本專利申請要求美國臨時專利申請No.61/918965(2013年12月20日提交)的優(yōu)先權(quán)。該優(yōu)先權(quán)申請的全部公開內(nèi)容通過引用以其整體并入本文并用于所有目的。

發(fā)明背景

背根神經(jīng)節(jié)(DRG)和三叉神經(jīng)的感覺神經(jīng)元通過皮膚中的突起可以檢測環(huán)境變化。這些神經(jīng)元包括專用于傷害感受/癢感、機械感覺和本體感覺三大類。傷害感受是其中如熱和觸摸之類有害刺激引起皮膚的感覺神經(jīng)元(傷害感受器)將信號發(fā)送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過程。癢感是癢的感覺。機械感覺是壓力的檢測，本體感覺是通過監(jiān)測肌肉拉伸檢測肌肉的運動。對影響各種類型的感覺神經(jīng)元的痛、癢和疾病的控制一直是藥物治療的一大挑戰(zhàn)。據(jù)報道，至少有11600萬美國人和35％的世界人口患有慢性神經(jīng)病或疼痛癥(Elzahaf等人,Curr.Med.Res.Opin.28,1221-1229,2012)。然而，只有30％的處于慢性疼痛的患者響應(yīng)“金標準”FDA批準的治療(Finnerup等人,PA/N 150,573-581,2010)。實驗室研究表現(xiàn)出響應(yīng)于相同疼痛刺激的大范圍的個體間差異。此外，日益認識到遺傳因素是疼痛表型和對藥物治療的響應(yīng)的主要貢獻者。盡管這些發(fā)現(xiàn)，許多有關(guān)疼痛的藥物發(fā)現(xiàn)一直依賴于動物模型，該動物模型在模擬人之間的細微差別方面是不太可能有用的并且與在體外篩選相比具有較低的吞吐量。這些因素可有助于解釋針對即使有前途的臨床前候選者的臨床試驗過程中驚人的高人員縮減率。對癢的控制和檢測是理解不足的，并且也是顯著未滿足的醫(yī)療需要。雖然死后的人感覺神經(jīng)元可用于研究，但這些細胞不能被遺傳性改變，具有有限的可用性。

本領(lǐng)域需要用于產(chǎn)生用于機理研究或藥物篩選的足夠數(shù)量的在體外的功能響應(yīng)的感覺神經(jīng)元的有效方法。本發(fā)明針對這一點以及在本領(lǐng)域中其他未滿足的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一個方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元(iSN)的方法。該方法需要在非神經(jīng)元細胞中共表達Brn3A/Ngnl(BN1)基因或Brn3A/Ngn2(BN2)基因的組合。通常，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因在非神經(jīng)元細胞中的表達是時序性的(temporal)。在一些方法中，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因在非神經(jīng)元細胞中瞬時(transiently)表達。例如，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因可以通過誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)(例如誘導(dǎo)型表達載體)在細胞中表達。在一些方法中，用于轉(zhuǎn)化成感覺神經(jīng)元的非神經(jīng)元細胞是成纖維細胞、胚胎干細胞(ESC)，或誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)。在一些方法中，非神經(jīng)元細胞是胚胎成纖維細胞或成體成纖維細胞。本發(fā)明的一些方法涉及從哺乳動物成纖維細胞(例如，來源于人、小鼠或大鼠的成纖維細胞)誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元的形成。在一些方法中，Brn3A基因和Ngnl基因在非神經(jīng)元細胞中共表達。在其他一些方法中，Brn3A基因和Ngn2基因在非神經(jīng)元細胞中共表達。在一些方法中，攜帶Brn3A基因和Ngnl或Ngn2基因的表達載體被引入非神經(jīng)元細胞。例如，表達BN1或BN2基因的慢病毒載體可用于誘導(dǎo)非神經(jīng)元細胞。本發(fā)明的一些方法還包括針對一種或多種神經(jīng)元標記物的存在檢測誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元。

在一些相關(guān)的實施方式中，本發(fā)明提供了根據(jù)本文描述的方法產(chǎn)生的誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元。在其他一些實施方式中，本發(fā)明提供了攜帶表達Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的組合的一種或多種表達載體的分離的細胞。這些細胞中的一些是非神經(jīng)元細胞。例如，該細胞可以是成纖維細胞、胚胎干細胞(ESC)，或誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)。在一些實施方式中，細胞是胚胎成纖維細胞或成體成纖維細胞。在一些優(yōu)選的實施方式中，成纖維細胞來源于哺乳動物，例如，人、小鼠或大鼠。在一些細胞中，共表達Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的表達載體是慢病毒載體。在一些實施方式中，表達載體是誘導(dǎo)型載體。

在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療受試者中與感覺神經(jīng)元的損失或變性相關(guān)或由感覺神經(jīng)元的損失或變性介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病癥的方法。該方法需要(1)從需要治療的受試者獲得非神經(jīng)元細胞的群；(2)通過在非神經(jīng)元細胞中共表達Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的組合從非神經(jīng)元細胞產(chǎn)生誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元(iSN)的群；以及(3)將治療有效量的iSN群施用給受試者。通常，所述非神經(jīng)元細胞瞬時表達Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因。在一些方法中，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因在非神經(jīng)元細胞中的表達是時序性的。在一些實施方式中，非神經(jīng)元細胞是成纖維細胞、胚胎干細胞(ESCs)、或誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)。在一些優(yōu)選的實施方式中，受試者是人，并且非神經(jīng)元細胞是人成纖維細胞。在一些方法中，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因通過慢病毒載體引入非神經(jīng)元細胞。

在另一個方面，本發(fā)明提供了用于識別刺激非神經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)的感覺神經(jīng)元(iSN)的試劑或細胞調(diào)制的方法。這些方法需要(1)在候選化合物或細胞調(diào)制物的存在下，在非神經(jīng)元細胞中共表達(1)Brn3A基因和(2)Ngnl或Ngn2基因，以及(2)檢測相對于從未進行與特定候選化合物接觸(或進行特定的細胞調(diào)制)的非神經(jīng)元細胞iSN的轉(zhuǎn)化，從已經(jīng)進行與特定候選化合物接觸(或進行特定的細胞調(diào)制)的非神經(jīng)元細胞的iSN轉(zhuǎn)化增強。該方法允許特定候選的化合物(或細胞調(diào)制)能識別為刺激非神經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元的試劑。通常，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因在非神經(jīng)元細胞中的表達是瞬時的。在一些優(yōu)選的實施方式中，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因的表達是時序受控的(例如，經(jīng)由使用誘導(dǎo)型表達載體)。在一些方法中，待篩選的候選化合物是轉(zhuǎn)錄因子或miRNA。一些其他方法涉及篩選細胞調(diào)制，如非神經(jīng)元細胞的表觀調(diào)制。在一些方法中，在篩選中使用的非神經(jīng)元細胞是成纖維細胞、胚胎干細胞(ESC)，或誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)。例如，本發(fā)明的一些篩選方法使用胚胎成纖維細胞或成體成纖維細胞，例如來源于人、小鼠或大鼠的哺乳動物成纖維細胞。在一些優(yōu)選的實施方式中，Brn3A/Ngnl基因或Brn3A/Ngn2基因通過慢病毒載體引入非神經(jīng)元細胞。

本發(fā)明的性質(zhì)和優(yōu)點的進一步理解可通過參考說明書和權(quán)利要求的剩余部分來實現(xiàn)。

附圖說明

圖1A-1H示出了穩(wěn)定地重新編碼成纖維細胞以獲得功能上成熟的神經(jīng)元的特性的兩種發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的瞬時共表達。(a)在成纖維細胞中持續(xù)8天的Brn3a與Ngnl或Ngn2的瞬時共表達誘導(dǎo)具有神經(jīng)形態(tài)的細胞，針對泛神經(jīng)標記物Map2和Tuj1細胞的染色在誘導(dǎo)后14天進行免疫染色。刻度條：100μm。(b)需要Brn3a與Ngnl或Ngn2的協(xié)同表達用于Map2/Tuj1雙陽性細胞的誘導(dǎo)。TF被誘導(dǎo)持續(xù)8天并在誘導(dǎo)后14天進行免疫染色。條和誤差代表平均值和來自三個重復(fù)實驗的SEM。(c)BN2神經(jīng)細胞中的突觸表達，針對泛神經(jīng)標記物Tuj1將細胞復(fù)染色。(d)在BN1神經(jīng)細胞中的小泡相關(guān)膜蛋白(Vamp)表達?？潭葪l：25μm。(e)多數(shù)用BN1和BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元表達指示成熟神經(jīng)元的突觸標記物。在圖中的條代表平均值，誤差條代表±SEM。(f)以電壓鉗模式記錄的全細胞電流。觀察到向內(nèi)快速滅活Na⁺和外向電流。(g)在培養(yǎng)14天后從MEF引起的代表動作電位。(h)在培養(yǎng)第14天觀察到一連串的自發(fā)動作電位。

圖2A-2I示出了用BN1或BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元顯示體感覺神經(jīng)系的分子標志。(a)在BN1和BN2神經(jīng)元的神經(jīng)肽、神經(jīng)絲、和神經(jīng)遞質(zhì)表達的量化。經(jīng)由免疫染色在誘導(dǎo)后20天評估表達。條代表平均值，誤差條代表來自至少100個細胞的SEM。(b)通過BN1或BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元的子集表達外圍神經(jīng)絲外周蛋白?？潭葪l：25μm。(c)通過BN1或BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元的子集表達外圍神經(jīng)絲NF200?？潭葪l：25μm。(d)在Brn3a/Ngnl或Brn3a/Ngn2誘導(dǎo)之后Isl1和內(nèi)源性Brn3a表達的定量RT-PCR的時間過程。雙重誘導(dǎo)計算為從針對每個時間點在相同的條件下針對相同的持續(xù)時間培育的未誘導(dǎo)的成纖維細胞的表達的增加。如箭頭所指示的，誘導(dǎo)后8天強力霉素被永久去除。(e)在誘導(dǎo)后20天誘導(dǎo)的神經(jīng)元的單細胞定量RT-PCR。(f)在誘導(dǎo)Brn3a/Ngnl或Brn3a/Ngn3之后TrkA、TrkB和TrkC的雙重誘導(dǎo)。雙重誘導(dǎo)計算為從針對每個時間點在相同的條件下針對相同的持續(xù)時間培育的未誘導(dǎo)的成纖維細胞表達的增加。(g)單獨和組合的p75和三種trk受體中的每種的陽性神經(jīng)元的量化。條代表平均值，誤差條代表來自兩個獨立的實驗的SEM，其中最少150個細胞被計數(shù)，(h)針對誘導(dǎo)后20天TrkA、TrkB和TrkC的代表免疫染色。(i)誘導(dǎo)后20天p75免疫染色?？潭葪l：25μm。

圖3A-3C示出了重新編碼誘導(dǎo)體感覺神經(jīng)的形態(tài)。(a)TrkA、TrkB和TrkC免疫反應(yīng)神經(jīng)元具有不同分布的體細胞大小。圖表描繪了通過Trk免疫反應(yīng)的平均體細胞面積。誤差條代表±SEM。***p<0.001；**p<0.01(單向ANOVA與Newman-Keuls事后比較)(b)由BN1和BN2誘導(dǎo)的假單極細胞的典型形態(tài)。刻度條：100μm(c)多數(shù)通過Brn3a/Ngnl或Brn3a/Ngn2誘導(dǎo)的Map2/Tuj1陽性細胞是假單極。該圖示出了誘導(dǎo)后14天代表性的實驗中觀察到的神經(jīng)形態(tài)的量化。條代表來自兩個獨立實驗的平均值。

圖4A-4E示出了iSN具有感覺神經(jīng)元的功能特性，(a)MEF、用BAZ誘導(dǎo)的神經(jīng)元和用BN1或BN2產(chǎn)生的iSN的RT-PCR分析。在BN1和BN2但不是在MEF或BAZ中檢測到TrpA1、TrpM8、TrpVl和Na_v1.7。(b)MEF、用BAZ誘導(dǎo)的神經(jīng)元和用BN1或BN2產(chǎn)生的iSN的定量RT-PCR。BAZ、BN1和BN樣品表達相似水平的Map2。在BN1和BN2中存在TrpA1、TrpM8、TrpVl和Na_v1.7，然而在MEF或BAZ樣品中未檢測到TrpA1、TrpM8、TrpVl和Na_v1.7，其由未檢出(n.d)表明。表達標準化到Gapdh。表達水平相對于BN1，使得BN1＝1.0。條和誤差條代表來自兩個獨立生物復(fù)制物的平均值和SEM。(c)針對10μΜ辣椒素(Cap)、100μΜ薄荷醇(Menth)和100μΜ芥子油(MO)的代表鈣響應(yīng)。用Map2::GCAMP5.G測量鈣瞬變。鈣響應(yīng)計算為超過初始熒光(F₀)的熒光變化(ΔF)。在每次實驗開始和結(jié)束用2.5mM氯化鉀去極化以證實神經(jīng)特性和維持功能的能力。(d)ΔF/F₀強度曲線：示出單個細胞對每種配體的響應(yīng)。每個細胞在每列中表示。細胞響應(yīng)于僅KCl(黑色圓圈)，KCl加一種其它配體(其他圓圈)，或KCl加兩種其他配體(菱形、三角形或正方形)(e)響應(yīng)于僅KCl、KCl加一種其它配體或KCl加兩種其他配體的KCl響應(yīng)體的分布。條代表至少四個實驗的平均值。誤差條表示SEM。。

