(yǎng)。將在上述條件下增殖的大腸埃希氏菌JM109以初始菌體濃度OD＝0.05來接種到100ml的LB液體培養(yǎng)基中，同時以4-HBA變?yōu)樽罱K濃度0、100、200mM來進行添加，在37℃下在好氧條件下進行振蕩培養(yǎng)。菌體的增殖通過測定OD610的吸光度來進行。將惡臭假單細胞S12涂布到LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉和1.5％瓊脂]上，在30℃下于暗處靜置15小時。將在上述培養(yǎng)皿中增殖的惡臭假單細胞S12涂布到LB液體培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％氯化鈉]上，在30℃下在需氧條件下進行13小時的振蕩培養(yǎng)。將在上述條件下增殖的惡臭假單細胞S12以初始菌體濃度OD610＝0.05來接種到100ml的LB液體培養(yǎng)基中，同時以4-HBA變?yōu)樽罱K濃度0、100、200、300mM來進行添加，在30℃下在好氧條件下進行振蕩培養(yǎng)。菌體的增殖通過測定OD610的吸光度來進行。將類球紅細菌涂布到LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉和1.5％瓊脂]上，在30℃下于暗處靜置20小時。將在上述培養(yǎng)皿中增殖的類球紅細菌涂布到LB液體培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％氯化鈉]上，在30℃下在好氧條件下進行13小時的振蕩培養(yǎng)。將在上述條件下增殖的類球紅細菌以初始菌體濃度OD＝0.1來接種到100ml的LB液體培養(yǎng)基中，同時以4-HBA變?yōu)樽罱K濃度0、100、200mM來進行添加，在30℃下在好氧條件下進行振蕩培養(yǎng)。菌體的增殖通過測定OD610的吸光度來進行。圖1示出向培養(yǎng)基中添加4-HBA對好氧增殖的影響的解析結(jié)果。大腸埃希氏菌在100mM的4-HBA存在下顯著受到增殖抑制，在200mM的4-HBA下增殖被完全抑制。惡臭假單細胞S12(作為溶劑抗性被報告的菌株)在200mM4-HBA下增殖被完全抑制。類球紅細菌在100mM的4-HBA下增殖被完全抑制。與此相對，谷氨酸棒狀桿菌在大腸埃希氏菌、惡臭假單細胞S12和類球紅細菌的增殖被完全抑制的200mM的4-HBA存在下也能夠增殖。進而，谷氨酸棒狀桿菌在250mM的4-HBA存在下也能夠增殖，雖然這里并未示出，但是在培養(yǎng)開始后28小時，增殖至與200mM的4-HBA存在下的增殖同等(野生株OD610的約65％)的增殖。這樣，谷氨酸棒狀桿菌與大腸埃希氏菌、惡臭假單細胞S12和類球紅細菌相比較，示出對4-HBA具有較高的抗性，作為4-HBA生產(chǎn)的宿主具有較高的適合性。根據(jù)本發(fā)明方法，能夠使用微生物以實用的效率由葡萄糖等制造4-HBA。當前第1頁1 2 3