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技術(shù)領(lǐng)域

本文中的實(shí)施方式總的來(lái)說(shuō)涉及用于多核苷酸處理的組合物和方法。更具體來(lái)說(shuō)，某些實(shí)施方式總的來(lái)說(shuō)涉及用于純化和標(biāo)記來(lái)自于生物樣品的長(zhǎng)的多核苷酸的方法和組合物。

發(fā)明概述

在某些實(shí)施方式中，提供了處理包含多核苷酸的樣品的方法。所述方法可以包括將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中。所述方法可以包括使所述薄層多孔基質(zhì)適形于基材。所述方法可以包括從適形于基材的薄層多孔基質(zhì)除去非多核苷酸分子，同時(shí)所述多核苷酸保持固定化在所述薄層多孔基質(zhì)中。所述方法可以包括下列至少一者：(a)將所述多核苷酸用第一標(biāo)記物標(biāo)記；或(b)從所述薄層多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸用所述第一標(biāo)記物標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸在固定化在所述薄層多孔基質(zhì)中的同時(shí)用所述第一標(biāo)記物標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸用所述第一標(biāo)記物酶法標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，從所述薄層多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)至少一次洗滌從所述薄層多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸用所述第一標(biāo)記物標(biāo)記并從所述薄層多孔基質(zhì)分離。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸在固定化在所述薄層多孔基質(zhì)中的同時(shí)用所述第一標(biāo)記物標(biāo)記，并隨后從所述薄層多孔基質(zhì)分離。在某些實(shí)施方式中，在從所述薄層多孔基質(zhì)除去非多核苷酸分子之后并在從所述基質(zhì)分離所述多核苷酸之前，將所述多核苷酸用所述第一標(biāo)記物標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸從所述薄層多孔基質(zhì)分離，并隨后用所述第一標(biāo)記物標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)至少一次洗滌從所述薄層多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸用所述第一標(biāo)記物酶法標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中和使所述薄層多孔基質(zhì)適形于基材同時(shí)地進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中和使所述薄層多孔基質(zhì)適形于基材分開(kāi)地進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中包括將所述樣品與所述薄層多孔基質(zhì)的前體相接觸，并且形成所述薄層多孔基質(zhì)是從包含所述樣品的所述前體形成的。在某些實(shí)施方式中，在已從所述薄層多孔基質(zhì)的前體形成所述薄層多孔基質(zhì)之后，將所述樣品固定化在所述薄層多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，形成所述薄層多孔基質(zhì)包括在所述基材上鋪展所述薄層多孔基質(zhì)的前體。在某些實(shí)施方式中，形成所述薄層多孔基質(zhì)包括向所述薄層多孔基質(zhì)的前體施加真空或來(lái)自于氣體的壓力。在某些實(shí)施方式中，形成所述薄層多孔基質(zhì)包括向所述薄層多孔基質(zhì)的前體施加離心力。在某些實(shí)施方式中，使所述薄層多孔基質(zhì)在所述基材與另一個(gè)實(shí)體之間適形于所述基材，由此限定所述薄層多孔基質(zhì)的厚度、直徑或體積中的至少一者。在某些實(shí)施方式中，使所述薄層多孔基質(zhì)適形于基材包括將所述基材包埋在所述薄層多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，所述基材包含網(wǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述網(wǎng)包含多個(gè)直徑為0.1μm至10mm的開(kāi)孔。在某些實(shí)施方式中，使所述薄層多孔基質(zhì)適形于基材包括將所述薄層多孔基質(zhì)布置在所述基材上方。在某些實(shí)施方式中，在從所述薄層多孔基質(zhì)除去所述非多核苷酸分子時(shí)，所述薄層多孔基質(zhì)保持基本上平坦地布置在所述基材上方。在某些實(shí)施方式中，使所述薄層多孔基質(zhì)從所述基材脫離但仍保持緊密貼近于所述基材，使得所述薄層多孔基質(zhì)在所述基材上方保持基本上平坦。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)系鏈、支架、電磁相互作用、摩擦或壓力中的至少一者維持所述薄層多孔基質(zhì)緊密貼近于所述基材，使得所述薄層多孔基質(zhì)保持基本上平坦地布置在所述基材上方。在某些實(shí)施方式中，將所述薄層多孔基質(zhì)置于從所述基材延伸的至少兩個(gè)柱狀物之間，以便維持所述薄層多孔基質(zhì)緊密貼近于所述基材。在某些實(shí)施方式中，將所述薄層多孔基質(zhì)置于所述基材與表面之間，使得所述薄層多孔基質(zhì)基本上平坦地布置在所述基材上方。在某些實(shí)施方式中，所述表面包含第一網(wǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述基材包含第二網(wǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述第一網(wǎng)包含多個(gè)開(kāi)孔，所述開(kāi)孔各自具有0.1μm至約10mm的直徑。在某些實(shí)施方式中，所述第二網(wǎng)包含多個(gè)開(kāi)孔，所述開(kāi)孔各自具有0.1μm至約10mm的直徑。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)真空維持所述薄層多孔基質(zhì)緊密貼近于所述基材。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)來(lái)自于氣體的壓力維持所述薄層多孔基質(zhì)緊密貼近于所述基材。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)系鏈維持所述薄層多孔基質(zhì)緊密貼近于所述表面。在某些實(shí)施方式中，所述系鏈包含多孔材料，所述多孔材料被配置成維持所述薄層多孔基質(zhì)緊密貼近于所述表面，同時(shí)允許接近固定化在所述薄層中的所述樣品。在某些實(shí)施方式中，所述基材是剛性的。在某些實(shí)施方式中，所述基材是柔性的。在某些實(shí)施方式中，所述基材包含載片、容器或片材的至少一部分。在某些實(shí)施方式中，將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中包括形成所述薄層多孔基質(zhì)，使得所述表面限定所述薄層多孔基質(zhì)的至少一個(gè)側(cè)面。在某些實(shí)施方式中，所述基材包含網(wǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述網(wǎng)包含直徑為0.1μm至約10mm例如約1μm至約10mm、10μm至約10mm、100μm至約10mm、約0.1μm至約1mm、約1μm至約1mm、約10μm至約1mm或約100μm至約1mm的多個(gè)開(kāi)孔。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)具有約1至999微米的厚度。在某些實(shí)施方式中，所述薄層基質(zhì)具有約80至200微米的厚度。在某些實(shí)施方式中，所述薄層基質(zhì)在流體裝置內(nèi)形成。在某些實(shí)施方式中，所述薄層基質(zhì)在微流體裝置或納米流體裝置外部形成，并隨后放置在所述流體裝置內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，在流體裝置內(nèi)使所述薄層基質(zhì)適形于所述基材。在某些實(shí)施方式中，在流體裝置內(nèi)從所述薄層多孔基質(zhì)除去所述非多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，所述流體裝置被配置成在所述處理期間控制體積、溫度或流體移動(dòng)中的至少一者。在某些實(shí)施方式中，所述流體裝置被配置成自動(dòng)進(jìn)行所述處理。在某些實(shí)施方式中，所述流體裝置包含微流體裝置。在某些實(shí)施方式中，所述流體裝置包含納米流體裝置。

在某些實(shí)施方式中，提供了一種處理包含多核苷酸的樣品的方法。所述方法可以包括將所述樣品在水性環(huán)境中固定化在多孔基質(zhì)中。所述方法可以包括破碎包含固定化的樣品的多孔基質(zhì)。所述方法可以包括從所述多孔基質(zhì)除去非多核苷酸分子，同時(shí)所述多核苷酸保留在所述多孔基質(zhì)中。所述方法可以包括從所述多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，在破碎所述多孔基質(zhì)之后從所述多孔基質(zhì)除去非多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，在破碎所述多孔基質(zhì)之前從所述多孔基質(zhì)除去非多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括在破碎所述基質(zhì)之后從所述多孔基質(zhì)除去痕量的非多核苷酸分子，其中多核苷酸分子保留在所述多孔基質(zhì)中，而所述痕量的非多核苷酸分子被去除。在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括在從所述多孔基質(zhì)除去非多核苷酸分子之后并在從所述基質(zhì)分離所述多核苷酸之前，用第一標(biāo)記物標(biāo)記所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，在流體裝置內(nèi)將所述樣品固定化在所述多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)在微流體裝置或納米流體裝置外部形成，并隨后放置在所述流體裝置內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，在流體裝置內(nèi)使所述多孔基質(zhì)適形于所述基材。在某些實(shí)施方式中，在流體裝置內(nèi)從所述多孔基質(zhì)除去所述非多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，所述流體裝置被配置成在所述處理期間控制體積、溫度或流體移動(dòng)中的至少一者。在某些實(shí)施方式中，所述流體裝置被配置成自動(dòng)進(jìn)行所述處理。在某些實(shí)施方式中，所述流體裝置包含微流體裝置。在某些實(shí)施方式中，所述流體裝置包含納米流體裝置。

在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述多核苷酸包含至少約200千堿基，例如至少約200kb、250kb、300kb、350kb、400kb、450kb、500kb、550kb、600kb、650kb、700kb、750kb、850kb、950kb或1000kb，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述多核苷酸包含至少約1兆堿基。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述樣品包含細(xì)胞懸液、核懸液、細(xì)胞器懸液、細(xì)胞勻漿物、組織勻漿物、全生物體勻漿物和生物流體中的至少一者。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述樣品包含全細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述多核苷酸包含單鏈DNA、單鏈RNA、雙鏈DNA或雙鏈RNA。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)或薄層多孔基質(zhì)包含合成聚合物、天然存在的聚合物或其組合。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)或薄層多孔基質(zhì)包含基于多糖的基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)或薄層多孔基質(zhì)包含瓊脂糖基質(zhì)、聚丙烯酰胺基質(zhì)、明膠基質(zhì)、膠原蛋白基質(zhì)、纖維蛋白基質(zhì)、殼聚糖基質(zhì)、藻酸鹽基質(zhì)、透明質(zhì)酸基質(zhì)或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)或薄層多孔基質(zhì)包含瓊脂糖基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)或薄層多孔基質(zhì)包含硅烷基團(tuán)、帶正電荷的基團(tuán)、帶負(fù)電荷的基團(tuán)、兩性離子基團(tuán)、極性基團(tuán)、親水性基團(tuán)、疏水性基團(tuán)或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)或薄層多孔基質(zhì)包含水性環(huán)境。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)或薄層多孔基質(zhì)被布置在水性溶液中。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，非多核苷酸分子包含蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖類(lèi)、細(xì)胞器和細(xì)胞碎片中的至少一者。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，除去非多核苷酸分子包括將所述多孔基質(zhì)或薄層多孔基質(zhì)與蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原蛋白酶、脂肪酶、糖水解酶、果膠酶、果膠溶解酶(pectolyase)、淀粉酶、RNA酶、透明質(zhì)酸酶、幾丁質(zhì)酶、gluculase、溶壁酶、酵母裂解酶、溶菌酶、labiase、消色肽酶(achromopeptidase)或其組合相接觸。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，除去非多核苷酸分子包括將所述多孔基質(zhì)或薄層多孔基質(zhì)與蛋白酶相接觸。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，除去非多核苷酸分子包括將所述多孔基質(zhì)或薄層多孔基質(zhì)與去污劑、離液劑、緩沖劑、螯合劑、有機(jī)溶劑、聚合物、醇、鹽、酸、堿、還原劑或其組合相接觸。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述聚合物包含聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或乙二醇之一。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述有機(jī)溶劑在基于水的溶液中可混溶。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，除去非多核苷酸分子包括施加電場(chǎng)以除去至少一些非多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述方法還包括在除去非多核苷酸分子之前進(jìn)行基質(zhì)內(nèi)核富集。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述標(biāo)記包括非位點(diǎn)特異性標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述標(biāo)記包括位點(diǎn)特異性標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述標(biāo)記包括將所述多核苷酸與染料或染色劑相接觸。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述標(biāo)記包括非光學(xué)標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述多核苷酸是雙鏈的，并且位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括在第一序列基序處切刻所述多核苷酸，由此形成至少一個(gè)切口，其中所述DNA在與所述至少一個(gè)切口相鄰處保持雙鏈；以及用所述第一標(biāo)記物標(biāo)記所述至少一個(gè)切口。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，將所述多核苷酸在被切刻時(shí)固定化在所述基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括將至少一個(gè)核苷酸摻入到所述至少一個(gè)切口中。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，至少一個(gè)核苷酸包含可逆終止子。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述至少一個(gè)核苷酸包含所述第一標(biāo)記物。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述方法還包括在第二序列基序處切刻所述多核苷酸，由此形成至少一個(gè)第二切口，其中所述DNA在與所述至少一個(gè)第二切口相鄰處保持雙鏈；以及用第二標(biāo)記物標(biāo)記所述至少一個(gè)第二切口，其中所述第一標(biāo)記物與所述第二標(biāo)記物相同或不同。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述標(biāo)記包括通過(guò)第一甲基轉(zhuǎn)移酶將所述標(biāo)記物轉(zhuǎn)移到所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括通過(guò)第一甲基轉(zhuǎn)移酶將所述第一標(biāo)記物轉(zhuǎn)移到第一序列基序。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括將第一反應(yīng)性基團(tuán)轉(zhuǎn)移到所述第一序列基序；以及將所述第一標(biāo)記物偶聯(lián)到所述第一反應(yīng)性基團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述方法還包括通過(guò)第二甲基轉(zhuǎn)移酶將第二標(biāo)記物轉(zhuǎn)移到第二序列基序，其中所述第二序列基序不同于所述第一序列基序，并且其中所述第二標(biāo)記物與所述第一標(biāo)記物相同或不同。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括將固定化在所述基質(zhì)中的所述多核苷酸的第一序列基序與特異性結(jié)合所述第一序列基序的第一結(jié)合組成部分相接觸。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述第一結(jié)合組成部分包含以下一種：三螺旋寡核苷酸、肽、核酸、聚酰胺、鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活物樣(TAL)效應(yīng)物DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、限制性酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗體或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述第一標(biāo)記物或第二標(biāo)記物中的至少一者選自熒光團(tuán)、量子點(diǎn)或非光學(xué)標(biāo)記物。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述方法還包括用非序列特異性標(biāo)記物標(biāo)記所述多核苷酸，其中所述非序列特異性標(biāo)記物不同于所述第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，分離包括以下至少一者：融化所述多孔基質(zhì)、消化所述多孔基質(zhì)、降解所述多孔基質(zhì)、溶解所述多孔基質(zhì)、電洗脫、通過(guò)篩的離心、轉(zhuǎn)印到膜上、透析步驟或其組合。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，分離包括向包含所述多核苷酸和所述基質(zhì)的至少一種組分的混合物添加溶劑。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述方法還包括檢測(cè)所述多核苷酸特征性的位點(diǎn)特異性標(biāo)記的模式。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，檢測(cè)包括將所述多核苷酸在流體通道中線(xiàn)性化。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述方法還包括將所述第一標(biāo)記物、第二標(biāo)記物或其任何組合的模式與參比DNA上的標(biāo)記物模式進(jìn)行比較。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述方法還包括在位點(diǎn)特異性標(biāo)記的重疊模式的基礎(chǔ)上組裝多個(gè)模式，由此構(gòu)建多核苷酸圖譜。

在某些實(shí)施方式中，提供了一種多核苷酸制備物。所述制備物可以包含適形于基材的薄層多孔基質(zhì)。所述制備物可以包含固定化在所述多孔基質(zhì)中的多核苷酸，其中所述多核苷酸基本上與非多核苷酸細(xì)胞組分分離，并且其中所述多核苷酸當(dāng)在所述基質(zhì)中時(shí)已被位點(diǎn)特異性標(biāo)記或酶法修飾。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)被基本上平坦地布置在所述基材上方。在某些實(shí)施方式中，所述基材被包埋在所述薄層多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，將所述基材放置在所述薄層多孔基質(zhì)的第一側(cè)面上，并且其中將表面放置在所述薄層多孔基質(zhì)的第二側(cè)面上。在某些實(shí)施方式中，所述基材包含網(wǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述網(wǎng)包含多個(gè)開(kāi)孔，每個(gè)開(kāi)孔具有0.1μm至10mm的直徑。在某些實(shí)施方式中，所述表面包含第二網(wǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述第二網(wǎng)包含多個(gè)開(kāi)孔，每個(gè)開(kāi)孔具有0.1μm至10mm的直徑。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸當(dāng)在所述基質(zhì)中時(shí)與細(xì)胞組分分離。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸在與細(xì)胞組分分離之前被標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸在與細(xì)胞組分分離之后被標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含至少約200千堿基，例如至少約200kb、250kb、300kb、350kb、400kb、450kb、500kb、550kb、600kb、650kb、700kb、750kb、850kb、950kb或1000kb，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含至少約1兆堿基。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含單鏈DNA、單鏈RNA、雙鏈DNA或雙鏈RNA。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)包含合成聚合物、天然存在的聚合物或其組合。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)包含聚丙烯酰胺基質(zhì)、明膠基質(zhì)、膠原蛋白基質(zhì)、纖維蛋白基質(zhì)、殼聚糖基質(zhì)、藻酸鹽基質(zhì)、透明質(zhì)酸基質(zhì)或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)包含瓊脂糖基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)包含基于多糖的基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)包含硅烷、帶正電荷的基團(tuán)、帶負(fù)電荷的基團(tuán)、兩性離子基團(tuán)、極性基團(tuán)、親水性基團(tuán)、疏水性基團(tuán)或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)以延伸的構(gòu)型布置在所述表面上方。在某些實(shí)施方式中，所述薄層基質(zhì)具有約1至999微米的厚度。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)具有約80至200微米的厚度。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)被固定化在所述表面上。在某些實(shí)施方式中，使所述薄層多孔基質(zhì)從所述表面脫離但仍保持緊密貼近于所述表面，使得所述層在整個(gè)所述處理中保持基本上延伸。在某些實(shí)施方式中，所述表面是剛性的。在某些實(shí)施方式中，所述表面是柔性的。在某些實(shí)施方式中，所述表面是載片、容器或片材的表面。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)基本上不含非多核苷酸細(xì)胞組分。在某些實(shí)施方式中，所述非多核苷酸細(xì)胞組分包含蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖類(lèi)、細(xì)胞器和細(xì)胞碎片中的至少一者。在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記或酶法修飾包括至少用與第一序列基序結(jié)合的第一標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記或酶法修飾還包括用與第二序列基序結(jié)合的第二標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，其中所述第二標(biāo)記物與所述第一標(biāo)記物相同或不同。在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括至少用摻入到雙鏈DNA或RNA中的切口內(nèi)的標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，所述制備物還包含結(jié)合到所述第一基序的至少一種結(jié)合組成部分，其中所述結(jié)合組成部分包含以下至少一者：三螺旋寡核苷酸、肽核酸、聚酰胺、鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活物樣(TAL)效應(yīng)物DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、限制性酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗體或其組合。在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括用選自熒光團(tuán)、量子點(diǎn)和非光學(xué)標(biāo)記物的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。