圖5A-5H示出了不需要細胞分裂或?qū)ｉT胚胎細胞的體感覺譜系的誘導(dǎo)。(a和b)誘導(dǎo)后14天EdU和Map2染色，(c)針對有絲分裂指示器EdU共同染色的Map2-陽性細胞的數(shù)量的定量。rtTA是感染了反向四環(huán)素反式激活子的MEF。BAZ是感染了Brn2、Mashl(也稱為Ascl1)和Zicl(將MEF轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元的先前報道的轉(zhuǎn)錄混合物)的MEF。條是來自兩個獨立的實驗的平均值。誤差條是SEM?？潭葪l：25μm。(d和e)BN1和BN2在有絲分裂抑制劑AraC的存在下生成神經(jīng)元。從誘導(dǎo)后三天直到實驗結(jié)束以4μΜ施用AraC，該濃度憑經(jīng)驗確定以抑制>90％的增殖性細胞，(e)有絲分裂抑制不顯著減少由BN1或BN2產(chǎn)生的神經(jīng)元的數(shù)量。條是兩個重復(fù)實驗的平均值。誤差條是SEM。(g)從尾尖成纖維細胞誘導(dǎo)的Map2/Tuj1陽性細胞的量化。(h)BN1和BN2從TTF誘導(dǎo)神經(jīng)細胞，TTF染色用于體感覺標記物?？潭葪l：25μm。

圖6A-6O示出了使用BN1和BN2產(chǎn)生人iSN。(a)誘導(dǎo)后14天BN1和BN2的表達將人胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成具有神經(jīng)元形態(tài)的MAP2/TUJ1雙陽性細胞，其中第8天去除強力霉素?？潭葪l：100μm。(b)在BN1、BN2和rtTA控制的條件下從HEF產(chǎn)生的TUJl單陽性(灰)和MAP2/TUJ1雙陽性細胞的百分數(shù)。(c-1)用BN1/2誘導(dǎo)的神經(jīng)元表達體感覺標記物，刻度條：25μm。(m)MEF和用BN1或BN2產(chǎn)生的iSN中的TRK受體的定量RT-PCR。表達水平標準化為MAP2。條及誤差條表示來自兩個獨立的生物復(fù)制物的平均值和SEM。(n)在BN1、BN2、BAZ和rtTA控制的條件下表達TRKA、TRKB、TRKC，VGLUT2和ISLl的TUJ陽性細胞的定量。(o)在BN1和BN2表達NF200、PRPH和RET的TUJ陽性細胞的定量。誤差條表示SEM。

圖7A-7I示出了人iSN具有感覺神經(jīng)元的功能特性。(a，b)在BN1和BN2iSN的Na/K電流的代表軌跡和誘發(fā)動作電位。(c)PCR分析顯示：在誘導(dǎo)后16天，與BAZ和未感染的對照(HEF)相比，在BN1和BN2人iSN中顯示配體門控鈣通道TRPA 1、TRPM8、TRPV1和電壓門控鈉通道Na_v1.7的存在。與未感染的對照組相比，BN1、BN2和BAZ樣品表達MAP2。TRPA1、M8、VI和Na_vl.7只存在于BN1和BN2中。樣品中GAPDH擴增提供負載控制，并且在沒有逆轉(zhuǎn)錄酶(-RT)的情況下使用的GAPDH控制污染的基因組DNA。(d)針對10μΜ辣椒素(Cap)，100μΜ薄荷腦(Men)和100μΜ芥子油(MO)的代表的鈣響應(yīng)。鈣瞬變用Map2::GCAMP5.G測量。鈣響應(yīng)計算為超過初始熒光(F₀)的熒光變化(ΔF)。在每次實驗開始和結(jié)束用2.5mM氯化鉀去極化以證實神經(jīng)特性和維持功能能力。(e)ΔF/F₀強度曲線：示出單個細胞對每個配體的反應(yīng)。每個細胞在每列中表示。細胞響應(yīng)于僅KCl(黑色圓圈)，KCl加一種其它配體(其他圓圈)，或KCl加兩種其他配體(三角形或正方形)。(f)響應(yīng)于僅KCl、KCl加一種其它配體或KCl加兩種其他配體的KCl響應(yīng)體的分布。條代表七個實驗的平均值。誤差條表示SEM。(g)對100μΜ組胺(Hist)、100μΜ氯喹(CQ)、10μΜBAM8-22(BAM)、10μΜSLI-GRL(SLI)的代表性鈣響應(yīng)。(h)三種獨立的配體結(jié)合方案的ΔF/F₀強度曲線顯示出單個細胞對每種配體的響應(yīng)。每個細胞在每列中表示。細胞響應(yīng)于僅KCl(黑色圓圈)，KCl加一種其它配體(其他圓圈)，或KCl加兩種其它配體(三角形或正方形)。(i)在BN2的響應(yīng)于僅KCl、KCl加一種其它配體，或KCl加多種配體的KCl響應(yīng)體的分布。條表示來自至少2個實驗的平均值。誤差條表示SEM。

圖8A-8C顯示，BN1或BN1的異位表達介導(dǎo)神經(jīng)重新編碼。(a)強力霉素誘導(dǎo)型慢病毒載體。(b)神經(jīng)誘導(dǎo)方法。(c)使用在S1a所描述的方案的BN1和BN1在MEF中的單和雙異位表達的代表染色。

圖9A-9C顯示，BN1和BN2神經(jīng)元具有感覺神經(jīng)元的分子特征，(a)用BN1或BN2誘導(dǎo)的iSN是興奮性神經(jīng)元，顯示Tuj1陽性細胞中的vGlutl、Vlut2、和vGlut3、CGRP的免疫染色?？潭葪l表示25μΜ。(b)在強力霉素去除后持續(xù)Brn3a而不是Ngnl/2表達，(c)針對單獨和成對組合的三種Trk受體是陽性的神經(jīng)元的定量。條代表方式和誤差棒代表來自兩個獨立實驗的SEM，其中計數(shù)至少100個細胞。

圖10A-10C示出了iSN形態(tài)的分析。(a)TrkA、TrkB和TrkC神經(jīng)元有不同分布的體細胞大小。通過Trk受體免疫反應(yīng)的體細胞大小的散布圖。(b)表呈現(xiàn)體細胞大小分布的統(tǒng)計特性。用Brn2、Ascl1(也稱為Mashl)和Zic1(BAZ)和BN1和BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元的代表性圖像。黑色是Tuj1染色?？潭葪l100μm。(c)用Brn2、Ascl1、Zic 1(BAZ)或BN1和BN2產(chǎn)生的iSN的代表神經(jīng)突分支。針對Tuj1免疫染色神經(jīng)元。

具體實施方式

I.概述

本發(fā)明部分地基于將小鼠和人成纖維細胞轉(zhuǎn)化成感覺神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄因子的本發(fā)明人的研究結(jié)果。如本文詳述的，發(fā)現(xiàn)兩種譜系相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在無需額外的外源線索的情況下可以誘導(dǎo)表型模擬許多包括形態(tài)特征、基因表達和功能性質(zhì)的體感神經(jīng)元的定義特征的神經(jīng)元。在小鼠中誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元(iSN)表現(xiàn)出外圍感覺神經(jīng)元的兩個重要形態(tài)特征，假單極形態(tài)和譜系限制大小分布。具體地，發(fā)現(xiàn)利用轉(zhuǎn)錄因子(Brn3a/Ngnl(BN1)或Brn3a/Ngn2(BN2))的共表達的神經(jīng)重新編碼是高選擇性的，絕大多數(shù)誘導(dǎo)神經(jīng)元呈現(xiàn)三種主要的體感神經(jīng)譜系之一并表達對體感神經(jīng)元獨特的標記物的特定組合陣列。此外，通過Ngnl或Ngn2產(chǎn)生的iSN之間沒有觀察到差異。此外，發(fā)明人能夠概括在人成纖維細胞中的這些誘導(dǎo)的感覺神經(jīng)元，并且這些iSN具有傷害感受神經(jīng)元的功能上的“黃金標準”，感測和選擇性響應(yīng)有害和癢誘導(dǎo)刺激的能力。這些結(jié)果表明，iSN是外周感覺神經(jīng)元的功能擬表型，并且導(dǎo)致在感覺生物學(xué)、疾病和在源自不同遺傳背景的人的細胞中直接藥物篩選的研究是有用的。

雖然觀察到iSN被分成從通用的前體發(fā)育產(chǎn)生的三種不同的體感譜系，但iSN轉(zhuǎn)化不需要通過增殖神經(jīng)前體過渡。直接轉(zhuǎn)化為通過定向分化從多能干細胞產(chǎn)生體外神經(jīng)元模型提供了一些明顯的優(yōu)勢。例如，直接iSN轉(zhuǎn)化是快速的、有效的，并且需要培養(yǎng)環(huán)境的盡可能少的操縱。此外，避免通過直接轉(zhuǎn)化的增殖前體限制了可消除致病的或表型期望的性狀的表觀遺傳變化的機會。

根據(jù)這些研究，本發(fā)明提供了通過共表達Brn3a/Ngnl(BN1)基因或Brn3a/Ngn2(BN2)的基因的組合從非神經(jīng)元細胞產(chǎn)生誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元的方法。該方法建立了一種新的和簡潔的用于從非神經(jīng)元細胞(如成纖維細胞)直接誘導(dǎo)神經(jīng)元特有分型的技術(shù)。本發(fā)明還包括含有用于瞬時表達BN1或BN2基因的表達載體的非神經(jīng)元細胞，由此產(chǎn)生的誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元，以及攜帶這樣的非神經(jīng)元細胞或誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因非人動物。通過利用最小組的轉(zhuǎn)錄因子，所述方法提供了用于理解神經(jīng)誘導(dǎo)如何進行的基礎(chǔ)，以及篩選能選擇性誘導(dǎo)特定的感覺亞群的附加因素的平臺。因此，本發(fā)明還提供了用于識別可以提高iSN誘導(dǎo)的效率、準確性或特異性的其它試劑或細胞調(diào)制的方法，包括轉(zhuǎn)錄因子、miRNA或其他遺傳和表觀遺傳調(diào)制。本發(fā)明進一步提供了在多種治療應(yīng)用中采用根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的iSN的方法。以下部分提供了制備和使用本發(fā)明的組合物以及用于實施本發(fā)明的方法的指導(dǎo)。

II.定義

除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。下列參考文獻提供給本領(lǐng)域技術(shù)人員本發(fā)明所用的術(shù)語的一般定義：Academic Press Dictionary of Science and Technology,Morris(編輯(Ed.)),Academic Press(第1版,1992)；Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Smith等人(Eds.),Oxford University Press(修改版,2000)；Encyclopaedic Dictionary ofChemistry,Kumar(Ed.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002)；Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,Singleton等人(Ed.),John Wiley&Sons(3rd ed.,2002)；Dictionary of Chemistry,Hunt(Ed.),Routledge(第1版,1999)；Dictionary of Pharmaceutical Medicine,Nahler(Ed.),Springer-Verlag Telos(1994)；Dictionary of Organic Chemistry,Kumar和Anandand(Eds.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002)；以及A Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference),Martin和Hine(Ed.),Oxford University Press(第4版,2000)。此外，提供下列定義以幫助讀者實踐本發(fā)明。

術(shù)語“試劑”或“測試劑”包括何物質(zhì)、分子、元素、化合物、實體或它們的組合。它包括，但不限于，例如，蛋白質(zhì)、多肽、有機小分子、多糖、多核苷酸等。它可以是天然產(chǎn)物、合成化合物或化學(xué)化合物或兩種或更多種物質(zhì)的組合物。除非另有規(guī)定，在本文中術(shù)語“試劑”、“物質(zhì)”和“化合物”可互換使用。

術(shù)語“類似物”在本文中用于指結(jié)構(gòu)上類似于參照分子但其通過用替代取代基取代參考分子的特定的取代基以針對性和可控的方式已被改性的分子。本領(lǐng)域技術(shù)的技術(shù)人員可以預(yù)期，類似物相比于參考分子表現(xiàn)出相同、相似或改進的效用。用以確定具有改善的性狀(如靶分子更高的結(jié)合親和力)的已知的化合物的變體的類似物的合成和篩選是藥物化學(xué)中公知的方法。

如本文所用的，“接觸”具有其正常的含義，指的是使兩種或更多種試劑(例如，多肽或小分子化合物)或結(jié)合試劑與細胞結(jié)合。接觸可在體外發(fā)生，例如，在試管或其他容器中結(jié)合兩種或更多種試劑或結(jié)合測試劑和細胞或細胞裂解物。接觸也可能在細胞中或原位發(fā)生，例如，通過在編碼兩個多肽的重組多核苷酸的細胞中共表達在細胞中使兩個多肽接觸，或在細胞裂解物中使兩個多肽接觸。

干細胞是特征在于通過有絲分裂細胞分裂進行自我更新的能力和有潛力分化成組織或器官的細胞。胚胎干細胞(ESCs)是從囊胚(早期胚胎)的內(nèi)細胞團衍生的多能干細胞。ESC是多能的，也就是說，它們能夠分化為三種胚層(外胚層、內(nèi)胚層和中胚層)的所有衍生物。這些包括在成人體內(nèi)的220種以上的細胞類型中的每種。多能性區(qū)分胚胎干細胞與成人中發(fā)現(xiàn)的成體干細胞；而胚胎干細胞可以產(chǎn)生身體中的所有細胞類型，成體干細胞是多能的，并且僅能夠產(chǎn)生數(shù)量有限的細胞類型。此外，在特定條件下，胚胎干細胞能夠無限期地傳播它們自己。這使得胚胎干細胞能用作用于研究和再生醫(yī)學(xué)的有用工具，因為它們能產(chǎn)生無限數(shù)量的其自身用于繼續(xù)研究或臨床使用。

誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)是通過誘導(dǎo)特定基因的“強制”表達人工衍生自非多能細胞(通常為成體細胞)的一種類型的多能干細胞。在例如某些干細胞的基因和蛋白質(zhì)的表達、染色質(zhì)甲基化模式、倍增時間、胚狀體形成、畸胎瘤的形成、能生長發(fā)育的嵌合體的形成、和效力和可區(qū)別性等許多方面，誘導(dǎo)多能干細胞類似于天然多能干細胞(例如胚胎干(ES)細胞)，但仍然要評估它們與天然多能干細胞的關(guān)系的全部范圍。已經(jīng)從成體胃、肝、皮膚細胞、血細胞、前列腺細胞、尿道細胞中產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細胞。

