專(zhuān)利名稱(chēng):多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的標(biāo)記物Nato3的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Nato3基因，該基因是多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞 (dopaminergic neuron proliferative progenitor cell)的標(biāo)記物。更具體地,本發(fā) 明涉及檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的手段，檢測(cè)該細(xì)胞的方法和檢測(cè) 該細(xì)胞的試劑盒。
背景技術(shù)：
多巴胺系統(tǒng)是很重要的系統(tǒng)，它參與對(duì)哺乳動(dòng)物腦而言至關(guān)重要的運(yùn) 動(dòng)控制、激素分泌控制、情感控制等。因此，多巴胺能神經(jīng)傳遞異常會(huì)導(dǎo) 致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。例如，帕金森氏病是錐體外系統(tǒng)的神經(jīng)變性疾病， 它是由中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的特異性變性引起的(HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE Vol. 2 23rd ed., Isselbacher et al. edited by McGraw-Hill Inc., NY (1994) pp. 2275-7)。
治療帕金森氏病的方法，即口服L-DOPA (3,4-二羥基-苯丙氨酸)的方法 主要用于補(bǔ)償多巴胺產(chǎn)量的降低，但已知其療效并不持久。
因此，為了補(bǔ)償多巴胺能神經(jīng)元的損失，最近人們嘗試了一種治療方 法，即移植6-9周齡流產(chǎn)胎兒的中腦腹側(cè)區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)含有多巴胺能神經(jīng) 元祖細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利5690927; Spencer et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1541-8; Freed et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1549-55; Widner et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1556-63; Kordower et al. (1995) N. Engl. J. Med. 332:1118-24; Defer et al. (1996) Brain 119:41-50; and Lopez-Lozano et al. (1"7) Transp. Proc. 2屮977』0)。然而，目前除了細(xì)胞供應(yīng)和倫理道德問(wèn)題外 (Rosenstain (1995) Exp. Neurol.33:106; Turner et al. (1993) Neurosurg. 33:1031-7),多種其它問(wèn)題也已顯現(xiàn)，例如，傳染性污染的風(fēng)險(xiǎn)、免疫移植 物排斥(Lopez-Lozano et al. (1997) Transp. Proc. 29:977-80 and Widner and Brudin(1988) Brain Res. Rev. 13:287-324)、因胎兒組織主要依賴(lài)于脂質(zhì)代謝 而不是糖酵解所造成的低存活率(Rosenstein (1995) Exp. Neurol. 33:106)等。例如，為了解決倫理道德或供應(yīng)短缺問(wèn)題，已被建議的方法有使用
得自豬的皮質(zhì)、紋狀體和中腦細(xì)胞(例如日本專(zhuān)利特許公開(kāi)號(hào)10-508487、 10-508488和10-509034)等。然而，在此方法中，需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的程序來(lái)修 飾細(xì)胞表面抗原(MHCI類(lèi)抗原)以抑制排斥。例如，為了解決移植物排斥問(wèn)
特許公開(kāi)號(hào)11-509170、 11-501818; and Sdawly and Cameron (1993) Cell Transplant2:123-9)。移植細(xì)胞可能來(lái)自MHC匹配的親屬、他人的骨髓、骨 髓庫(kù)、臍血庫(kù)等。然而，如果可使用患者自身的細(xì)胞，無(wú)需額外的程序和 麻煩即可解決排斥問(wèn)題。
因此，得自非-神經(jīng)細(xì)胞，如胚胎-干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的多 巴胺能神經(jīng)元體外分化系統(tǒng)有望被用作移植材料，以替代得自流產(chǎn)胎兒的 細(xì)胞。實(shí)際上，有報(bào)道表明通過(guò)將ES細(xì)胞移植到大鼠帕金森氏病模型的 損害條紋中，形成了功能性的多巴胺能神經(jīng)元(Kim et al. (2002) Nature 418:50-56)。據(jù)認(rèn)為，得自ES細(xì)胞或患者自身神經(jīng)干細(xì)胞的再生藥物的重 要性將會(huì)增加。
另一方面，治療神經(jīng)組織損傷時(shí)，需要重構(gòu)腦功能，而為了與周?chē)?細(xì)胞形成適當(dāng)?shù)穆?lián)接(網(wǎng)絡(luò)形成)，需要移植的不是成熟細(xì)胞，而是可在體內(nèi) 分化成神經(jīng)元的祖細(xì)胞。然而，在移植神經(jīng)元祖細(xì)胞時(shí)，除了存在上述與 供應(yīng)有關(guān)的問(wèn)題，還存在一個(gè)問(wèn)題，即祖細(xì)胞可分化成不均一的細(xì)胞群體。 例如，在治療帕金森氏病時(shí)，需要在含有兒茶酚胺神經(jīng)元中選擇性地移植 多巴胺能神經(jīng)元。以前，有人建議將下述細(xì)胞用作移植細(xì)胞以治療帕金森 氏病紋狀體(Lindvall et al. (1989) Arch. Neurol. 46:615-31 and Widner et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1556-63),得自人胚胎神經(jīng)的無(wú)限增殖化細(xì)胞系 (日本專(zhuān)利特許公開(kāi)號(hào)8-509215, 11-506930和2002-522070), NT2Z細(xì)胞有 絲分裂后的人神經(jīng)元(日本專(zhuān)利特許公開(kāi)號(hào)9-5050554),神經(jīng)元原基細(xì)胞(曰 本專(zhuān)利特許公開(kāi)號(hào)11-509729),被外源基因轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生兒茶酚胺，如多巴胺 的細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(日本專(zhuān)利特許公開(kāi)號(hào)2002-504503和2002-513545), 基因被修飾的ES細(xì)胞(Kimetal. (2002) Nature 418:50-56),等等。然而，這 些細(xì)胞無(wú)一僅含有多巴胺能神經(jīng)元或能分化成多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞。
有人建議了 一種從未分化的細(xì)胞群體中選擇性濃縮或分離多巴胺能神 經(jīng)元的方法在細(xì)胞群體的每個(gè)細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)熒光蛋白的報(bào)道基因，所述基因處于在多巴胺能神經(jīng)元中表達(dá)的基因，如酪氨酸羥化酶(TH)基因的 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的控制之下，分離發(fā)出熒光的細(xì)胞，籍此用肉眼觀察活的多
巴胺能神經(jīng)元，以進(jìn)行濃縮、分離或鑒定(日本專(zhuān)利特許公開(kāi)號(hào)2002-51775)。 然而，該方法需要復(fù)雜的導(dǎo)入外源基因的步驟，此外，當(dāng)用于基因治療時(shí)， 報(bào)道基因的存在會(huì)導(dǎo)致毒性和免疫原性的問(wèn)題。
如上所述，目前，移植治療帕金森氏病的最大問(wèn)題之一是多巴胺能 神經(jīng)元祖細(xì)胞無(wú)論是得自流產(chǎn)胎兒的中腦腹側(cè)區(qū)域，還是經(jīng)誘導(dǎo)后分化的， 皆為多種細(xì)胞的混合物?？紤]到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的安全性，僅分離和使用所 需的細(xì)胞種類(lèi)才是合乎需要的。另外，考慮到存活力或在移植了細(xì)胞的腦 中正確形成網(wǎng)絡(luò)的能力，可以說(shuō)分離和移植較早的增殖祖細(xì)胞會(huì)獲得合意 的治療效果。
以前，有人報(bào)道過(guò)在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)的基因 Lrp4(WO 2004/065599)。另外， 一些多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的標(biāo)記物也已被 報(bào)道(WO 2004/038018和WO 2004/052190)。其中，關(guān)于Lmxla,已證實(shí)它 表達(dá)于人和小鼠的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，有絲分裂后的多巴胺能神 經(jīng)元前體纟田胞(postmitotic dopaminergic neuron precursor cell)和多巴胺能神 經(jīng)元(WO 2005/052190)。
另外，Nato3基因是具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)的轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)報(bào)道 Nato3基因在中腦中表達(dá)，在發(fā)育過(guò)程中起著重要作用(Segev, E., N. Halachmi， A. Salzberg, and N. Ben-Arie. 2001. Mech Dev 106:197-202)。此外， 有人報(bào)道Nato3在中腦中表達(dá)，特別是在最腹側(cè)部位(底板)中表達(dá)，并與神 經(jīng)細(xì)胞的分化有關(guān)(Verzi, M. P., J. P. Anderson, E. Dodou， K. K. Kelly, S.B. Greene, B. J. North, R. M. Cripps, and B. L. Black. 2002. Dev Biol 249:174-90)。
然而，無(wú)人報(bào)道Nato3在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)。
發(fā)明簡(jiǎn)述
最近，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Nato3基因(下文中有時(shí)也將其簡(jiǎn)稱(chēng)為"Nato3")在多 巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的手段，檢測(cè)多 巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的方法和檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的試劑此外，本發(fā)明的目的是提供篩選物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生 成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過(guò)程。
另外，本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)生可用于治療帕金森氏病的多巴胺能神 經(jīng)元增殖3且細(xì)力包的方法。
本發(fā)明提供了可用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的多核苷
酸探針或多核苷酸引物，它們可與由Nato3基因的核苷酸序列組成的多核苷 酸，或其互補(bǔ)序列雜交(下文有時(shí)也稱(chēng)之為"本發(fā)明的探針，，或"本發(fā)明的引 物")。
