于無錫市亞盛化工有限公司；DPPH(1，1-di-pheny l-2-picryhydrazyl)購自于 ALDRICH Chemistry，ABTS(2, 2' -azinobis-3-ethyl-benzoth iazolin-6-sulfonic acid)，三P比啶三嘆（2, 4, 6-tripyridyl-s-triaz_ine，TPTZ)購自于 sigma公司。
[0062] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0063] 2. IDPPH清除率的測定
[0064] 在96孔板中加入實(shí)施例1至6制備得到的的總丹參酚酸樣品，稀釋終濃度分別為 50 μ g · ml_l、100 μ g · ml_l、200 μ g · ml_l、400 μ g · ml-1。加入溶于無水乙醇終濃度為 0. 05mg .IiiI-IDPPH溶液，避光反應(yīng)30min后在517nm波長下測定其吸光度為A0。同時(shí)作空 白對照，在517nm波長下測定其吸光度為Al。為扣除藥物本底顏色對實(shí)驗(yàn)的影響，在加入終 濃度分別為50 μ g · πιΓ1、100 μ g · ml'200 μ g · ml'400 μ g · πιΓ1的總丹參酷酸樣品后加 入無水乙醇在517nm波長下測定其吸光度A2。按照下列公式進(jìn)行計(jì)算各樣品對DPPH清除 率（％)41-(六0-六2)/^1\100，計(jì)算1〇50。
[0065] 2. 2ABTS清除率的測定
[0066] 用去離子水將ABTS和K2S2O8(過二硫酸鉀）分別溶解并混合，使其終濃度分別為 7mmol · Γ1和2mmol · L 在室溫、避光條件下靜置12?16h，得到ABTS儲液。測定時(shí)用 PBS(pH7.4)稀釋到734nm處吸光度為0. 7±0.02, -20°C保存?zhèn)溆?。反?yīng)在96孔板中進(jìn) 行，200 yL反應(yīng)液中含有100 yL不同濃度的實(shí)施例1至5制備得到的的總丹參酚酸樣品 (12. 5、25、50和IOOygil-I)或參比溶液、IOOyL的ABTS反應(yīng)溶液。振蕩搖勻，于室溫 下避光靜置6min，測定溶液在734nm處的吸光值。AO為溶劑與ABTS反應(yīng)溶液作用后的吸 光度；Al為受試樣品與ABTS反應(yīng)液作用后的吸光度；A2為受試樣品中未加 ABTS反應(yīng)溶液 時(shí)的吸光度。計(jì)算六8了5自由基清除率（％)41-仏042)/^1\100，計(jì)算扣50。
[0067] 2. 3FRAP 法測定
[0068] 用去離子水分別配置2mM的FeC13和TPTZ (三吡啶三啞嗪）溶液，于實(shí)驗(yàn)前將兩 者按1:1體積比混合，混合液加入96孔板中，每孔100 μ L，然后加入不同濃度實(shí)施例1至5 制備得到的的總丹參酚酸樣品（25、50、100和200 μ g · πιΓ1)，每孔100 μ L，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，振 蕩均勻，在室溫下靜置30min，于593nm處測吸光度，OD值越高，表明還原Fe3+的能力越強(qiáng)。 樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO 4的物質(zhì)的量（mmol)表示，其標(biāo)準(zhǔn)方程為y =14.65x-0. 0081，R2 = 0.992。
[0069] 2· 40H ·清除率的測定
[0070] 在96孔板中加入終濃度為2. 25mol · L-1的FeS04 · 7H20的溶液和終濃度 為2. 25mol · L-I的水楊酸各50 μ 1，加入終始濃度分別為50 μ g · ml'100 μ g · πιΓ1、 200 μ g · ml'400 μ g · ml-1實(shí)施例1至5制備得到的的總丹參酷酸樣品50 μ L后，加入終 濃度為2. 2mmol · 1^!1202, 37°0水浴鍋加熱30min在536nm波長下測定其吸光度為Α0。同 時(shí)作空白對照，在536nm波長下測定其吸光度為Al。為扣除藥物本底顏色對實(shí)驗(yàn)的影響， 在同法加入FeSO 4 · 7H20、水楊酸和各樣品各50 μ L后，加入50 μ L蒸餾水，37°C水浴鍋加熱 30min后在536nm波長下測定其吸光度為A2。按照下列公式進(jìn)行計(jì)算各樣品對OH ·清除率 (%) 41-(六0-六2)/^1\100，計(jì)算1〇50。
[0071] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0072] 3. IDPPH清除率的測定結(jié)果
[0073] 在DPPH自由基清除法中，DPPH可在無水乙醇中形成一種穩(wěn)定的自由基，呈紫紅 色，且具有典型的特征吸收峰。當(dāng)反應(yīng)體系中存在抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑提供氫原子和電子 給DPPH自由基，生成無色產(chǎn)物，導(dǎo)致溶液的特征吸收峰下降，吸光值變小。在此反應(yīng)中，體 系顏色變得越淺表明所檢測物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)。結(jié)果表明，本發(fā)明實(shí)施例1至6制備 得到的總丹參酚酸樣品1-6(IC 5(I〈0. 2mg · πιΓ1)具有強(qiáng)的清除DPPH的作用，結(jié)果見1。