感覺神經(jīng)元是負責轉(zhuǎn)化從生物體的環(huán)境出現(xiàn)的各種外部刺激從而產(chǎn)生相應(yīng)的內(nèi)部刺激的神經(jīng)元。它們通過感覺輸入激活，并發(fā)送推測至神經(jīng)系統(tǒng)的其他部件，最終傳送感覺信息至腦或脊髓。不像中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元(它們的輸入來自其它神經(jīng)元)，感覺神經(jīng)元通過例如可見光、聲、熱、物理接觸等物理方式，或通過例如在氣味或味道的情況下之類的化學(xué)信號激活的。外周感覺神經(jīng)元包括三種主要譜系：傷害感受器、機械感受器和本體感受器，它們分別通過TrkA、TrkB和TrkC的表達劃分。外圍感覺神經(jīng)元從通過共表達神經(jīng)元素1(Ngnl)和神經(jīng)元素2(Ngn2)協(xié)調(diào)發(fā)育的兩個波產(chǎn)生。

誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元(iSN)是指通過實驗操作從非神經(jīng)元細胞產(chǎn)生的神經(jīng)元譜系細胞，即有絲分裂的神經(jīng)元祖細胞和有絲分裂后神經(jīng)元前體細胞和成熟神經(jīng)元。iSN表達對神經(jīng)元譜系的細胞有特異性的標記物(例如Tau、Tuj1、MAP2、NeuN，等等)，且可具有功能性神經(jīng)元的特性，即，它們能夠被去極化，即，傳播動作電位，并且它們能夠形成并保持與其他神經(jīng)元的突觸。

miRNA(或微RNA)是指一類能夠調(diào)節(jié)RNA翻譯的小RNA分子(參見，Zeng和Cullen,RNA,9:112-123,2003；Kidner和Martienssen,Trends Genet,19:13-6,2003；Dennis等人,Nature,420:732,2002；以及Couzin等人,Science 298:2296-7,2002)。微RNA(miRNA)包括約22個核苷酸(nt)非編碼RNA的族。在從線蟲到人類范圍的生物體中這些RNA已被識別。許多miRNA是廣泛跨門類進化上保守的，通過轉(zhuǎn)錄后基因抑制調(diào)控基因表達。長初級轉(zhuǎn)錄(Pri-miRNA)由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄；通過核酶Drosha處理；并釋放為約60bp發(fā)夾前體(pre-miRNA)。pre-miRNA由RNase III酶(Dicer酶)處理成約22nt(成熟miRNA)，然后摻入RISC(RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物)。miRNA-RISC的復(fù)合物結(jié)合靶mRNA的3'UTR，并進行mRNA的翻譯抑制或降解。

相對于參照分子或細胞活性(例如，轉(zhuǎn)錄或DNA甲基化)的術(shù)語“調(diào)制”是指參照分子或細胞活性的生物學(xué)活性的抑制或激活。調(diào)制可以是上調(diào)(即，激活或刺激)或下調(diào)(即，抑制或抑制)。操作的方式可以是直接的，例如，通過結(jié)合至參考分子。調(diào)制也可以是間接的，例如通過結(jié)合至另一分子和/或改性另一分子，所述另一分子以其他方式調(diào)制參考分子。

增強的轉(zhuǎn)化效率是指非神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)物在與化合物接觸(或經(jīng)受遺傳或表觀調(diào)制)時相對于不與所述化合物接觸(或進行調(diào)制)的相同類型的細胞的培養(yǎng)物能夠產(chǎn)生誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元的上調(diào)的能力。增強，它是指該細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生誘導(dǎo)的感覺神經(jīng)元的能力比不與所述候選劑或誘導(dǎo)劑接觸的群體的能力大，例如，是未接觸(或無調(diào)制)的群體的能力的150％、200％、300％、400％、600％、800％、1000％，或2000％。換言之，細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元的數(shù)量是未接觸(或無調(diào)制)的群體的1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、6倍以上、8倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上。

“多核苷酸”或“核酸序列”是指聚合形式的核苷酸(多核糖核苷酸或多脫氧核苷酸)。在一些情況下，多核苷酸是指不能直接鄰接在所來源的生物體的天然存在的基因組中與編碼序列直接鄰接(一個在5'端，一個在3'端)的所述編碼序列中的任何一個的一序列。因此該術(shù)語包括，例如，摻入載體的重組DNA；摻入自主復(fù)制質(zhì)?；虿《镜闹亟MDNA；或摻入原核生物或真核生物的基因組DNA的重組DNA，或其中存在作為獨立于其它序列的單獨的分子(如cDNA)。多核苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或任一核苷酸的修飾形式。

多肽或蛋白質(zhì)是指其中單體是通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。當氨基酸是α-氨基酸時，可以使用L型光學(xué)異構(gòu)體或D型光學(xué)異構(gòu)體，L-異構(gòu)體是典型的。多肽或蛋白質(zhì)片段可以與天然存在的蛋白質(zhì)具有相同的或基本上相同的氨基酸序列。具有基本上相同的序列的多肽或肽是指氨基酸序列在很大程度上是同樣的，但不完全同樣，而保留了與其相關(guān)的序列的功能活性。

由于保守取代，多肽可以基本上相關(guān)。保守變異表示氨基酸殘基由另一個生物學(xué)上相似的殘基取代。保守變異的實例包括用一個疏水殘基(如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代另一個疏水殘基，或者用一個極性殘基取代另一個，例如用精氨酸置取代賴氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺，等等。保守取代的其它示例性實例包括以下的變化：丙氨酸至絲氨酸；精氨酸至賴氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或組氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸到絲氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；組氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；異亮氨酸至亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸至纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸至精氨酸、谷氨酰胺、或谷氨酸；蛋氨酸至亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸至蘇氨酸；蘇氨酸至絲氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；纈氨酸至異亮氨酸至亮氨酸。

術(shù)語“受試者”包括哺乳動物，尤其是人，以及其它非人動物，例如，馬、狗和貓。

“基本相同”的核酸或氨基酸序列是指包括如使用標準參數(shù)通過本文所述的公知的)密碼指令序列(例如，BLAST)中的一種測得的具有與參考序列至少75％、80％或90％的序列同一性的序列的多核苷酸或氨基酸序列。序列同一性優(yōu)選是至少95％，更優(yōu)選至少98％，最優(yōu)選至少99％。在一些實施方式中，目標序列相比于參考序列具有大約相同的長度，即，包括大約相同數(shù)量的連續(xù)氨基酸殘基(針對多肽序列)或者核苷酸殘基(針對多核苷酸序列)。

序列同一性可以使用本領(lǐng)域已知的各種方法容易地確定。例如，BLASTN密碼指令序列(針對核苷酸序列)使用默認值：字長(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及兩條鏈的比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認值：字長3(W)，期望值(E)10，和BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。序列同一性的百分比通過在對比窗口上比較兩個最佳對準的序列，其中在對比窗口中多核苷酸序列的一部分可以包含針對兩個序列的最佳對準的相比于參考序列(其不包含添加物或缺失物)的添加物或缺失物(即，間隙)。百分比通過下列方式來計算：確定在兩個序列中相同核酸堿基或氨基酸殘基出現(xiàn)的位置的數(shù)量以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)量，將匹配位置的數(shù)量除以在對比窗口中的位置的總數(shù)量，并將得到的結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。

如本文所用，“治療”或“改善”包括(i)預(yù)防病理病癥(例如，感覺神經(jīng)元病)的發(fā)生(例如，防治)；(ii)抑制病理病癥(例如，感覺神經(jīng)元病)或阻止其發(fā)展；和(iii)緩解與病理病癥(例如，感覺神經(jīng)元病)相關(guān)的癥狀。因此，“治療”包括本發(fā)明的分離(和/或純化)的iSN群體和/或其它治療性組合物或藥劑的給藥，以預(yù)防或延遲癥狀的發(fā)作、并發(fā)癥、或本文所描述的疾病的生化標記，緩解或改善癥狀或阻止或抑制疾病、病癥或病癥的進一步發(fā)展?！爸委煛边€指在本文描述的疾病、病癥或病癥的治療或改善或預(yù)防中成功的任何征象，包括任何客觀參數(shù)或主觀參數(shù)，諸如癥狀的減輕、緩解、消退或使疾病癥狀對于患者是更可容忍的；減緩?fù)嘶蛩ネ说乃俣龋换蚴雇嘶慕K點不太虛弱。用于治療或改善病癥或癥狀的詳細操作方法可以基于客觀參數(shù)或主觀參數(shù)，包括由醫(yī)師檢查的結(jié)果。

參考分子的“變體”(例如，神經(jīng)元素1或神經(jīng)元素2)是指在結(jié)構(gòu)和生物活性上基本上相似于整個參考分子或者其片段的分子。因此，如果兩個分子具有相似的活性，那么變體被認為是如在本文中使用的術(shù)語，即使該分子之一的二級、三級或四級結(jié)構(gòu)與在其他分子中發(fā)現(xiàn)的是不相同的，或者如果氨基酸殘基的序列是不相同的也如此。

“載體”是另一多核苷酸片段可連接到其上以引起所連接段的復(fù)制的復(fù)制子，諸如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒。能夠引導(dǎo)編碼一種或多種多肽的基因的表達的載體被稱為“表達載體”。

逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒)基載體或反轉(zhuǎn)錄病毒載體是指所述載體的基因組包括來自作為骨架的病毒的組件。從載體所產(chǎn)生的病毒顆粒作為一個整體包含與RNA基因組兼容的必需載體組件，包括反轉(zhuǎn)錄和整合系統(tǒng)。通常這些將包括來源于病毒的gag和pol蛋白質(zhì)。如果該載體來源于慢病毒，病毒顆粒能夠感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細胞。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒能夠提供選定的外源基因或多核苷酸序列(例如治療活性基因)給靶細胞的基因組。

III.用于誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元的形成的Brn3a和Ngnl/Ngn2基因

為了從非神經(jīng)元細胞產(chǎn)生誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元(iSN)，本發(fā)明的方法需要在非神經(jīng)元細胞中共表達Brn3a基因(基因組或cDNA序列)和Ngnl(或Ngn2)基因(基因組或cDNA序列)。Brn3a(也稱為Pou4fl)編碼腦特異性同源框/POU域蛋白3A(BRN3A)，又名“POU域轉(zhuǎn)錄因子”(POU4F1)，其調(diào)節(jié)從神經(jīng)產(chǎn)生到最終成熟的分化狀態(tài)的過渡。神經(jīng)產(chǎn)生是參與特化神經(jīng)元分化的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的族。它們對于背根神經(jīng)節(jié)的形成是必不可少的。神經(jīng)元素1(Ngn1)通過與編碼神經(jīng)發(fā)生的基因上的調(diào)節(jié)器的增強子結(jié)合來充當神經(jīng)元分化的調(diào)節(jié)器。Ngnl是原神經(jīng)基因，因為其表達在神經(jīng)系的確定之前可以看出。為了Ngnl以高的保真度與基因組DNA結(jié)合，它必須用另一bHLH蛋白質(zhì)二聚化。神經(jīng)元素2(Ngn2)是參與了神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)特化的轉(zhuǎn)錄因子。該蛋白質(zhì)結(jié)合在許多涉及神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)特化的基因的啟動子上的增強子框調(diào)節(jié)元件。為了足夠的DNA結(jié)合，Ngn2必須與增強蛋白質(zhì)形成二聚體。

來自不同物種的Brn3a基因和Ngnl/Ngn2基因可以容易地在本發(fā)明的實踐中使用。這些基因的基因組和cDNA序列在本領(lǐng)域中是都是已知的。參見，例如，Trieu等人，Development 130,111-121,2003；Lanier等人，Dev.Dyn.238,3065-3079,2009；Velkey等人，Dev.Dyn.242,230-253,2013；以及Ma等人，Genes Dev.13:1717-28,1999.例如,來自不同物種的Brn3a基因組和/或cDNA序列已在文獻中被報道、克隆和表征,包括人Brn3a基因、小鼠BrnSa基因、大鼠Brn3a基因、雞Brn3a基因、和斑馬魚Brn3a基因。參見，例如，He等人，Nature 340,35-41,1989；Collum等人，Nucleic Acids Res.20,4919-4925,1992；Gerrero等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,10841-10845,1993；Bhargava等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,10260-10264,1993；Turner等人，Neuron 12,205-218,1994；Xiang等人，J.Neurosci.15,4762-4785,1995；Smith等人，J.Biol.Chem.272,1382-1388,1997；Fedtsova和Turner,Mech.Dev.105,129-144,2001；Thomas等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.318,1045-1051,2004；Aizawa等人，Curr Biol.15,238-43,2005；以及Trieu等Development 130,111-121,2003。類似地,來自人、小鼠、大鼠、雞、爪蟾、斑馬魚以及許多其他物種的Ngn1和Ngn2cDNA序列已經(jīng)被克隆和功能性表征。參見，例如，Sommer等人，Mol.Cell.Neurosci.8,221-241,1996；McCormick等人，Mol.Cell.Biol.16,5792-5800,1996；Ma等人，Cell 87,43-52,1996；Gradwohl等人，Dev.Biol.180,227-241,1996；Tamimi等人，Genomics 40,355-357,1997；Fode等人，Neuron 20,483-494,1998；Korzh等人，Dev.Dyn.213,92-104,1998；Ma等人，Genes Dev.13:1717-28,1999；Perez等人，Development 126,1715-1728,1999；Franklin等人，J.Child Neurol.16,849-853,2001；Simons等人，Dev.Biol.229,327-339,2001；Kim等人，Exp.Mol.Med.34,469-475,2002；Klein等人，Dev.Dyn.225,384-391,2002；以及Zimin等人，Genome Biol.10,R42,2009.對應(yīng)于這些基因的特定基因組或mRNA序列也可從例如GenBank獲得。任何這些Brn3a基因和Ngnl/Ngn2基因可以在本發(fā)明的實踐中使用。