本發(fā)明提供了可用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的抗 Nato3蛋白的抗體或其部分(下文有時(shí)也稱(chēng)之為"本發(fā)明的抗體")。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的方法，其包 括檢測(cè)Nato3基因表達(dá)的步驟(下文有時(shí)也稱(chēng)之為"本發(fā)明的檢測(cè)方法，，)。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的試劑盒，其 至少包含本發(fā)明的探針，本發(fā)明的引物或本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明提供了篩選物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神 經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過(guò)程，所述方法包括檢測(cè)Nato3基因表達(dá)的步驟。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生可用于治療帕金森氏病的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì) 月包的方法。
本發(fā)明提供了多核苷酸用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的 用途，所述多核苷酸可與由Nato3基因的核苷酸序列組成的多核苷酸，或其 互補(bǔ)序列雜交。
本發(fā)明提供了抗Nato3蛋白的抗體或其部分用于檢測(cè)或選擇多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的用途。
本發(fā)明的探針，本發(fā)明的引物，和本發(fā)明的抗體可用作多巴胺能神經(jīng) 元增殖祖細(xì)胞的選4爭(zhēng)標(biāo)記。因此，本發(fā)明對(duì)于移植材料的純度^r測(cè)，以及 開(kāi)發(fā)體外誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過(guò)程的方法等十分有 用，本發(fā)明有望促進(jìn)再生醫(yī)療的實(shí)際應(yīng)用。
附圖筒述

圖1顯示了與多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)的標(biāo)記基因的表達(dá)時(shí)期。
圖2顯示了 12.5-曰齡小鼠胚胎的中腦。沿著背腹軸將中腦分成四個(gè)區(qū)域(V:最腹側(cè)區(qū)域，VL:腹側(cè)區(qū)逸DL:背側(cè)區(qū)域，D:最背側(cè)區(qū)域)。
圖3顯示了通過(guò)RT-PCR法，分析Nato3， DAT, Lmxla和Lip4在中腦各個(gè)區(qū)域 中的mRNA表達(dá)的結(jié)果。
圖4顯示了通過(guò)原位雜交，分析Nato3,Nuni和TH在11.5-日齡小鼠胚胎中 腦中的mRNA表達(dá)的結(jié)果。點(diǎn)^^示產(chǎn)生多^肯M申^iL的區(qū)域，破折號(hào)^4示VZ (腦室區(qū))和ML (套層)之間的分界。
圖5顯示了通過(guò)免疫染色法，分析Nato3, Lmxla和Nurrl在11.5-日齡小鼠 胚胎中腦中的蛋白質(zhì)表ii^^^表超雙染色)的結(jié)果。點(diǎn)線表示產(chǎn)生了多e^肯a申經(jīng) 元的區(qū)域，破折號(hào)l汰示VZ (腦室區(qū))和ML (套層)之間的分界。
圖6顯示了通過(guò)RT-PCR法,分析Nato3和其它多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記基因 在由ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果。
圖7顯示了通過(guò)細(xì)胞分選儀分離Lip4陽(yáng)性細(xì)月M口陰性細(xì)胞。
圖8顯示了通過(guò)RT-PCR法,分析Nato3和其它多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記基因 在每個(gè)多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果，所述細(xì)胞分離自由12.5-曰齡小鼠胚胎(E12.5)的中腦獲得的細(xì)胞和SDIA分化誘導(dǎo)細(xì)胞。
發(fā)明詳述
下文將要詳細(xì)解釋本發(fā)明。以下描述是解釋本發(fā)明的例子，本發(fā)明并 不局限于所描述的實(shí)施方案。本說(shuō)明書(shū)中使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)、科技術(shù)語(yǔ) 和術(shù)語(yǔ)學(xué)與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同，
它們僅用于解釋具體的實(shí)施方案，而不會(huì)對(duì)其構(gòu)成限制。只要不背離本發(fā) 明的精神，本發(fā)明可在不同的實(shí)施方案中被實(shí)施。本說(shuō)明書(shū)中提及的所有 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)、公開(kāi)出版物、專(zhuān)利出版物和其它專(zhuān)利文獻(xiàn)皆以參考文獻(xiàn)的 形式被引入本說(shuō)明書(shū)中，可用于實(shí)施本發(fā)明。 [多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞]
身為本發(fā)明中被檢測(cè)或選擇的目標(biāo)的"多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞"指 的是有絲分裂停滯前的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞。
經(jīng)過(guò)增殖祖細(xì)胞和有絲分裂后前體細(xì)胞的分化階段，多巴胺能神經(jīng)元 由神經(jīng)上皮細(xì)胞分化為成熟的多巴胺能神經(jīng)元。多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì) 胞是多巴胺能神經(jīng)元中最早的祖細(xì)胞，因此，預(yù)期可獲得高存活力，并在 移植了細(xì)胞的腦中獲得網(wǎng)絡(luò)形成的高能力。因此，多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞可用于移植療法，以治療因多巴胺能神經(jīng)元變性使多巴胺減少而導(dǎo)致 的疾病，如帕金》兔氏病。
使用本發(fā)明的探針、引物或抗體作為指標(biāo)選擇的細(xì)胞是有絲分裂停滯 前的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，因此，從安全性、存活率和網(wǎng)絡(luò)形成能 力方面考慮，與常規(guī)的混合細(xì)胞群體或?qū)胪庠椿虻亩喟桶纺苌窠?jīng)元增 殖祖細(xì)胞相比，本發(fā)明的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞可優(yōu)選用于神經(jīng)變性 疾病，如帕金森氏病的移植治療。細(xì)胞是有絲分裂停滯前的多巴胺能神經(jīng) 元增殖祖細(xì)胞，即為處于增殖過(guò)程中的細(xì)胞，其具有在腦中的大多數(shù)合適 的位置分化為成熟細(xì)胞的可能性，另外，多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞也具有在 體內(nèi)增殖的可能性，因此，預(yù)期可獲得較長(zhǎng)期的治療效果。因此，可以認(rèn) 為本發(fā)明為神經(jīng)變性疾病，如帕金森氏病的有效移植治療的實(shí)際應(yīng)用鋪平 了道路。
本發(fā)明的探針和引物可與Nato3基因特異性雜交。如上所述，Nato3基 因的表達(dá)可用作多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的指標(biāo)。因此，本發(fā)明的探針 或引物可用作;險(xiǎn)測(cè)多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的標(biāo)記物。
本發(fā)明的探針和引物可用于檢測(cè)Nato3基因的表達(dá)，相當(dāng)于由多個(gè)堿基 或石成基對(duì)，如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)組成的聚合物。已知雙 鏈cDNA也可用于組織原位雜交，本發(fā)明的探針和引物包括該雙鏈cDNA。 用于檢測(cè)組織中的RNA的特別優(yōu)選的探針和引物可以是例如RNA探針(核 糖核酸探針)。
本發(fā)明的探針和引物包括由含有Nato3基因核苷酸序列的至少10個(gè)， 優(yōu)選至少15個(gè)，更優(yōu)選至少20個(gè)，更優(yōu)選至少25個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的 多核普酸，或其互補(bǔ)序列組成的探針和引物。本發(fā)明的探針和引物也包括 由含有Nato3基因核苷酸序列的10-50或10-30, 15-50或15-30, 20-50或 20-30,以及25-50或25-30個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的多核苷酸，或其互補(bǔ)序 列組成的探針和引物。
本發(fā)明的探針和引物的長(zhǎng)度可以至少為10個(gè)堿基，優(yōu)選至少為15個(gè)
堿基，更優(yōu)選至少為20個(gè)堿基，更優(yōu)選至少為25個(gè)堿基。本發(fā)明的探針
和引物的長(zhǎng)度也可以為10-50個(gè)堿基或10-30個(gè)堿基，15-50個(gè)堿基或15-30
個(gè)堿基，20-50個(gè)堿基或20-30個(gè)堿基，以及25-50個(gè)堿基或25-30個(gè)堿基。本發(fā)明探針和引物的優(yōu)選實(shí)施方案提供了長(zhǎng)度為15-30個(gè)堿基的探針 和引物，用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，所述探針和引物由
含有Nato3基因核苷酸序列的至少I(mǎi)O個(gè)(優(yōu)選至少15個(gè)，更優(yōu)選至少20個(gè)， 更優(yōu)選至少25個(gè))連續(xù)核苷酸的序列的多核苷酸，或其互補(bǔ)序列組成，并能 與Nato3基因雜交。
本發(fā)明探針和引物的優(yōu)選實(shí)施方案提供了可與Nato3基因核苷酸序列 的高辨別部分雜交的探針和引物。使用該探針和引物，可以較高的準(zhǔn)確度 檢測(cè)到增殖祖細(xì)胞。所述探針和引物包括可與含有選自SEQ ID NO:l的核 苷酸1-365和534-640、 SEQ ID NO:3的核香酸1-376和545-662、 SEQ ID NO:5 的核苷酸1-306和475-501、 SEQIDNO:7的核香酸1-377和546-886、 SEQ ID NO:9的核苷酸1-312和481-507、 SEQ ID NO:ll的核苷酸1-306和 475-501、 SEQ ID NO:13的核苷酸1-306和475-501、 SEQ ID NO:15的核苷 酸1-177和346-372、 SEQ ID NO: 17的核苷酸1-359和528-557、 SEQ ID NO: 19 的核苷酸1-357和523-552的核苷酸序列的部分或全部的核芬酸序列雜交的 探針和引物。
本發(fā)明的探針可在^r測(cè)感興趣基因的已知方法，如northern印跡法、 southern印跡法、原位雜交法等中用作根據(jù)一般方法的探針。
可根據(jù)本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的核苷酸序列，化學(xué)合成本發(fā)明的探針。探針 的制備方法是眾所周知的，可根據(jù)例如"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed."(Cold Spring Harbor Press (1989))和"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997))進(jìn)行制備。
本發(fā)明的引物也可用作由兩種或多種引物組成的引物套。
本發(fā)明的引物和引物套可在利用核酸擴(kuò)增法，如PCR法、RT-PCR法、 實(shí)時(shí)PCR法、原位PCR法或LAMP法檢測(cè)感興趣基因的已知方法中用作 根據(jù)一般方法的引物和引物套。
可選擇本發(fā)明的引物套，以使通過(guò)核酸擴(kuò)增法可擴(kuò)增出Nato3基因的核 苷酸序列。核酸擴(kuò)增法是眾所周知的，核酸擴(kuò)增法中引物對(duì)的選擇也是本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的。例如，在PCR法中，可選擇引物，以使兩個(gè)引 物(引物對(duì))中的一個(gè)與Nato3基因雙鏈DNA的正鏈配對(duì)，另一個(gè)引物與雙 鏈DNA的負(fù)鏈配對(duì)，由一個(gè)引物延伸的鏈可與另一個(gè)引物配對(duì)。另外，在 LAMP法(WO 00/28082)中，關(guān)于耙基因，從3，末端一側(cè)，限定了三個(gè)區(qū)域F3c、 F2c和Flc,從5，末端一側(cè)，限定了三個(gè)區(qū)域B1、 B2和B3，通過(guò)使 用這六個(gè)區(qū)域，可設(shè)計(jì)四種引物。