根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，提供了一種處理樣品的方法。所述方法可以包括將所述樣品固定化在布置在基材上方的薄層多孔基質(zhì)中。所述方法可以包括處理捕獲在基材結(jié)合層中的所述樣品以除去不想要的組分，同時(shí)至少一種所需組分保持固定化在所述樣品中。所述方法可以包括從所述多孔基質(zhì)分離所述至少一種所需組分。所述方法可以包括表征所述至少一種所需組分。在某些實(shí)施方式中，所述所需組分包含以下至少一者：核酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、脂類(lèi)、多糖、代謝物、小分子、抗體或其組合。在某些實(shí)施方式中，所述所需組分是DNA，并且其中所述表征包括確定濃度、質(zhì)量度量、物理圖譜、序列含量、表觀遺傳信息、SNP、單體型、RFLP、尺寸、拷貝數(shù)變體或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，所述所需組分是RNA，并且其中所述表征包括確定濃度、質(zhì)量度量、序列含量、表達(dá)水平、穩(wěn)定性、剪接事件或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，所述所需組分是蛋白質(zhì)，并且其中所述表征包括確定濃度、純度、序列含量、結(jié)構(gòu)性質(zhì)、抗體反應(yīng)性、酶活性、抑制活性、翻譯后修飾、毒性效應(yīng)或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括在所述多核苷酸處于所述基質(zhì)中時(shí)標(biāo)記所述多核苷酸或共價(jià)修飾所述多核苷酸。

在某些實(shí)施方式中，提供了一種用于處理含有至少一種多核苷酸的樣品的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可以包含多孔基質(zhì)，其被配置成形成包含所述樣品的薄層多孔基質(zhì)。所述系統(tǒng)可以包含用于形成所述薄層多孔基質(zhì)的基材。所述系統(tǒng)可以包含用于維持所述薄層多孔基質(zhì)適形于基材的工具。在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)還包含用于在基本上布置在所述基材上方的所述薄層多孔基質(zhì)周?chē)纬煽椎墓ぞ?。在某些?shí)施方式中，所述系統(tǒng)還包含用于將所述薄層多孔基質(zhì)維持在所需溫度下的工具。在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)還包含用于除去所述至少一種多核苷酸之外的樣品組分的純化試劑，用于用第一標(biāo)記物標(biāo)記所述至少一種多核苷酸的序列基序的第一標(biāo)記試劑，以及用于從所述薄層多孔基質(zhì)分離標(biāo)記的多核苷酸的分離試劑，其中分離的多核苷酸的序列基序標(biāo)記的模式能夠被表征。在某些實(shí)施方式中，所述基材包含第一網(wǎng)，并且用于維持所述薄層多孔基質(zhì)適形于基材的工具包含第二網(wǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述第一網(wǎng)和第二網(wǎng)各自包含多個(gè)開(kāi)孔，其中每個(gè)開(kāi)孔具有0.1μm至10mm的直徑。在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包含流體系統(tǒng)。在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)被配置成自動(dòng)形成所述薄層多孔基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)被配置成接收預(yù)先形成的薄層多孔基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)被配置成自動(dòng)從所述薄層多孔基質(zhì)分離標(biāo)記的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包含微流體系統(tǒng)。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)與納米通道流體連通。

在某些實(shí)施方式中，提供了一種用于形成薄層多孔基質(zhì)的試劑盒。所述試劑盒可以包含基材；以及包含一個(gè)或多個(gè)開(kāi)孔的形成孔的裝置，所述一個(gè)或多個(gè)開(kāi)孔被配置成當(dāng)緊靠所述基材放置時(shí)，限定垂直或基本上垂直于所述基材的一個(gè)或多個(gè)表面。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含薄層多孔基質(zhì)前體。在某些實(shí)施方式中，所述形成孔的裝置包含密封元件，所述密封元件被配置成針對(duì)所述基材形成密封。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含加壓板，所述加壓板被配置成將所述形成孔的裝置緊靠所述基材固定。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含加熱元件，所述加熱元件被配置成加熱所述基材和所述形成孔的裝置。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含網(wǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述基材包含PTFE涂層，所述涂層形成多個(gè)特征，所述特征被配置成維持薄層多孔基質(zhì)布置在所述基材上方。在某些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含流體裝置。

在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述基材包括松或緊的網(wǎng)，由此將所述前體材料形成為插入在所述網(wǎng)的纖維的一個(gè)或多個(gè)表面之間或之上的薄層，從而將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，將所述薄層多孔基質(zhì)固定化成插入在網(wǎng)的纖維的一個(gè)或多個(gè)表面之間或所述網(wǎng)的纖維的一個(gè)或多個(gè)表面上的薄層，以便于洗滌或標(biāo)記來(lái)自于所述網(wǎng)的第一和第二表面的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述基材包含特征，由此將所述前體材料形成為插入在所述特征之間的薄層，從而將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，所述特征包含柱狀物。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述薄層多孔基質(zhì)通過(guò)與空氣壓力變化例如壓縮空氣或真空的接觸來(lái)形成，由此將所述前體材料形成為薄層，從而將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，與空氣壓力變化的接觸包括壓縮空氣或真空。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于任何上述方法來(lái)說(shuō)，所述薄層多孔基質(zhì)通過(guò)與離心力例如來(lái)自于離心機(jī)的離心力的接觸來(lái)形成，由此將所述薄層多孔基質(zhì)的前體形成為薄層，從而將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，與離心力的接觸包括來(lái)自于離心機(jī)的力。

附圖簡(jiǎn)述

圖1是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，處理包含多核苷酸的樣品的方法的流程圖。

圖2是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，處理包含多核苷酸的樣品的方法的流程圖。

圖3A和3B是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，載片上的薄層多孔基質(zhì)的照片。如圖3A中所示，將20ul瓊脂糖-大腸桿菌(E.coli)混合物沉積在載片上，并通過(guò)用另一個(gè)載片在存在80um間隔物的情況下進(jìn)行夾心來(lái)鋪展。如圖3B中所示，在由載片上的PTFE涂層所限定的直徑為14mm且高度為100um的孔中，產(chǎn)生薄層多孔基質(zhì)中的瓊脂糖-哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞(黑色)。

圖4A和4B是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，沉積在培養(yǎng)板中的瓊脂糖-大腸桿菌混合物的照片。如圖3A中所示，將20ul瓊脂糖-大腸桿菌混合物沉積在6孔培養(yǎng)板的孔中。如圖3B中所示，將900ul瓊脂糖-大腸桿菌混合物沉積在10cm培養(yǎng)板中。在每個(gè)圖3A和3B中，將瓊脂糖-大腸桿菌混合物用移液管頭鋪展，以獲得附著于其容器底部的薄層。添加尼龍網(wǎng)以保持所述層系留到所述表面。

圖5A是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，在納米通道(Irys^TM平臺(tái)，BioNano Genomics)中伸展的標(biāo)記的DNA分子的照片。骨架(非序列特異性)染色示出在(I)中。(I)中的兩種分子的紅色(位點(diǎn)特異性)標(biāo)記模式示出在(II)中，而綠色(位點(diǎn)特異性)標(biāo)記模式示出在(III)中。

圖5B是示出了圖5A的標(biāo)記的DNA的標(biāo)記度量的表。薄層多孔基質(zhì)DNA純化在載片上進(jìn)行，隨后用一種顏色進(jìn)行基質(zhì)內(nèi)序列特異性標(biāo)記或用兩種顏色進(jìn)行連續(xù)標(biāo)記(G：綠色標(biāo)記物；R：紅色標(biāo)記物；FP：假陽(yáng)性；FN：假陰性)。

圖6是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，在孔中進(jìn)行系留的薄層DNA純化，然后在薄層中進(jìn)行序列特異性標(biāo)記的標(biāo)記度量的表(FP：假陽(yáng)性；FN：假陰性)。

圖7是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，進(jìn)行微層/薄層DNA純化，然后在溶液中進(jìn)行序列特異性標(biāo)記的標(biāo)記度量的表(FP：假陽(yáng)性；FN：假陰性)。

圖8是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，在板中進(jìn)行大規(guī)模薄層DNA純化，然后在溶液中進(jìn)行序列特異性標(biāo)記的標(biāo)記度量的表(FP：假陽(yáng)性；FN：假陰性)。

圖9是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，進(jìn)行柱塞/多孔單元DNA純化，然后在多孔單元中進(jìn)行序列特異性標(biāo)記的標(biāo)記度量的表(FP：假陽(yáng)性；FN：假陰性)。

圖10A、10B、10C和10D是示出了符合本文中的某些實(shí)施方式的樣品處理裝置的照片。圖10A示出了用于固持載片的金屬底座10，其安裝有用于溫度控制的加熱塊。圖10B示出了載片，其包含用放置在金屬底座10上的網(wǎng)12系留的薄層多孔基質(zhì)。圖10C示出了孔形成單元14，其包括反應(yīng)孔16和o型環(huán)18。圖10D示出了在載片上組裝的孔形成單元14，所述載片包含用尼龍網(wǎng)12系留的薄層多孔基質(zhì)，并示出了反應(yīng)孔16。還示出了用于封閉反應(yīng)孔的蓋子20。

圖11是示出了在圖10中所示的載片處理裝置中用于薄層多孔基質(zhì)DNA純化和序列特異性標(biāo)記的標(biāo)記度量的表(FP：假陽(yáng)性；FN：假陰性)。

圖12A是示出了使用薄層多孔基質(zhì)純化的人類(lèi)基因組材料的重新作圖結(jié)果的表。

圖12B是示出了來(lái)自于圖12A中描述的重新作圖的組裝的基因組圖譜的圖。

圖13A、13B和13C是示出了符合本文中的某些實(shí)施方式的樣品處理裝置的照片。圖13A示出了所述裝置的側(cè)視圖。圖13B示出了所述裝置的頂視圖(不存在頂蓋)。圖13C示出了所述裝置在存在頂蓋的情況下的頂視圖。

圖14是示出了符合本文中的某些實(shí)施方式的2#樣品處理裝置的照片。圖14示出了用于固持載片的金屬底座140，其安裝有用于溫度控制的加熱爐。

圖15是示出了符合本文中的某些實(shí)施方式的2#樣品處理裝置的照片。圖15示出了放置在金屬底座145上的載片，其包含在用網(wǎng)144系留的聚四氟乙烯(PTFE)環(huán)143內(nèi)鋪展的薄層多孔基質(zhì)。

圖16A-G是示出了符合本文中的某些實(shí)施方式的2#樣品處理裝置的一系列照片。圖16A示出了孔形成單元165。圖16B示出了孔形成單元165，其包括反應(yīng)孔167和o型環(huán)166。圖16C示出了波形墊圈168。圖16D示出了放置在載片上并包含用尼龍網(wǎng)164系留的薄層多孔基質(zhì)的孔形成單元165，并示出了波形墊圈168位于每個(gè)反應(yīng)孔167上方。圖16E示出了金屬加壓板169。圖16F示出了在載片上組裝的孔形成單元165，其包含用尼龍網(wǎng)164系留的薄層多孔基質(zhì)，并示出了加壓板169位于孔形成單元165上方。圖16G示出了用于產(chǎn)生頂部空氣密封的膠黏密封薄膜170的放置。

圖17A和17B是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，載片上的PTFE涂層環(huán)的特征的示意圖。所述PTFE特征可以包含用于薄層多孔基質(zhì)的持留柱狀物。圖17A示出了在涂層在載片162上的PTFE環(huán)163的內(nèi)徑周?chē)腜TFE特征171，其用于在處理期間將薄層多孔基質(zhì)保持在位。圖17B示出了在涂層在載片172上的PTFE環(huán)173內(nèi)部的整個(gè)孔上方均勻放置的PTFE特征171，其用于在處理期間將薄層多孔基質(zhì)保持在位。

圖18A和18B是示出了按照本文中的某些實(shí)施方式形成的薄層多孔基質(zhì)的照片。圖18A示出了載片上的薄層多孔基質(zhì)。圖18A示出了在向前體材料施加壓縮空氣后，薄層多孔基質(zhì)172在載片162上的形成。圖18B示出了多孔網(wǎng)基材上的薄層多孔基質(zhì)。圖18B示出了在將前體材料在兩個(gè)載片之間壓縮后，薄層多孔基質(zhì)172在網(wǎng)164上的形成。

圖19的表示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式的流程，完成薄層多孔基質(zhì)(例如微層)流程的時(shí)間縮減，以及根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，使用2#樣品制備裝置進(jìn)行微層/薄層DNA純化，然后在基質(zhì)(第1行)或溶液(第2行)中進(jìn)行序列特異性標(biāo)記的度量(FP：假陽(yáng)性；FN：假陰性)。

圖20的表示出了在根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式進(jìn)行薄層多孔基質(zhì)(例如微層)DNA純化，然后根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，使用2#樣品制備裝置在基質(zhì)(第1行)或溶液(第2行)中進(jìn)行序列特異性標(biāo)記之后的DNA得率和DNA濃度。

圖21的圖示出了在根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式使用2#樣品制備裝置進(jìn)行的載片處理上，柱塞方法與符合本文中的某些實(shí)施方式的薄層多孔基質(zhì)(例如微層)方法相比，獲得≥1Mb n50重疊群尺寸所需的人類(lèi)基因組深度(x覆蓋度)。

圖22的表示出了對(duì)于從基因組變體數(shù)據(jù)庫(kù)(Database of GenomicVariants)(DGV)收集的并入到hg19中的一組187個(gè)已知倒位來(lái)說(shuō)，DNA純化和標(biāo)記的符合本文中的某些實(shí)施方式的薄層多孔基質(zhì)(例如微層)方法相對(duì)于柱塞方法的倒位(基因組結(jié)構(gòu)變異)檢測(cè)靈敏度。

圖23的表示出了DNA純化和標(biāo)記的符合本文中的某些實(shí)施方式的薄層多孔基質(zhì)(例如微層)方法相對(duì)于柱塞方法，在較高基因組深度下增加的n50重疊群尺寸(Mb)。

圖24的表示出了DNA純化和標(biāo)記的符合本文中的某些實(shí)施方式的薄層多孔基質(zhì)(例如微層)方法相對(duì)于柱塞方法，脆弱位點(diǎn)距離(bp)的減小。

圖25的表示出了DNA純化和標(biāo)記的符合本文中的某些實(shí)施方式的薄層多孔基質(zhì)(例如微層)方法相對(duì)于柱塞方法，DNA尺寸(kb)的增加。值得注意的是，盡管柱塞可以純化高達(dá)350kb至400kb的DNA，但符合本文中的某些實(shí)施方式的薄層多孔基質(zhì)方法可以純化至少1000kb的DNA(除了小于1000kb的DNA之外)。

詳細(xì)描述

單分子水平上的基因組作圖可以包括多核苷酸的純化和標(biāo)記，某些所述多核苷酸含有至少1兆堿基的材料。根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，提供了用于純化和任選地標(biāo)記多核苷酸的方法和結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方式中，將多核苷酸固定化在多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)相對(duì)于其體積具有高的表面積。高的表面積可以便于除去非多核苷酸分子和其他操作，同時(shí)所述多核苷酸仍保持固定化在所述多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸在被固定化在所述多孔基質(zhì)中的同時(shí)被標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸從所述基質(zhì)除去，然后進(jìn)行標(biāo)記。