除了上述各種野生型Brn3a基因(或cDNA序列)和Ngnl/Ngn2基因(或cDNA序列)，這類基因(或cDNA序列)的變體或功能性衍生物也還可以用于本發(fā)明。因此，本發(fā)明的方法可以利用與其野生型對應(yīng)物基本相同的變體或修飾的Brn3a序列和/或Ngnl(或Ngn)序列，例如，保守修飾的變體。例如，基本上相同的變體應(yīng)包含至少80％、90％、95％或99％相同于野生型序列的序列。在一些實施方式中，功能性衍生物是通過非保守取代物產(chǎn)生的變體，達到它們基本上保留天然蛋白的活性的程度。對編碼感興趣的多肽的多核苷酸的修飾可以用本領(lǐng)域常規(guī)實踐的標準技術(shù)進行。在其它一些實施方式中，功能性衍生物可以包含野生型Brn3a基因和/或Ngnl(或Ngn2)基因的部分序列。這樣的部分序列應(yīng)編碼具有野生型蛋白的部分或全部的細胞功能(例如，在調(diào)節(jié)神經(jīng)中的活動)的功能性片段。所述BRN3A、Ngnl和Ngn2轉(zhuǎn)錄因子的細胞功能(例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié))已在本領(lǐng)域中被描述?；诒绢I(lǐng)域中公知的它們的結(jié)構(gòu)和功能的信息，這些轉(zhuǎn)錄因子的功能性片段的克隆和表達可以通過分子生物學(xué)的標準技術(shù)容易地進行。此外，本文中所描述BRN3A、Ngnl和Ngn2的功能性衍生物可以進行如下所述的篩選方法，以確認它們在誘導(dǎo)的感覺神經(jīng)元的促進形成中的活性。

IV.用于產(chǎn)生誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元的非神經(jīng)元細胞

在本發(fā)明中各種非神經(jīng)元細胞可以被用來產(chǎn)生誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元。這些非神經(jīng)元細胞包括成纖維細胞、干細胞、血細胞，以及其它非神經(jīng)元體細胞。非神經(jīng)元細胞可以從人類和包括脊椎動物和哺乳動物的非人類的動物中獲得。因此，除了如本文例舉的人類細胞和小鼠細胞以外，細胞也可以來自其它動物物種，如牛、羊、豬、犬、貓、鳥、硬骨魚和軟骨魚、大鼠，其他靈長類動物(包括猴子)，以及其他動物，如貂、羊、兔和豚鼠。

通常，適合用于本發(fā)明的方法的非神經(jīng)元細胞可以是在無實驗操作的情況下不會產(chǎn)生感覺神經(jīng)的任何體細胞。這些非神經(jīng)元體細胞的實例包括從外胚層(例如，角質(zhì)形成細胞)、中胚層(例如，成纖維細胞)、內(nèi)胚層(例如，胰腺細胞)、或神經(jīng)嵴細胞譜系(例如，黑素細胞)分化中或已分化的細胞。體細胞可以是，例如，胰腺β細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞(例如，少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞)、肝細胞、肝干細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞，平滑肌細胞、造血細胞、破骨細胞、成骨細胞、周細胞、血管內(nèi)皮細胞、雪旺細胞、真皮成纖維細胞，等等。它們可以是最終分化的細胞，或者它們能夠產(chǎn)生特定的、非神經(jīng)元譜系的細胞，例如，心臟干細胞、肝干細胞等。所述體細胞容易識別為非神經(jīng)細胞，依據(jù)是不存在如本文描述的現(xiàn)有技術(shù)中所公知的神經(jīng)元特異性標記物。感興趣的細胞是屬于脊椎動物的細胞，例如哺乳動物細胞，如人細胞，包括成人人細胞。

本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方式利用成纖維細胞以產(chǎn)生iSN。如本文所例舉的，這些成纖維細胞包括胚胎成纖維細胞和成體成纖維細胞。成纖維細胞可以從例如人、小鼠和大鼠等各種動物(例如，哺乳動物)物種得到或衍生。在一些實施方式中，干細胞可以用于轉(zhuǎn)化成iSN。適于實施本發(fā)明的干細胞包括但不限于造血干細胞(HSC)、胚胎干細胞、間質(zhì)干細胞，并且也包括誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)。除了成纖維細胞以外，本發(fā)明的一些實施方式還可以利用體細胞，如血細胞等。在這些實施方式中，從各種器官，包括例如肝、脾、骨髓和淋巴系統(tǒng)，獲得的血液細胞可全部在本發(fā)明的實踐中使用。此外，本發(fā)明的方法還可以用于從如紅細胞、白細胞和血小板等外周血細胞產(chǎn)生iSN。在其它一些實施方式中，所采用的非神經(jīng)元體細胞可以是神經(jīng)膠質(zhì)細胞(膠質(zhì))。膠質(zhì)細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞是指與神經(jīng)元緊密接觸中發(fā)現(xiàn)的非神經(jīng)元細胞，并包括若干不同的細胞，包括但不限于小膠質(zhì)細胞、大膠質(zhì)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、室管膜細胞、放射狀膠質(zhì)細胞、雪旺細胞、衛(wèi)星細胞和腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞。

V.在非神經(jīng)元細胞中表達Brn3a和Ngnl/Ngn2

在非神經(jīng)元細胞中共表達如上所述的Brn3a/Ngnl(BN1)基因、Brn3a/Ngn2(BN2)基因或它們的功能性變體可以根據(jù)本文所例舉的方法和本領(lǐng)域公知的其他的方法來進行。優(yōu)選地，所述基因在非神經(jīng)元細胞中瞬時表達。這可以通過將基因(基因組或cDNA序列)克隆到表達載體然后將表達載體引入目標非神經(jīng)元細胞來完成。這兩個基因可從如本文所舉例說明的相同的載體共表達?？商娲兀@兩個基因可被克隆到兩個表達載體并從兩個表達載體分別表達。優(yōu)選地，所述基因被克隆到用于轉(zhuǎn)導(dǎo)到非神經(jīng)元細胞的反轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(慢病毒載體)。如在下面的實施例證明，表達BN1基因或BN2基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以容易地通過下列方式來構(gòu)建：將基因可操作地插入載體，在如本文所述的合適的包裝細胞中復(fù)制載體，獲得由其產(chǎn)生的病毒顆粒，然后用重組病毒感染目標非神經(jīng)元細胞(例如，成纖維細胞)。

將BN1或BN2基因克隆到表達載體中并在非神經(jīng)元細胞中表達基因可以使用本文所述的具體的方案和在本領(lǐng)域常規(guī)實踐的方法來進行，本領(lǐng)域常規(guī)實踐的方法例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,(第3版,2000)；以及Brent等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(ringbou ed.,2003)。用于克隆受研究的基因到慢病毒載體，在包裝細胞(例如，293T細胞)中產(chǎn)生慢病毒，以及針對基因的表達用病毒感染宿主細胞的詳細過程也被描述在本領(lǐng)域中，例如，Boland等人，Nature 461,91-94,2009。除非另有說明，用于實施本發(fā)明所需的其他方法過程或步驟可以基于如下列文獻所描述的標準方法過程，例如，Murray等人,Gene Transfer and Expression Protocols,The Humana Press Inc.(1991)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1986)；或Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152,S.L.Berger和A.R.Kimmerl Eds.,Academic Press Inc.,San Diego,USA(1987)；Current Protocols in Protein Science(CPPS)(John E.Coligan等人，ed.,John Wiley and Sons,Inc.),Current Protocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等人，ed.,John Wiley and Sons,Inc.),以及Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Technique，R.Ian Freshney,Publisher:Wiley-Liss；5th edition(2005),Animal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology,Vol.57,Jennie P.Mather和David Barnes editors,Academic Press,1st edition,1998)。

在一些實施方式中，在非神經(jīng)元細胞表達BN1或BN2基因是時序受控的。這些基因的時序表達可以通過例如使用誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)來實現(xiàn)。任何誘導(dǎo)型表達的方法可以在本發(fā)明的實踐中使用。例如，表達載體可以結(jié)合在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下是活性的誘導(dǎo)型啟動子，例如，強力霉素(dox)誘導(dǎo)型慢病毒載體。如本發(fā)明所列舉的，基因可以在與反向四環(huán)素反式激活因子(rtTA)結(jié)合并與強力霉素、四環(huán)素或四環(huán)素類似物接觸時被激活的啟動子的控制下表達。tTA蛋白質(zhì)通過融合在大腸桿菌細菌中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)TetR(四環(huán)素阻遏物)與在單純皰疹病毒中發(fā)現(xiàn)的另一種蛋白質(zhì)VP 16而創(chuàng)建。所得tTA蛋白質(zhì)能夠在特定TetO操縱基因序列與DNA結(jié)合。在誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)中，若干重復(fù)的TetO序列放置在最小啟動子(如CMV啟動子)的上游。具有最小啟動子的若干TetO序列整體稱為四環(huán)素響應(yīng)元件(TRE)，因為它通過增加其啟動子的下游的一個或多個基因的表達響應(yīng)于四環(huán)素反式激活因子蛋白tTA的結(jié)合。通常情況下，除了在用于表達目的外源基因的(例如，BN1或BN2基因)TetO的控制下的表達載體，用于表達反向tet反式激活因子的另一種載體也包含在誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)中。

該誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)允許在使神經(jīng)元成熟的非神經(jīng)元細胞中BN1或BN2基因表達的優(yōu)化。誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)相比于非誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)也可以允許基因的較高和/或較長時間的表達。在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方式中，BN1或BN2基因表達的誘導(dǎo)可以持續(xù)至少約2天、4天、8天、12天，例如，介于2-8、4-10、6-12、8-14、10-20、12-30、或15-40之間的天數(shù)。誘導(dǎo)的時間段是指從BN1或BN2基因的初始表達(或用如本文列舉的強力霉素的添加誘導(dǎo)表達)到iSN被選擇的時間(或用強力霉素誘導(dǎo)的終止)的時間段。在TetO的控制下引入表達載體之后，BNl或BN2基因表達可以在非神經(jīng)元細胞中用四環(huán)素、強力霉素、或另一種四環(huán)素類似物來誘導(dǎo)，培養(yǎng)細胞并選擇iSN。用于在宿主細胞中外源基因的誘導(dǎo)型表達的詳細的方案，例如，使用本發(fā)明列舉的rtTA/TetO系統(tǒng)，是本領(lǐng)域中公知的(例如，WO2011005580)。

逆轉(zhuǎn)錄病毒是一組單鏈RNA病毒，特征在于它們通過逆轉(zhuǎn)錄的過程在感染的細胞中將RNA轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA的能力。所得DNA然后穩(wěn)定地整合到細胞染色體中作為原病毒，并引導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的合成。整合導(dǎo)致在受體細胞及其后代中病毒基因序列的保留。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包含三種基因，gag、pol和env，其分別對衣殼蛋白、聚合酶、和包膜成分編碼。在gag基因上游發(fā)現(xiàn)的序列包含將基因組包裝進入病毒體的信號。在病毒基因組的5'端和3'端存在兩個長末端重復(fù)(LTR)序列。這些元件包含強啟動子和增強子序列，并且在宿主細胞基因組的整合中是需要的。

在各種治療或工業(yè)應(yīng)用中在基因轉(zhuǎn)移中廣泛使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。例如，基因治療程序已被用于校正獲得的和遺傳的遺傳缺陷，并在一些情況下用于治療癌癥或病毒感染。在人類中表達人造基因的能力有利于許多重要的人類疾病(包括通過其他療法不能治療的多種疾病)的預(yù)防和/或治愈。對于基因治療的步驟的綜述，參見Anderson,Science256:808-813,1992；Nabel&Feigner,TIBTECH 11:211-217,1993；Mitani&Caskey,TIBTECH 11:162-166,1993；Mulligan,Science 926-932,1993；Dillon,TIBTECH 11:167-175,1993；Miller,Nature 357:455-460,1992；Van Brunt,Biotechnology 6:1149-1154,1998；Vigne,Restorative Neurology and Neuro science 8:35-36,1995；Kremer&Perricaudet,British Medical Bulletin 51:31-44,1995；Haddada等人，in Current Topics in Microbiology and Immunology(Doerfler&Bohm eds.,1995)；以及Yu等人，Gene Therapy 1:13-26,1994。

為了構(gòu)建用于BN1或BN2基因的瞬時表達的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，編碼一個或兩個基因的多核苷酸在某些病毒序列的位置被插入到病毒基因組，以產(chǎn)生有復(fù)制缺陷的病毒構(gòu)建物。為了產(chǎn)生病毒粒子，采用生產(chǎn)者宿主細胞或包裝細胞系。宿主細胞通常表達gag、pol和env基因但沒有LTR和包裝成分。當含有目的基因與逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列的重組病毒載體被引入該細胞系(例如，通過磷酸鈣沉淀)時，包裝序列允許該重組載體的RNA轉(zhuǎn)錄物被包裝入病毒顆粒中，然后分泌到培養(yǎng)介質(zhì)中。然后含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)介質(zhì)被收集，任選濃縮，并在基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用中用于轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細胞(例如，成纖維細胞或干細胞)。