可根據(jù)本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的核苷酸序列，化學(xué)合成本發(fā)明的引物。引物 的制備方法是眾所周知的，可根據(jù)例如"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed."(Cold Spring Harbor Press (1989))和"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997))進(jìn)行制備。
在本發(fā)明中，"Nato3基因"是多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞存在的指標(biāo)， 已知其存在于人、小鼠、大鼠、黑猩猩、狗、牛、雞等中。公開(kāi)各個(gè)序列
的GenBank登錄號(hào)如下。 Nato3基因
人NM一152898 (SEQIDNO:l (堿基序列)，SEQ IDNO:2 (氨基酸序列)， 下文中以相同的次序表示)，AF517122 (SEQ ID NO:3， SEQ ID NO:4), BC069147(SEQIDNO:5， SEQIDNO:6)， AF369897 (與BC069147相同)
小鼠NM—033522(SEQ ID NO:7 ， SEQ ID NO:8) ， AF517121(與 NM一033522相同)，AF369896(SEQ ID NO:9， SEQIDNO:IO)
大鼠XM—345658(SEQIDNO:11, SEQIDNO:12)
黑猩猩XM_527676(SEQIDNO:13， SEQIDNO:14)
狗XM—539457(SEQIDNO:15， SEQIDNO:16)
牛XM—584097(SEQIDNO:17, SEQIDNO:18)
雞XM_425989(SEQIDNO:19, SEQIDNO:20)
至于除上述動(dòng)物外的動(dòng)物(優(yōu)選哺乳動(dòng)物)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于已 知的全長(zhǎng)Nato3基因序列，詳細(xì)列出其固有的Nato3基因序列。例如，通過(guò) 基于人或小鼠Nato3基因的同源性檢索，可檢索并鑒定出動(dòng)物的Nato3基因。 在同源性4全索中，可使用下文描述的BLAST等。
Nato3基因包括
編碼人Nato3蛋白的多核苷酸，所述蛋白由選自SEQIDNO:2、 SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的至少一個(gè)氨基酸序列組成；
編碼小鼠Nato3蛋白的多核苷酸，所述蛋白由選自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO: 10的至少 一個(gè)氨基酸序列組成；
編碼大鼠Nato3蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQIDNO:12的氨基酸 序列組成；編碼黑猩猩Nato3蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQIDNO:14的氨基 酸序列組成；
編碼狗Nato3蛋白的多核香酸，所述蛋白由SEQ ID NO:16的氨基酸序 列組成；
編碼牛Nato3蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQIDNO:18的氨基酸序 列組成；和
編碼雞Nato3蛋白的多核香酸，所述蛋白由SEQIDNO:20的氨基酸序 列組成。
此外，Nato3基因包括
含有選自SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的至少一個(gè)人
Nato3基因DNA序列的多核苷酸；
含有選自SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的至少一個(gè)小鼠Nato3基因
DNA序列的多核苷酸；
含有SEQIDNO:ll的大鼠Nato3基因DNA序列的多核苷酸；
含有SEQIDNO:13的黑猩猩Nato3基因DNA序列的多核苷酸；
含有SEQ ID NO: 15的狗Nato3基因DNA序列的多核苷酸；
含有SEQ ID NO: 17的牛Nato3基因DNA序列的多核苷酸；和
含有SEQ ID NO: 19的雞Nato3基因DNA序列的多核苷酸。
本發(fā)明的Nato3基因包括編碼與Nato3蛋白功能等同的蛋白質(zhì)的基因。
通過(guò)評(píng)價(jià)與Nato3基因的表達(dá)相關(guān)的生物學(xué)現(xiàn)象或功能，例如，通過(guò)評(píng)價(jià)基
因是否在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)，即可測(cè)定基因是否為 "功能等同的"基因。
此外，當(dāng)編碼氨基酸序列(如SEQIDNO:2的氨基酸序列)的基因具有多
態(tài)性時(shí)，與Nato3蛋白功能等同的蛋白質(zhì)包括具有多態(tài)性的蛋白質(zhì)。 編碼與Nato3蛋白功能等同的蛋白質(zhì)的基因包括 編碼Nato3蛋白(例如SEQ IDNO:2的氨基酸序列和SEQ ID NO:8的氨
基酸序列)經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入、取代或缺失，或在氨基酸序列
的 一端或兩端添加所得的氨基酸序列(經(jīng)修飾的氨基酸序列)的基因；
在嚴(yán)緊條件下與編碼Nato3蛋白氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2的氨基
酸序列和SEQIDNO:8的氨基酸序列)的基因雜交的基因；和
編碼與Nato3蛋白氨基酸序歹'](例如SEQ IDNO:2的氨基酸序列和SEQIDN0:8的氨基酸序列)具有至少70°/。或更高同一性的氨基酸序列的基因。
在本說(shuō)明書(shū)中，"經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入、取代或缺失，或在 氨基酸序列的一端或兩端添加"指的是通過(guò)眾所周知的技術(shù)方法，如定點(diǎn)誘 變或通過(guò)在自然產(chǎn)生的程度下取代多個(gè)氨基酸而進(jìn)行的修飾。
Nato3蛋白經(jīng)修飾的氨基酸序列可以是如下所述的氨基酸序列，其中 1-30，優(yōu)選1-20,更優(yōu)選1-9,更優(yōu)選1-5,特別優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸被插 入、取代或缺失，或在氨基酸序列的一端或兩端被添加。優(yōu)選經(jīng)修飾的氨 基酸序列可以是在Nato3蛋白的氨基酸序列中具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè)或 幾個(gè)，或1， 2, 3或4個(gè))保守取代的氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)"保守取代"指的是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被其它化學(xué)類(lèi)似氨基酸 殘基所取代，但實(shí)質(zhì)上不會(huì)改變蛋白質(zhì)的活性。例如，某個(gè)疏水殘基被另 一個(gè)疏水殘基取代的情形，某個(gè)極性殘基被另 一個(gè)具有相同電荷的極性殘 基取代的情形。對(duì)每個(gè)氨基酸而言，可按照此方式被取代的功能類(lèi)似的氨 基酸是本領(lǐng)域已知的。具體例如非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、 異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸。極性(中性) 氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半 胱氨酸。帶正電(堿性)的氨基酸包括精氨酸、祖氨酸和賴(lài)氨酸。另外，帶負(fù) 電(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
在本說(shuō)明書(shū)中，"雜交"指的是在嚴(yán)緊條件下與靶多核苷酸雜交。具體地 說(shuō)，例如，當(dāng)使用缺省參數(shù)(最初的設(shè)置)，用同源性;f全索軟件，如FASTA， BLAST, Smith-Waterman [Meth. Enzym., 164, 765 (1988)]進(jìn)行計(jì)算時(shí)，與靶核 苷酸序列具有的同一性為至少70%或更高，優(yōu)選80%或更高，更優(yōu)選85% 或更高，更優(yōu)選90%或更高，更優(yōu)選95%或更高，特別優(yōu)選98%或更高， 最優(yōu)選99%或更高的多核苷酸。另夕卜，"在嚴(yán)緊條件下，，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人 員通常使用的在雜交緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)的方法來(lái)進(jìn)行，以使溫度為 40-70。C,優(yōu)選為60-65°C，并在鹽濃度為15-300 mmol/L,優(yōu)選為15-60 mmol/L的漂洗溶液中進(jìn)行洗滌。可根據(jù)所用探針的長(zhǎng)度適當(dāng)調(diào)整溫度和鹽 濃度。另外，洗滌雜交核苷酸的條件可以是0.2或2xSSC, 0.1%SDS，溫度 為20-68°C。至于控制嚴(yán)緊條件(高嚴(yán)緊度)或溫和條件(低嚴(yán)緊度)，洗滌時(shí) 的鹽濃度或溫度即可提供差異。當(dāng)由鹽濃度提供雜交差異時(shí)，可使用嚴(yán)緊 的洗滌緩沖液(高嚴(yán)緊度洗滌緩沖液)0.2xSSC和0.1。/c) SDS,以及溫和的洗滌緩沖液(低嚴(yán)緊度洗滌緩沖液)2xSSC和0.1% SDS。另外，當(dāng)由溫度提供 雜交差異時(shí)，嚴(yán)緊條件下的溫度為68。C,中度嚴(yán)緊條件下的溫度為42°C, 溫和條件下的溫度為室溫(20-25。C)，每種情形都可在0.2xSSC和0.1°/。 SDS 中進(jìn)行。
一般說(shuō)來(lái)，在與雜交相同的條件下進(jìn)行預(yù)雜交。然而，不局限于在相 同條件下進(jìn)行雜交和初步洗滌。
可根據(jù)已知方法進(jìn)行雜交。另外，在使用商購(gòu)的文庫(kù)時(shí)，可根據(jù)所附 使用說(shuō)明中描述的方法進(jìn)行雜交。
在本說(shuō)明書(shū)中，與氨基酸序列有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"同 一性"(有時(shí)也稱(chēng)之為同源 性)指的是在被比較的序列之間，各個(gè)序列的氨基酸殘基的同一性水平。此 時(shí)，要考慮缺口的存在和氨基酸的特性(Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730(1993))。為了計(jì)算同源性，可使用BLAST(Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))、 FASTA (Peasron: Methods in Enzymiology 183:63-69 (1990))等。
與Nato3蛋白氨基酸序列的同一性至少為70%或更高的氨基酸序列可 以是同一性優(yōu)選為80%或更高，更優(yōu)選為85%或更高，更優(yōu)選為90%或更 高，更優(yōu)選為95%或更高，特別優(yōu)選為98%或更高，最優(yōu)選為99%或更高 的氨基酸序列。
"同一性，，可以是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的同源性檢索程序計(jì)算出的 凄M直，通過(guò)例如4吏用NCBI (National Center for Biotechnology Information)的 同源't"生算法BLAST(Basic local alignment search tool) http:www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/中的缺省參數(shù)(最初的設(shè)置)即可計(jì)算同一性。
本發(fā)明的抗體可特異性識(shí)別Nato3蛋白。如上所述，Nato3基因的表達(dá) 可用作多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的指標(biāo)。因此，本發(fā)明的抗體可用作檢 測(cè)多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的標(biāo)記物。