根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，用于處理多核苷酸的方法和組合物可以產(chǎn)生高純度的含有兆堿基的多核苷酸分子，并且可以便于標(biāo)記和除去非多核苷酸分子。傳統(tǒng)上，處理大的多核苷酸分子包括將生物樣品包埋在瓊脂糖柱塞中并純化。然而，在這種柱塞中用于產(chǎn)生純化的多核苷酸的典型的機(jī)械操作可以限制柱塞的可接近表面積，并且可以使含有多核苷酸的柱塞變成基質(zhì)內(nèi)反應(yīng)的不良候選者。盡管可以將生物樣品包埋在瓊脂糖微珠或纖維中以增加用于基質(zhì)內(nèi)反應(yīng)的表面積，但這種配置可能限制用于純化和/或順序酶法處理的機(jī)械處理。此外，微珠難以生產(chǎn)和操縱。例如，微珠可能粘著到試管側(cè)壁和移液管頭內(nèi)部，并容易變得透明且難以觀察。此外，制造微珠的方法可能產(chǎn)生不一致的結(jié)果。也被稱(chēng)為“瓊脂糖線(xiàn)蟲(chóng)”的瓊脂糖纖維可能引起與微珠相似的挑戰(zhàn)。在本文中認(rèn)識(shí)到，符合本文中的某些實(shí)施方式的多核苷酸的處理，在將多核苷酸以可接近的方式固定化在多孔基質(zhì)中的同時(shí)，可以從樣品污染物中純化多核苷酸(包括大的多核苷酸例如含有兆堿基的多核苷酸)，并且便于高效的多核苷酸操作。如實(shí)施例1-6中所示(也參見(jiàn)圖5B、圖6-9和圖11的標(biāo)記度量)，本文中的實(shí)施方式可以以高的標(biāo)記速率和低的假陽(yáng)性(FP)和假陰性(FN)率得到純化的多核苷酸。所述多核苷酸可以在隨后被回收和分析。

多孔基質(zhì)

根據(jù)某些實(shí)施方式，提供了一種多孔基質(zhì)。所述多孔基質(zhì)可以包含孔眼以允許分子例如標(biāo)記物和非多核苷酸分子(例如將要從樣品中除去的分子)進(jìn)、出所述基質(zhì)和在所述基質(zhì)內(nèi)的移動(dòng)。在某些實(shí)施方式中，多孔基質(zhì)從前體材料形成。例如，液體瓊脂糖溶液可以在冷卻后形成基質(zhì)。因此，在某些實(shí)施方式中，通過(guò)將多核苷酸與所述前體材料相接觸，然后形成基質(zhì)以使所述多核苷酸被包埋在其中，將所述多核苷酸包埋在所述多孔基質(zhì)中。

在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)包含合成聚合物、天然存在的聚合物或兩者的組合。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)包含瓊脂糖基質(zhì)、聚丙烯酰胺基質(zhì)、明膠基質(zhì)、膠原蛋白基質(zhì)、纖維蛋白基質(zhì)、殼聚糖基質(zhì)、藻酸鹽基質(zhì)、透明質(zhì)酸基質(zhì)或所列出的條目的兩者或更多者，例如所列出的條目的2、3、4、5、6、7或8者的組合。在某些實(shí)施方式中，將兩種或更多種列出的材料的前體的組合合并，并形成為多孔基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，形成由兩種或更多種列出的材料形成的多孔基質(zhì)，然后合并。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)是瓊脂糖基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)是基于多糖的基質(zhì)。作為一些實(shí)例，例如核酸，可以在水性環(huán)境中溶解。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)包含水性環(huán)境。在某些實(shí)施方式中，所述基質(zhì)本身被布置在水性環(huán)境例如水性緩沖液中。

對(duì)于多孔基質(zhì)來(lái)說(shuō)，取決于多孔基質(zhì)的所需功能，包含一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)可能是有用的。例如，不受任何特定理論限制，通過(guò)在基質(zhì)中包含親水官能團(tuán)，可以便于從基質(zhì)中除去疏水性材料。例如，不受任何特定理論限制，通過(guò)基質(zhì)中帶正電荷的官能團(tuán)，可以便于多核苷酸在所述基質(zhì)中的固定化。因此，在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)包含硅烷、帶正電荷的基團(tuán)、帶負(fù)電荷的基團(tuán)、兩性離子基團(tuán)、極性基團(tuán)、親水性基團(tuán)、疏水性基團(tuán)，或所列出的條目的兩者或更多者，例如所列出的條目的2、3、4、5、6或7者的組合。

薄層多孔基質(zhì)

當(dāng)在本文中使用時(shí)，薄層多孔基質(zhì)是指厚度小于其寬度或長(zhǎng)度的多孔基質(zhì)材料，其中所述厚度不超過(guò)999微米。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)具有不超過(guò)999微米的厚度，例如約1微米、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、960、970、980、990、991、992、993、994、995、996、997、998或999微米，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。在某些實(shí)施方式中，所述薄層具有約1微米至約999微米、1微米至800微米、1微米至600微米、1微米至400微米、1微米至200微米、1微米至150微米、1微米至100微米、10微米至800微米、10微米至600微米、10微米至400微米、10微米至200微米、10微米至150微米、10微米至100微米、20微米至800微米、20微米至600微米、20微米至400微米、20微米至200微米、20微米至100微米、20微米至150微米、50微米至800微米、50微米至600微米、50微米至400微米、50微米至200微米、50微米至100微米、50微米至150微米、100微米至800微米、100微米至600微米、100微米至400微米或100微米至200微米的厚度。

在某些實(shí)施方式中，薄層多孔基質(zhì)從前體材料形成。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)從含有包含至少一種多核苷酸的生物樣品的前體材料形成。例如，可以將生物樣品添加到所述多孔基質(zhì)的液體前體，使得當(dāng)將所述液體前形成為多孔基質(zhì)時(shí)，所述生物樣品可以固定化在其中。

在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)在所述基質(zhì)形成時(shí)不含所述生物樣品或多核苷酸?？梢岳缤ㄟ^(guò)施加電場(chǎng)，將所述生物樣品或多核苷酸添加到所述薄層多孔基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，在所述多孔基質(zhì)形成的同時(shí)添加所述生物樣品或多核苷酸。

在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)與基材結(jié)合。廣泛的各種基材可以與本文中的實(shí)施方式聯(lián)合使用。在某些實(shí)施方式中，所述基材是剛性的。在某些實(shí)施方式中，所述基材是柔性的。在某些實(shí)施方式中，所述基材包含載片、容器或片材的表面。在某些實(shí)施方式中，形成所述薄層多孔基質(zhì)以使所述基材限定了所述薄層多孔基質(zhì)的至少一個(gè)側(cè)面。在某些實(shí)施方式中，薄層多孔基質(zhì)被形成在所述基材與另一個(gè)表面或一組表面之間，由此限定了所述薄層多孔基質(zhì)的厚度、直徑或體積中的至少一者。例如，可以將液體基質(zhì)前體例如瓊脂糖在模具中冷卻以形成薄層多孔基質(zhì)。例如，較厚的多孔基質(zhì)可以被機(jī)械或化學(xué)操作，例如通過(guò)剃除、切除、磨除或溶解掉一部分基質(zhì)以便將它形成為薄層。在某些實(shí)施方式中，將前體材料放置在基材上并鋪展成薄層，其形成所述多孔基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，將所述基材包埋在所述薄層多孔基質(zhì)中。任選地，所述基材包含如本文中所述包含多個(gè)納米或微米尺度的開(kāi)孔的網(wǎng)。

“適形于”基材的薄層多孔基質(zhì)是指所述薄層多孔基質(zhì)的主表面(即具有最大表面積的兩個(gè)表面之一)被放置成平行或基本上平行于所述基材的主表面。如果當(dāng)在側(cè)視圖中觀察(以便將兩個(gè)直徑的表述合并在單一平面內(nèi))時(shí)，所述薄層多孔基質(zhì)的主表面的最長(zhǎng)直徑平行于所述基材的主表面的最長(zhǎng)直徑或以小于15°的角與所述基材的主表面相交，則所述薄層多孔基質(zhì)的主表面被認(rèn)為基本上平行于所述基材的主表面。在某些實(shí)施方式中，使所述薄層多孔基質(zhì)適形于所述基材，使得所述基材被包埋在所述薄層多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，使所述薄層多孔基質(zhì)適形于所述基材，使得它以基本上平坦的構(gòu)型被布置在所述基材上方。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“基本上平坦”以及該根術(shù)語(yǔ)的變化形式是指所述薄層多孔基質(zhì)不具有相接觸的兩個(gè)不相鄰的邊，并且最長(zhǎng)的直徑和與其垂直的直徑各自分別為當(dāng)所述薄層多孔基質(zhì)以完全平坦但不形變的構(gòu)型鋪展時(shí)的最長(zhǎng)直徑和與其垂直的直徑的至少80％。在某些實(shí)施方式中，在從所述多孔基質(zhì)除去非多核苷酸的整個(gè)過(guò)程中，薄層多孔基質(zhì)保持以基本上平坦的構(gòu)型布置在所述基材上方。在某些實(shí)施方式中，在所述多核苷酸被標(biāo)記時(shí)，薄層多孔基質(zhì)保持以基本上平坦的構(gòu)型布置在所述基材上方。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)被固定化在所述基材上。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)被共價(jià)結(jié)合到所述基材。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)被脫離但仍緊密貼近于所述表面，使得所述層在整個(gè)處理期間保持基本上平坦地延伸。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)采取基本上平坦的構(gòu)型，并且所述薄層多孔基質(zhì)的最長(zhǎng)直徑上的所有點(diǎn)距所述基材不超過(guò)100微米，例如距所述基材不超過(guò)100微米、99、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、5、6、5、4、3、2或1微米。

在某些實(shí)施方式中，薄層多孔基質(zhì)被維持在基本上平坦的構(gòu)型。所述薄層多孔基質(zhì)可以在所述樣品處理的整個(gè)過(guò)程中被維持在基本上平坦的構(gòu)型。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)通過(guò)例如網(wǎng)或織帶被系留到所述基材，所述網(wǎng)或織帶被配置成將所述薄層多孔基質(zhì)維持在基本上平坦的構(gòu)型并緊密貼近于所述基材。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)壓力、摩擦或電磁力中的至少一者將所述薄層多孔基質(zhì)維持在基本上平坦的構(gòu)型并緊密貼近于所述基材。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)被放置在從所述基材突出的兩個(gè)或更多個(gè)特征例如柱狀物之間，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200或500個(gè)特征，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。適合于本文中的某些實(shí)施方式的特征的實(shí)例包括在所述基材上由聚合物涂層例如PTFE形成的柱狀物(參見(jiàn)例如圖17A-B)。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)包含螺紋、縫合、織帶、網(wǎng)、夾子或織物中的至少一者的附連，將所述薄層多孔基質(zhì)維持在基本上平坦的構(gòu)型并緊密貼近于所述表面。任選地，所述基材包含第一網(wǎng)，并且將包含第二網(wǎng)的表面放置在所述薄層多孔基質(zhì)的與所述基材相反的側(cè)面上(即所述薄層多孔基質(zhì)被夾在兩個(gè)網(wǎng)之間)，以維持所述層在布置在所述基材上方的位置中。不受任何理論限制，據(jù)設(shè)想將薄層多孔基質(zhì)置于網(wǎng)基材和第二網(wǎng)表面之間，可以便于固定化在所述薄層多孔基質(zhì)中的多核苷酸的洗滌和/或標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，所述附連允許接近所述薄層多孔基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述附連允許所述薄層多孔基質(zhì)的水性相與水性溶液流體連通?？梢詫⑺霰佣嗫谆|(zhì)浸泡在所述水性溶液中。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)未附連到所述表面或者被可逆地附連到所述表面。在本文中設(shè)想了當(dāng)從所述薄層多孔基質(zhì)回收核酸時(shí)，脫離的基質(zhì)可能便于所述回收。

基材

根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，可以使用各種不同的基材。

在某些實(shí)施方式中，所述基材包含載片。任選地，將所述載片用聚合物例如PTFE涂層。任選地，所述聚合物形成所述基材的可以將薄層多孔基質(zhì)在所述基材上保持在位的特征，例如兩個(gè)或更多個(gè)柱狀物，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、90、100、120、150、200、250、300、400、500或1000個(gè)柱狀物，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。圖17A和17B是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，載片上的PTFE涂層的環(huán)的PTFE特征的示意圖。所述PTFE特征可以包含用于薄層多孔基質(zhì)的持留柱狀物。圖17A示出了涂層在載片162上的PTFE環(huán)163的內(nèi)徑周?chē)腜TFE特征171，其用于在處理期間將薄層多孔基質(zhì)保持在位。圖17B示出了在涂層在載片172上的PTFE環(huán)173內(nèi)部的整個(gè)孔上方均勻放置的PTFE特征171，其用于在處理期間將薄層多孔基質(zhì)保持在位。

在某些實(shí)施方式中，所述基材是剛性的。在某些實(shí)施方式中，所述基材是柔性的。在某些實(shí)施方式中，所述基材包含載片、容器或片材。

在某些實(shí)施方式中，所述基材包含網(wǎng)，例如尼龍網(wǎng)或金屬網(wǎng)或聚合物網(wǎng)例如PTFE網(wǎng)。所述網(wǎng)可以包含多個(gè)開(kāi)孔。所述多個(gè)開(kāi)孔可以具有至少0.1nm的直徑，例如0.1nm、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、700、900、1000、2000、3000、5000、9000或10000nm，包括任兩個(gè)列出的值之間的范圍，例如0.1nm至10mm、0.1nm至1mm、0.1nm至500nm、0.1nm至100nm、0.1nm至10nm、1nm至10mm、1nm至1mm、1nm至500nm、1nm至100nm、1nm至10nm、10nm至1mm、10nm至500nm、10nm至100nm、100nm至10mm或100nm至1mm。在某些實(shí)施方式中，所述網(wǎng)的開(kāi)孔具有近似相同尺寸的直徑。在某些實(shí)施方式中，所述網(wǎng)的開(kāi)孔具有不同尺寸的直徑。

多核苷酸

根據(jù)本文中的實(shí)施方式，可以處理各種不同的多核苷酸。基因組多核苷酸可以包括DNA、RNA或DNA與RNA的組合。因此，在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含DNA。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含RNA。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸是雙鏈的。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸是單鏈的。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含DNA-RNA雜合體。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含至少約100千堿基(kb)，例如至少約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、15,000、20,000、30,000或40,000千堿基，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。

基因組多核苷酸可以包含各種不同的修飾，例如表觀遺傳修飾例如甲基化。因此，在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含對(duì)多核苷酸骨架的一種或多種修飾，例如甲基化。在某些實(shí)施方式中，一種或多種修飾已從所述多核苷酸移除。

生物樣品

根據(jù)本文中的實(shí)施方式，可以提供各種不同的包含多核苷酸的生物樣品。在某些實(shí)施方式中，所述樣品包含一個(gè)或多個(gè)全細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述樣品包含一個(gè)或多個(gè)單細(xì)胞生物體。在某些實(shí)施方式中，所述樣品包含多細(xì)胞生物體的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述樣品包含多細(xì)胞生物體的組織。在某些實(shí)施方式中，所述樣品包含兩種或更多種細(xì)胞類(lèi)型的組合。

在某些實(shí)施方式中，所述樣品包含至少一個(gè)細(xì)胞的至少一部分。在某些實(shí)施方式中，所述樣品包含與其他部分分離的細(xì)胞的含有核酸的部分。例如，可以在沉降速率的基礎(chǔ)上(例如通過(guò)離心)將核與細(xì)胞的其他部分分離。

在某些實(shí)施方式中，所述樣品包含細(xì)胞懸液、核懸液、細(xì)胞器懸液、細(xì)胞勻漿物、組織勻漿物、全生物體勻漿物和生物流體中的至少一者。

非多核苷酸及其去除

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“非多核苷酸”包括該根術(shù)語(yǔ)的變化形式，是指來(lái)自于生物樣品的不是多核苷酸的任何分子、復(fù)合物或結(jié)構(gòu)。示例性的非多核苷酸包括細(xì)胞中存在的生物分子(除了多核苷酸之外)，包括但不限于多肽、氨基酸、單核苷酸、糖類(lèi)、脂類(lèi)、輔因子、無(wú)機(jī)分子、細(xì)胞器及其組分、細(xì)胞碎片等。在某些實(shí)施方式中，所述被除去的非多核苷酸包含蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖類(lèi)、細(xì)胞器和細(xì)胞碎片中的至少一者。

由于非多核苷酸分子的存在可以干擾多核苷酸的操作、處理和分析，因此在某些實(shí)施方式中，將非多核苷酸分子與所述多核苷酸分離。在某些實(shí)施方式中，將非多核苷酸分子從所述多孔基質(zhì)除去，而此時(shí)所述多核苷酸仍保持在所述多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，在從所述多孔基質(zhì)除去之前，非多核苷酸經(jīng)歷修飾、處理和/或降解。

在某些實(shí)施方式中，當(dāng)所述非多核苷酸被除去時(shí)，多核苷酸保持固定化在所述多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)所述非多核苷酸被除去時(shí)，所述多核苷酸保持在所述基質(zhì)中，但不必定被固定化。