用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的合適的宿主或生產(chǎn)細胞是本領(lǐng)域公知的(例如，本文例舉的293T細胞)。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒已經(jīng)分裂成復(fù)制缺陷型基因組和包裝成分。對于其它逆轉(zhuǎn)錄病毒，載體和相應(yīng)的包裝細胞系可以用本領(lǐng)域常規(guī)實踐的方法產(chǎn)生。生產(chǎn)者細胞通常編碼不是由如gag、pol和env蛋白之類的載體基因組編碼的病毒成分。gag、pol和env基因可以被引入到生產(chǎn)者細胞并穩(wěn)定地整合到細胞基因組中，以創(chuàng)建包裝細胞系。然后通過轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)將反轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組引入到包裝細胞系，以創(chuàng)建具有產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒所需的所有DNA序列的穩(wěn)定細胞系。另一種方法是通過瞬時三重轉(zhuǎn)染引入產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒所需的不同的DNA序列同時進入細胞，例如env編碼序列、gag-pol編碼序列和有缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組?？商娲?，結(jié)構(gòu)成分和載體基因組都可由穩(wěn)定地整合到宿主細胞基因組的DNA編碼。

本發(fā)明的方法可用本領(lǐng)域中公知的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝細胞系來實施。廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)，以及它們的組合(參見，例如，Buchscher等人，J.Virol.66:2731-2739,1992；Johann等人,J.Virol.66:1635-1640,1992；Sommerfelt等人，Virol.176:58-59,1990；Wilson等人，J.Virol.63:2374-2378,1989；Miller等人，J.Virol.65:2220-2224,1991；以及PCT/US94/05700)的那些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。特別適合于本發(fā)明的是慢病毒載體。慢病毒載體是能夠轉(zhuǎn)換或感染非分裂細胞并通常產(chǎn)生高病毒效價的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。針對許多疾病已在基因治療中使用慢病毒載體。例如，使用慢病毒載體或γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的造血基因療法已被用于x連接的腎上腺腦白質(zhì)和β地中海貧血。參見，例如，Kohn等人，Clin.Immunol.135:247-54,2010；Cartier等人，Methods Enzymol.507:187-198,2012；以及Cavazzana-Calvo等人,Nature 467:318-322,2010。本發(fā)明的方法可以容易地在基因治療或用此類載體的基因轉(zhuǎn)移中應(yīng)用。在其它一些實施方式中，其他的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可在本發(fā)明的方法的實踐中使用。這些包括，例如，基于人泡沫病毒(HFV)或在泡沫病毒屬的其他病毒的載體。

特別地，一些病毒載體方法目前可用于在臨床試驗中的基因轉(zhuǎn)移，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是目前為止最常用的系統(tǒng)。所有這些病毒載體利用涉及由插入輔助細胞系的基因進行缺陷載體的補碼以產(chǎn)生誘導(dǎo)試劑的方法。pLASN和MFG-S是已經(jīng)在臨床試驗中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的例子(Dunbar等人，Blood 85:3048-305(1995)；Kohn等人，Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malech等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:22 12133-12138(1997)).PA317/pLASN是用于基因療法試驗的首個治療載體(Blaese等人,Science270:475-480,1995).對于MFG-S包裝載體已經(jīng)觀察到50％以上的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(Ellem等人，Immunol Immunother.44:10-20,1997；Dranoff等人，Hum.Gene Ther.1:111-2,1997)。許多用于轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和產(chǎn)生病毒顆粒的生產(chǎn)細胞系或包裝細胞系也是本領(lǐng)域中公知的。在本發(fā)明中要使用的生產(chǎn)細胞不需要源于與靶細胞(例如，人靶細胞)相同的物種。相反，適用于本發(fā)明的生產(chǎn)細胞系或包裝細胞系包括從人(例如，HEK 293細胞或293T細胞)，猴(如COS-1細胞)，小鼠(例如，NIH 3T3細胞)或其它物種(例如，犬)的細胞系。這些細胞系中的一些在以下實施例中公開。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和用于在基因轉(zhuǎn)移中產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的相容的包裝細胞系的其他例子在下列文獻中報道，例如Markowitz等人，Virol.167:400-6,1988；Meyers等人，Arch.Virol.119:257-64,1991(基于脾壞死病毒(SNV)的載體，諸如vSN021)；Davis等人，Hum.Gene.Ther.8:1459-67,1997("293-SPA"細胞系)；Povey等人，Blood 92:4080-9,1998("1MI-SCF"細胞系)；Bauer等人，Biol.Blood MarrowTransplant.4:119-27,1998(犬包裝細胞系"DA")；Gerin等人，Hum.Gene Ther.10:1965-74,1999；Sehgal等人，Gene Ther.6:1084-91,1999；Gerin等人，Biotechnol.Prog.15:941-8,1999；McTaggart等人，Biotechnol.Prog.16:859-65,2000；Reeves等人，Hum.Gene.Ther.11:2093-103,2000；Chan等人，Gene Ther.8:697-703,2001；Thaler等人，Mol.Ther.4:273-9,2001；Martinet等人，Eur.J.Surg.Oncol.29:351-7,2003；以及Lemoine等人，I.Gene Med.6:374-86,2004。在本發(fā)明的實踐中可以使用任何的這些和其他的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝生產(chǎn)細胞系中。

在本領(lǐng)域中許多用于基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝細胞系可商購獲得。例如，一些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和兼容包裝細胞系可從Clontech公司(加州山景城)獲得?；诼《镜妮d體的實例包括，例如，pLVX-Puro,pLVX-IRES-Neo,pLVX-IRES-Hyg,和pLVX-IRES-Puro。也可獲得相應(yīng)的包裝細胞系，例如，Lenti-X 293T細胞系。除了基于慢病毒的載體和包裝系統(tǒng)，其它基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體和包裝系統(tǒng)也可商購獲得。這些包括基于MMLV的載體pQCXI，pQCXIQ和pQCXIH，以及兼容的生產(chǎn)者細胞系，例如基于HEK 293的包裝細胞系GP2-293，EcoPack 2-293和AmphoPack 293，以及基于NIH/3T3的包裝細胞系RetroPack PT67。在本發(fā)明的實踐中可使用任何的這些和其他的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和生產(chǎn)者細胞系。

VI.治療應(yīng)用和其它應(yīng)用

按照本發(fā)明產(chǎn)生的誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元(iSN)可以找到各種治療和非治療應(yīng)用。它們可以用于細胞替代療法以治療各種疾病、改善各種疾病的癥狀，或預(yù)防各種疾病的發(fā)展，所述疾病例如，與感覺神經(jīng)元的丟失或變性相關(guān)或由感覺神經(jīng)元的丟失或變性介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病或障礙，以及于功能異常感覺神經(jīng)元相關(guān)聯(lián)用由其引起的病癥。在這些應(yīng)用中，從需要治療的受試者的非神經(jīng)元細胞制備的iSN細胞可以移植或轉(zhuǎn)移到患有范圍廣泛的與感覺神經(jīng)元死亡或變性相關(guān)或由感覺神經(jīng)元死亡或變性介導(dǎo)的疾病或病癥中的任何一個的相同受試者。移植的細胞可以重建或補充受試者中的區(qū)分的或有區(qū)別的感覺神經(jīng)元。這些治療應(yīng)用可以涉及處理疾病的病因或處理疾病或病癥的影響。例如，治療可涉及替換其死亡或變性引起疾病(例如，各種感覺神經(jīng)元病)的感覺神經(jīng)元。治療也可以用于替換死于疾病的感覺神經(jīng)元，所述疾病例如，眼部疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)。

本發(fā)明的一些實施方式旨在治療感覺神經(jīng)元病癥或感覺神經(jīng)元疾病。感覺神經(jīng)元病包括一組特征在于背根神經(jīng)節(jié)中外周感覺神經(jīng)元的變性的副腫瘤性、免疫異常的、有毒的、或特發(fā)性疾病或病癥。例子包括副腫瘤性感覺神經(jīng)元病，遺傳性感覺和自主神經(jīng)病變，感染艾滋病毒，肖格倫綜合征，各種結(jié)締組織疾病，F(xiàn)reidreich共濟失調(diào)，和其他罕見特發(fā)性病例。參見，例如，Hainfellner等人，Ann.Neurol.,39:543-7,1996；Kurokawa等人，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 65:278-9,1998；Lodi等人，Antioxid.Redox Signal.8:438-43,2006；和Colli等人，Surg Neurol.,69:266-73,2008。感覺神經(jīng)元病經(jīng)常與威脅生命的疾病(如癌癥)或潛在可治療的疾病(如免疫介導(dǎo)的疾病)有關(guān)。適合用本發(fā)明的方法治療的感覺神經(jīng)元疾病包括與免疫介導(dǎo)的疾病和腫瘤性疾病和病毒感染，以及維生素中毒，和神經(jīng)毒性藥物相關(guān)的感覺神經(jīng)元病。參見，例如，Horwich等人,Ann Neurol,2:7-19,1977；Griffin等人,Ann Neurol,27:304-315,1990；Merchut等人,Neurol.,43:2410-2411,1993；Scaravilli等人,Acta.Neuropathol.(Berl),84:163-170,1992；Rubin等人,Muscle Nerve,22:1607-1610,1999；Ramos等人，Rev Neurol,28:1067-1069,1999；Shimazaki等人,J.Neurol Sci,194:55-58,2002；Schaumburg等人,N Engl.J.Med,309:445-448,1983；以及Quasthoff等人,J.Neurol,249:9-17,2002。

本發(fā)明的一些其他實施方式涉及治療與感覺神經(jīng)元的問題和衰變相關(guān)或由感覺神經(jīng)元的問題和衰變引起的眼新血管形成或眼血管變性疾病。視網(wǎng)膜內(nèi)的神經(jīng)元的五種基本類是感光細胞、雙極細胞、神經(jīng)節(jié)細胞、水平細胞和無長突細胞。與這些感覺神經(jīng)元相關(guān)的疾病或病癥的實例包括黃斑變性，由于在視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間累積細胞碎片或血管從而干擾和/或破壞存在那里的神經(jīng)元的復(fù)雜的相互作用而造成的中心視野的變性。其它實例包括青光眼；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損失，其導(dǎo)致視力的一些損失至失明；以及糖尿病性視網(wǎng)膜病變，其由于在視網(wǎng)膜中微小血管的糖尿病損傷與血糖控制不佳相關(guān)?？捎帽景l(fā)明的方法治療的其他眼部血管病癥包括局部缺血性視網(wǎng)膜病、虹膜新生血管、眼內(nèi)新生血管、角膜新生血管、視網(wǎng)膜新生血管、脈絡(luò)膜新生血管、糖尿病性視網(wǎng)膜局部缺血和視網(wǎng)膜變性。

適用于用本發(fā)明的方法治療的受試者可以是新生兒、青少年或完全成年的成年人。在一些實施方式中，待治療的受試者是患有上面提到的疾病或病癥的新生兒受試者。在一些優(yōu)選的實施方式中，受試者是人，并且在治療中使用的iSN是人類細胞，優(yōu)選從要進行治療的相同的受試者分離的自體細胞。在本發(fā)明的各種治療應(yīng)用中，iSN群體通常使用本文描述的方法首先用來自需要治療的受試者的非神經(jīng)元細胞(例如，成纖維細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞)產(chǎn)生。然后，iSN群體可以轉(zhuǎn)移到或接近在受試者的受傷部位。或者，所述細胞可以以使細胞遷移或回到受傷部位的方式引入到受試者。轉(zhuǎn)移的細胞可以有利地替換損壞或損傷的細胞，并允許受試者的總體狀況的改善。在一些情況下，所傳送的細胞可以刺激組織再生或修復(fù)。在一些實施方式中，誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元可以直接移植到損傷部位來治療感覺神經(jīng)元病或神經(jīng)疾病。iSN替換療法可用本領(lǐng)域中用于細胞移植的公知方案來執(zhí)行。參見，例如，Morizane等人,Cell Tissue Res.,331(l):323-326,2008；Coutts和Keirstead,Exp.Neurol.,209(2):368-377,2008；以及Goswami和Rao,Drugs,10(10):713-719,2007。用于實施本發(fā)明的其它技術(shù)和治療方法的具體程序可以基于本領(lǐng)域中公知的方法或根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法進行修改。參見，例如，Areman等人,Cellular Therapy:Principles,Methods,and Regulations,American Association of Blood Banks(AABB),第1版,2009；Wingard等人,Hematopoietic Stem Cell Transplantation:A Handbook for Clinicians,American Association of Blood Banks(AABB)；第1版,2009；以及Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Mack Publishing Co.,第20版,2000。

一般地，要施用給受試者的iSN細胞的數(shù)量應(yīng)足以阻止疾病狀態(tài)，例如，至少約1×10²個，至少約1×10³個，至少約1×10⁴個，至少1×10⁵或至少1×10⁶個細胞。待施用的細胞的數(shù)量可取決于疾病或病癥的嚴重程度，受試者的年齡和其它因素，其對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。細胞可以在一段時間內(nèi)以單一劑量或以多劑量施用，如可以由負責治療的醫(yī)生所決定的。此外，細胞的數(shù)量和給藥頻率可以根據(jù)治療是預(yù)防性的還是治療性的而改變。在預(yù)防性應(yīng)用中，數(shù)量相對較少的細胞可以在一段長時間內(nèi)以相對不頻繁的間隔施用。一些受試者可在他們的一輩子都繼續(xù)接受治療。在治療應(yīng)用中，在相對短的時間間隔可能需要相對高數(shù)量的細胞，直到疾病的進展減輕或停止，優(yōu)選直至受試者顯示疾病或病癥的癥狀的部分或完全改善。此后，受試者可以施用預(yù)防性方案。

除了治療應(yīng)用，用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的iSN還可用作基礎(chǔ)研究或藥物發(fā)現(xiàn)工具。本發(fā)明的一些實施方式涉及識別可促進從非神經(jīng)元細胞形成iSN的試劑或調(diào)制，如下詳述。本發(fā)明的一些其它實施方式涉及識別減輕疼痛和癢的化合物，或具有引起疼痛和癢的不必要脫靶效應(yīng)的化合物。在這些實施方式中，首先根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生iSN。然后將細胞與候選試劑接觸，以識別能夠調(diào)節(jié)(例如，抑制或增強)神經(jīng)元的傷害感受/癢感受的化合物。本發(fā)明的一些其它實施方式還涉及識別能緩解或引起各種感覺神經(jīng)元類型變性的化合物。同樣地，這些方法需要首先按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生特定的感覺神經(jīng)元型。然后誘導(dǎo)神經(jīng)元與候選試劑接觸，以檢測能夠調(diào)節(jié)(促進或抑制)神經(jīng)元的存活或功能的一種或多種化合物。