用于獲得本發(fā)明抗體的Nato3蛋白可具有Nato3的抗原性，其包括在 Nato3蛋白氨基酸序列中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失、插入、取代或 添加所得的蛋白質(zhì)。已知在這種蛋白質(zhì)中，會(huì)維持與原始蛋白質(zhì)相同的生 物活性(Mark et al. (1984) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-6; Zoller and Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-500; Wang et al. (1984) Science224:1431-3; and Dalbadie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409-13)。缺失、插入、取代或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，而能在蛋 白質(zhì)中維持原始蛋白質(zhì)的抗原性的方法是已知的。例如，編碼突變蛋白質(zhì)
的多核苷酸可通過(guò)定點(diǎn)誘變的方法來(lái)制備，并能被適當(dāng)表達(dá)(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.， Cold Spring Harbor Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997); Sections 8.1-8.5; Hashimoto-Goto et al. (1995) Gene 152:271-5; Kinkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92; Kramer and Fritz (1987) Method. Enzymol. 154:350-67; and Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85:2763-6)。
本發(fā)明的抗體包括特異于Nato3蛋白的一部分的抗體。具體地說(shuō)，用于 獲得本發(fā)明抗體的Nato3蛋白包括具有Nato3蛋白的至少6個(gè)或更多個(gè)氨基 酸殘基(例如6， 8， 10， 12或15個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基)的多肽片段，以及具 有全長(zhǎng)氨基酸序列的多肽。本說(shuō)明書(shū)中Nato3蛋白的多肽片段包括每一個(gè)片 段，只要該片段具有Nato3蛋白的抗原性即可。
優(yōu)選的片段包括多肽片段，例如Nato3蛋白的氨基末端或羧基末端。通 過(guò)分析蛋白質(zhì)氨基酸序列的疏水性/親水性的方法(Kyte-Doolittle(1982) J. Mol. Biol. 157:105-22),或分析二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法(Chou-Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:251-76)估計(jì)多肽的抗原決定簇位點(diǎn)，再通過(guò)計(jì)算機(jī)程序 (Anal. Biochem. 151:540-6 (1985))或合成短肽并證實(shí)抗原性的技術(shù)，如 PEPSCAN法(日本專(zhuān)利特許公開(kāi)號(hào)60-500684)進(jìn)一步證實(shí)該位點(diǎn)。
抗Nato3蛋白的抗體包括
抗具有選自SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的至少一個(gè)氨 基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體；
抗具有選自SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的至少一個(gè)氨基酸序列的蛋
白質(zhì)或其部分的抗體；
抗具有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體； 抗具有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體； 抗具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體； 抗具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體；和 抗具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其部分的抗體。 本發(fā)明抗體的優(yōu)選實(shí)施方案提供了可識(shí)別Nato3蛋白的高辨別多肽部分的抗體。使用該抗體，可以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)到增殖祖細(xì)胞。所述抗體
包括抗Nato3蛋白的高辨別多肽部分的抗體，所述多肽部分例如可為選自 SEQ ID NO:2的氨基酸1-102和159-166， SEQ ID NO:4的氨基酸1-102和 159-166, SEQ ID NO:6的氨基酸1-102和159-166， SEQ ID NO:8的氨基酸 1-104和161-168, SEQ IDNO:IO的氨基酸1-104和161-168， SEQIDNO:12 的氨基酸1-102和159-166, SEQIDNO:14的氨基酸1-102和159-166, SEQ ID NO: 16的氨基酸1-59和116-123， SEQ ID NO: 18的氨基酸1-101和 158-164, SEQ ID NO:20的氨基酸1-119和176-183中的至少6個(gè)氨基酸殘 基或全部氨基酸序列。
通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，例如"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987) and Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane， Cold Spring Harbor Laboratory (1988)，也 可獲得本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體 (scFv)、人源化抗體、多特異性抗體和抗體片段，如Fab,Fab，，F(xiàn)(ab，)2,Fc和 Fv。
對(duì)于多克隆抗體而言，抽取經(jīng)過(guò)抗原致敏的哺乳動(dòng)物的血液，通過(guò)已 知方法從血液中分離出血清，用作含有多克隆抗體的血清。
根據(jù)需要，也可以進(jìn)一步分離含有多克隆抗體的級(jí)分。
對(duì)單克隆抗體而言，提取從經(jīng)過(guò)上述抗原致敏的哺乳動(dòng)物的脾臟或淋 巴結(jié)中獲得的能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并將所述細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。對(duì)所 得雜交瘤進(jìn)行克隆，從培養(yǎng)物中收集抗體以用作單克隆抗體。
可將Nato3蛋白的片段用作免疫抗原?；蛘?，可使用基于上述氨基酸序 列合成的抗原?？乖梢砸耘c載體蛋白形成復(fù)合物的形式來(lái)使用。為了制 備抗原與載體蛋白的復(fù)合物，可使用多種凝聚劑(condensation),如戊二醛、 碳二亞胺、馬來(lái)酰亞胺-活化的酯等。載體蛋白可以是常用的那些，如牛血 清白蛋白、曱狀腺球蛋白、血藍(lán)蛋白等， 一般以1-5倍量進(jìn)行連接。
被免疫的動(dòng)物包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和倉(cāng)鼠。注射方法包括皮下、 肌肉或腹膜內(nèi)給藥。給藥時(shí)，抗原可與完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑混 合。 一般每2-5周給藥一次。
將得自經(jīng)免疫動(dòng)物的脾臟或淋巴結(jié)的能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，并分離雜交瘤?？墒褂玫米孕∈?、大鼠或人的骨髓瘤細(xì)胞， 優(yōu)選其與產(chǎn)生抗體的細(xì)胞源自相同物種，但源自不同物種的細(xì)胞有時(shí)也是 可以的。
可根據(jù)先前已知的方法，例如Nature, 256, 495， 1975中公開(kāi)的方法進(jìn)行 細(xì)月包融合。
融合促進(jìn)劑包括聚乙二醇或仙臺(tái)病毒，通常，在20-40。C，優(yōu)選30-37。C， 使用濃度約為20-50%的聚乙二醇(平均分子量為1000-4000),反應(yīng)約1-10 分鐘，使抗體生成細(xì)胞的數(shù)目與骨髓瘤細(xì)胞的數(shù)目之比大致約為1:1-10:1， 以進(jìn)行細(xì)胞融合。
為了篩選產(chǎn)生抗體的雜交瘤，可使用多種免疫化學(xué)方法。例如，使用 包被Nato3蛋白的微滴板進(jìn)行ELISA,使用包被抗-免疫球蛋白抗體的微滴 板進(jìn)行EIA,以及將含Nato3蛋白的樣品電泳之后使用硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜進(jìn) 4亍免疫印跡。
通過(guò)例如有限稀釋法從所述孔中進(jìn)行進(jìn)一步克隆，籍此獲得克隆。一 般在添加了 HAT(次黃。票呤、氨基蝶呤和胸苷)的含有10-20%牛胚胎血清的 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基(例如RPMI1640)中進(jìn)行雜交瘤的選擇和培養(yǎng)。將按上述方 法獲得的克隆移植到預(yù)先施用過(guò)pristine的SCID小鼠的腹腔中，10-14天后， 收集含有高濃度單克隆抗體的腹水液以用作純化抗體的材料。另外，培養(yǎng) 克隆，培養(yǎng)物也可以是純化抗體的材料。
為了純化單克隆抗體，可使用先前已知的純化免疫球蛋白的方法，所 述純化可通過(guò)例如石克酸銨分級(jí)分離法、PEG分級(jí)分離法、乙醇分級(jí)分離法、 使用陰離子交換劑、使用Nato3蛋白進(jìn)行的親和層析等容易地進(jìn)行。
可按類(lèi)似方法，從血清中純化多克隆抗體。
Nato3基因的表達(dá)可用作多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞存在的指標(biāo)。因 此，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)檢測(cè)Nato3基因的表達(dá)，即可檢測(cè)或選擇多巴胺能神 經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
對(duì)本文所用的"檢測(cè)Nato3基因表達(dá)，，的方法沒(méi)有特別的限制，只要它能 檢測(cè)待測(cè)試細(xì)胞樣品中的Nato3基因表達(dá)即可，例如，所述方法包括雜交法、 核酸擴(kuò)增法和抗原-抗體反應(yīng)法。
本文所用的"待測(cè)試細(xì)胞樣品，，可以是據(jù)認(rèn)為含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞樣品，可以使用中腦腹側(cè)區(qū)域的細(xì)胞。通過(guò)已知方法可獲得
中腦腹側(cè)區(qū)域的細(xì)胞(Studer, L" et al. Nature Ne腦sci (1998) 1:2卯-295)。優(yōu) 選將胎兒(優(yōu)選人流產(chǎn)胎兒)或患者本人中腦腹側(cè)區(qū)域的細(xì)胞用作待測(cè)試細(xì) 胞樣品。另外，可將培養(yǎng)物細(xì)胞用作待測(cè)試細(xì)胞樣品，所述培養(yǎng)物細(xì)胞中 含有在體外能被誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。通過(guò)將已知的ES
細(xì)胞(Kawasaki et al. Ne腸n (2000) 28(1):31-40 and Lee， SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、得自神經(jīng)的無(wú)限增殖化細(xì)胞系 (曰本專(zhuān)利特許公開(kāi)號(hào)8-509215, 11-506930和2002-522070)、神經(jīng)元原基細(xì) 胞(日本專(zhuān)利特許公開(kāi)號(hào)11-509729)等用作起始材料，用已知方法進(jìn)行分化 處理即可體外誘導(dǎo)其向多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞分化，所述方法如SDIA 法(Kawasaki et al. Neuron (2000) 28(1):31陽(yáng)40)或5-階4爻法(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)。優(yōu)選將用SDIA法進(jìn)行分化處理的ES細(xì) 胞用作待檢測(cè)細(xì)胞樣品。