[0074] 表1樣品對DPPH自由基清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0075]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種丹參酚酸類成分，其特征在于，它由下列方法制備得到： (1) 取丹參地上莖葉作為原料，采用水或醇溶液提取，得到水或醇提取液； (2) 取步驟（1)的提取液在無菌條件下，接種提取液1/10~1/20體積的光合細(xì)菌菌液， 在400-3200LUX光照厭氧條件下培養(yǎng)3?20天，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液，將光合細(xì) 菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液在l〇〇〇-l〇〇〇〇r/min離心； (3) 取步驟（2)離心上清液，上大孔吸附樹脂柱進(jìn)行吸附，先用水洗，然后采用不同濃度 乙醇進(jìn)行洗脫分離； (4) 收集步驟（3)體積濃度為20~70%乙醇洗脫液，減壓濃縮，噴霧干燥，得到總丹參酚 酸類成分。
2. -種從丹參地上莖葉中提取制備丹參酚酸類成分的方法，其特征在于，它包括如下 步驟： (1) 取丹參地上莖葉作為原料，采用水或醇溶液提取，得到水或醇提取液； (2) 取步驟（1)的提取液在無菌條件下，接種提取液1/10~1/20體積的光合細(xì)菌菌液， 在400-3200LUX光照厭氧條件下培養(yǎng)3?20天，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液，將光合細(xì) 菌轉(zhuǎn)化丹參培養(yǎng)液在l〇〇〇-l〇〇〇〇r/min離心； (3) 取步驟（2)的上清液，上大孔吸附樹脂柱進(jìn)行吸附，先用水洗，然后采用不同濃度乙 醇進(jìn)行洗脫分離； (4) 收集體積濃度為20~70%乙醇洗脫液，減壓濃縮，噴霧干燥，得到總丹參酚酸類成 分。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的從丹參地上莖葉中提取制備丹參酚酸類成分的方法，其特征 在于，所采用的丹參地上莖葉為6月下旬~7月下旬生長期內(nèi)的地上莖葉部分。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的從丹參地上莖葉中提取制備丹參酚酸類成分的方法，其特 征在于，步驟（2)所述的光合細(xì)菌菌液制備方法為：在經(jīng)過滅菌的光合細(xì)菌培養(yǎng)基中接入 1/10份數(shù)光合細(xì)菌菌種，在光照、厭氧條件下，培養(yǎng)3-5天，作為光合細(xì)菌種子培養(yǎng)液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的從丹參地上莖葉中提取制備丹參酚酸類成分的方 法，其特征在于，步驟（2)采用光合細(xì)菌為紅螺菌屬、紅假單胞菌屬、紅細(xì)菌屬中的任意一株 菌或它們的任意組合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的從丹參地上莖葉中提取制備丹參酚酸類成分的方法，其特征 在于，所述的紅螺菌屬為深紅紅螺菌；紅假單胞菌屬為沼澤紅假單胞菌、綠色紅假單胞菌、 綠硫紅假單胞菌、海洋紅假單胞菌；紅細(xì)菌屬為球形紅細(xì)菌、莢膜紅細(xì)菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的從丹參地上莖葉中提取制備丹參酚酸類成分的方法，其特征 在于，所述的大孔吸附樹脂型號為D101或AB-8。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的從丹參地上莖葉中提取制備丹參酚酸類成分的方法，其特征 在于，步驟（3)所述乙醇洗脫的體積濃度為10~95%。
9. 權(quán)利要求1所述的丹參酚酸類成分在制備治療心腦血管疾病藥物或功能保健產(chǎn)品 中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一從丹參地上莖葉提取制備丹參酚酸類成分的方法。本發(fā)明利用丹參地上莖葉，提取后經(jīng)光合細(xì)菌包括沼澤紅假單胞菌、綠硫紅假單胞菌、球形紅細(xì)菌、莢膜紅細(xì)菌等進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，促使莖葉中丹酚酸類成分升高，尤其是活性成分丹酚酸B含量可為丹參根藥材中含量的3~4倍，迷迭香酸則高于丹參藥材數(shù)十倍；再經(jīng)大孔吸附樹脂柱分離純化，可高效獲得高含量的丹參酚酸B、丹參素、迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸等酚酸類成分的提取物。本發(fā)明提供的丹酚酸類成分具有很好的抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及活血化瘀功效，可用于制備防治心腦血管疾病藥物或功能保健產(chǎn)品。
【IPC分類】A61P9-00, C12P1-04, A23L1-29, A61K36-537
【公開號】CN104611373
【申請?zhí)枴緾N201510070147
【發(fā)明人】宿樹蘭, 段金廒, 江曙, 嚴(yán)輝, 郭盛, 錢大瑋
【申請人】南京中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年2月10日