利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)從丹參地上莖葉中高效制備丹參酚酸類成分的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種丹參地上莖葉資源化利用方法，具體涉及一 種從一定生長(zhǎng)期的丹參地上莖葉經(jīng)光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化后提取制備丹參酚酸類成分的方法及其 制備得到丹參酚酸類成分和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 丹參（Salvia miltiorrhizaBge.)為唇形科鼠尾草屬植物。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》， 列為上品。其根及根莖入藥稱為丹參，其味苦，性微寒，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、 涼血消癰的功效?，F(xiàn)代臨床多用于治療心腦血管疾病、心絞痛等。
[0003] 我國(guó)藥用丹參資源豐富，包括野生丹參和栽培丹參，每年年產(chǎn)量達(dá)5000?7000t。 但除根及根莖藥用外，其地上莖葉、花等資源，并未得到產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用。目前雖有開展相 關(guān)研宄和開發(fā)的報(bào)道，但并未真正有效利用地上部分資源，因此丹參資源的綜合高效利用 逐漸引起廣大科研工作者的關(guān)注和重視，
[0004] 現(xiàn)代研宄表明丹參中丹參酚酸類成分為其主要的活性成分，具有強(qiáng)心、抗血栓形 成、改善微循環(huán)、促進(jìn)組織的修復(fù)與再生、抑制過度增生、保肝、抗菌、降血脂等多種生物活 性，廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療。
[0005] 光合細(xì)菌（Photosynthetic bacteria，簡(jiǎn)稱PSB)是一類以光作為能源進(jìn)行光合 作用而不產(chǎn)氧的特殊生理類群的總稱，其種類繁多，生長(zhǎng)繁殖快速，酶系豐富。沼澤紅假單 胞菌（Rhodopseudomonas palustris, Rps. Palustris)屬于紫色非硫桿菌，它是一種適應(yīng)能 力很強(qiáng)的光合細(xì)菌，被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥等領(lǐng)域。該屬細(xì)菌一般為光能異養(yǎng)型， 能利用有機(jī)酸、氨基酸及糖類作為光合作用的氫供體或合成細(xì)胞的碳源。PBS的生物轉(zhuǎn)化反 應(yīng)條件溫，處理法的流程工藝簡(jiǎn)單，處理成本低，能穩(wěn)定運(yùn)行，且不產(chǎn)生二次污染，因而有望 成為生物法處理植物次生代謝產(chǎn)物的首選菌種之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，是基于資源價(jià)值最大化原理，提供一種從 一定生長(zhǎng)期的丹參地上莖葉中制備丹參酚酸類成分的方法，其工藝新穎，流程簡(jiǎn)單，并可實(shí) 現(xiàn)丹參地上莖葉的資源化利用，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和生態(tài)效益。
[0007] 技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0008] -種丹參酚酸類成分，它由下列方法制備得到：
[0009] (1)取丹參地上莖葉作為原料，采用水或醇溶液提取，得到水或醇提取液；
[0010] (2)取步驟⑴的提取液在無菌條件下，接種提取液1/10?1/20體積的光合細(xì)菌 菌液，在400-3200LUX光照厭氧條件下培養(yǎng)3?20天，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液，將光 合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液在l〇〇〇-l〇〇〇〇r/min離心；
[0011] (3)取步驟（2)離心上清液，上大孔吸附樹脂柱進(jìn)行吸附，先用水洗，然后采用不 同濃度乙醇進(jìn)行洗脫分離；
[0012] (4)收集步驟⑶體積濃度為20?70 %乙醇洗脫液，減壓濃縮，噴霧干燥，得到總 丹參酚酸類成分。
[0013] 作為優(yōu)選方案，以上所述的丹參酚酸類成分，所述的光合細(xì)菌優(yōu)選如下：紅 螺菌屬Rhodospirillium為深紅紅螺菌（Rhodospirillium rubrum);紅假單胞菌屬 Rhodopseudomonas為沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonaspalustris)、綠色紅假單胞菌 (Rhodopseudomonas viridis)、綠硫紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、 海洋紅假單胞菌（Rhodopseudomonas marina);紅細(xì)菌屬Rodobacter為球形紅細(xì)菌 (Rhodobacter sphaeroides)、莢膜紅細(xì)菌（Rhodobacter capsulatus) 〇