通過(guò)在無(wú)血清培養(yǎng)基中共培養(yǎng)ES細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞系PA6來(lái)進(jìn)行本文所 用的"SDIA法，，(Kawasakietal. Neuron (2000) 28(1):31-40)。另外，可按下述 進(jìn)行"5-階段法"。在存在血清時(shí)，在非-貼壁的培養(yǎng)板上培養(yǎng)ES纟田月包，籍此 形成胚狀體(embryoid body, EB),隨后，將EB粘附在貼壁培養(yǎng)板上，籍此 選^^神經(jīng)元祖細(xì)胞。最后，在其中加入生長(zhǎng)因子，如Shh、 FGF2或FGF8， 從而誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(Lee, SH.， et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)。
根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)方法的第 一 個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的探針與核酸樣品 (mRNA或其轉(zhuǎn)錄物)雜交，檢測(cè)雜交復(fù)合物，即核苷酸雙鏈。因此，可檢測(cè) 細(xì)胞樣品中的Nato3基因表達(dá)。
關(guān)于雜交方法的詳細(xì)程序，可參考"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.，，(Cold Spring Harbor Press (1989)，特別是第9.47-9.58節(jié)， "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997)),特 另ll是第6.3和6.4節(jié),"DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed." (Oxford University (1995),特別是與條件有關(guān)的第2,10節(jié))。
可通過(guò)例如下述步驟，利用雜交法檢測(cè)Nato3基因的表達(dá)
(a)使得自待測(cè)試細(xì)胞樣品的多核苷酸與本發(fā)明的多核苷酸探針接觸；
和(b) 檢測(cè)雜交復(fù)合物。
在步驟(a)中，可將由據(jù)認(rèn)為含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的待測(cè)試 細(xì)胞樣品制備的mRNA，或由該mRNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA(cDNA)用作得自 待測(cè)試細(xì)胞樣品的多核香酸，進(jìn)而與探針接觸。
在使用探針的檢測(cè)方法中，可標(biāo)記探針。標(biāo)記物包括利用放射性(如"P， "C和35S)、熒光(如FITC、銪)、酶(如過(guò)氧化物酶或^ 成性磷酸酶)反應(yīng)，如 化學(xué)顯色等的標(biāo)記物。
使用眾所周知的方法，如northern雜交、southern雜交或集落雜交即可 進(jìn)行雜交產(chǎn)物的檢測(cè)。
檢測(cè)到其中的雜交復(fù)合物的細(xì)胞是表達(dá)Nato3基因的細(xì)胞，因此，可被 測(cè)定為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)方法的第二個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)使用本發(fā)明的引物或引 物對(duì)的核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增核酸樣品(mRNA或其轉(zhuǎn)錄物)，并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，即 可檢測(cè)到細(xì)胞樣品中的Nato3基因表達(dá)。
通過(guò)例如下述步驟，可利用核酸擴(kuò)增法^^測(cè)Nato3基因的表達(dá)
(c) 使用得自待測(cè)試細(xì)胞樣品的多核苷酸作為模板，并使用本發(fā)明的多 核苷酸引物或多核苷酸引物對(duì)進(jìn)行核酸擴(kuò)增法；和
(d) 檢測(cè)所形成的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在步驟(c)中，可將由據(jù)認(rèn)為含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的待測(cè)試 細(xì)胞樣品制備的mRNA,或由該mRNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA(cDNA)用作模板。
使用核酸擴(kuò)增法，如PCR法、RT-PCR法、實(shí)時(shí)PCR法或LAMP法可 進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。
檢測(cè)到其中的擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞也表達(dá)Nato3基因，因此，可被測(cè)定為多 巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)方法的第三個(gè)實(shí)施方案，使本發(fā)明的抗體與細(xì)胞樣品 接觸，檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)。因此，可檢測(cè)到細(xì)胞樣品中的Nato3基因表達(dá)。
通過(guò)例如下述步驟，可利用抗原-抗體反應(yīng)4企測(cè)Nato3基因的表達(dá)
(e) ^^得自待測(cè)試細(xì)胞樣品的蛋白質(zhì)與本發(fā)明的抗體接觸；和
(f) 測(cè)定抗原-抗體復(fù)合物。
檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，例如，可通 過(guò)免疫學(xué)方法，在據(jù)認(rèn)為含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的待測(cè)試細(xì)胞樣品中檢測(cè)Nato3蛋白。關(guān)于免疫學(xué)方法，可對(duì)根據(jù)需要經(jīng)適當(dāng)處理，如細(xì)胞 的分離或提取操作的細(xì)胞樣品使用先前已知的方法，如免疫組織染色法、 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、western印跡法、凝集法、竟?fàn)幏ɑ驃A心法?？赏ㄟ^(guò) 例如使用經(jīng)標(biāo)記抗體的直接法，或使用經(jīng)標(biāo)記的抗抗體之抗體的間接法來(lái) 進(jìn)行免疫組織染色法。關(guān)于標(biāo)記試劑，可使用已知的標(biāo)記物質(zhì)，如熒光物 質(zhì)、放射性物質(zhì)、酶、金屬或色素。
檢測(cè)到其中的抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞是表達(dá)Nato3基因的細(xì)胞，因此， 可被測(cè)定為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
為了用于治療帕金森氏病，多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的純度較高才 是合乎需要的。
通過(guò)將上述檢測(cè)步驟中的每一步重復(fù)多次，而不是一次，即可增強(qiáng)檢 測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的準(zhǔn)確度。
因此，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，通過(guò)將上述步驟進(jìn)行兩次或多次，即 可以高準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
另夕卜，通過(guò)同時(shí)使用其它標(biāo)記基因，優(yōu)選除Nato3基因以外的多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因，也可增強(qiáng)檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞的準(zhǔn)確度。
因此，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，通過(guò)同時(shí)使用除Nato3基因以外的多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因以及有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞 標(biāo)記基因等，并同時(shí)檢測(cè)Nato3基因的表達(dá)以及上述其它標(biāo)記基因的表達(dá)， 也可以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
圖1顯示了在各個(gè)分化階段選擇性表達(dá)的與多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)的標(biāo) 記基因。
在特征在于檢測(cè)Nato3基因表達(dá)的檢測(cè)方法中，通過(guò)同時(shí)使用除Nato3 基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因，同時(shí)檢測(cè)Nato3基因以及 除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因，即可以高準(zhǔn)確度 檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
具體地說(shuō)，在步驟(a)、步驟(c)或步驟(e)中，通過(guò)將其中的除Nato3基 因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)需被檢測(cè)的細(xì)胞用作 待測(cè)試細(xì)胞樣品，即可以高準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。 此時(shí)，在步驟(b)中被檢測(cè)雜交復(fù)合物的細(xì)胞，在步驟(d)中被檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞，在步驟(f)中被檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞各自表達(dá)Nato3基因和 除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因。因此，可以高準(zhǔn) 確度將細(xì)胞測(cè)定為被檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
另外，關(guān)于在步驟(b)中被檢測(cè)雜交復(fù)合物的細(xì)胞，在步驟(d)中被檢測(cè) 擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞，以及在步驟(f)中被檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞，分別進(jìn) 行檢測(cè)除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的步 驟(g-l),即可以高準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。此時(shí)， 在步驟(g-l)中，其中的除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記 基因的表達(dá)需被檢測(cè)的細(xì)胞是表達(dá)Nato3基因，以及除Nato3基因以外的多 巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的細(xì)胞。因此，可以高準(zhǔn)確度將細(xì)胞測(cè) 定為被檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
在特征在于檢測(cè)Nato3基因表達(dá)的檢測(cè)方法中，通過(guò)同時(shí)使用有絲分裂 后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因，可以證實(shí)表達(dá)了 Nato3基因，但未 檢測(cè)到有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)。因此，可 以高準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖前體細(xì)胞。