一些其他的實施方式涉及評估遺傳性疾病的表型，例如，以便更好地了解該疾病的病因?qū)W，以便確定治療性處理的靶蛋白，以便識別具有疾病修飾活性的候選試劑。這些方法允許具有期望的治療活性的化合物的識別，例如，在患有神經(jīng)疾病或病癥的受試者中調(diào)節(jié)感覺神經(jīng)元的存活或功能的活性，例如，以確定將在治療受試者中有效的藥劑。例如，候選試劑可以加入到包含衍生自受試者的體細胞的iSN的細胞培養(yǎng)物，并且候選試劑的效果通過本文所述的和本領(lǐng)域的方法通過監(jiān)控輸出參數(shù)進行評估，所述輸出參數(shù)諸如iSN存活率、iSN成為去極化的能力、iSN形成突觸的程度，等等。本發(fā)明的各種篩選方法的詳細方法過程可以基于用于識別促進iSN形成的試劑的本領(lǐng)域中公知的方法或本發(fā)明例示的方法，或根據(jù)它們進行修改。

在本發(fā)明的iSN的各種應(yīng)用中，監(jiān)測至少一個參數(shù)。所監(jiān)測的參數(shù)是細胞的可量化的組分，特別是可準確地測量的組分，理想地在高通量系統(tǒng)中。參數(shù)可以是任何細胞組分或細胞產(chǎn)物，包括細胞表面決定簇、受體、蛋白質(zhì)或它們的構(gòu)象或翻譯后修飾物、脂質(zhì)、碳水化合物、有機或無機分子、核酸(例如，mRNA、DNA等)、或衍生自該細胞組分或它們的組合的部分。雖然大多數(shù)參數(shù)將提供定量的讀數(shù)，但在一些情況下，半定量或定性的結(jié)果將是可以接受的。讀數(shù)可以包括單個測定值，或者可以包括平均值，中值或方差等。特征性地，參數(shù)讀出值的范圍將從多次的相同實驗針對每個參數(shù)來獲得。差異性是預(yù)期的，并且每個組的測試參數(shù)的值的范圍使用用于提供單值的標準統(tǒng)計方法與通用統(tǒng)計方法來獲得。

在一些相關(guān)的實施方式中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生iSN和用于在本文描述的各種應(yīng)用中使用iSN的試劑盒或藥物組合物。一些試劑盒將包含用于從非神經(jīng)元細胞誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元的形成的本文描述的試劑的一個或多個組分。任何上述組分可以在試劑盒中提供，例如，特異性BN1或BN2編碼多核苷酸或表達攜帶它們的表達載體，用于制備重組病毒的包裝細胞系，以及用于將重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入非神經(jīng)元細胞的試劑。所述試劑盒還可以包括用于轉(zhuǎn)化成iSN的非神經(jīng)元細胞。所述試劑盒還可以包括管、緩沖劑等，以及使用說明書。根據(jù)需要，該試劑盒的各個組件可以存在于分開的容器中，或組件中的某些或所有可以在單個容器中被預(yù)先組合成試劑混合物。除了上述組件，本發(fā)明的試劑盒還可以包括用于實施本發(fā)明的方法的說明書。這些說明書可以以各種形式存在于本發(fā)明的試劑盒中，其中一種或多種形式可以存在于試劑盒中。這些說明書可以存在的其中一種形式是作為在適當?shù)慕橘|(zhì)或基底上(例如，在其上印刷信息的一張或多張紙)的打印信息，在試劑盒的包裝上的打印信息，在包裝插頁上的打印信息，等等。然而這些說明書的另一種形式是在其上已記錄信息的計算機可讀介質(zhì)，例如，軟盤、光盤(CD)，等等。然而這些說明書可以存在的另一種形式是可以通過因特網(wǎng)訪問該信息的網(wǎng)站地址。

VII.篩選刺激從非神經(jīng)元細胞形成iSN的因

利用用于產(chǎn)生本文描述的iSN的系統(tǒng)，本發(fā)明還提供了一些方法來篩選可以促進或刺激非神經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)化成iSN的化合物、細胞因子或調(diào)制?；衔锘蚣毎蜃踊虿僮骺梢允峭庠葱曰衔锖头巧窠?jīng)元細胞內(nèi)的遺傳或表觀遺傳調(diào)制。在這些方法中，在非神經(jīng)元細胞中共表達BN1或BN2是在候選化合物或細胞因子的存在下進行的。這允許識別可以增強非神經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)化成iSN的轉(zhuǎn)化效率的特定候選因子(例如，miRNA或表觀調(diào)制)。本領(lǐng)域中公知的各種生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)或測定可用于實施本發(fā)明的篩選方法。這樣的技術(shù)描述于，例如，Handbook ofDrug Screening,Seethala等人(eds.),Marcel Dekker(l P^stP版,2001)；High Throughput Screening:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,190),Janzen(ed.),Humana Press (lP^stP版,2002)；Current Protocols in Immunology,Coligan等人(Ed.),John Wiley&Sons Inc(2002)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(3P^rdP版,2001)；以及Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(ringbou ed.,2003)。

針對促進iSN形成篩選的候選化合物可以是任何多肽、β-轉(zhuǎn)角模擬物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳香族化合物、雜環(huán)化合物、苯二氮類、低聚N-取代的甘氨酸、低聚氨基甲酸酯、多核苷酸(例如，miRNA或siRNA)、多肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合。一些候選化合物是合成分子，和其他天然分子。

舉例來說，本發(fā)明的篩選方法通常涉及在候選化合物或細胞操縱(例如，表觀調(diào)制)的存在下如本發(fā)明描述的誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元的形成。因此，在非神經(jīng)元細胞(例如，成纖維細胞)中BN1或BN2基因的共表達在候選化合物(例如，miRNA)的存在下進行，或與其它調(diào)制(例如，DNA甲基化改變)結(jié)合進行。如果候選試劑或調(diào)制的存在導(dǎo)致增強的非神經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)化成iSN的效率，則候選化合物(或特定調(diào)制)被識別為促進iSN形成的試劑或因子。增強的轉(zhuǎn)化效率是指被轉(zhuǎn)化成iSN的起始非神經(jīng)元細胞在數(shù)量上的任何實質(zhì)性的增加。其可以是被轉(zhuǎn)化成iSN的細胞的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、或至少90％或更多的增加。

在一些方法中，各種轉(zhuǎn)錄因子或其它多肽針對促進iSN形成的能力進行篩選。針對iSN促進轉(zhuǎn)錄因子或其它DNA結(jié)合蛋白的篩選可以通過使用和/或修改在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述的各種測定法來進行。參見，例如，Wiese等人,Front.Neurosci.,6:1-15,2012；Alvarado等人,J.Neurosci.,31(12):4535-43,2011；Ouwerkerk等人,Methods Mol.Biol.,678:211-27,2011；Laurenti等人,Nat.Immunol.14,756-763,2013；以及Xu等人,Virol.446:17-24,2013。本發(fā)明的一些其它方法涉及識別能夠刺激形成iSN的核酸試劑。例如，候選的miRNA可以在非神經(jīng)元細胞中共表達。在宿主細胞中表達miRNA和針對增強iSN形成的能力測試miRNA可以用基于或來源于文獻中已經(jīng)描述的許多miRNA篩選的技術(shù)來進行。參見，例如，Voorhoeve等人,Cell,124:169-1181,2006；Becker等人,PLoS ONE 7(11):e48474,2012；Lam等人”Mol.Cancer Ther.9:2943-2950,2010；以及Olarerin-George等人，BMCBiol.,11:19,2013。

在另一些方法中，所述候選化合物是有機小分子(例如，分子量不超過約500或1000的分子)。優(yōu)選地，高通量測定法是適合的并用于篩選此類小分子。在一些方法中，小分子測試劑的組合文庫可以容易地用于篩選增強iSN形成的小分子調(diào)節(jié)劑。許多本領(lǐng)域已知的測定法可以被容易地修改或在本發(fā)明的篩選方法的實踐中適用，例如，在Schultz等人,Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414,1998；Weller等人，Mol Divers.3:61-70,1997；Fernandes等人,Curr Opin Chem Biol 2:597-603,1998；以及Sittampalam等人,Curr Opin Chem Biol 1:384-91,1997中描述的。

實施例

提供下面的實施例以進一步說明而非限制本發(fā)明。

實施例1.用于產(chǎn)生iSN的一些實驗技術(shù)

胚胎成纖維細胞的分離和衍生：野生型CD1小鼠在TSRI動物設(shè)施中飼養(yǎng)。在解剖顯微鏡下從E14.5胚胎分離MEF。頭部、內(nèi)臟和含有背根神經(jīng)節(jié)的脊柱被移除并丟棄，以消除具有神經(jīng)原性潛力的細胞。剩余的組織在37℃下在0.25％胰蛋白酶(Gibco)中手動分離進行10分鐘，隨后消化液被稀釋，并通過離心除去。將所得細胞以約3×10⁶細胞/平方厘米接種。MEF生長至匯合，并在使用前傳代至少兩次。對于HEF分化，人iPSC集落用1毫克/毫升膠原酶IV型收獲并通過胚胎體形成進行分化。EB在非粘附懸浮培養(yǎng)盤(Corning)培養(yǎng)7天，在20％KSR培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，接著在10％FBSDMEM中培養(yǎng)5天。在第8天，EB被接種在粘附組織培養(yǎng)皿上并在實驗開始前針對三次傳代使用胰蛋白酶根據(jù)原代成纖維協(xié)議傳代。

分子克隆，細胞培養(yǎng)和慢病毒感染：人BRN3A(與小鼠Brn3a肽97％同源)和小鼠Ngnl和Ngn2的cDNA在四環(huán)素操縱子序列(TetO)的控制下使用以下引物克隆入慢病毒構(gòu)建體：分別BRN3A正向和反向，5'-ATGATGTCCATGAACAGCAAGCAG(SEQ ID NO：l)和5'-TCAGTAAGTGGCAGAGAATTTC(SEQ ID NO：2)。不能復(fù)制的VSVg包被的慢病毒顆粒被包裝在293T細胞中，如Boland等人，Nature 461,91-94,2009中所述。3次傳代的CD1MEF被感染MEF培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清和青霉素/鏈霉素)中的慢病毒。感染12-16小時后，含病毒培養(yǎng)基用新鮮的MEF培養(yǎng)基替換。通過轉(zhuǎn)化到補充有5μΜ強力霉素(Sigma)的MEF培養(yǎng)基，在感染培養(yǎng)基后48小時誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子。用強力霉素開始誘導(dǎo)后四天，培養(yǎng)基用N3培養(yǎng)基替換(Vierbuchen等人,Nature 463,1035-1041,2010)。誘導(dǎo)后七天，強力霉素被撤回，除非另有說明。誘導(dǎo)后十天，換成神經(jīng)維持培養(yǎng)基，其由1：1DMEM/F12混合物(Invitrogen)和補充有均為10ng/ml的B27、和NGF、BDNF和GDNF的Neurobasal組成。轉(zhuǎn)化效率通過Map2-陽性細胞的數(shù)量除以接種細胞的初始數(shù)量來測量。

免疫組織化學(xué)和RT-PCR：對于免疫熒光染色，在室溫下用4％多聚甲醛將細胞固定持續(xù)10分鐘。然后將細胞用PBS洗滌三次，隨后用PBS中的0.1％Triton X-100(Sigma)滲透。洗滌和滲透后，在室溫下將細胞在5％馬血清中阻斷持續(xù)三十分鐘。在阻斷中在4℃下進行初級染色過夜。第二抗體在阻斷溶液進行稀釋并在室溫下染色一小時。依照制造商的說明，使用Click-it EdU試劑盒(Invitrogen；C10337)進行EdU染色。使用以下抗體和稀釋液：MS-βIII(Tuj l)(1:1000,Covance MMS-435P)；Rb-βIII(Tuj l)(1:1000,Covance MRB-435P)；Ms-Map2(1:500,BD 556320)；Ms-VGlutl(1:100,Millipore MAB5502)；Rb-Vglut2(1:50,abcam ab72310)；Gp-VGlut3(1:1000,Millipore AB5421)；Ms-Brn3a(1:200,Millipore MAB 1585)；Gt-人Ret(1:100,R&D AF1485)；Gt-小鼠Ret(1:100,R&D AF482)；Ms-Isletl(1:200,DSHB40.2D6)；Gt-mouse TrkB(1:200,R&D BAF1494)；Gt-TrkA(1:200,R&DAF175)；Sh-TrkC(1:200,Abeam ab72120)；Ms-NF200(1:200,Millipore MAB5266)；Rb-Runxl(1:100,Novus Bio NBP1-61277)；Rb-外周蛋白(1:200,Millipore AB 1530)；Gaba(Sigma),Ngnl(1:500Abeam),Ngn 2(l:500Millipore),P75(Abeam),CGRP(1:500Neuromics),物質(zhì)P(1:500Neuromics),VAMP(突觸系統(tǒng)),突觸蛋白(Synaptic systems).第二抗體:A21447D-G647A10036-DM546A21202-DM488A10040-DR546Al 1015-DSh488Al 1056-DGt546A21206-DRb488A21208-DRt488A21098-DSh546。