不受任何特定理論限制，所述多孔基質(zhì)中的非多核苷酸分子可以被修飾或降解，以便于它們從所述多孔基質(zhì)離開(kāi)。因此，在某些實(shí)施方式中，除去所述非多核苷酸分子包括將所述多孔基質(zhì)與彈性蛋白酶、膠原蛋白酶、脂肪酶、糖水解酶、果膠酶、果膠溶解酶、淀粉酶、RNA酶、透明質(zhì)酸酶、幾丁質(zhì)酶、gluculase、溶壁酶、酵母裂解酶、溶菌酶、labiase、消色肽酶或其組合相接觸。在某些實(shí)施方式中，除去所述非多核苷酸分子包括將所述多孔基質(zhì)與蛋白酶相接觸。在某些實(shí)施方式中，除去非多核苷酸包括施加電場(chǎng)以除去至少一些所述非多核苷酸。

所述多核苷酸的純化可以包括將非多核苷酸包括修飾或降解的非多核苷酸從所述多孔基質(zhì)洗出去。因此，在某些實(shí)施方式中，除去非多核苷酸分子包括將所述多孔基質(zhì)與去污劑、離液劑、緩沖劑、螯合劑、水溶性有機(jī)溶劑、聚合物(例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、乙二醇)、鹽、酸、堿、還原劑或其組合相接觸。在某些實(shí)施方式中，除去所述非多核苷酸分子包括用包含緩沖劑、去污劑、離液劑、螯合劑、醇、酸、堿、還原劑、聚合物或其組合的溶液洗滌所述多孔基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，除去非多核苷酸分子包括施加電場(chǎng)以除去至少一些非多核苷酸分子。

在某些實(shí)施方式中，從所述多孔基質(zhì)純化所述多核苷酸，其在所述基質(zhì)中沒(méi)有進(jìn)行任何標(biāo)記或表征。然后可以將所述多核苷酸用于專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員已知的各種下游應(yīng)用中的任一種。設(shè)想了使用本文中所描述的方法，可以純化特別粗的起始原料(例如全細(xì)胞提取物)，并提供比使用標(biāo)準(zhǔn)柱塞的純化更干凈的核酸，這是因?yàn)榉媳疚闹械哪承?shí)施方式的方法提供了增強(qiáng)的酶和化學(xué)洗滌動(dòng)力學(xué)。

在除去非多核苷酸分子之前在所述多孔基質(zhì)中進(jìn)行所述樣品的一些處理，可能是有用的。例如，在除去其他組分之前將所述樣品的含有核酸的組分集中到特定區(qū)域，可能是有用的。在某些實(shí)施方式中，在除去非多核苷酸分子之前進(jìn)行基質(zhì)內(nèi)核富集。

標(biāo)記

根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，可以使用各種不同的方法和組合物來(lái)標(biāo)記多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸經(jīng)歷位點(diǎn)特異性標(biāo)記，以例如標(biāo)記一個(gè)或多個(gè)序列基序。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸經(jīng)歷非位點(diǎn)特異性標(biāo)記，以例如標(biāo)記骨架。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸經(jīng)歷位點(diǎn)特異性標(biāo)記和非位點(diǎn)特異性標(biāo)記。

標(biāo)記可以在固定化在本文中描述的多孔基質(zhì)中的多核苷酸上進(jìn)行，和/或可以在從所述基質(zhì)分離所述多核苷酸之后進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸在所述基質(zhì)中進(jìn)行標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸從所述基質(zhì)分離，然后進(jìn)行標(biāo)記。某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸在所述基質(zhì)中經(jīng)歷至少一個(gè)標(biāo)記事件，并且在從所述基質(zhì)分離后經(jīng)歷至少一個(gè)標(biāo)記事件。例如，在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸在所述基質(zhì)內(nèi)經(jīng)歷位點(diǎn)特異性標(biāo)記，并在與所述基質(zhì)分離后經(jīng)歷非位點(diǎn)特異性標(biāo)記。

在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸被兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記物例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)標(biāo)記物標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記物是不同的。在某些實(shí)施方式中，兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記物是相同的。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸用至少一種位點(diǎn)特異性標(biāo)記物和至少一種不同于所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記物的非序列特異性標(biāo)記物標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸用兩種或更多種位點(diǎn)特異性標(biāo)記物標(biāo)記，并且所述非序列特異性標(biāo)記物不同于所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記物。

在某些實(shí)施方式中，將第一多核苷酸用第一標(biāo)記物標(biāo)記，并且將第二多核苷酸用第二標(biāo)記物標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，所述第一和第二標(biāo)記物是相同的。在某些實(shí)施方式中，所述第一和第二標(biāo)記物是不同的。在某些實(shí)施方式中，將第三多核苷酸用第三標(biāo)記物標(biāo)記。所述第三標(biāo)記物可以與所述第一和第二標(biāo)記物中的任一者或兩者相同或不同。

根據(jù)本文中的實(shí)施方式，可以使用各種不同的用于位點(diǎn)特異性標(biāo)記的方法。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸與序列特異性探針相接觸。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸是雙鏈的，并且位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括在第一序列基序處切刻所述多核苷酸從而形成至少一個(gè)切口，使得所述多核苷酸在與所述一個(gè)或多個(gè)切口相鄰處保持雙鏈，并且用所述第一標(biāo)記物標(biāo)記所述一個(gè)或多個(gè)切口。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)核苷酸被并入到所述切口中。所述并入的核苷酸可以包含便于標(biāo)記的組成部分，例如可逆終止子、反應(yīng)性基團(tuán)或標(biāo)記物本身。

適合情況下，探針是包含本文中所描述的標(biāo)記物的核酸(單個(gè)或多個(gè))。在某些實(shí)施方式中，探針是序列特異性的(例如AGGCT或一些其他特定堿基序列)。在某些實(shí)施方式中，探針被隨機(jī)產(chǎn)生。如本文中所述，探針可以在用戶(hù)愿望的基礎(chǔ)上選擇或構(gòu)建，以使所述探針結(jié)合于目標(biāo)序列，或者在一種可選方案中結(jié)合于特定DNA聚合物上目標(biāo)序列或其他區(qū)域上游或下游的序列(即探針結(jié)合以便位于目標(biāo)區(qū)域兩側(cè)或?qū)⒛繕?biāo)區(qū)域夾在其中)。探針可以與懸垂片一樣長(zhǎng)(即最多約1000堿基)。適合情況下，探針長(zhǎng)度在1至約500堿基或約1至100堿基或約3至50堿基范圍內(nèi)，或者長(zhǎng)度甚至在約5至約20堿基范圍內(nèi)。

在某些實(shí)施方式中，多核苷酸例如RNA或DNA，通過(guò)將探針雜交到所述多核苷酸的單鏈來(lái)標(biāo)記。所述探針可以與所述RNA或DNA的鏈或其一部分互補(bǔ)。在某些實(shí)施方式中，所述探針與特定序列基序互補(bǔ)。在某些實(shí)施方式中，提供多個(gè)探針以便與多個(gè)特異性序列基序互補(bǔ)，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5,000或10,000個(gè)探針，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。在某些實(shí)施方式中，所述探針具有隨機(jī)序列。在某些實(shí)施方式中，提供具有多個(gè)隨機(jī)序列的探針。

在某些實(shí)施方式中，雙鏈DNA可以如下標(biāo)記：首先通過(guò)提高溫度或使用有機(jī)溶劑操作來(lái)解開(kāi)某些基因組區(qū)域的雙鏈之間的氫鍵以打開(kāi)所謂的D-環(huán)，然后與對(duì)單鏈區(qū)具有相等或更高親和性的至少一種特異性探針雜交，隨后退火回到相對(duì)穩(wěn)定的形式。因此，在某些實(shí)施方式中，雙鏈DNA可以如本文中所述用探針標(biāo)記，而不用在任一條鏈上形成切口。在某些實(shí)施方式中，可以在單一鏈上打開(kāi)多個(gè)D-環(huán)。因此，可以將多個(gè)探針退火到特定雙鏈DNA。

在某些實(shí)施方式中，標(biāo)記包括將標(biāo)記物通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移到所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，所述甲基轉(zhuǎn)移酶特異性地甲基化序列基序。因此，標(biāo)記可以包括通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶將標(biāo)記物轉(zhuǎn)移到序列基序。示例性的適合的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)包括但不限于M.BseCI(在N6處甲基化5'-ATCGAT-3'序列內(nèi)的腺嘌呤)、M.Taql(在N6處甲基化5'-TCGA-3'序列內(nèi)的腺嘌呤)和M.Hhal(在C5處甲基化5'-GCGC-3'序列內(nèi)的第一個(gè)胞嘧啶)。在某些實(shí)施方式中，兩種或更多種甲基轉(zhuǎn)移酶提供兩種或更多種標(biāo)記物，其可以是相同或不同的。

在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括將反應(yīng)性基團(tuán)轉(zhuǎn)移到所述第一序列基序；以及將標(biāo)記物偶聯(lián)到所述第一反應(yīng)性基團(tuán)。

在某些實(shí)施方式中，雙鏈多核苷酸如下進(jìn)行標(biāo)記：首先在雙鏈多核苷酸的第一鏈產(chǎn)生切口。適合情況下，這種切口的形成在一個(gè)或多個(gè)序列特異性位置處進(jìn)行，盡管所述切口形成也可以在一個(gè)或多個(gè)非特異性位置、包括隨機(jī)或非特異性位置處進(jìn)行。適合情況下，切口形成可以通過(guò)將所述雙鏈多核苷酸暴露于形成切口的內(nèi)切核酸酶或切口酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。適合情況下，切口酶是高度序列特異性的，意味著它們以高度特異性結(jié)合特定堿基序列(基序)。切口酶可以例如從New EnglandBioLabs獲得(可登陸萬(wàn)維網(wǎng)址www.neb.com)。示例性的切口酶包括但不限于Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII及其組合。切口形成也可以通過(guò)在多核苷酸鏈中進(jìn)行斷裂或切割的其他酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種斷裂或切口也可以通過(guò)暴露于電磁輻射(例如UV光)、一種或多種自由基等來(lái)實(shí)現(xiàn)。切口可以通過(guò)這些技術(shù)中的一種或多種來(lái)實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方式中，適合情況下，將替換堿基摻入到雙鏈多核苷酸的第一鏈(即有切口的鏈)中，包括將所述多核苷酸與聚合酶、一種或多種核苷酸、連接酶或其任何組合相接觸。在某些實(shí)施方式中，在標(biāo)記有切口的多核苷酸之后用連接酶處理，可以恢復(fù)所述雙鏈多核苷酸的完整性并顯著提高得到的鏈的強(qiáng)度。

在某些實(shí)施方式中，靶向相同序列基序但在相反鏈處產(chǎn)生切口的切口酶，被用于靶向特定DNA鏈以最小化脆弱位點(diǎn)的形成。在某些實(shí)施方式中，切口酶已被修飾，以?xún)H僅結(jié)合到雙鏈DNA的一條鏈。在某些實(shí)施方式中，切口酶被用于靶向來(lái)自于第一DNA分子的單鏈和來(lái)自于第二DNA分子的單鏈。在某些這些實(shí)施方式中，來(lái)自于所述第一DNA的單鏈被第一切口酶靶向，并且來(lái)自于所述第二DNA分子的互補(bǔ)鏈被識(shí)別與所述第一切口酶相同的序列基序的第二切口酶靶向。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于所述鏈之一來(lái)說(shuō)，延伸方向被逆轉(zhuǎn)。例如，在某些實(shí)施方式中，從切口形成位點(diǎn)的延伸對(duì)于第一DNA分子來(lái)說(shuō)以一個(gè)方向進(jìn)行，而對(duì)于第二DNA分子來(lái)說(shuō)以相反方向進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，從切口形成位點(diǎn)的延伸對(duì)于DNA分子的上鏈來(lái)說(shuō)以一個(gè)方向進(jìn)行，并且對(duì)于同一DNA分子的下鏈來(lái)說(shuō)以相反方向進(jìn)行。

在某些實(shí)施方式中，對(duì)包含第一多核苷酸鏈和第二多核苷酸鏈的雙鏈多核苷酸進(jìn)行處理，以產(chǎn)生所述第一多核苷酸鏈的未雜交的懸垂片和所述第二多核苷酸鏈上的對(duì)應(yīng)區(qū)域，所述未雜交的懸垂片包含約1至約1000個(gè)堿基；沿著所述第二多核苷酸鏈的對(duì)應(yīng)區(qū)域延伸所述第一多核苷酸鏈；以及至少標(biāo)記所述未雜交的懸垂片的一部分、所述延伸的第一多核苷酸鏈的一部分。適合情況下，標(biāo)記可以如下實(shí)現(xiàn)：(a)將至少一個(gè)互補(bǔ)的探針結(jié)合到未雜交的懸垂片的至少一部分，所述探針包含一種或多種標(biāo)記物；(b)利用包含一種或多種標(biāo)記物的核苷酸作為替換堿基，所述替換堿基是沿著所述第二多核苷酸鏈的對(duì)應(yīng)區(qū)域延伸的所述第一多核苷酸鏈的一部分；或(a)與(b)的任何組合。通過(guò)這種方式，懸垂片、填充到間隙中的堿基或兩者，可以被標(biāo)記。

各種不同物質(zhì)可以充當(dāng)可以在本文中提供的方法中使用的標(biāo)記物。標(biāo)記物可以包括例如熒光團(tuán)、量子點(diǎn)、樹(shù)枝狀聚合物、納米絲、珠子、半抗原、鏈親和素、親和素、中性親和素、生物素和反應(yīng)性基團(tuán)、肽、蛋白質(zhì)、磁珠、放射性標(biāo)記物或非光學(xué)標(biāo)記物。在某些實(shí)施方式中，所選的標(biāo)記物是熒光團(tuán)或量子點(diǎn)。

在某些實(shí)施方式中，本文中描述的至少一種標(biāo)記物包含非光學(xué)標(biāo)記物。各種不同的非光學(xué)標(biāo)記物可以與本文中的實(shí)施方式聯(lián)合使用。在某些實(shí)施方式中，非光學(xué)標(biāo)記物包含電子標(biāo)記物。示例性的電子標(biāo)記物包括但不限于具有強(qiáng)電荷的分子，例如離子如金屬離子、帶電荷的氨基酸側(cè)鏈或其他陽(yáng)離子或陰離子。電子標(biāo)記物可以例如通過(guò)當(dāng)所述標(biāo)記物被布置在檢測(cè)器中時(shí)的電導(dǎo)率(或電阻率)來(lái)檢測(cè)。在某些實(shí)施方式中，納米通道包含電極，其被配置成通過(guò)確定布置在所述通道中的物質(zhì)的電導(dǎo)率或電阻率來(lái)確定電子標(biāo)記物的存在或不存在。在某些實(shí)施方式中，所述非光學(xué)標(biāo)記物包含金屬、金屬氧化物或氧化硅組成部分。在某些實(shí)施方式中，所述非光學(xué)標(biāo)記物包含含有金屬、金屬氧化物或其他氧化物的組成部分(例如納米粒子)。特定金屬或氧化物組成部分的存在可以例如通過(guò)核磁共振來(lái)檢測(cè)。在某些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物被配置成在某些條件(例如pH的改變)下釋放組成部分例如質(zhì)子或陰離子，并檢測(cè)釋放的組成部分的存在或不存在。

在某些實(shí)施方式中，位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括將所述多核苷酸的序列基序與特異性結(jié)合所述序列基序的結(jié)合組成部分相接觸。各種不同的結(jié)合組成部分可以與本文中的實(shí)施方式聯(lián)合使用。示例性的結(jié)合組成部分包括但不限于三螺旋寡核苷酸、肽、核酸、糖類(lèi)、聚酰胺、鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活物樣(TAL)效應(yīng)物DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、限制性酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗體，以及兩種或更多種所列出的結(jié)合組成部分的組合。

在某些實(shí)施方式中，探針包括下列一者或多者：有機(jī)熒光團(tuán)，量子點(diǎn)，樹(shù)枝狀聚合物，納米絲，珠子，Au珠，順磁性珠子，磁珠，放射性標(biāo)記物，聚苯乙烯珠，聚乙烯珠，肽，蛋白質(zhì)，半抗原，抗體，抗原，鏈親和素，親和素，中性親和素，生物素，核苷酸，寡核苷酸，序列特異性結(jié)合因子例如工程化改造的限制性酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、鋅指結(jié)合蛋白等。在某些實(shí)施方式中，所述探針包括熒光團(tuán)-淬滅劑對(duì)。探針的一種配置可以包括將熒光團(tuán)附連到探針的第一末端，并將適合的淬滅劑連接到探針的第二末端。因此，當(dāng)所述探針未雜交時(shí)，所述淬滅劑可以阻止熒光團(tuán)產(chǎn)生熒光，而當(dāng)所述探針雜交到靶序列時(shí)，探針被線(xiàn)性化，因此淬滅劑遠(yuǎn)離熒光團(tuán)并允許熒光團(tuán)在被適合波長(zhǎng)的電磁輻射激發(fā)時(shí)產(chǎn)生熒光。在某些實(shí)施方式中，第一探針包括FRET對(duì)的第一熒光團(tuán)，并且第二探針包括FRET對(duì)的第二熒光團(tuán)。因此，所述第一探針和第二探針與彼此的FRET半徑內(nèi)的單一懸垂片或一對(duì)懸垂片的雜交，可以允許通過(guò)FRET進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移。在某些實(shí)施方式中，第一探針包括FRET對(duì)的第一熒光團(tuán)，并且在被并入以填補(bǔ)相應(yīng)間隙的核苷酸上的標(biāo)記物可以包括FRET對(duì)的第二熒光團(tuán)。因此，所述第一探針與懸垂片的雜交和相應(yīng)間隙內(nèi)的標(biāo)記的核苷酸，可以允許通過(guò)FRET進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移。