具體地說(shuō)，在步驟(a)、步驟(c)或步驟(e)中，通過(guò)使用未檢測(cè)到其有絲 分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的細(xì)胞，即可以高準(zhǔn)確度 檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。此時(shí)，在步驟(b)中被檢測(cè)雜交復(fù) 合物的細(xì)胞，在步驟(d)中被檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞，在步驟(f)中被檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞各自表達(dá)Nato3基因，但不表達(dá)有絲分裂后的多巴胺能神 經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因。因此，可以高準(zhǔn)確度將細(xì)胞測(cè)定為被檢測(cè)或選擇 的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
另外，關(guān)于在步驟(b)中被檢測(cè)雜交復(fù)合物的細(xì)胞，在步驟(d)中被檢測(cè) 擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞，以及在步驟(f)中被檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞，分別進(jìn) 行檢測(cè)有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的步驟(g-2), 即可以高準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。此時(shí)，在步驟(g-2) 中，其中的有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)未被檢 測(cè)到的細(xì)胞是表達(dá)Nato3基因，但不表達(dá)有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體 細(xì)胞標(biāo)記基因的細(xì)胞。因此，可以高準(zhǔn)確度將細(xì)胞測(cè)定為被檢測(cè)或選擇的 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
"除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因"包括，在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)域(VZ區(qū))表達(dá)的、除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增 殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因，其包括Lrp4基因、Msxl基因、Msx2基因和Mashl基因。
Lrp4基因描述于WO 2004/065599。 Mashl基因描述于Kele J, Simplicio N, Ferri AL, Mira H, Guillemot F， Arenas E, Ang SL. Neurogenin 2 is required for the development of ventral midbrain dopaminergic neurons , 以及 Development. 2006 Feb; 133(3):495-505。本發(fā)明人已證實(shí)Msxl基因和Msx2 基因在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。
對(duì)除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的檢測(cè)沒(méi) 有限制，只要使用可檢測(cè)已知基因表達(dá)的方法即可，例如，所述方法包括 上述的雜交法、核酸擴(kuò)增法和抗原-抗體反應(yīng)法。
"有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因"包括，在中腦最腹側(cè) 套層(ML區(qū))表達(dá)的基因，其包括Nurrl基因、Enl基因、En2基因、Ptx3 基因和TH基因。另外，標(biāo)記基因包括在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)(VZ區(qū))表達(dá)的 基因，其包括65B13基因。
Nurrl基因描述于Science. 1997 11; 276(5310):248-50。 Enl基因描述于 J. Ne薦ci. 2001 21(9): 3126-34。 En2基因描述于J. Ne畫(huà)ci. 2001 21(9) 3126-34。 Ptx3基因描述于Proc. Natl. Acad. Sci. 1997 94:13305-10。 TH基因 描述于Science 1997 11; 276(5310):248-50。 65B13基因描述于WO 2004/ 038018。
對(duì)有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記基因的檢測(cè)沒(méi)有特別的 限制，只要使用可檢測(cè)已知基因表達(dá)的方法即可，例如，所述方法包括上 述的雜交法、核酸擴(kuò)增法和抗原-抗體反應(yīng)法。
本發(fā)明的檢測(cè)方法可用于篩選物質(zhì)，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生成多巴胺 能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過(guò)程。具體地說(shuō)，通過(guò)使用Nato3基因的表達(dá)為 指標(biāo)，測(cè)定待測(cè)試的物質(zhì)的添加是否能誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì) 胞的分化過(guò)程，即可篩選出能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的 分化過(guò)程的物質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供了篩選物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生成多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過(guò)程，所述方法包括下述步驟
(i) 使能分化成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞與待測(cè)試的物質(zhì)接 觸j 和
(ii) 檢測(cè)與待測(cè)試物質(zhì)接觸的細(xì)胞中的Nato3基因表達(dá)。 步驟(i)中可分化成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞優(yōu)選收集自胚胎
中腦腹側(cè)區(qū)域，或收集自含有由ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元祖細(xì)胞的培養(yǎng)物 細(xì)胞。
通過(guò)例如在含有能分化成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞的培養(yǎng)物 細(xì)胞中加入待測(cè)試物質(zhì)，即可進(jìn)行步驟(i)中的"與待測(cè)試物質(zhì)接觸"。
"待測(cè)試物質(zhì)"包括合成的低分子量化合物、蛋白質(zhì)、合成的肽、純化或 部分純化的多肽、抗體、細(xì)菌-釋放物質(zhì)(含有細(xì)菌代謝產(chǎn)物)和核酸(如反義 核酸、核酶和RNAi)，優(yōu)選為合成的低分子量化合物，但并不局限于此。"待 測(cè)試物質(zhì)"可以是新物質(zhì)或已知物質(zhì)。
在步驟(ii)中，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，可檢測(cè)到Nato3基因的表達(dá)。
具體地說(shuō)，進(jìn)行步驟(a)和(b)以利用雜交法進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行步驟(c)和(d) 以利用核酸擴(kuò)增法進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行步驟(e)和(f)以利用抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)行檢 測(cè)。因此，可檢測(cè)到Nato3基因的表達(dá)。
在步驟(ii)中，當(dāng)通過(guò)與待測(cè)試物質(zhì)接觸檢測(cè)到細(xì)胞樣品中的Nato3基 因表達(dá)時(shí)，可將該物質(zhì)測(cè)定為能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過(guò)程的物質(zhì)。
通過(guò)本發(fā)明的篩選方法篩選出的物質(zhì)可用作能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過(guò)程的物質(zhì)。
本發(fā)明提供了篩選物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神
經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過(guò)程，所述方法還包括下述步驟
(iii) 檢測(cè)除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的 表達(dá)。
當(dāng)在步驟(ii)中檢測(cè)到Nato3基因的表達(dá)，在步驟(iii)中檢測(cè)到除Nato3 基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)時(shí)，可以高準(zhǔn)確度 將物質(zhì)測(cè)定為能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的分化過(guò)程的物質(zhì)。
步驟(iii)可在步驟(i)之后進(jìn)行，可在步驟(ii)之前或之后進(jìn)行。 "除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因"包括，在中 腦最腹側(cè)腦室區(qū)域(VZ區(qū))表達(dá)的、除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增 殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因，其包括例如Lrp4基因、Msxl基因、Msx2基因和Mashl基因。
對(duì)除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的檢測(cè)沒(méi) 有特別的限制，只要使用可檢測(cè)已知基因表達(dá)的方法即可，例如，所述方 法包括上述的雜交法、核酸擴(kuò)增法和抗原-抗體反應(yīng)法。
本發(fā)明的檢測(cè)方法可檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。多巴胺 能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞可用于治療帕金森氏病。因此，可使用Nato3基因的表 達(dá)為指標(biāo)，由被檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞制備可用于治療 帕金森氏病的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
本發(fā)明提供了制備多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的方法，所述方法包括 下述步驟
(iv) 獲得含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞；
(v) 使用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞；和
(vi) 培養(yǎng)步驟(v)中檢測(cè)或選擇的細(xì)胞。
本發(fā)明提供了治療帕金森氏病的方法，所述方法包括將通過(guò)本發(fā)明的 檢測(cè)方法檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，或通過(guò)本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞移植到包括人的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的治療方法，移植的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞能產(chǎn)生多 巴胺，因此，可預(yù)防和/或治療帕金森氏病。