對于RT-PCR分析，總RNA依照制造商的說明使用Trizol(Invitrogen)在所指示的時間點被分離，用DNaseI(Ambion)處理，且1.0微克用iScript(BioRad)反向轉(zhuǎn)錄。采用TaqMan基因表達分析(AppliedBiosystems)或SYBR green執(zhí)行PCR。對于從單細胞定量RT-PCR，在玻璃蓋玻片上生長單細胞，使用膜片吸管和顯微操縱器誘導(dǎo)后三周從所述玻璃蓋玻片分離單細胞。細胞置于4μl的裂解/RT緩沖液中，所述緩沖液含有補充有0.5％NP-40，1mM DTT和SuperRnase抑制劑(Ambion)，和PrimeRNase抑制劑(5Prime)的Superscript III RT緩沖液(Invitrogen)。細胞在微型離心機中旋轉(zhuǎn)甩下，并在-80℃下閃凍直到進一步的處理。使用Superscript III(Invitrogen)用130nM各基因特異性3'-引物進行逆轉(zhuǎn)錄。然后逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用15nM的旨在產(chǎn)生300-400bp擴增子的外嵌式引物進行15次循環(huán)的靶特異性預(yù)擴增。隨后使用SYBR Select(Applied Biosystems，4472918)與旨在產(chǎn)生約100個堿基對的擴增子的內(nèi)部引物進行定量實時PCR。為了確保特異性，進行模板滴定，只使用能顯示線性擴增的引物，針對單細胞和對照組也獲得熔融曲線，以確保產(chǎn)品的特異性。

鈣成像和電生理學(xué)：使用Map2：GCAMP5.G慢病毒報告基因(Addis等人,PLoS ONE 6,e28719,2011)在誘導(dǎo)后2至3周在小鼠和人iSN上進行鈣成像。以250毫升/小時的恒定流速在蒂羅德溶液(145mM NaCl,2.5mM KC1,10mM Hepes,NaH2P04,2mM CaCl2,1mM MgCl2,10mM葡萄糖,和0.4mM抗壞血酸)中進行成像。為了監(jiān)測鈣響應(yīng)，辣椒素、薄荷醇和芥子油以10倍的濃度以隨機的順序依次加入到流腔室，得到10μΜ辣椒素、100μΜ薄荷醇和100μΜ芥子油的最終溶度。每個跟蹤試驗相同之處在于5mM氯化鉀的初始脈沖和最終脈沖以確認神經(jīng)特性和維持功能的能力。只對具有神經(jīng)特征和持續(xù)功能能力的細胞進行了分析。鈣響應(yīng)通過計算超過初始熒光的熒光變化來確定(F-F₀)/F₀，其中F＝在給定的時間點的熒光和F₀＝每個細胞的平均基本的、未刺激的熒光。針對熒光失色規(guī)范化和背景減除選擇典型的非反應(yīng)區(qū)域。

電生理學(xué)：如細胞培養(yǎng)方法中描述的，成纖維細胞在層粘連蛋白涂覆的Thermanox塑料蓋玻片(13mm)上被接種、轉(zhuǎn)導(dǎo)和培養(yǎng)。蓋玻片放置在安裝在奧林巴斯IX 71顯微鏡上的記錄腔室中。通過用膜片電極的全細胞記錄在室溫下記錄自發(fā)或誘發(fā)反應(yīng)。信號使用Axopatch200B和MultiClamp700B(Axon Instruments)放大，并通過貝塞爾低通濾波器以2千赫過濾。使用pClam10.1軟件結(jié)合DigiData接口(型號1322A，1440A Axon Instruments)對數(shù)據(jù)進行采樣和分析。膜片微電極(Patch pipette)被從1.5毫米外徑(Warner Instruments)的標準壁玻璃拉出并有5-11M的輸入阻抗。通常，用于記錄電壓門控電流和動作電位，膜片電極用下述溶液(以mM計)填充：140葡萄糖酸鉀，5NaCl,1MgCl₂,10EGTA,10HEPES,10EGTA；通過KOH調(diào)整pH值至7.25，滲透壓滲量為290mOsm。為了從K⁺電流分離Na+電流，用鉀代替銫作為片微電極填充溶液中的主要陽離子。用于記錄配體-門控電流的細胞內(nèi)溶液的組成(以mM計)如下：130葡萄糖酸銫，2MgATP，1氯化鎂；10EGTA；10HEPES；pH值7.25，滲透壓300mOsm。為了誘發(fā)動作電位，我們在靜息膜電位值以電流鉗模式開始記錄并通過負電流注射25pA的A電位使用人工超極化。浴溶液通常含有基于Na+生理鹽水的Hank平衡鹽溶液(pH＝7.3)。為了監(jiān)測電壓門控電流，在初始預(yù)超極化至-90mV持續(xù)300毫秒以減輕Na+的失活之后，我們施用從-60至+30毫伏的跨步電壓持續(xù)100毫秒。

實施例2.從小鼠胚胎成纖維細胞產(chǎn)生感覺神經(jīng)元

為了確定使用涉及體感覺神經(jīng)系發(fā)展的因子是否可以產(chǎn)生誘導(dǎo)神經(jīng)元，我們在小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)中用慢病毒載體表達Brn3a和Ngnl(BN1)或Brn3a和Ngn2(BN2)。通過與編碼強力霉素誘導(dǎo)型因子rtTA的慢病毒共轉(zhuǎn)染并將BN1/BN2因子置于強力霉素誘導(dǎo)型啟動子TetO的控制下，對重新編碼因子的表達進行時序控制(圖8a和b)。誘導(dǎo)八天后，去除強力霉素并使細胞能成熟，而沒有外源重新編碼因子的進一步表達。BN1和BN2條件兩者均產(chǎn)生表現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)的Tuj 1陽性細胞，且大多數(shù)這些細胞也表達Map2(圖1a-b和圖8b)。這種轉(zhuǎn)化需要兩種因子。單獨任一的Ngnl或Ngn2的表達誘導(dǎo)Tuj 1-陽性細胞，但是，這些細胞不表達Map2，而且沒有表現(xiàn)出神經(jīng)元形態(tài)。在未經(jīng)處理的MEF和那些只暴露于Brn3a的MEF中沒有發(fā)現(xiàn)Tujl或Map2陽性細胞(圖8b)。免疫染色進一步證實，>98％的通過Brn3a/Ngnl或Brn3a/Ngn2表達的突觸素與小泡相關(guān)膜蛋白(也稱為VAMP)誘導(dǎo)的Map2/Tuj1雙陽性細胞與能夠形成功能性突觸(圖1c-e)的相對成熟的神經(jīng)狀態(tài)保持一致。

為了確定BN1和BN2神經(jīng)細胞是否表現(xiàn)神經(jīng)元的膜和電生理特性，我們進行了全細胞膜片鉗記錄。通過BN1或BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞的平均靜止膜電位為-42.01毫伏(SEM＝1.74，n＝4)，其類似于針對其他誘導(dǎo)神經(jīng)元報道的靜息電位(Vierbuchen等人，Nature 463，1035-1041，2010)。在電壓鉗模式的去極化引起快速內(nèi)向電流隨后慢外向電流，其分別與電壓激活鈉和鉀通道的開放一致(n＝5；圖1f)。在表現(xiàn)出Na+/K+電流的五個細胞中，四個能夠引發(fā)誘發(fā)的動作電位，這些細胞中的一個還表現(xiàn)出自發(fā)放電(圖1g和h)?？偲饋砜?，這些數(shù)據(jù)表明，BN1和BN2足以重新編碼成纖維細胞成神經(jīng)元細胞，突觸和電生理性能與神經(jīng)元特性一致。

用BN1或BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元表現(xiàn)出體感覺神經(jīng)系的分子標志。為了確定通過BN1或BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元類似于內(nèi)源性體感覺神經(jīng)元的程度，我們研究了常用來表征這些神經(jīng)元群體的神經(jīng)絲神經(jīng)遞質(zhì)以及神經(jīng)肽的表達譜。在DRG中，不同群體的感覺神經(jīng)元，薄的(C-纖維)和厚的(A-纖維)，可以分別通過其外周蛋白或NF200的表達來識別。外周蛋白是主要在外周神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的III型神經(jīng)元特異性中間絲。DRG神經(jīng)元的大約60％表達外周蛋白，其對應(yīng)于小直徑無髓神經(jīng)群落。類似于DRG神經(jīng)元，誘導(dǎo)神經(jīng)元的50-60％(BN1＝64.17％±9.67；BN2＝51.93％±9.12)表達外周蛋白(圖2a和2b)。大部分剩余的非外周蛋白陽性神經(jīng)元表達重神經(jīng)絲NF-200(也稱為NF-H)，對應(yīng)于厚髓纖維。類似于內(nèi)源性DRG，iSN的約30％(BN1＝29.38±1.46；BN2＝30.60+3.11)表達NF200(圖2a和c)。這些數(shù)據(jù)表明，BN1和BN2轉(zhuǎn)錄因子的組合均以與那些在DRG中觀察到的類似比例誘導(dǎo)神經(jīng)元來表達通常在感覺神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)絲。體感覺神經(jīng)元是表達3種囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運體1、2和3(也分別稱為vGlutl(Slcl7A7)，vGlut2(slc17A6)，和vGlut3(slcl 7a8))的興奮性谷氨酸能神經(jīng)元。與體感覺神經(jīng)特征一致，誘導(dǎo)神經(jīng)元表達所有三種囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運體但不表達GABA，這表明該轉(zhuǎn)化產(chǎn)生興奮性而非抑制性神經(jīng)元亞型(圖2a；和圖9a)。在DRG中，傷害感受神經(jīng)元的子集也表達神經(jīng)肽CGRP。在誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞的約10％中我們觀察到CGRP表達(圖2a；以及圖9a)。這些數(shù)據(jù)表明，用BN1和BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元表達外周感覺神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的特性神經(jīng)絲、神經(jīng)遞質(zhì)和肽。

成熟的外周感覺神經(jīng)元表達轉(zhuǎn)錄因子Isl1和Brn3a但不再表達Ngnl或Ngn2。在用BN1或BN2重新編碼的過程中，Isl1和內(nèi)源性Brn3a表達兩者均被強烈上調(diào)，并且該表達在去除強力霉素后至少14天還維持(圖2d)。與此相反，在外源性誘導(dǎo)消失之后Ngnl和Ngn2不再可檢測(圖9b)。用BN1或BN2處理不誘導(dǎo)如Satb2、Ctip2、Brn2、Tbr2和Tbx21之類其他神經(jīng)元亞型的各種標記物的表達(數(shù)據(jù)未顯示)。最后，單細胞RT-PCR證實具有上調(diào)Map2和Isl1的誘導(dǎo)神經(jīng)元也將成纖維細胞特異性基因Snail1和Fspl(圖2E)下調(diào)。這些數(shù)據(jù)進一步支持BN1和BN2重新編碼纖維細胞以確保并保持與內(nèi)源性體感覺神經(jīng)元的神經(jīng)特性相一致的神經(jīng)特性的結(jié)論。

在體內(nèi)，三種Trk受體，TrkA、TrkB和TrkC中的一種的選擇性表達對適當?shù)哪繕松窠?jīng)支配、存活和區(qū)分感覺神經(jīng)元的三種譜系的下游分子程序的表達是至關(guān)重要的。定量RT-PCR顯示在BN1和BN2條件兩者中早在誘導(dǎo)4天后就存在TrkA、TrkB和TrkC的mRNA。7天后，Trk受體mRNA水平達到平臺，其維持至少22天，這顯示轉(zhuǎn)化已經(jīng)變?yōu)楠毩⒂谡T導(dǎo)因子。(圖2f)。免疫染色證實在誘導(dǎo)后第16天TrkA、TrkB和TrkC蛋白存在于體細胞中并沿著用BN1或BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元的神經(jīng)突存在(圖2h)。每種Trk受體的免疫染色標記約25-30％的誘導(dǎo)神經(jīng)元(圖2g)，這表明它們可以各自包括如在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的獨特的非重疊亞群。

為了確定Trk-染色是否對應(yīng)表達所有三種受體的一個同源種群，或每種表達三種Trk-受體之一的三種獨特種群；我們同時針對TrkA、B和C以及三種受體的每個成對組合共染色。TrkA、B和C的每個成對組合染色約60％的由BN1和BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元(圖9c)。與此相反，針對所有三種Trk受體同時共染色標記約90％的誘導(dǎo)神經(jīng)元(BN1＝88.95％±2.17；BN2＝91.09％1.80)(圖2g)。在DRG中，大部分感覺神經(jīng)元也表達了p75^Ngfr低親和力NGF受體。在我們的實驗中由BN1和BN2誘導(dǎo)的總神經(jīng)元的大部分(>80％)表達p75^Ngfr(圖2g和i)?？傊?，這些結(jié)果表明，TrkA-、TrkB-、和TrkC-陽性細胞代表占多數(shù)的由BN1和BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元的三種不同的種群。因為由BN1或BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元表達體感覺神經(jīng)元特征性的轉(zhuǎn)錄因子、神經(jīng)絲、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽，并選擇性地表達三種主要Trk受體系標記物之一，我們選擇將該神經(jīng)元群指定為誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元(iSN)或誘導(dǎo)體感覺系神經(jīng)元(iSLN)。有趣的是，盡管在體內(nèi)研究表明，Ngnl和Ngn2表達可偏分化成不同的Trk受體亞系，但是在多個實驗(用BN1和BN2處理產(chǎn)生比例相等的表達每個譜系標記物的細胞Ma等人，Genes Dev.13:1717-28,1999)。