在某些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記包括將所述多核苷酸與染料或染色劑相接觸。在某些實(shí)施方式中，所述染料或染色劑是非序列特異性標(biāo)記物例如嵌入劑?？梢愿鶕?jù)本文中的實(shí)施方式使用的示例性的非序列特異性標(biāo)記物包括YOYO、POPO、TOTO、SYBR Green I(Molecular Probes)、PicoGreen(Molecular Probes)、碘化丙啶、溴化乙錠等。

從多孔基質(zhì)分離多核苷酸

在多核苷酸已在多孔基質(zhì)中經(jīng)歷所需處理后，從所述多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸可能是有用的，以例如分析或表征所述多核苷酸。

在某些實(shí)施方式中，在非多核苷酸已被除去之后，從所述多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸。

根據(jù)本文中的實(shí)施方式，可以使用各種不同的方法從所述多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，分離包括以下至少一者：融化所述多孔基質(zhì)、消化所述多孔基質(zhì)、降解所述多孔基質(zhì)、溶解所述多孔基質(zhì)、電洗脫、通過(guò)篩的離心、轉(zhuǎn)印到膜上、透析步驟或兩種或更多種所列出的方法的組合。在某些實(shí)施方式中，例如在所述多孔基質(zhì)包含瓊脂糖的實(shí)施方式中，將所述多孔基質(zhì)融化并與瓊脂糖酶接觸，以從所述多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，在基質(zhì)中以序列特異性方式純化和標(biāo)記DNA之后，通過(guò)融化/消化(例如對(duì)于瓊脂糖來(lái)說(shuō))、透析以及隨后與流動(dòng)緩沖液混合，將它回收。在某些實(shí)施方式中，所述流動(dòng)緩沖液包含非特異性多核苷酸標(biāo)記物，例如DNA骨架染色染料(例如YOYO或POPO)。所述非特異性標(biāo)記可便于隨后在例如流體通道如Irys^TM系統(tǒng)(Bionano genomics)中的分析。

在某些實(shí)施方式中，在從所述多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸之后，對(duì)所述多核苷酸進(jìn)行分析和/或表征。如果所述多核苷酸已用至少一種位點(diǎn)特異性標(biāo)記物標(biāo)記，則可以檢測(cè)所述多核苷酸特征性的位點(diǎn)特異性標(biāo)記的模式。在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)兩種或更多種位點(diǎn)特異性標(biāo)記物的模式。在某些實(shí)施方式中，參照所述多核苷酸的非特異性標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)位點(diǎn)特異性標(biāo)記的模式。

根據(jù)本文中的實(shí)施方式，用于檢測(cè)標(biāo)記模式的方法可以包括將所述多核苷酸線(xiàn)性化。將多核苷酸線(xiàn)性化的手段可以包括使用液體流動(dòng)、毛細(xì)管流動(dòng)、對(duì)流流動(dòng)的剪切力、電場(chǎng)、介電場(chǎng)、熱梯度、磁場(chǎng)或其組合(例如使用物理約束和電場(chǎng))，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他方法。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸在流體通道例如微通道或納米通道例如Irys^TM系統(tǒng)(Bionano Genomics)中線(xiàn)性化并進(jìn)行分析。納米通道和涉及納米通道使用的方法的實(shí)例，提供在美國(guó)公開(kāi)號(hào)2011/0171634和2012/0237936中，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)參考并入本文。

在某些實(shí)施方式中，所述流體通道包含微通道。在某些實(shí)施方式中，所述流體通道包含納米通道。適合的流體納米通道區(qū)段具有小于約1000nm、小于約500nm、或小于約200nm、或小于約100nm、或甚至小于約50nm、約10nm、約5nm、約2nm或甚至小于約0.5nm的特征性橫截面維度。適合情況下，流體納米通道區(qū)段具有小于分子的回轉(zhuǎn)半徑的約2倍的特征性橫截面維度。在某些實(shí)施方式中，所述納米通道具有至少約所述分子的持續(xù)長(zhǎng)度的特征性橫截面維度。適合于本發(fā)明的流體納米通道區(qū)段具有至少約100nm、至少約500nm、至少約1000nm、至少約2微米、至少約5微米、至少約10微米、至少約1mm或甚至至少約10mm的長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方式中，流體納米通道區(qū)段以每立方厘米至少1個(gè)流體納米通道區(qū)段的密度存在。

分析可以包括將所述多核苷酸上的位點(diǎn)特異性標(biāo)記模式與參比多核苷酸的進(jìn)行比較。這種比較可以指示所述多核苷酸的尺寸，突變、遺傳標(biāo)志物和/或基因組重排事件例如缺失、重復(fù)、倒位等的存在或不存在。在某些實(shí)施方式中，將第一標(biāo)記物、第二標(biāo)記物或所述第一與第二標(biāo)記物的組合的模式與參比DNA上標(biāo)記物的模式進(jìn)行比較。在某些實(shí)施方式中，所述參比DNA的模式通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。在某些實(shí)施方式中，所述參比DNA的模式在計(jì)算機(jī)中確定。

在某些實(shí)施方式中，在位點(diǎn)特異性標(biāo)記的重疊模式的基礎(chǔ)上組裝多個(gè)模式，由此構(gòu)建多核苷酸圖譜。

處理包含多核苷酸的樣品的方法

根據(jù)某些實(shí)施方式，提供了處理包含多核苷酸的樣品的方法。所述方法可以包括將所述樣品固定化在多孔基質(zhì)中。所述方法可以包括從所述多孔基質(zhì)除去非多核苷酸分子，而同時(shí)所述多核苷酸保留在所述基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，從薄層多孔基質(zhì)除去所述非多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，從所述多孔基質(zhì)除去所述非多核苷酸分子，并將所述多孔基質(zhì)破碎以便形成多個(gè)多孔單元。在某些實(shí)施方式中，在破碎之前從所述基質(zhì)除去非多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，在破碎之前從所述基質(zhì)除去非多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，在破碎之前和破碎之后從所述基質(zhì)除去非多核苷酸分子。不受任何理論限制，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)去除在破碎之后進(jìn)行時(shí)，除去非多核苷酸分子的效率通常更高。在某些實(shí)施方式中，在除去所述非多核苷酸分子之后收集破碎的多孔單元。例如，所述多孔單元可以通過(guò)離心來(lái)收集。在某些實(shí)施方式中，在破碎之前和破碎之后從所述基質(zhì)除去非多核苷酸分子，以便優(yōu)化去除所述非多核苷酸分子的動(dòng)力學(xué)。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸被標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，從所述基質(zhì)分離所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)位點(diǎn)特異性標(biāo)記的模式。

不受任何特定理論限制，增加所述多孔基質(zhì)的相對(duì)表面積可以提高從所述多核苷酸除去非多核苷酸分子的有效性和效率，和/或可以提高在其中標(biāo)記多核苷酸的有效性和效率。因此，在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)處于具有相對(duì)高的表面積的構(gòu)型中，例如作為薄層或作為多個(gè)多孔單元。在某些實(shí)施方式中，將所述樣品包埋在前體材料，然后使所述多孔基質(zhì)形成所需形狀或構(gòu)型。例如，所述前體材料可以是液體，并且可以被傾倒在模具或倉(cāng)室中，以便在所述液體形成多孔基質(zhì)時(shí)使多孔基質(zhì)形成所需形狀。在某些實(shí)施方式中，將所述多孔基質(zhì)成型為具有高表面積的構(gòu)型(例如薄層或多孔單元)，然后例如通過(guò)電磁場(chǎng)或通過(guò)擴(kuò)散將所述樣品添加到所述基質(zhì)。

圖1示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，處理包含多核苷酸的樣品的方法。在某些實(shí)施方式中，在110中將樣品固定化在前體材料中。在120中，可以使所述前體材料形成薄層多孔基質(zhì)。在125中，可以使所述薄層多孔基質(zhì)適形于基材。任選地，可以在所述薄層多孔基質(zhì)形成時(shí)使所述薄層多孔基質(zhì)適形于所述基材。任選地，可以在薄層多孔基質(zhì)形成后使所述薄層多孔基質(zhì)適形于所述基材。在某些實(shí)施方式中，在130中，形成薄層多孔基質(zhì)。在135中，可以使所述薄層多孔基質(zhì)適形于基材。任選地，可以在所述薄層多孔基質(zhì)形成時(shí)使所述薄層多孔基質(zhì)適形于所述基材。任選地，可以在薄層多孔基質(zhì)形成后使所述薄層多孔基質(zhì)適形于所述基材。在140中，可以將所述樣品固定化在所述薄層多孔基質(zhì)中。由此在150中，可以將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中，其中使所述薄層基質(zhì)適形于基材。在160中，可以將所述非多核苷酸分子從布置在所述表面上方的薄層多孔基質(zhì)除去，而所述多核苷酸仍保持固定化在所述薄層多孔基質(zhì)中。在170中，任選地可以從所述基質(zhì)分離所述多核苷酸。在180中，可以將所述多核苷酸標(biāo)記。在190中，任選地，可以檢測(cè)所述多核苷酸特征性的標(biāo)記模式。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸在從所述基質(zhì)分離之后被標(biāo)記。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)于本文中公開(kāi)的這種和其他過(guò)程和方法來(lái)說(shuō)，在所述過(guò)程和方法中執(zhí)行的功能可以以不同順序?qū)嵤４送?，所概括的步驟和操作僅僅作為實(shí)例提供，并且一些所述步驟和操作可以是任選的，合并成較少的步驟和操作，或者擴(kuò)展成其他步驟和操作，而不背離所公開(kāi)的實(shí)施方式的本質(zhì)。

在某些實(shí)施方式中，如本文中所述，當(dāng)所述多核苷酸被固定化在布置在基材上方的薄層多孔基質(zhì)中時(shí)，除去所述非多核苷酸分子。任選地，在不存在施加到薄層多孔基質(zhì)的電場(chǎng)的情況下(例如在不存在電泳的情況下)除去所述非多核苷酸分子。任選地，通過(guò)洗滌除去所述非多核苷酸分子，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50次洗滌，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)所述非多核苷酸分子被去除時(shí)，所述薄層多孔基質(zhì)處于基本上平坦的構(gòu)型中。

在某些實(shí)施方式中，當(dāng)所述多核苷酸被固定化在所述薄層多孔基質(zhì)中時(shí)，當(dāng)所述基材被包埋在所述薄層多孔基質(zhì)中時(shí)，除去所述非多核苷酸分子。任選地，所述薄層基材包含含有多個(gè)開(kāi)孔的網(wǎng)，所述開(kāi)孔具有至少0.1nm的直徑，例如0.1nm、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、700、900、1000、2000、3000、5000、9000或10000nm，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍，例如0.1nm至10mm、0.1nm至1mm、0.1nm至500nm、0.1nm至100nm、0.1nm至10nm、1nm至10mm、1nm至1mm、1nm至500nm、1nm至100nm、1nm至10nm 10nm至1mm、10nm至500nm、10nm至100nm、100nm至10mm或100nm至1mm。不受任何理論限制，據(jù)設(shè)想，根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，所述被包埋的網(wǎng)可以為所述薄層多孔基質(zhì)提供剛性以維持在伸張模式中，以保持所述薄層多孔基質(zhì)的多個(gè)側(cè)面暴露于流體環(huán)境，以獲得更好的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。不受任何理論限制，據(jù)設(shè)想根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，所述被包埋的網(wǎng)可以便于薄層多孔基質(zhì)內(nèi)多核苷酸的標(biāo)記和/或洗滌。任選地，在不存在任何施加到所述薄層多孔基質(zhì)的電場(chǎng)的情況下(例如在不存在電泳的情況下)除去所述非多核苷酸分子。任選地，通過(guò)洗滌除去所述非多核苷酸分子，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50次洗滌，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。

在某些實(shí)施方式中，如本文中所述，至少一些標(biāo)記在所述多核苷酸被固定化在布置在基材上方的薄層多孔基質(zhì)中時(shí)進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，在所述標(biāo)記進(jìn)行時(shí)所述薄層多孔基質(zhì)處于基本上平坦的構(gòu)型中。

在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸從所述多孔基質(zhì)分離，然后進(jìn)行標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸標(biāo)記，然后從所述多孔基質(zhì)分離。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸在所述多孔基質(zhì)中用第一標(biāo)記物標(biāo)記，從所述多孔基質(zhì)移除，然后用第二標(biāo)記物標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，所述第一標(biāo)記物是位點(diǎn)特異性的，并且所述第二標(biāo)記物是非序列特異性的。在某些實(shí)施方式中，所述第一標(biāo)記物是非序列特異性的，并且所述第二標(biāo)記物是位點(diǎn)特異性的。

圖2示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，處理包含多核苷酸的樣品的方法。在某些實(shí)施方式中，將樣品固定化在前體材料中210?？梢允顾銮绑w材料形成多孔基質(zhì)220。在某些實(shí)施方式中，形成多孔基質(zhì)230?？梢詫⑺鰳悠饭潭ɑ谒龆嗫谆|(zhì)中240。在某些實(shí)施方式中，將所述非多核苷酸材料從所述多孔基質(zhì)去除，而所述多核苷酸仍保留在所述多孔基質(zhì)中250。在某些實(shí)施方式中，在去除所述非多核苷酸材料時(shí)，所述多核苷酸保持固定化在所述多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)包含所述固定化的樣品，從而形成包含所述固定化的樣品的多個(gè)多孔單元260。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸標(biāo)記270。任選地，可以從所述基質(zhì)分離所述多核苷酸280。任選地，可以檢測(cè)所述多核苷酸特征性的標(biāo)記模式290。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“多孔單元”和該根術(shù)語(yǔ)的變化形式是指多孔基質(zhì)的片段，其體積不超過(guò)約1000納升，例如不超過(guò)約1000納升、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、40、30、20、10、5或1納升，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。

可以將多孔基質(zhì)破碎成通過(guò)各種不同方法形成的多孔單元。在某些實(shí)施方式中，將所述多孔基質(zhì)研磨或勻漿成多孔單元，例如通過(guò)使用研杵的勻漿。在某些實(shí)施方式中，將所述多孔基質(zhì)切碎成多孔單元。在某些實(shí)施方式中，將所述多孔基質(zhì)搗碎成多孔單元。在某些實(shí)施方式中，將所述多孔基質(zhì)用酶部分消化，由此形成多孔單元。

流體裝置

在某些實(shí)施方式中，本文中所描述的處理多核苷酸的方法，部分或完全在流體裝置中進(jìn)行。流體裝置可用于自動(dòng)或部分自動(dòng)地執(zhí)行本文中描述的處理多核苷酸的方法，例如控制待添加和/或移除的反應(yīng)物的量和順序，進(jìn)行相繼反應(yīng)和/或洗滌，調(diào)節(jié)溫度，調(diào)節(jié)壓力，調(diào)節(jié)流體移動(dòng)等。任選地，所述流體裝置包含微流體裝置。任選地，所述流體裝置包含納米流體裝置。適合的流體裝置的實(shí)例包括微型反應(yīng)器，其描述在Mollova等，(2009)“使用微型反應(yīng)器分離和處理細(xì)菌DNA的亞兆堿基片段的自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)”(An automated sample preparation system with mini-reactor to isolate and process submegabase fragments of bacterial DNA)，Analytical Biochemistry 391(2):135-43中，所述文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)參考并入本文。在某些實(shí)施方式中，所述整個(gè)方法(例如圖1和/或圖2的方法)在所述流體裝置中進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，所述方法的一部分在所述流體裝置中進(jìn)行，例如非多核苷酸分子的去除、多核苷酸的標(biāo)記和/或從所述多孔基質(zhì)(例如薄層多孔基質(zhì)或多孔單元)分離核苷酸。

在某些實(shí)施方式中，在所述流體裝置外部制備包含樣品和多孔基質(zhì)(例如薄層多孔基質(zhì)或多孔單元)前體的混合物，在所述流體裝置中形成多孔基質(zhì)(例如薄層多孔基質(zhì)或多孔單元)，并在所述流體裝置中處理所述多核苷酸。任選地，將包含樣品和多孔基質(zhì)(例如薄層多孔基質(zhì)或多孔單元)前體的混合物添加到所述流體裝置(例如通過(guò)注射)，在所述流體裝置中形成所述薄層多孔基質(zhì)或多孔單元以便在所述裝置內(nèi)進(jìn)行所述樣品在薄層多孔基質(zhì)或多孔單元中的固定化。例如，所述薄層多孔基質(zhì)可以通過(guò)向所述流體裝置施加真空或輕柔壓力來(lái)形成。所述固定化的多核苷酸可以任選地在所述流體裝置中自動(dòng)處理。任選地，非多核苷酸分子的去除、多核苷酸的標(biāo)記和/或所述多核苷酸從所述薄層多孔基質(zhì)的移除，可以在所述流體裝置內(nèi)自動(dòng)進(jìn)行。任選地，所述非多核苷酸分子的去除可以在不存在任何向所述薄層多孔基質(zhì)施加的電場(chǎng)(例如不存在電泳)的情況下進(jìn)行。任選地，所述非多核苷酸分子可以通過(guò)洗滌去除，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50次洗滌，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。