[0014] 本發(fā)明提供到從丹參地上莖葉中提取制備丹參酚酸類成分的方法，其包括如下步 驟：
[0015] (1)取丹參地上莖葉作為原料，采用水或醇溶液提取，得到水或醇提取液；
[0016] (2)取步驟⑴的提取液在無菌條件下，接種提取液1/10?1/20體積的光合細(xì)菌 菌液，在400-3200LUX光照厭氧條件下培養(yǎng)3?20天，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液，將光 合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液在l〇〇〇-l〇〇〇〇r/min離心；
[0017] (3)取步驟（2)的上清液，上大孔吸附樹脂柱進(jìn)行吸附，先用水洗，然后采用不同 濃度乙醇進(jìn)行洗脫分離；
[0018] (4)收集體積濃度為20?70%乙醇洗脫液，減壓濃縮，噴霧干燥，得到總丹參酚酸 類成分。
[0019] 作為優(yōu)選方案，以上所述的從丹參地上莖葉提取制備丹參酚酸類成分 的方法，所述的光合細(xì)菌優(yōu)選如下：紅螺菌屬Rhodospirillium為深紅紅螺菌 (Rhodospirillium rubrum);紅假單胞菌屬Rhodopseudomonas為沼澤紅假單胞菌 (Rhodopseudomonaspalustris)、綠色紅假單胞菌(Rhodopseudomonas viridis)、綠硫 紅假單胞菌（Rhodopseudomonas sulfoviridis)、海洋紅假單胞菌（Rhodopseudomonas marina);紅細(xì)菌屬Rodobacter為球形紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides)、莢膜紅細(xì)菌 (Rhodobacter capsulatus)〇
[0020] 作為優(yōu)選方案，以上所述的從丹參地上莖葉中提取制備丹參酚酸類成分的方法， 所采用的丹參地上莖葉為6月下旬?7月下旬生長(zhǎng)期內(nèi)的地上莖葉部分。
[0021] 作為優(yōu)選方案，以上所述的從丹參地上莖葉中提取制備丹參酚酸類成分的方法， 步驟（2)所述的光合細(xì)菌菌液制備方法為：在經(jīng)過滅菌的光合細(xì)菌培養(yǎng)基中接入1/10份數(shù) 光合細(xì)菌菌種，在光照、厭氧條件下，培養(yǎng)3-5天，作為光合細(xì)菌培養(yǎng)液。
[0022] 作為優(yōu)選方案，以上所述的從丹參地上莖葉提取制備丹參酚酸類成分的方法， 取丹參地上莖葉烘干后，打粉，過40目篩，取50?150g丹參莖葉的干燥粉末，分別置于 1500ml的錐形瓶中，精密加入500?IOOOml的純水，精密稱定，浸泡10?16h后在30? 50°C、100?200KHz下超聲30?60min，稱量補(bǔ)足失重，過濾，重復(fù)提取三次，合并濾液，得 提取液，將溶液濃縮至干燥粉末。
[0023] 作為優(yōu)選方案，以上所述的從丹參地上莖葉提取制備丹參酚酸類成分的方法，取 一定的干燥粉末，用水溶解至一定的體積，過〇. 22 μ m膜，定容至一定的含量，加入不同體 積的水，無菌條件下，接種1/20體積的球形紅細(xì)菌或莢膜紅細(xì)菌菌液后培養(yǎng)3?5d，得球形 紅細(xì)菌或莢膜紅細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液。
[0024] 作為優(yōu)選方案，以上所述的從丹參地上莖葉提取制備丹參酚酸類成分的方法，所 述的大孔吸附樹脂型號(hào)為DlOl或AB-8。
[0025] 作為優(yōu)選方案，以上所述的從丹參地上莖葉提取制備丹參酚酸類成分的方法，步 驟（3)所述乙醇洗脫的體積濃度為10?95%。
[0026] 作為優(yōu)選方案，以上所述的從丹參地上莖葉提取制備丹參酚酸類成分的方法，步 驟（4)中收集體積濃度為20 %?70 %到乙醇洗脫液。
[0027] 本發(fā)明所述的從丹參地上莖葉提取制備丹參酚酸類成分的方法，步驟（1)所使用 的丹參地上莖葉原料為一定生長(zhǎng)期的丹參地上部分，也可以是采挖丹參前割取的廢棄丹參 地上植株。
[0028] 本發(fā)明制備得到的丹參酚酸類成分，高效液相質(zhì)量分析結(jié)果表明，總丹參酚酸純 度為80%以上，可用于制備治療心腦血管疾病藥物或功能保健產(chǎn)品。
[0029] 本發(fā)明提供的從丹參地上莖葉中制備丹參酮類成分的方法，通過大量實(shí)驗(yàn)篩選， 采用優(yōu)選的光合細(xì)菌生物處理丹參地上莖葉，可以使所含丹參酚酸類有效成分大幅提高， 再進(jìn)行提取，提取液經(jīng)大孔吸附樹脂柱，分離純化，乙醇洗脫，可以高效獲得丹參酚酸類成 分，取得了非常好的技術(shù)效果。
[0030] 上述的從丹參地上莖葉中制備丹參酚酸類成分的方法中，所述大孔吸附樹脂洗脫 溶劑為10%?95%乙醇溶液，收集20%?70%乙醇洗脫液。本發(fā)明根據(jù)有機(jī)溶劑萃取物 的成分性質(zhì)，采用大量實(shí)驗(yàn)篩選得到丹參酚酸類成分的最佳洗脫溶液，先采用濃度水洗脫 除雜質(zhì)，然后再收集20%?70%乙醇洗脫液，可以得到高純度的丹參酚酸類成分。
[0031] 上述的從丹參地上莖葉中制備丹參酚酸類成分的方法中，所述噴霧干燥條件為： 進(jìn)風(fēng)溫度為40?80 °C，出風(fēng)溫度為80?90 °C，物料溫度為30?50 °C，霧化壓力為0. 05? 0. 2兆帕，噴霧速