當(dāng)進(jìn)行本發(fā)明的治療方法時(shí)，可能含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的 細(xì)胞可收集自哺乳動(dòng)物，包括人，優(yōu)選收集自接受移植的個(gè)體或流產(chǎn)胎兒。
多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞可被移植到腦，優(yōu)選移植到中腦。
在本說(shuō)明書(shū)中，"檢測(cè)"包括"區(qū)分"。
實(shí)施例
下文將通過(guò)實(shí)施例具體解釋本發(fā)明，但下文的實(shí)施例不會(huì)限制本發(fā)明 的范圍。
Nato3蛋白的表達(dá)分析
接著，通過(guò)使用抗-Nato3抗體研究Nato3蛋白的表達(dá)。另外，通過(guò)使用 抗-Lmxla抗體和抗-Nurrl抗體進(jìn)行雙染色。
首先，在大腸桿菌JM109細(xì)胞系(TAKARA)中將Nato3蛋白的l刁2氨 基酸區(qū)域表達(dá)成與GST蛋白的融合蛋白，并收集所述融合蛋白。用收集到 的融合蛋白免疫大鼠，然后取出淋巴細(xì)胞，與骨髓瘤P3U1進(jìn)行細(xì)胞融合， 從而獲得能產(chǎn)生抗-Nato3抗體的雜交瘤(雜交瘤源自Kojin-Bio Co., Ltd.)。同 樣地，將Lmxla蛋白的271-307氨基酸區(qū)域表達(dá)成與GST蛋白的融合蛋白， 并收集該融合蛋白。用收集的融合蛋白免疫倉(cāng)鼠(得自SLC),然后取出淋巴 細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞(ATCC)進(jìn)行細(xì)胞融合，從而獲得能產(chǎn)生抗-Lmxla抗體 的雜交瘤。
取出11.5-日齡的小鼠胚胎，于4。C使用4Q/oPFA(WAKO)/PBS(-)固定2 小時(shí)，然后，于4。C,替換成20。/。蔗糖(WAKO)/PBS (-)溶液放置過(guò)夜，用 OCT(SakuraSeikiCo.，Ltd.)包埋胚胎。制備12fam厚的切片，固定在載玻片 上，室溫干燥30分鐘，然后再用PBS(-)潤(rùn)濕。接著，于室溫封閉(Blockase (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.))30分鐘，然后，室溫與第一抗體(得 自上述雜交瘤培養(yǎng)物上清液的抗-Nato3和抗-Lmxla抗體，得自Santa Cruz 的抗-Nurrl抗體)反應(yīng)1小時(shí)，隨后，于4。C反應(yīng)過(guò)夜。室溫使用0.1%吐溫 -20/PBS (-)洗滌15分鐘，共3次。接著，室溫使經(jīng)熒光-標(biāo)記的第二抗體 (Jackson)反應(yīng)1小時(shí)，按相同的方式進(jìn)行洗滌，然后于室溫用PBS(-)洗滌IO分鐘，并密封。
結(jié)果表明Nato3在11.5-日齡小鼠胚胎的中腦中被表達(dá)成蛋白質(zhì)以及 mRNA(圖5)?？?Lmxla抗體和抗-Nurrl抗體的雙染色結(jié)果表明Nato3蛋 白與Lmxla蛋白共表達(dá)，因此揭示出Nato3蛋白在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞中選4奪性表達(dá)(圖5)。另外，還證實(shí)了 Nato3蛋白在不表達(dá)Nurrl蛋白 的VZ區(qū)選擇性表達(dá)，因此表明Nato3蛋白在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中 選擇性表達(dá)(圖5)。
Nato3基因在由ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元中的表
逸
本實(shí)施例研究了當(dāng)ES細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元時(shí)，Nato3基 因是否表達(dá)。
首先，根據(jù)SDIA法(Kawasaki et al. Neuron. 2000 28(1):31-40.)， ES細(xì)胞 (小鼠CCE品系，由Riken CDB的Mr. Nishikawa提供，Kawasaki et al. Neuron. 2000 28(1):31-40.)被誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元。誘導(dǎo)4, 6， 8, 10, 12天后收 集細(xì)胞。使用Rneasy微型試劑盒(Qiagen)制備總RNA,進(jìn)行RT-PCR。首先， 對(duì)于1嗎總RNA,使用RNA PCR試劑盒(TAKARA)進(jìn)行cDNA合成。使 用相當(dāng)于10ng， 1 ng和O.l ng的cDNA為模板，在下述反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR。 10xExTaq 2 ]ul
2.5mMdNTP 1,6 pi
ExTaq 0.1 |al
lOOiaM引物 各為0.2iil cDNA 1 pi
蒸餾水 14.9 pi
94°C保溫2分鐘，然后于94°C反應(yīng)30秒，65°C反應(yīng)30秒，72。C反 應(yīng)2分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后，于72。C保溫2分鐘。 PCR中使用了下列引物。
TH:
gttcccaaggaaagtgtcagagttgg (SEQ ID NO:37) gaagctggaaagcctccaggtgttcc (SEQ ID NO:38) DAT: ctccgagcagacaccatgaccttagc (SEQ ID NO:39) aggagtagggcttgtctcccaacctg (SEQ ID NO:40) Nurrl: cactcctgtgtctagctgccagatgc (SEQ ID NO:41)agtgcgaacaccgtagtgctgacagg (SEQ ID NO:42)
Ptx3: tgagccgcaggtctgtggatccatcc (SEQ ID NO:43)
tccctgttcctggccttagtcctagg (SEQ ID NO:44)
Enl: atcctccgagtggacattcacatagg (SEQ ID NO:45)
atgtccagcaaatagagatcgctacac (SEQ ID NO:46) 另外，對(duì)于Nato3和Lmxla而言，使用的是實(shí)施例1中的引物。此外， 已知Ptx3和Enl是有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的標(biāo)記物。
結(jié)果，在ES細(xì)胞(CCE)和基質(zhì)細(xì)胞(PA6)中未檢測(cè)到Nato3 mRNA的表 達(dá)，但該結(jié)果表明作為誘導(dǎo)分化的結(jié)果，從第4天開(kāi)始，按照與Lmxla 相同的方式誘導(dǎo)表達(dá)，所述Lmxla是多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的標(biāo)記基 因(圖6)。
Nato3基因在通過(guò)Lrp4分選的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中 的表達(dá)
為了證實(shí)Nato3基因在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中表達(dá)，使用在多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)的Lrp4基因作為標(biāo)記物，分別從得自 12.5-日齡小鼠胚胎中腦的細(xì)胞和經(jīng)SDIA分化誘導(dǎo)的細(xì)胞中分離多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，并研究這些細(xì)胞中的Nato3 mRNA表達(dá)。
首先，將編碼Lrp4基因胞外區(qū)域(161-502氨基酸)的基因序列轉(zhuǎn)染至 293E細(xì)胞(ATCC)，表達(dá)并收集Lrp4蛋白的胞外區(qū)域。用收集的蛋白質(zhì)免 疫倉(cāng)鼠(得自SLC),然后，提取淋巴細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞(ATCC)融合，以獲 得能產(chǎn)生抗-Lrp4抗體的雜交瘤。
使用細(xì)胞分散緩沖液(Invitrogen)分散細(xì)胞群，該細(xì)胞群含有得自12.5-曰齡小鼠胚胎中腦，或在體外由ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì) 胞，然后，無(wú)需經(jīng)固定和透化處理，于4。C用抗-Lrp4單克隆抗體(稀釋至 1/2的培養(yǎng)物上清液，P/。胎牛血清(JRH), lmM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基 (Kawasaki et al. Neuron (2000)28(1):31-40))將細(xì)胞染色20分鐘。然后，于4。C 用1%胎牛血清和lmM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基洗滌3分鐘，共3次，于4。C 使用經(jīng)生物素標(biāo)記的抗-倉(cāng)鼠IgG抗體(Jackson, 10 ng/ml， 1%胎牛血清，lmM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)將細(xì)胞染色20分鐘，然后，按相同的方式進(jìn)行洗 滌。于4。C使用經(jīng)PE標(biāo)記的鏈霉親和素(Pharmingen, 20 [ig/ml， 1%胎牛血 清，lmMEDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)將細(xì)胞染色20分鐘，然后，按相同的方式進(jìn)行洗滌。染色后，通過(guò)細(xì)胞分選儀(FACS vantage SE, Becton Dickinson) 分離Lrp4陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞(圖7)。分離后，立即使用Rneasy微型試劑 盒(Qiagen)從細(xì)胞中制備總RNA，使用cDNA合成試劑盒(TAKARA)合成雙 鏈cDNA。用限制性酶RsaI(TAKARA)消化之后，在其中加入ad2,將ad2S 用作引物，通過(guò)15個(gè)PCR循環(huán)擴(kuò)增cDNA,并用作RT-PCR的模板。在下 述條件下進(jìn)行擴(kuò)增72。C保溫5分鐘，然后于94。C反應(yīng)30秒，65。C反應(yīng) 30秒，72。C反應(yīng)2分鐘，共15個(gè)循環(huán)，最后，于72。C保溫2分鐘。
接著，使用相當(dāng)于4ng、 0.4ng和0.04ng擴(kuò)增cDNA的cDNA為模板， 在下述反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR。
10xExTaq 1 (il
2.5 mM dNTP 0.8 pl
ExTaq 0.05 pl
100pM引物 各為0.1 pl
cDNA 1 jil
蒸餾水 6.95 pl
使用了具有上述序列的引物。
94。C保溫2分鐘之后，94。C30秒，65。C30秒，72。C2分鐘以進(jìn)行擴(kuò) 增反應(yīng)，最后，于72。C保溫2分鐘。對(duì)Lmxla和Nurrl進(jìn)行24個(gè)PCR擴(kuò) 增循環(huán)，對(duì)其它的進(jìn)行26個(gè)PCR擴(kuò)增循環(huán)。
結(jié)果，在得自12.5-日齡小鼠胚胎中腦的細(xì)胞中，Nato3 mRNA在Lrp4-陽(yáng)性細(xì)胞群體(即多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)中強(qiáng)表達(dá)(圖8)。另外，在SDIA 分化誘導(dǎo)細(xì)胞中，Nato3 mRNA在Lrp4-陽(yáng)性細(xì)胞群體中強(qiáng)表達(dá)(圖8)。因此 揭示出Nato3 mRNA在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞、SDIA分化誘導(dǎo)細(xì)胞以 及得自小鼠胚胎中腦的細(xì)胞中表達(dá)。
因此，本發(fā)明揭示出Nato3基因是有用的標(biāo)記物，它不僅可區(qū)分得自胚 胎中腦的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，還能區(qū)分在體外由ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化 成的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的多核苷酸探針或多核苷酸引物，所述探針或引物能與由Nato3基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成的多核苷酸雜交。
2. 根據(jù)權(quán)利要求