在某些實(shí)施方式中，包含樣品和多孔基質(zhì)(例如薄層多孔基質(zhì)或多孔單元)前體的混合物在所述流體裝置的內(nèi)部制備，多孔基質(zhì)(例如薄層多孔基質(zhì)或多孔單元)在所述流體裝置中形成，并且所述多核苷酸在所述流體裝置中處理。任選地，將樣品添加到所述流體裝置(例如通過(guò)注射)，并在所述流體裝置內(nèi)與所述多孔基質(zhì)或多孔基質(zhì)前體合并，由此在所述裝置中進(jìn)行所述樣品在薄層多孔基質(zhì)(多孔單元)中的固定化。例如，所述薄層多孔基質(zhì)可以通過(guò)向所述流體裝置施加真空或輕柔壓力來(lái)形成。任選地，非多核苷酸分子的去除、多核苷酸的標(biāo)記和/或所述多核苷酸從所述多孔基質(zhì)(例如薄層多孔基質(zhì)或多孔單元)的移除，可以在所述流體裝置內(nèi)自動(dòng)進(jìn)行。

在某些實(shí)施方式中，多孔基質(zhì)(例如薄層多孔基質(zhì)或多孔單元)在如本文中所述的流體裝置的外部形成，并放置到所述流體裝置內(nèi)部。任選地，將樣品固定化在所述薄層多孔基質(zhì)或多孔單元中，然后將它放置到所述流體裝置內(nèi)部。例如，可以通過(guò)將樣品與薄層多孔基質(zhì)的前體相接觸，將樣品固定化在所述薄層多孔基質(zhì)或多孔單元中。所述固定化在所述薄層多孔基質(zhì)或多孔單元中的樣品，可以在所述流體裝置中自動(dòng)處理。任選地，非多核苷酸分子的去除、多核苷酸的標(biāo)記和/或所述多核苷酸從所述薄層多孔基質(zhì)的移除，可以在所述流體裝置內(nèi)自動(dòng)進(jìn)行。

制備物

根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，提供了多核苷酸制備物。所述制備物可以包括固定化在本文中所描述的多孔基質(zhì)中的處理或部分處理過(guò)的多核苷酸。

在某些實(shí)施方式中，所述制備物包含被布置在基材上方的薄層多孔基質(zhì)和固定化在所述多孔基質(zhì)中的多核苷酸，其中所述多核苷酸與非多核苷酸細(xì)胞組分基本上分離，并且其中所述多核苷酸在所述基質(zhì)中時(shí)已被標(biāo)記或酶法修飾。

在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含與第一序列基序結(jié)合的第一標(biāo)記物。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸還包含與第二序列基序結(jié)合的第二標(biāo)記物，其中所述第二基序不同于所述第一基序，并且所述第二標(biāo)記物與所述第一標(biāo)記物相同或不同。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸的標(biāo)記物包括摻入到雙鏈DNA或RNA中的切口中的至少一個(gè)標(biāo)記的寡核苷酸。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含本文中所描述的至少一個(gè)結(jié)合組成部分。

處理樣品的方法

根據(jù)某些實(shí)施方式，提供了一種處理樣品的方法。所述方法可以包括如本文中所述將所述樣品固定化在布置在基材上方的薄層多孔基質(zhì)中。所述方法可以包括處理固定化在所述基材結(jié)合層中的樣品以除去不想要的組合，而至少一種所需組分仍保留在所述樣品中。所述方法可以包括從所述多孔基質(zhì)分離至少一種所需組分。所述方法可以包括表征所述至少一種所需組分。在某些實(shí)施方式中，所述樣品是生物樣品。在某些實(shí)施方式中，所述所需組分包括至少一種生物分子或其復(fù)合物，例如多核苷酸、多肽、脂類(lèi)、糖類(lèi)或細(xì)胞器。在某些實(shí)施方式中，所述不想要的組分包括一種或多種所述所需組分之外的任何細(xì)胞組分或產(chǎn)物。

系統(tǒng)

根據(jù)某些實(shí)施方式，提供了用于處理含有至少一個(gè)多核苷酸的樣品的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可以包括多孔基質(zhì)或前體材料，其被配置成形成包含所述樣品的薄層多孔基質(zhì)。所述系統(tǒng)可以包括用于形成所述薄層多孔基質(zhì)的基材。所述系統(tǒng)可以包括用于維持所述薄層多孔基質(zhì)基本上布置在所述基材上方的工具。用于維持所述薄層多孔基質(zhì)的布置的示例性的機(jī)械工具包括網(wǎng)例如尼龍網(wǎng)、夾具、托架、墊圈、螺紋、網(wǎng)眼布、凝膠、膠黏劑、樁子、螺釘、支柱、支架等。

在圖10A-10D中示出了樣品處理系統(tǒng)的一些實(shí)施方式。所述系統(tǒng)可以包括用于固持載片的金屬底座10，其安裝有用于溫度控制的加熱塊。所述系統(tǒng)可以包括基材，其包含薄層多孔基質(zhì)，例如使用放置在底座10上方的尼龍網(wǎng)12系留的薄層多孔基質(zhì)。所述系統(tǒng)可以包括形成孔的裝置14，其包括反應(yīng)孔16和o型環(huán)18。孔形成單元14可以組裝在包含使用尼龍網(wǎng)12系留的薄層多孔基質(zhì)的基材(例如載片)上方，并且顯示出反應(yīng)孔16。所述系統(tǒng)可以包括蓋子20，以封閉反應(yīng)孔。符合本文中的某些實(shí)施方式的系統(tǒng)以及這些系統(tǒng)的組件，也示出在圖16A-16G和圖17A-17B中。

在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包含用于在所述薄層多孔基質(zhì)周?chē)纬煽椎臋C(jī)械工具。在某些實(shí)施方式中，所述機(jī)械工具包含通過(guò)所述系統(tǒng)的頂板的孔，其中將所述系統(tǒng)的頂板和底板之間的間隙收緊，以使所述薄層多孔基質(zhì)被包含在所述孔內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，在所述孔的靠近所述薄層多孔基質(zhì)的末端處的墊圈，使基質(zhì)材料的泄露最小化，例如在所述基質(zhì)材料已被融化或消化后。

在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包含用于如本文中所述除去至少一種非多核苷酸的純化試劑。

在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包括用于如本文中所述標(biāo)記所述多核苷酸的序列基序的第一標(biāo)記試劑。

在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包括用于如本文中所述從多孔層分離所述標(biāo)記的多核苷酸的分離試劑。因此，可以表征所述分離的多核苷酸的序列基序標(biāo)記模式。

在圖13A-13C中示出了樣品處理系統(tǒng)的一些實(shí)施方式。將所述薄層多孔基質(zhì)維持在特定溫度下可能是有用的，以例如融化所述薄層多孔基質(zhì)。因此，所述系統(tǒng)可以包含用于加熱所述薄層多孔基質(zhì)并在同時(shí)提供所述薄層多孔基質(zhì)的入口的裝置。所述系統(tǒng)可以包含金屬頂板20。所述系統(tǒng)可以包含金屬底板22。在某些實(shí)施方式中，金屬頂板20被放置在金屬底板22上方。在某些實(shí)施方式中，金屬頂板20與金屬底板22整體成形，例如作為單件金屬材料。在某些實(shí)施方式中，金屬頂板20與金屬底板22分開(kāi)。

在某些實(shí)施方式中，金屬頂板20被放置在金屬底板22上方，其間具有間隙24?？梢詫⒉贾迷诨纳系谋佣嗫谆|(zhì)布置在間隙24中。在某些實(shí)施方式中，間隙24包含金屬頂板20與金屬底板22之間的狹縫。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)可以布置在載片25上，所述載片可以被放置在間隙24中。在某些實(shí)施方式中，載片25包含聚合物涂層例如聚四氟乙烯涂層。通過(guò)將所述薄層多孔基質(zhì)放置在間隙24中，所述薄層多孔基質(zhì)的每個(gè)側(cè)面可以與金屬板相接觸，由此最小化或消除了所述薄層多孔基質(zhì)的各個(gè)不同側(cè)面之間的任何溫度梯度。因此，與將所述多孔基質(zhì)放置在開(kāi)放基材上相比，可以提高加熱的均勻性和溫度的均勻性。此外，與開(kāi)放面排布方式相比，將所述多孔基質(zhì)放置在所述間隙內(nèi)可以最小化液體的蒸發(fā)。在某些實(shí)施方式中，間隙24的寬度是可調(diào)的。在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包含至少一個(gè)拉緊器26，例如螺釘或螺栓，其可以被調(diào)節(jié)以根據(jù)需要增加或減小間隙24的寬度。在某些實(shí)施方式中，間隙26的厚度被調(diào)整到接近所述載片的厚度。

在某些實(shí)施方式中，金屬底板22包含加熱元件或通過(guò)導(dǎo)熱材料連接到加熱元件。為了提高所述薄層多孔基質(zhì)的加熱均勻性，金屬頂板20的至少一部分可以直接接觸金屬底板22的至少一部分。在某些實(shí)施方式中，金屬頂板20包含加熱元件。在某些實(shí)施方式中，金屬頂板20和金屬底板22各自包含加熱元件。在某些實(shí)施方式中，金屬頂板20可以從金屬底板22拆下。在某些實(shí)施方式中，金屬頂板20通過(guò)鉸鏈附連到金屬底板22。在某些實(shí)施方式中，金屬頂板20通過(guò)軌道連接到金屬底板22，所述軌道被配置成使得金屬頂板20可以在金屬底板22上來(lái)回滑動(dòng)。

為了接近放置在間隙24中的薄層多孔基質(zhì)，金屬頂板20可以包含至少一個(gè)孔27。孔27可以包含通過(guò)金屬頂板20的開(kāi)口，由此提供對(duì)間隙23的接近，并因此提供對(duì)間隙24內(nèi)的多孔基質(zhì)的接近。多個(gè)孔27可以通過(guò)允許同時(shí)處理兩個(gè)或更多個(gè)多孔基質(zhì)來(lái)增加通量。在某些實(shí)施方式中，可以在每個(gè)孔27中布置不同的薄層多孔基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，金屬頂板20包含至少2個(gè)孔，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個(gè)孔，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。在某些實(shí)施方式中，每個(gè)孔包含O型環(huán)，例如圖13B中所示。在某些實(shí)施方式中，所述孔具有基本上圓形形狀。在某些實(shí)施方式中，所述孔具有非圓形形狀，例如橢圓形、三角形、正方形或多種多邊形中的任一者。在某些實(shí)施方式中，孔27的接近間隙24的開(kāi)口包含密封件。在某些實(shí)施方式中，可以將載片25或其他基材插入到間隙24中并放置在孔下方，以便通過(guò)所述孔提供對(duì)所述多孔基質(zhì)的接近。在將載片25或其他基材插入到間隙24中之后，可以調(diào)節(jié)間隙24的寬度以便將金屬底板22和金屬頂板20拉緊到在載片25或其他基材周?chē)?。可以?duì)寬度進(jìn)行選擇以便最小化孔27的泄露(孔開(kāi)口上的密封件也可以最小化泄露)，以最小化載片25或其他基材上的壓力以便防止破裂。

在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)包含頂蓋28。置于孔27上方的頂蓋28可以保留孔27內(nèi)的熱量，由此提高加熱的均勻性。此外，頂蓋28可以進(jìn)一步防止從放置在孔27的底部處的薄層多孔基質(zhì)的蒸發(fā)，并且可以保護(hù)所述薄層多孔基質(zhì)中的標(biāo)記的分子免于光漂白。

在某些實(shí)施方式中，多個(gè)系統(tǒng)包含可互換的部件，以便例如聚四氟乙烯載片和持留板底座以及所述載片上的密封件，可以在各種不同系統(tǒng)之間互換(例如圖10A-10D的系統(tǒng)、圖13A-13C的系統(tǒng)、圖16A-16G和圖17A-17B的系統(tǒng))。

用于形成薄層多孔基質(zhì)的方法和試劑盒

符合本文中的某些實(shí)施方式的薄層多孔基質(zhì)，可以通過(guò)各種不同方法來(lái)形成。

在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)的前體以液體狀態(tài)被提供(例如處于足以融化所述前體的溫度下，所述溫度通常高于環(huán)境溫度)。可以將樣品與所述前體相接觸。任選地，可以將所述前體與樣品混合?？梢詫⑺銮绑w布置在表面上方并冷卻，由此形成薄層多孔基質(zhì)。任選地，將所述前體直接布置在基材上方并冷卻。任選地，將所述前體直接布置在加熱的基材上方并隨后將所述基材冷卻。例如，所述基材可以包含網(wǎng)。任選地，所述基材包含一個(gè)或多個(gè)特征例如柱狀物，其在所述薄層多孔基質(zhì)被布置在所述基材上方之后可以將薄層多孔基質(zhì)保持在位。任選地，所述前體在所述基材之外的表面上形成，冷卻，隨后被移動(dòng)到所述基材。任選地，將所述液體前體鋪展在網(wǎng)基材上，以便將所述網(wǎng)基材包埋在所述薄層多孔基質(zhì)中。

在某些實(shí)施方式中，提供所述薄層多孔基質(zhì)的前體并向所述前體施加離心力，以形成薄層多孔基質(zhì)。不受任何理論限制，據(jù)設(shè)想離心力可以使前體扁平以形成薄層多孔基質(zhì)。離心力可以例如通過(guò)離心機(jī)提供。任選地，所述前體可以在離心之前包含樣品。任選地，樣品可以在離心后添加到所述薄層多孔基質(zhì)。

在某些實(shí)施方式中，提供了所述薄層多孔基質(zhì)的前體并且向所述前體施加真空或氣體壓力，以形成薄層多孔基質(zhì)。例如，可以向所述前體施加壓縮氣體以使它扁平成為薄層多孔基質(zhì)。適合的氣體的實(shí)例包括空氣、氮?dú)饣蚨栊詺怏w例如氬氣或氦氣。

在某些實(shí)施方式中，多孔基質(zhì)以薄層之外的構(gòu)型提供，并隨后形成薄層，例如通過(guò)壓縮、切除、剃除、磨除或溶解掉一部分所述多孔基質(zhì)，或通過(guò)將所述多孔基質(zhì)離心。任選地，所述多孔基質(zhì)在被形成為薄層多孔基質(zhì)之前包含固定化的樣品。任選地，在所述多孔基質(zhì)被造型成薄層多孔基質(zhì)之后將樣品固定化在所述多孔基質(zhì)中。

在某些實(shí)施方式中，提供了形成孔的裝置(參見(jiàn)例如圖10A-D中的14或圖16A-G中的165)，并將其放置成與基材(參見(jiàn)例如圖16A-G中的162)相接觸。所述形成孔的裝置可以包含多個(gè)開(kāi)孔，例如至少2、3、4、5、5、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100個(gè)開(kāi)孔，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。所述形成孔的裝置的一個(gè)或多個(gè)開(kāi)孔可以限定與所述基材垂直的表面。在某些實(shí)施方式中，所述形成孔的裝置針對(duì)所述基材形成密封。任選地，所述形成孔的裝置包含密封元件例如o型環(huán)，其限定了所述形成孔的裝置的開(kāi)孔。任選地，所述形成孔的裝置被布置在底座上，所述底座被配置成控制所述形成孔的裝置的溫度，例如被配置成安裝在加熱元件(參見(jiàn)例如圖16D中的161)上方的金屬底座?？梢詫⑺霰佣嗫谆|(zhì)的液體前體放置在所述形成孔的裝置的開(kāi)孔內(nèi)部，以便將液體前體布置在所述基材上方。任選地，所述液體前體包含樣品。任選地，在所述液體前體已被放置在所述形成孔的裝置的開(kāi)孔內(nèi)部后，將樣品與所述液體前體相接觸?？梢詫⑺霰佣嗫谆|(zhì)的前體在所述基材上冷卻。

圖16A-G是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式的#2樣品處理裝置的一系列照片。圖16A示出了孔形成單元165。圖16B示出了孔形成單元165，其包括反應(yīng)孔167和o型環(huán)166。圖16C示出了波形墊圈168。圖16D示出了放置在載片上的孔形成單元165，其包含使用尼龍網(wǎng)164系留的薄層多孔基質(zhì)，并顯示出放置在每個(gè)反應(yīng)孔167上方的波形墊圈168。圖16E示出了金屬加壓板169。圖16F示出了在載片上組裝的孔形成單元165，其包含使用尼龍網(wǎng)164系留的薄層多孔基質(zhì)，并示出了放置在孔形成單元165上方的加壓板169。圖16G示出了膠黏密封薄膜170的放置，以產(chǎn)生頂部空氣密封。

圖18A和18B是示出了根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式形成的薄層多孔基質(zhì)的照片。圖18A示出了載片上的薄層多孔基質(zhì)。圖18A示出了在向前體材料施加壓縮空氣后，薄層多孔基質(zhì)172在載片162上的形成。圖18B示出了多孔網(wǎng)基材上的薄層多孔基質(zhì)。圖18B示出了在將前體材料壓縮在兩個(gè)載片之間后，薄層多孔基質(zhì)172在網(wǎng)164上的形成。