實施例3.由MEF產(chǎn)生的iSN的表征

我們觀察到，在此描述的重新編碼誘導(dǎo)體感覺神經(jīng)形態(tài)。在體內(nèi)，感覺神經(jīng)元也相對于它們的細胞體的大小而變化。TrkA-陽性神經(jīng)元是最小的，TrkB-陽性神經(jīng)元是中等大小，TrkC-陽性神經(jīng)元包括具有最大的細胞體的群體。為了確定用BN1或BN2產(chǎn)生的iSN是否也采用該形態(tài)特征，我們測量了TrkA、TrkB和TrkC-陽性神經(jīng)元的面積。由BN1和BN2兩者產(chǎn)生的誘導(dǎo)神經(jīng)元表現(xiàn)出與TrkA、TrkB和TrkC的表達相關(guān)的體細胞大小的不同分布(圖3a，圖10a-b)。TrkA-陽性細胞的平均體細胞面積(BN1＝231.3μm±14.02；BN2＝237.8μm±21.87)顯著小于TrkB-陽性細胞的平均體細胞面積(BN1＝456.2μm±34.38；BN2＝397.5μm±30.69)。同樣地，TrkB-陽性細胞的平均體細胞面積顯著小于TrkC-陽性神經(jīng)元平均體細胞面積(BN1＝569.9μm±47.01；BN2＝598.5μm±53.29)(圖3a，以及圖10a-b)。這些結(jié)果進一步表明，我們觀察到的TrkA陽性細胞、TrkB陽性細胞和TrkC陽性細胞代表三種不同的種群。

DRG的感覺神經(jīng)元也顯示出獨特的假單極形態(tài)，特征在于不存在樹突而存在單一分叉神經(jīng)突。由BN1和BN2誘導(dǎo)的神經(jīng)元的目視檢查表明它們已經(jīng)采用了這種形態(tài)(圖3b)。因此我們量化使用BN1和BN2從兩個獨立實驗產(chǎn)生的多極、雙極、單極和假單極神經(jīng)元的數(shù)量。值得注意的是，多數(shù)誘導(dǎo)神經(jīng)元(BN1＝91.99％±0.40；BN2＝84.69％±1.357)顯示出假單極形態(tài)(圖3c和圖10c)。剩余的神經(jīng)細胞是單極的，沒有可觀察到的分叉(BN1＝6.13％±0.414；BN2＝11.89％±1.43)，或雙極(BN1＝1.89％±0.02，BN2＝3.4％±0.08)(圖3c)。與此相反，如先前報道的，使用Brn2、Ascl1和Zicl(BAZ)產(chǎn)生的神經(jīng)元主要是多極的(Vierbuchen等人，Nature 463，1035-1041，2010)；使用這些因子沒有觀察到假單極神經(jīng)元(圖3c)。這一發(fā)現(xiàn)表明，使用僅兩個轉(zhuǎn)錄因子直接重新編碼能夠誘導(dǎo)與以前的方法所不同的高度特異性的神經(jīng)突形態(tài)，預(yù)測如合適的靶標或神經(jīng)膠質(zhì)衍生因子之類的外源線索對于這一方面的神經(jīng)元規(guī)范而言是不需要的。

我們還發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)iSN包括與傷害感受器的不同群體類似的細胞。iSN對機械和篩選研究的效用取決于這些神經(jīng)元的概括生物醫(yī)學(xué)相關(guān)的神經(jīng)亞型的功能特性的能力。因為TrkC系本體感受功能需要肌肉的神經(jīng)支配以及TrkB系的機械響應(yīng)與成纖維細胞的固有力學(xué)響應(yīng)相似，所以區(qū)分感覺神經(jīng)元的功能特性的測定法主要限于TrkA的傷害感受亞型。因此，我們專注于建立傷害感受神經(jīng)元的TrkA系的功能響應(yīng)。在DRG和三叉神經(jīng)中的TrkA陽性細胞通過表達離子通道受體的瞬時受體電位(Trp)族的各種組合部分地檢測例如疼痛和溫度之類的感覺。為了確定iSN是否表現(xiàn)出感覺神經(jīng)元的重要功能性質(zhì)，我們首先分別評估了受體離子通道TrpVl、TRPM8和TRPA1的表達，其介導(dǎo)諸如熱、冷和有毒化學(xué)品之類的廣譜感覺。未感染的MEF，和用原神經(jīng)混合物Brn2、Mashl、Zicl(BAZ)誘導(dǎo)的神經(jīng)元未能表達任何Trp通道(圖4a和b)。然而，用BN1或BN2誘導(dǎo)的iSN穩(wěn)健地表達TrpA1、TrpM8和TrpVl(圖4a和b)。此外，BN1或BN2iSN選擇性表達已知在傷害感受神經(jīng)元中的動作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用的電壓門控鈉通道Nav1.7(也稱為Scn9d)(圖4a和b)。總的來說，這些數(shù)據(jù)預(yù)測一些iSN應(yīng)該能夠感知和響應(yīng)于諸如熱、冷和刺激性天然化合物之類的刺激。

為了確定iSN是否可以在功能上響應(yīng)于Trp通道配體，我們評估在分別暴露于已知濃度的異硫氰酸烯丙酯(芥菜油)、薄荷醇和辣椒素以選擇性地激活TrpA1、TrpM8和TrpVl后的鈣瞬變。使用2.5mM氯化鉀初始去極化以確定響應(yīng)性iSN之后，將細胞連續(xù)用薄荷醇、芥子油和辣椒素以隨機順序洗滌。BN1和BN2iSN在對辣椒素(BN119.7％±3.0和BN221.2％+3.5)、薄荷(BN115.4％±2.6和BN217.4％+4.3)、芥子油(BN112.9％±3.8和BN212.5％±3.4)的響應(yīng)中均表現(xiàn)出快速的瞬態(tài)鈣變化(圖4c-e)。雖然大多數(shù)配體響應(yīng)iSN都只對一個配體響應(yīng)，一些iSN依次響應(yīng)于兩種配體：辣椒素和薄荷醇(BN11.7％+1.7％和BN20.7％±0.7)；辣椒素和芥子油(BN12.3％±2.3和BN24.1％±1.7)；薄荷腦和芥子油(BN11.7％+1.7和BN20.7％±0.7)。沒有iSN響應(yīng)于所有三種感覺配體。雖然細胞的響應(yīng)于刺激的各種組合的相對比例與在體內(nèi)看到的不同，但是這些結(jié)果表明，iSN可以被多樣化并表達選擇性地響應(yīng)于生物醫(yī)學(xué)相關(guān)的感覺刺激所需要的初級受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

實施例4.重新編碼不需要細胞分裂或胚胎前體。

我們研究了所觀察的成纖維細胞重新編碼成體感覺系是否需要細胞分裂或?qū)ｉT的胚胎前體。在成纖維細胞中BN1或BN2的誘導(dǎo)導(dǎo)致神經(jīng)元的多種相關(guān)亞型(TrkA、TrkB或TrkC陽性)的產(chǎn)生，其似乎以大致相當?shù)臄?shù)量出現(xiàn)。對于此的一個可能的解釋將涉及分化成這三種亞型的多能增殖前體細胞。為了論述這種可能性，我們進行了兩個實驗。第一，MEF在增殖標記物EdU(5-乙炔基-2'-脫氧尿苷，點擊化學(xué)BrdU類似物)的存在下重新編碼。誘導(dǎo)后3天加入EdU至培養(yǎng)介質(zhì)相比于重新編碼14天后少標記0.5％的總Map2-陽性iSN，這表明BN1和BN2神經(jīng)轉(zhuǎn)化不涉及增殖(圖5a-c)。第二，為了進一步阻斷增殖，從誘導(dǎo)后三天我們連續(xù)施加有絲分裂抑制劑阿糖呋喃胞苷(AraC)至培養(yǎng)物并在第14天定量Map2陽性細胞的數(shù)量。與沒有增殖中間體一致，從第3天開始有絲分裂抑制沒有顯著改變在重新編碼的過程中產(chǎn)生的神經(jīng)元的數(shù)量(圖5d-f)。這些數(shù)據(jù)表明對于iSN的誘導(dǎo)不需要細胞分裂，并預(yù)測神經(jīng)元的多樣化可涉及在非分裂細胞中操作的隨機細胞命運選擇。

雖然使用此方案產(chǎn)生的iSN的頻率相對高(約1-10％)并取決于病毒滴度而變化，但該轉(zhuǎn)化要求可以“預(yù)致力于”該譜系的特定胚胎細胞類型仍然是有可能的。為了驗證這一點，我們從5日齡小狗獲得尾尖成纖維細胞(TTF)。神經(jīng)前體的標記物的染色表明，這些培養(yǎng)物不包含神經(jīng)祖細胞(數(shù)據(jù)未示出)。當TTF暴露于BN1或BN2持續(xù)8天，并在沒有強力霉素誘導(dǎo)的情況下另外培養(yǎng)7天，觀察到Map2/Tuj1-陽性細胞。正如前面所觀察到的，這些細胞表現(xiàn)出與感覺神經(jīng)特征(圖5g，h)一致的假單極形態(tài)。此外，用BN1和BN2兩者誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞表達所有三種TrkA、TrkB和TrkC受體(圖5h)。這些結(jié)果證明BN1和BN2產(chǎn)生神經(jīng)元的能力并不限于胚胎組織并且iSN確實可以從成體成纖維細胞產(chǎn)生。

實施例5.從人成纖維細胞產(chǎn)生iSN

我們還試圖確定該方法是否可以適用于人細胞。人胚胎成纖維細胞(HEF)使用已建立的方法(Son等人，Cell Stem Cell9，205-218，2011)從iPSC衍生。用編碼BN1或BN2的可誘導(dǎo)慢病毒載體和如在小鼠重新編碼實驗中描述的強力霉素依賴性活化劑rtTA轉(zhuǎn)導(dǎo)HEF。轉(zhuǎn)錄因子的表達被誘導(dǎo)持續(xù)八天，隨后至少7天去除強力霉素誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后十五天，在BN1和BN2條件下我們觀察到具有神經(jīng)元形態(tài)的MAP2/TUJl-陽性細胞，而在未感染HEF或用單一轉(zhuǎn)錄因子處理的HEF的對照組中沒有觀察到(圖6a-b)。類似于小鼠iSN，人BN1和BN2誘導(dǎo)神經(jīng)元表現(xiàn)出mRNA和體感覺譜系標記物TrkA、TrkB和TrkC的蛋白表達(圖6c-e，m)。iSN的免疫染色表明在約三分之一的群體分別表達TRKA(BN133.6％±6.2，BN235.8％±7.6)、TRKB(BN128.6％+5.6，BN229.0％±0.5)和TRKC(BN130.0％±7.6，BN232.3％+1.7)(圖6c-e，n)。此外，它們表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄因子ISL1的近乎遍在的表達(BN1＝93.15％±4.14；BN2＝90.5±5.14)(圖6f，n)。這些標記物在使用泛神經(jīng)混合物Brn2、Ascl1和Zicl(BAZ)衍生的神經(jīng)元中不存在(圖6n)。然而，通過vGLUT2的免疫染色，BN1/2和BAZ神經(jīng)元兩者大部分顯示是谷氨酸能(圖6g，n)。這表明，通過Brn3a與Ngnl或Ngn2的瞬時異位表達，感覺神經(jīng)表型被選擇性地傳遞到人成纖維細胞。

我們進一步表征了BN1和BN2iSN并觀察到在幾乎所有iSN中低結(jié)合性NGF受體p75的強表達(圖6k和6o)，以及在iSN的子集中GDNF受體c-RET的表達(圖6j和6o)，其由于不明原因在小鼠iSN中不存在。此外，iSN神經(jīng)群分別表達與薄和厚的纖維神經(jīng)元相關(guān)的特性神經(jīng)絲、外周蛋白和NF200(圖6h，6i和6o)。此外，BN1和BN2顯示出vGLUTl的表達(圖6l和6o)并且完全沒有GABA(數(shù)據(jù)未示出)。最后，我們測試用BN1和BN2重新編碼是否可以將新生兒人成纖維細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。二十天重新編碼產(chǎn)生表達ISL1和譜系標記物TRKA和TRKB的具有神經(jīng)元形態(tài)的MAP2/TUJ1陽性細胞，這表明iSN的誘導(dǎo)并不限于胚胎成纖維細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。

我們還研究了人iSN是否表現(xiàn)成熟神經(jīng)元的膜和電生理特性。我們進行全細胞膜片鉗記錄。人iSN的平均靜息電位是40.067毫伏(SEM＝3.724，n＝15)。在電壓鉗模式中去極化引起快速的內(nèi)向電流隨后是慢的外向電流，分別與電壓激活的鈉和鉀通道的開放一致(圖7a)。此外，人iSN能夠觸發(fā)動作電位(圖7b)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明人iSN擁有功能性神經(jīng)元的膜和電生理特性。

為了確定人iSN是否已經(jīng)獲得傷害感受神經(jīng)元的各種亞群的主要特征，我們評估了在HEF、BAZ神經(jīng)元和iSN中TRPA1、TRPM8、TRPV1和NAV1.7的表達。在HEF或BAZ神經(jīng)元中未檢測到TRPA1、TRPM8、TRPV1或NAV1.7的表達。與此相反，在用BN1和BN2兩者產(chǎn)生的人iSN中觀察到穩(wěn)健的表達(圖7c)。為了確定TRP通道是否是功能性的，我們進行了如先前針對小鼠iSN說明的鈣成像研究。用BN1或BN2產(chǎn)生的人iSN表現(xiàn)出響應(yīng)于辣椒素(BN14.4％±1.7和BN25.9％±3.3)、薄荷腦(BN14.4％±1.4和BN26.0％±2.3)、芥子油(BN112.8％+4.5和BN28.8％±3.7)的快速和選擇性鈣瞬變。多數(shù)KC1響應(yīng)性iSN不響應(yīng)于三種配體(BN183.1％±4.9和BN282.6％±3.4)中的任何一種(圖7d和7e)。一些iSN依次響應(yīng)于兩種配體：辣椒素和芥子油(BN13.2％+0.7和BN21.2％±1.2)；薄荷腦和芥子油(BN110.9％+1.9和1.1BN2％±10.1)。我們沒有檢測到同時響應(yīng)于辣椒素和薄荷腦兩種或所有三種配體的任何神經(jīng)元。響應(yīng)于配體特異性活化的這些鈣通量表明，通道受體TRPA1、TRPM8和TRPV1確實是功能性的，雖然可能在如基于體內(nèi)研究所預(yù)期的相似數(shù)量的細胞中沒有共表達(圖7d-f)。