在某些實(shí)施方式中，提供了用于形成薄層多孔基質(zhì)的試劑盒。所述試劑盒可以包含本文中所描述的基材。所述試劑盒可以包含形成孔的裝置，其中所述形成孔的裝置包含一個(gè)或多個(gè)開(kāi)孔，所述一個(gè)或多個(gè)開(kāi)孔被配置成當(dāng)緊靠所述基材放置時(shí)限定垂直或基本上垂直于所述基材的一個(gè)或多個(gè)表面。任選地，所述形成孔的裝置包含密封元件例如o型環(huán)，其被配置成針對(duì)所述基材形成密封。任選地，所述試劑盒還包含薄層多孔基質(zhì)前體。任選地，所述試劑盒還包含加壓板。所述加壓板可以被配置成將所述形成孔的裝置緊靠所述基材固定。所述加壓板還可以被配置成將所述形成孔的裝置和/或基材直接或間接緊靠所述加熱元件固定。任選地，所述試劑盒還包含加熱元件，所述加熱元件被配置成加熱所述基材和所述形成孔的裝置。任選地，所述試劑盒還包含網(wǎng)，例如尼龍網(wǎng)。任選地，所述試劑盒還包含流體裝置，例如微流體裝置或納米流體裝置。根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，所述流體裝置可用于自動(dòng)處理多核苷酸。任選地，所述試劑盒可用于執(zhí)行本文中所描述的一種或多種形成薄層多孔基質(zhì)的方法。任選地，所述試劑盒還包含包裝和/或用于形成薄層多孔基質(zhì)的說(shuō)明書(shū)。符合本文中的某些實(shí)施方式的試劑盒的組件的實(shí)例，示出在圖13A-C、14、15、16A-G、17和18中。

其他實(shí)施方式

根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，提供了處理包含多核苷酸的樣品的方法。所述方法可以包括將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中，其中所述薄層基質(zhì)被布置在基材上方。所述方法可以包括從布置在所述基材上方的所述薄層基質(zhì)除去非多核苷酸分子，而所述多核苷酸仍保持固定化在所述基質(zhì)中。所述方法可以包括用第一標(biāo)記物標(biāo)記所述多核苷酸或從所述薄層多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸中的至少一者。在某些實(shí)施方式中，用第一標(biāo)記物標(biāo)記所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，從所述薄層多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸用第一標(biāo)記物標(biāo)記并從所述薄層多孔基質(zhì)分離。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸用第一標(biāo)記物標(biāo)記，并隨后從所述薄層多孔基質(zhì)分離。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸從所述薄層多孔基質(zhì)分離，并隨后用第一標(biāo)記物標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，在除去非多核苷酸分子之后并在從所述基質(zhì)分離所述多核苷酸之前，將所述多核苷酸用所述第一標(biāo)記物標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，將所述多核苷酸用所述第一標(biāo)記物標(biāo)記，并在所述多核苷酸仍在所述基質(zhì)中時(shí)檢測(cè)所述標(biāo)記物。在某些實(shí)施方式中，將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中包括將所述樣品與前體材料相接觸，并隨后使所述前體材料形成薄層，由此將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)保持基本上平坦地布置在所述基材上方。在某些實(shí)施方式中，所述薄層基質(zhì)具有約1至999微米的厚度。在某些實(shí)施方式中，所述薄層基質(zhì)具有約80至200微米的厚度。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)被附連到所述基材。在某些實(shí)施方式中，使所述薄層多孔基質(zhì)從所述基材脫離，但仍保持緊密貼近于所述基材，使得在整個(gè)所述處理過(guò)程中所述層保持基本上平坦。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)系鏈、支架、電磁相互作用、摩擦或壓力中的至少一者維持所述薄層多孔基質(zhì)緊密貼近于所述基材。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)系鏈維持所述薄層多孔基質(zhì)緊密貼近于所述基材。在某些實(shí)施方式中，所述系鏈包含多孔材料，其被配置成維持所述薄層多孔基質(zhì)緊密貼近于所述基材，并同時(shí)允許接近固定化在所述薄層中的樣品。在某些實(shí)施方式中，所述基材是剛性的。在某些實(shí)施方式中，所述基材是柔性的。在某些實(shí)施方式中，所述基材是載片、容器或片材的基材。在某些實(shí)施方式中，將所述樣品固定化在薄層多孔基質(zhì)中包括形成所述薄層多孔基質(zhì)，使得所述基材限定所述薄層多孔基質(zhì)的至少一個(gè)側(cè)面。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)被形成在所述基材與另一個(gè)實(shí)體之間，由此限定所述薄層多孔基質(zhì)的厚度、直徑或體積中的至少一者。

在某些實(shí)施方式中，提供了處理包含多核苷酸的樣品的方法。所述方法可以包括將所述樣品固定化在多孔基質(zhì)中。所述方法可以包括破碎所述多孔基質(zhì)。所述方法可以包括從所述多孔基質(zhì)除去非多核苷酸分子，同時(shí)所述多核苷酸仍保留在所述多孔基質(zhì)中。所述方法可以包括從所述多孔基質(zhì)分離所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，在破碎所述多孔基質(zhì)后從所述多孔基質(zhì)除去非多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，在破碎所述多孔基質(zhì)之前從所述多孔基質(zhì)除去非多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括在破碎所述基質(zhì)后從所述多孔基質(zhì)除去痕量的非多核苷酸分子，其中多核苷酸分子仍保留在所述多孔基質(zhì)中，而所述痕量的非多核苷酸分子被除去。在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括在從所述多孔基質(zhì)除去非多核苷酸分子之后并在從所述基質(zhì)分離所述多核苷酸之前，用第一標(biāo)記物標(biāo)記所述多核苷酸。

在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述多核苷酸包含至少約200千堿基，例如至少約200kb、250kb、300kb、350kb、400kb、450kb、500kb、550kb、600kb、650kb、700kb、750kb、850kb、950kb或1000kb，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述多核苷酸包含至少約1兆堿基。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述樣品包含細(xì)胞懸液、核懸液、細(xì)胞器懸液、細(xì)胞勻漿物、組織勻漿物、全生物體勻漿物和生物流體中的至少一者。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述樣品包含全細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述多核苷酸包含單鏈DNA、單鏈RNA、雙鏈DNA或雙鏈RNA。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)包含合成聚合物、天然存在的聚合物或其組合。

在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)包含基于多糖的基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)包含瓊脂糖基質(zhì)、聚丙烯酰胺基質(zhì)、明膠基質(zhì)、膠原蛋白基質(zhì)、纖維蛋白基質(zhì)、殼聚糖基質(zhì)、藻酸鹽基質(zhì)、透明質(zhì)酸基質(zhì)或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)包含瓊脂糖基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)包含硅烷基團(tuán)、帶正電荷的基團(tuán)、帶負(fù)電荷的基團(tuán)、兩性離子基團(tuán)、極性基團(tuán)、親水性基團(tuán)、疏水性基團(tuán)或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)包含水性環(huán)境。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述多孔基質(zhì)被布置在水性溶液中。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，非多核苷酸分子包含蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖類(lèi)、細(xì)胞器和細(xì)胞碎片中的至少一者。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，除去非多核苷酸分子包括將所述多孔基質(zhì)與蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原蛋白酶、脂肪酶、糖水解酶、果膠酶、果膠溶解酶、淀粉酶、RNA酶、透明質(zhì)酸酶、幾丁質(zhì)酶、gluculase、溶壁酶、酵母裂解酶、溶菌酶、labiase、消色肽酶或其組合相接觸。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，除去非多核苷酸分子包括將所述多孔基質(zhì)與蛋白酶相接觸。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，除去非多核苷酸分子包括將所述多孔基質(zhì)與去污劑、離液劑、緩沖劑、螯合劑、有機(jī)溶劑、聚合物(例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、乙二醇)、鹽、酸、堿、還原劑或其組合相接觸。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，除去非多核苷酸分子包括用包含緩沖劑、去污劑、離液劑、螯合劑、有機(jī)溶劑、醇、鹽、酸、堿、還原劑、聚合物或其組合的溶液洗滌所述多孔基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述有機(jī)溶劑在基于水的溶液中可混溶。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，除去非多核苷酸分子包括施加電場(chǎng)以除去至少一些非多核苷酸分子。在某些實(shí)施方式中，本文中描述的任一方法還包括在除去非多核苷酸分子之前進(jìn)行基質(zhì)內(nèi)核富集。

在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述標(biāo)記包括非位點(diǎn)特異性標(biāo)記，例如使用YOYO或POPO染料。

在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述標(biāo)記包括位點(diǎn)特異性標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，標(biāo)記包括將所述多核苷酸與染料或染色劑相接觸。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述標(biāo)記包括非光學(xué)標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述多核苷酸是雙鏈的，并且位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括在第一序列基序處切刻所述多核苷酸以便形成至少一個(gè)切口，其中所述DNA在與所述至少一個(gè)切口相鄰處保持雙鏈，以及用所述第一標(biāo)記物標(biāo)記所述至少一個(gè)切口。在某些實(shí)施方式中，在切刻時(shí)將所述多核苷酸固定化在所述基質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括將至少一個(gè)核苷酸摻入到所述至少一個(gè)切口中。在某些實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)核苷酸包含可逆終止子。在某些實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)核苷酸包含所述第一標(biāo)記物。在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記還包括在第二序列基序處切刻所述多核苷酸，由此形成至少一個(gè)第二切口，其中所述DNA在與所述至少一個(gè)第二切口相鄰處保持雙鏈，以及用第二標(biāo)記物標(biāo)記所述至少一個(gè)第二切口，其中所述第一標(biāo)記物與所述第二標(biāo)記物相同或不同。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述標(biāo)記包括通過(guò)第一甲基轉(zhuǎn)移酶將所述標(biāo)記物轉(zhuǎn)移到所述多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括通過(guò)第一甲基轉(zhuǎn)移酶將所述第一標(biāo)記物轉(zhuǎn)移到第一序列基序。在某些實(shí)施方式中，位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括將第一反應(yīng)性基團(tuán)轉(zhuǎn)移到所述第一序列基序，并將所述第一標(biāo)記物偶聯(lián)到所述第一反應(yīng)性基團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，位點(diǎn)特異性標(biāo)記還包括通過(guò)第二甲基轉(zhuǎn)移酶將第二標(biāo)記物轉(zhuǎn)移到第二序列基序，其中所述第二序列基序不同于所述第一序列基序，并且其中所述第二標(biāo)記物與所述第一標(biāo)記物相同或不同。在某些實(shí)施方式中，位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括將固定化在所述基質(zhì)中的所述多核苷酸的第一序列基序與特異性結(jié)合于所述第一序列基序的第一結(jié)合組成部分相接觸。在某些實(shí)施方式中，所述第一結(jié)合組成部分包含以下一種：三螺旋寡核苷酸、肽、核酸、聚酰胺、鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活物樣(TAL)效應(yīng)物DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、限制性酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗體或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，所述第一標(biāo)記物或第二標(biāo)記物中的至少一者選自熒光團(tuán)、量子點(diǎn)或非光學(xué)標(biāo)記物。在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，所述方法還包括用非序列特異性標(biāo)記物標(biāo)記所述多核苷酸，其中所述非序列特異性標(biāo)記物不同于所述第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物。

在某些實(shí)施方式中，對(duì)于本文中描述的任一方法來(lái)說(shuō)，分離包括以下至少一者：融化所述多孔基質(zhì)、消化所述多孔基質(zhì)、降解所述多孔基質(zhì)、溶解所述多孔基質(zhì)、電洗脫、通過(guò)篩的離心、轉(zhuǎn)印到膜上、透析步驟或其組合。在某些實(shí)施方式中，分離包括向包含所述多核苷酸和所述基質(zhì)的至少一種組分的混合物添加溶劑。

在某些實(shí)施方式中，本文中描述的任一方法還包括檢測(cè)所述多核苷酸特征性的位點(diǎn)特異性標(biāo)記模式。在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)包括將所述多核苷酸在流體通道中線(xiàn)性化。在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)包括將所述第一標(biāo)記物、第二標(biāo)記物或其任何組合的模式與參比DNA上標(biāo)記物的模式進(jìn)行比較。在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)包括在位點(diǎn)特異性標(biāo)記的重疊模式的基礎(chǔ)上組裝多個(gè)模式，由此構(gòu)建多核苷酸圖譜。

根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，提供了一種多核苷酸制備物。所述制備物可以包含布置在基材上方的薄層多孔基質(zhì)。所述制備物可以包含固定化在所述多孔基質(zhì)中的多核苷酸，其中所述多核苷酸與非多核苷酸細(xì)胞組分基本上分離，并且其中所述多核苷酸當(dāng)在所述基質(zhì)中時(shí)已被位點(diǎn)特異性標(biāo)記或酶法修飾。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸當(dāng)在所述基質(zhì)中時(shí)與細(xì)胞組分分離。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸在與細(xì)胞組分分離之前被標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸在與細(xì)胞組分分離之后被標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含至少約200千堿基，例如至少約200kb、250kb、300kb、350kb、400kb、450kb、500kb、550kb、600kb、650kb、700kb、750kb、850kb、950kb或1000kb，包括任兩個(gè)所列出的值之間的范圍。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含至少約1兆堿基。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含單鏈DNA、單鏈RNA、雙鏈DNA或雙鏈RNA。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)包含合成聚合物、天然存在的聚合物或其組合。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)包含聚丙烯酰胺基質(zhì)、明膠基質(zhì)、膠原蛋白基質(zhì)、纖維蛋白基質(zhì)、殼聚糖基質(zhì)、藻酸鹽基質(zhì)、透明質(zhì)酸基質(zhì)或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)包含瓊脂糖基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)包含基于多糖的基質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述多孔基質(zhì)包含硅烷、帶正電荷的基團(tuán)、帶負(fù)電荷的基團(tuán)、兩性離子基團(tuán)、極性基團(tuán)、親水性基團(tuán)、疏水性基團(tuán)或其任何組合。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)以伸展的構(gòu)型被布置在所述基材上方。在某些實(shí)施方式中，所述薄層基質(zhì)具有約1至999微米的厚度。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)具有約80至200微米的厚度。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)被固定化在所述基材上。在某些實(shí)施方式中，使所述薄層多孔基質(zhì)從所述基材脫離但仍保持緊密貼近于所述基材，使得所述層在整個(gè)所述處理期間保持基本上伸展。在某些實(shí)施方式中，所述基材是剛性的。在某些實(shí)施方式中，所述基材是柔性的。在某些實(shí)施方式中，所述基材是載片、容器或片材的基材。在某些實(shí)施方式中，所述薄層多孔基質(zhì)基本上不含非多核苷酸細(xì)胞組分。在某些實(shí)施方式中，所述非多核苷酸細(xì)胞組分包含蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖類(lèi)、細(xì)胞器和細(xì)胞碎片中的至少一者。在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記或酶法修飾包括至少用與第一序列基序結(jié)合的第一標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記或酶法修飾還包括用與第二序列基序結(jié)合的第二標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，其中所述第二標(biāo)記物與所述第一標(biāo)記物相同或不同。在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括至少用摻入到雙鏈DNA或RNA中的切口中的標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，所述制備物還包含結(jié)合到所述第一基序的至少一種結(jié)合組成部分，其中所述結(jié)合組成部分包含以下至少一者：三螺旋寡核苷酸、肽核酸、聚酰胺、鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活物樣(TAL)效應(yīng)物DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、限制性酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗體或這些物質(zhì)的任何組合。在某些實(shí)施方式中，所述位點(diǎn)特異性標(biāo)記包括用選自熒光團(tuán)、量子點(diǎn)和非光學(xué)標(biāo)記物的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。

根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式，提供了一種用于處理包含至少一種多核苷酸的樣品的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可以包含多孔基質(zhì)，其被配置成形成包含所述樣品的薄層多孔基質(zhì)。所述系統(tǒng)可以包含用于形成所述薄層多孔基質(zhì)的基材。所述系統(tǒng)可以包含用于維持所述薄層多孔基質(zhì)基本上布置在所述基材上方的工具。在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)還包含用于在基本上布置在所述基材上方的所述薄層多孔基質(zhì)周?chē)纬煽椎臋C(jī)械工具。在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)還包含用于將所述薄層多孔基質(zhì)維持在所需溫度下的工具。在某些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)還包含用于除去所述至少一種多核苷酸之外的樣品組分的純化試劑，用于用第一標(biāo)記物標(biāo)記所述至少一種多核苷酸的序列基序的第一標(biāo)記試劑，以及用于從所述薄層多孔基質(zhì)分離所述標(biāo)記的多核苷酸的分離試劑，其中所述分離的多核苷酸的序列基序標(biāo)記的模式可以被表征。

實(shí)施例1：在載片上基于薄層的DNA純化和隨后的基質(zhì)內(nèi)單色或雙色標(biāo)記

將大腸桿菌細(xì)胞與瓊脂糖溶液混合，并通過(guò)在80um間隔物存在下用另一個(gè)載片進(jìn)行夾心，鋪展在玻璃載片上。在所述瓊脂糖-大腸桿菌基質(zhì)在4℃下固化后，移除頂部夾心載片，留下附著于底部載片的多孔微層(圖3)。將所述附著的微層用溶菌酶和蛋白酶K處理，然后進(jìn)行幾次洗滌以除去污染物，留下干凈的DNA。將保留在所述微層中的DNA用Nt.BspQI產(chǎn)生切口，洗滌，并使用taq聚合酶在偶聯(lián)到dUTP的綠色熒光染料存在下通過(guò)切口平移進(jìn)行標(biāo)記。在另一個(gè)洗滌步驟后，通過(guò)用PreCR(New England BioLabs)進(jìn)行處理來(lái)修復(fù)標(biāo)記的切口。對(duì)于雙色標(biāo)記來(lái)說(shuō)，對(duì)保留在所述微層中的切刻、標(biāo)記和修復(fù)過(guò)的DNA進(jìn)行另一輪使用不同切口酶(Nb.BbvCI)的切刻，用偶聯(lián)到dUTP的紅色熒光染料進(jìn)行標(biāo)記并用PreCR進(jìn)行修復(fù)，在其間進(jìn)行洗滌。通過(guò)融化瓊脂糖并將它用瓊脂糖酶處理，將所述含有DNA的微層液化，以釋放所述DNA，將所述DNA用YOYO染色并在Irys^TM系統(tǒng)(BioNano Genomics)上處理。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將DNA在大規(guī)模平行納米通道中線(xiàn)性化，用適合的激光激發(fā)以備骨架和標(biāo)記物檢測(cè)，并任選地成像以揭示DNA分子上的標(biāo)記物模式(圖5A)。向參比基因組的作圖和覆蓋所質(zhì)詢(xún)的分子質(zhì)量的中心、假陽(yáng)性(FP)和假陰性(FN)的基本度量，使用nanoStudio數(shù)據(jù)分析軟件(BioNano Genomics)來(lái)進(jìn)行。結(jié)果示出在圖5B中。由此，可以在薄層多孔基質(zhì)中純化和標(biāo)記核酸并根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式標(biāo)記。

實(shí)施例2：在系留孔中基于薄層的DNA純化和隨后的基質(zhì)內(nèi)單色標(biāo)記

將大腸桿菌細(xì)胞與瓊脂糖溶液混合，并用移液管頭在6孔板的孔的表面上手動(dòng)鋪展以產(chǎn)生薄層。在所述瓊脂糖-大腸桿菌基質(zhì)在4℃下固化后，將尼龍網(wǎng)放置在所述薄層頂上，以保持它在隨后的處理步驟期間系留到所述表面(圖4A)。將所述系留的瓊脂糖-大腸桿菌層用溶菌酶和蛋白酶K處理，隨后進(jìn)行幾次洗滌以除去污染物，留下干凈的DNA。將保留在所述薄層中的DNA用Nt.BspQI產(chǎn)生切口，洗滌，并使用taq聚合酶在偶聯(lián)到dUTP的綠色熒光染料存在下通過(guò)切口平移進(jìn)行標(biāo)記。在另一個(gè)洗滌步驟后，通過(guò)用PreCR(New England BioLabs)進(jìn)行處理來(lái)修復(fù)標(biāo)記的切口。通過(guò)融化瓊脂糖并用瓊脂糖酶處理，將所述含有DNA的薄層液化，以釋放所述DNA，將所述DNA用YOYO染色并在Irys^TM系統(tǒng)(BioNano Genomics)上如實(shí)施例1中所概述的進(jìn)行處理。結(jié)果示出在圖6中。由此，可以根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式在薄層多孔基質(zhì)中純化和標(biāo)記核酸。

實(shí)施例3：載片上基于微層的DNA純化/孔中的薄層DNA純化以及隨后在溶液中的DNA回收和單色標(biāo)記

將20ul大腸桿菌-瓊脂糖混合物如實(shí)施例1和2中所述鋪展在玻璃載片或孔上。將所述附著層用溶菌酶和蛋白酶K處理，隨后進(jìn)行幾次洗滌以除去污染物，留下干凈的DNA。通過(guò)融化瓊脂糖并用瓊脂糖酶處理，將所述瓊脂糖-DNA復(fù)合物液化。在液滴透析后，將純化的DNA用Nt.BspQI產(chǎn)生切口，并使用taq聚合酶在偶聯(lián)到dUTP的綠色熒光染料存在下通過(guò)切口平移進(jìn)行標(biāo)記。通過(guò)用PreCR(New England BioLabs)進(jìn)行處理來(lái)修復(fù)標(biāo)記的切口。如實(shí)施例1中所述將得到的DNA用YOYO染色并在Irys^TM系統(tǒng)(BioNano Genomics)上進(jìn)行處理。結(jié)果示出在圖7中。由此，可以根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式在薄層多孔基質(zhì)中純化核酸并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。

實(shí)施例4：在系留板中基于薄層的DNA純化和隨后在溶液中的DNA回收和單色標(biāo)記——較大規(guī)模

將900ul大腸桿菌-瓊脂糖混合物用移液管頭鋪展在10cm培養(yǎng)板的底面上。在4℃下固化后，將尼龍網(wǎng)放置在附著于所述板的底面的所述薄層的頂上，以保持它在隨后的處理期間系留到所述板的表面(圖4B)。將所述系留的瓊脂糖-大腸桿菌薄層用溶菌酶和蛋白酶K處理，隨后進(jìn)行幾次洗滌以除去污染物，留下干凈的DNA。通過(guò)融化瓊脂糖并用瓊脂糖酶處理，將所述瓊脂糖-DNA復(fù)合物液化。在液滴透析后，將純化的DNA用Nt.BspQI產(chǎn)生切口，并使用taq聚合酶在偶聯(lián)到dUTP的綠色熒光染料存在下通過(guò)切口平移進(jìn)行標(biāo)記。通過(guò)用PreCR(New England BioLabs)進(jìn)行處理來(lái)修復(fù)標(biāo)記的切口。如實(shí)施例1中所述將得到的DNA用YOYO I染色并在Irys^TM系統(tǒng)(BioNano Genomics)上進(jìn)行處理。結(jié)果示出在圖8中。由此，可以根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式在薄層多孔基質(zhì)中純化核酸并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。

實(shí)施例5：基于柱塞的DNA純化和隨后在多孔單元中的破碎和單色標(biāo)記

如BioRad(CHEF細(xì)菌基因組DNA柱塞試劑盒#170-3592)所述產(chǎn)生大腸桿菌-瓊脂糖柱塞。將含有細(xì)菌細(xì)胞的柱塞用溶菌酶處理，然后用蛋白酶K和RNA酶處理，留下干凈的DNA。通過(guò)在微量離心管中使用藍(lán)色研杵(Sigma)進(jìn)行勻漿，將所述柱塞分解成小碎片。將保留在所述多孔單元中的DNA用Nt.BspQI產(chǎn)生切口，洗滌，并使用taq聚合酶在偶聯(lián)到dUTP的綠色熒光染料存在下通過(guò)切口平移進(jìn)行標(biāo)記。在另一個(gè)洗滌步驟后，通過(guò)用PreCR(New England BioLabs)進(jìn)行處理來(lái)修復(fù)標(biāo)記的切口。在每次洗滌后，將所述多孔單元離心以集中在管的底部處。通過(guò)融化瓊脂糖并用瓊脂糖酶進(jìn)行處理，將多孔單元中標(biāo)記的DNA液化。在液滴透析后，如實(shí)施例1中所述，將所述DNA用YOYO I染色并在Irys^TM系統(tǒng)(BioNano Genomics)上進(jìn)行處理。結(jié)果示出在圖9中。由此，可以根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式在多孔單元中純化和標(biāo)記核酸。

實(shí)施例6：基于微層的DNA純化和隨后在圖8的裝置中的基質(zhì)內(nèi)單色標(biāo)記

將大腸桿菌細(xì)胞與瓊脂糖溶液混合，并通過(guò)用無(wú)粘性載片夾心所述瓊脂糖-細(xì)胞混合物，鋪展在玻璃載片上由PTFE涂層限定的100um厚的孔中。在將所述瓊脂糖-大腸桿菌基質(zhì)在4℃下固化后，移除所述非粘性載片，留下占據(jù)所述PTFE涂層的載片的孔的100um厚的微層(圖3B)。將所述載片組裝到圖10D中所描述的處理裝置中。在反應(yīng)孔中進(jìn)行蛋白酶K消化，隨后進(jìn)行幾次洗滌以除去污染物，留下捕獲在微層中的干凈的DNA。標(biāo)記和修復(fù)也在所述處理裝置中進(jìn)行。將捕獲在所述微層中的DNA用Nt.BspQI產(chǎn)生切口，洗滌，并使用taq聚合酶在偶聯(lián)到dUTP的綠色熒光染料存在下通過(guò)切口平移進(jìn)行標(biāo)記。在另一個(gè)洗滌步驟后，通過(guò)用PreCR(New England BioLabs)進(jìn)行處理來(lái)修復(fù)標(biāo)記的切口。從圖10D中所示的裝置移除載片。將含有DNA的微層收獲在微量離心管中，并通過(guò)融化瓊脂糖進(jìn)行液化并用瓊脂糖酶處理以釋放所述DNA，將所述DNA如實(shí)施例1中所述用YOYO染色并在Irys^TM系統(tǒng)(BioNano Genomics)上進(jìn)行處理。結(jié)果示出在圖11中。由此，可以根據(jù)本文中的某些實(shí)施方式在薄層多孔基質(zhì)中純化和標(biāo)記核酸。

實(shí)施例7：重新組裝和作圖

提供來(lái)自于人類(lèi)細(xì)胞系的細(xì)胞(Coriell，目錄ID GM12878)。將所述細(xì)胞與瓊脂糖溶液混合并鋪展在PTFE涂層的玻璃載片上，以形成包含所述細(xì)胞的薄層多孔基質(zhì)。將所述載片和薄層多孔基質(zhì)放置在圖13A-13C中示出的系統(tǒng)的間隙25中，使得所述薄層多孔基質(zhì)可以被系統(tǒng)加熱，通過(guò)反應(yīng)孔27接近。在反應(yīng)孔27中進(jìn)行蛋白酶K消化，隨后進(jìn)行幾次洗滌以除去污染物，留下捕獲在所述薄層多孔基質(zhì)中的干凈的DNA。當(dāng)所述DNA在所述薄層多孔基質(zhì)中時(shí)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記：將DNA用Nt.BspQI產(chǎn)生切口，并使用taq聚合酶在偶聯(lián)到dUTP的綠色熒光染料存在下通過(guò)切口平移進(jìn)行標(biāo)記。通過(guò)用PreCR(New England BioLabs)處理或如IrysPrep^TMLabeling-NLRS流程(BioNano Genomics)中所述對(duì)標(biāo)記的切口進(jìn)行修復(fù)。將所述包含標(biāo)記的DNA的多孔基質(zhì)收獲在微量離心管中，并通過(guò)融化瓊脂糖進(jìn)行液化并用瓊脂糖酶處理以釋放所述DNA，將所述DNA如實(shí)施例1中所述用YOYO染色并在Irys^TM系統(tǒng)(BioNano Genomics)上線(xiàn)性化。將標(biāo)記的DNA分子以迭代方式對(duì)齊，以產(chǎn)生代表了重新組裝的人類(lèi)基因組圖譜的重疊群。將重新產(chǎn)生的重疊群與所述參比人類(lèi)圖譜(HG19)對(duì)齊，并圖形示出在圖12B中。數(shù)字度量顯示在圖12A中。因此，本文中所描述的薄層多孔基質(zhì)和處理系統(tǒng)可用于可靠地分離和標(biāo)記核酸，用于在流體微通道系統(tǒng)中進(jìn)行分析。

盡管本文中已公開(kāi)了各種不同方面和實(shí)施方式，但其他方面和實(shí)施方式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。本文公開(kāi)的各種不同方面和實(shí)施方式是出于說(shuō)明的目的而不打算是限制性的，其中真正的范圍和精神由權(quán)利要求書(shū)指明。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)于本文中公開(kāi)的這種和其他過(guò)程和方法來(lái)說(shuō)，在所述過(guò)程和方法中執(zhí)行的功能可以以不同順序?qū)嵤?/p>

此外，概括的步驟和操作僅僅作為實(shí)例提供，并且某些步驟和操作可以是任選的，合并在更少的步驟和操作中，或擴(kuò)充成附加的步驟和操作，而不損害所公開(kāi)的實(shí)施方式的本質(zhì)。

對(duì)于本文中基本上任何復(fù)數(shù)和/或單數(shù)術(shù)語(yǔ)的使用來(lái)說(shuō)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在適合于語(yǔ)境和/或應(yīng)用的情況下將復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)換成單數(shù)和/或?qū)螖?shù)轉(zhuǎn)換成復(fù)數(shù)。為清晰起見(jiàn)，在本文中可能明確陳述各種不同的單數(shù)/復(fù)數(shù)排列。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，一般來(lái)說(shuō)，在本文中、特別是權(quán)利要求書(shū)(例如權(quán)利要求書(shū)的主體)中使用的術(shù)語(yǔ)，通常打算作為“開(kāi)放性”術(shù)語(yǔ)(例如術(shù)語(yǔ)“包括”應(yīng)該被解釋為“包括但不限于”，術(shù)語(yǔ)“具有”應(yīng)該被解釋為“至少具有”等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，如果意圖指示介紹的權(quán)利要求項(xiàng)敘述的特定數(shù)目，這種意圖應(yīng)該在所述權(quán)利要求項(xiàng)中明確敘述，并且在缺少這種敘述的情況下不存在這種意圖。例如，為了幫助理解，權(quán)利要求書(shū)可能含有使用介紹性短語(yǔ)“至少一個(gè)”和“一個(gè)或多個(gè)”來(lái)介紹權(quán)利要求項(xiàng)敘述。然而，這種短語(yǔ)的使用不應(yīng)被解釋為暗示著由不定冠詞介紹的權(quán)利要求項(xiàng)敘述將含有這種介紹的權(quán)利要求項(xiàng)敘述的任何特定權(quán)利要求項(xiàng)限制于只含有一個(gè)這種敘述的實(shí)施方式，即使在同一權(quán)利要求項(xiàng)包括介紹性短語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)”或“至少一個(gè)”和不定冠詞的情況下(例如，不定冠詞應(yīng)該被解釋為意味著“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”)；這同樣適用于使用定冠詞來(lái)介紹權(quán)利要求項(xiàng)敘述的情況。此外，即使介紹的權(quán)利要求項(xiàng)敘述的特定數(shù)目被明確敘述，本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，這種敘述應(yīng)該被解釋為意味著至少所述敘述的數(shù)目(例如，沒(méi)有其他修飾語(yǔ)的僅僅“兩個(gè)敘述”的敘述，意味著至少兩個(gè)敘述或兩個(gè)或更多個(gè)敘述)。此外，在使用類(lèi)似于“A、B和C等中的至少一者”的常用語(yǔ)的情況下，一般來(lái)說(shuō)這種結(jié)構(gòu)意指本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的所述常用語(yǔ)的意義(例如，“具有A、B和C中的至少一者的系統(tǒng)”將包括但不限于具有單獨(dú)的A、單獨(dú)的B、單獨(dú)的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起等的系統(tǒng))。在使用類(lèi)似于“A、B或C等中的至少一者”的常用語(yǔ)的情況下，一般來(lái)說(shuō)這種結(jié)構(gòu)意指本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的所述常用語(yǔ)的意義(例如，“具有A、B或C中的至少一者的系統(tǒng)”將包括但不限于具有單獨(dú)的A、單獨(dú)的B、單獨(dú)的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起等的系統(tǒng))。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，事實(shí)上任何提出兩個(gè)或更多個(gè)可選項(xiàng)的反意連接(disjunctive)的詞和/或短語(yǔ)，不論是在說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求書(shū)還是附圖中，都應(yīng)該被理解為設(shè)想了包含所述項(xiàng)中的一項(xiàng)、所述項(xiàng)的任一項(xiàng)或兩個(gè)所述項(xiàng)的可能性。例如，短語(yǔ)“A或B”應(yīng)該被理解為包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

此外，當(dāng)本公開(kāi)的特點(diǎn)或情況按照馬庫(kù)什(Markush)組進(jìn)行描述時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本公開(kāi)因此也按照所述馬庫(kù)什組的任一單個(gè)成員或成員的亞組進(jìn)行描述。

正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的，出于任何和所有目的，例如就提供書(shū)面描述而言，本文中公開(kāi)的所有范圍也涵蓋了其任何和所有可能的子范圍和子范圍的組合?？梢匀菀椎卣J(rèn)識(shí)到，任何列出的范圍充分描述并能夠?qū)⑼环秶纸獬芍辽傧嗟鹊膬煞?、三份、四份、五份、十份等。作為非限制性?shí)例，本文中討論的每個(gè)范圍可以被容易地分解成較小的三分之一、中間的三分之一和較大的三分之一等。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員也將理解的，諸如“至多”、“至少”等的所有措詞包括了所敘述的數(shù)目，并且是指可以隨后分解成如上所討論的子范圍的范圍。最后，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的，范圍包括每個(gè)個(gè)體成員。因此，例如具有1-3個(gè)細(xì)胞的組是指具有1、2或3個(gè)細(xì)胞的組。同樣地，具有1-5個(gè)細(xì)胞的組是指具有1、2、3、4或5個(gè)細(xì)胞的組，以此類(lèi)推。

從上述內(nèi)容可以認(rèn)識(shí)到，在本文中出于說(shuō)明的目的已描述了本公開(kāi)的各種不同實(shí)施方式，并且可以做出各種不同修改而不背離本公開(kāi)的范圍和精神。因此，本文中公開(kāi)的各種不同實(shí)施方式不打算是限制性的，并且真正的范圍和精神由權(quán)利要求書(shū)指明。