1的多核苷酸探針或多核苷酸引物，所述探針或引物 由含有Nato3基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的多 核苷酸組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求
1或2的多核苷酸探針或多核苷酸引物，其中Nato3 基因的核香酸序列含有部分或完整的選自由以下核苦酸序列組成的組的核 苷酸序列SEQ ID NO:l的核苷酸1-365和534-640、 SEQ ID NO:3的核苷 酸1-376和545-662、 SEQ ID NO:5的核香酸1-306和475-501 、 SEQ ID NO:7 的核苷酸1-377和546-886、 SEQIDNO:9的核普酸1-312和481-507、 SEQ ID NO: 11的核香酸1-306和475-501、 SEQ ID NO: 13的核苷酸1-306和 475-501、 SEQ ID NO:15的核苷酸1-177和346-372、 SEQ ID NO:17的核香 酸1-359和528-557、以及SEQIDNO:19的核苷酸1-357和523-552。
4. 根據(jù)權(quán)利要求
1至3中任一項(xiàng)的多核苷酸探針或多核普酸引物，其 長(zhǎng)度至少為15個(gè);成基。
5. 多核苷酸引物套，含有兩種或多種根據(jù)權(quán)利要求
1至4中任一項(xiàng)的 多核苷酸引物。
6. 抗Nato3蛋白或其部分的抗體,是用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增 殖祖細(xì)胞的抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求
6的抗體，其中Nato3蛋白或其部分含有選自下組的氨 基酸序列中的至少6個(gè)氨基酸殘基或其整個(gè)序列SEQ ID NO:2的氨基酸 1-102和159-166, SEQ ID NO:4的氨基酸1-102和159-166, SEQ ID NO:6 的氨基酸1-102和159-166, SEQ ID NO:8的氨基酸1-104和161-168, SEQ ID NO:10的氨基酸1-104和161-168, SEQ ID NO:12的氨基酸1-102和 159-166, SEQ ID NO:14的氨基酸1-102和159-166, SEQ ID NO:16的氨基 酸1-59和116-123， SEQIDNO:18的氨基酸1-101和158-164,以及SEQID NO:20的氨基酸1-119和176-183。
8. 檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的方法，其包括檢測(cè)Nato3基因表達(dá)的步驟。
9. 根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中檢測(cè)Nato3基因表達(dá)的步驟包括下述步驟(a) 使得自待測(cè)試細(xì)胞樣品的多核苷酸與根據(jù)權(quán)利要求
1至4中任一項(xiàng) 的多核苷酸探針接觸；和(b) 檢測(cè)雜交復(fù)合物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求
9的方法，其中在步驟(a)中，將制備自待測(cè)試細(xì)胞 樣品的mRNA或由該mRNA轉(zhuǎn)錄出的互補(bǔ)DNA(cDNA)與所述多核香酸4笨 針接觸。
11. 根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中檢測(cè)Nato3基因表達(dá)的步驟包括下 述步驟(c) 使用得自待測(cè)試細(xì)胞樣品的多核苷酸作為模板，并使用根據(jù)權(quán)利要 求1至4中任一項(xiàng)的多核苷酸引物或根據(jù)權(quán)利要求
5的多核苷酸引物對(duì)， 進(jìn)行核酸擴(kuò)增；和(d) 檢測(cè)所形成的擴(kuò)增產(chǎn)物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求
11的方法，其中在步驟(c)中，將制備自待測(cè)試細(xì) 胞樣品的mRNA或由該mRNA轉(zhuǎn)錄出的互補(bǔ)DNA(cDNA)用作模板。
13. 根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其中檢測(cè)Nato3基因表達(dá)的步驟包括下 述步驟(e) 使得自待測(cè)試細(xì)胞樣品的蛋白質(zhì)與根據(jù)權(quán)利要求
6或7的抗體接 角蟲(chóng)^ 和(f) 測(cè)定抗原-抗體復(fù)合物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求
9至13中任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)試細(xì)胞樣品是 經(jīng)誘導(dǎo)而向多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞分化的ES細(xì)胞。
15. 根據(jù)權(quán)利要求
14的方法，其中通過(guò)SDLA法進(jìn)行分化誘導(dǎo)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求
9至13中任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)試細(xì)胞樣品是 得自胚胎中腦腹側(cè)區(qū)域的細(xì)胞。
17. 根據(jù)權(quán)利要求
9至16中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)、步驟(c) 或步驟(e)中，將檢測(cè)到除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo) 記基因的表達(dá)的細(xì)胞用作待測(cè)試細(xì)胞樣品。
18. 根據(jù)權(quán)利要求
9至16中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)、步驟(d)或步驟(f)之后，還包括步驟(g),其檢測(cè)除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng) 元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求
17或18的方法，其中除Nato3基因以外的多巴胺 能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因是選自Lrp4基因、Msxl基因、Msx2基因和 Mashl基因中的至少 一個(gè)基因。
20. 用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的試劑盒，其至少含 有根據(jù)權(quán)利要求
1至4中任一項(xiàng)的多核苷酸探針。
21. 根據(jù)權(quán)利要求
20的試劑盒，其還包括能檢測(cè)除Nato3基因以外的 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的探針、引物、引物套或抗體。
22. 用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的試劑盒，其至少含 有根據(jù)權(quán)利要求
1至4中任一項(xiàng)的多核苷酸引物或根據(jù)權(quán)利要求
5的多核 苦酸引物套。
23. 根據(jù)權(quán)利要求
22的試劑盒，其還包括能檢測(cè)除Nato3基因以外的 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的探針、引物、引物套或抗體。
24. 用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的試劑盒，其至少含 有根據(jù)權(quán)利要求
6或7的抗體。
25. 根據(jù)權(quán)利要求
24的試劑盒，其還包括能檢測(cè)除Nato3基因以外的 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的探針、引物、引物套或抗體。
26. 篩選物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)能有效誘導(dǎo)生成多巴胺能神經(jīng)元增殖 祖細(xì)胞的分化過(guò)程，所述方法包括下述步驟(i) 使能分化成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞與待測(cè)試的物質(zhì)接 觸；和(ii) 檢測(cè)與待測(cè)試物質(zhì)接觸后的細(xì)胞中的Nato3基因表達(dá)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求
26的方法，其還包括下述步驟(iii) 在與待測(cè)試物質(zhì)接觸后的細(xì)胞中檢測(cè)除Nato3基因以外的多巴胺 能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)。
28. 根據(jù)權(quán)利要求
27的方法，其中除Nato3基因以外的多巴胺能神經(jīng) 元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記基因是選自L卬4基因、Msxl基因、Msx2基因和Mashl 基因中的至少一個(gè)基因。
29. 制備多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的方法，包括下述步驟(iv) 獲得多個(gè)細(xì)胞，其中含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞；(v) 使用根據(jù)權(quán)利要求
8至19中任一項(xiàng)的方法檢測(cè)或選擇多巴胺能神 經(jīng)元增殖^L細(xì)月包；和(vi) 培養(yǎng)步驟(v)中檢測(cè)到或選出的細(xì)胞。
30. 多核苷酸用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的用途，所 述多核苷酸能與由Nato3基因的核苦酸序列組成的多核苦酸或其互補(bǔ)序列 雜交多巴胺能神經(jīng)元。
31. 根據(jù)權(quán)利要求
30的用途，其中能雜交的多核苷酸由Nato3基因核 苷酸序列或其互補(bǔ)序列中至少I(mǎi)O個(gè)連續(xù)核苷酸的序列組成。
32. 根據(jù)權(quán)利要求
30或31的用途，其中Nato3基因的核香酸序列含 有部分或完整的選自由以下核苷酸序列組成的組的核苷酸序列SEQ ID NO:l的核香酸1-365和534-640、 SEQIDNO:3的核苷酸1-376和545-662、 SEQ ID NO:5的核苷酸1-306和475-501、 SEQ ID NO:7的核苷酸1-377和 546-886、 SEQ IDNO:9的核苷酸1-312和481-507、 SEQIDNO:ll的核苦酸 1-306和475-501、 SEQ ID NO:13的核苷酸1-306和475-501 、 SEQIDNO:15 的核香酸1-177和346-372、 SEQ ID NO: 17的核苷酸1-359和528-557、以 及SEQ ID NO: 19的核苷酸1-357和523-552。
33. 根據(jù)權(quán)利要求
30至32中任一項(xiàng)的用途，其中能雜交的多核苷酸 的長(zhǎng)度至少為15個(gè)堿基。
34. 抗Nato3蛋白或其部分的抗體用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增 殖祖細(xì)胞的用途。
35. 根據(jù)權(quán)利要求
34的用途，其中Nato3蛋白或其部分含有選自下組 的氨基酸序列中的至少6個(gè)氨基酸殘基或其整個(gè)序列SEQ ID NO:2的氨基 酸1-102和159-166, SEQIDNO:4的氨基酸1-102和159-166, SEQIDNO:6 的氨基酸1-102和159-166， SEQIDNO:8的氨基酸1-104和161-168, SEQ ID NO:10的氨基酸1-104和161-168, SEQ ID NO:12的氨基酸1-102和 159-166, SEQ ID NO:14的氨基酸1-102和159-166, SEQ ID NO:16的氨基 酸1-59和116-123, SEQ ID NO:18的氨基酸1-101和158-164，以及SEQID NO:20的氨基酸1-119和176-183。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明提供了用于檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的探針、引物和抗體。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的多核苷酸探針和多核苷酸引物，所述探針和引物能與由Nato3基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交，本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的抗Nato3蛋白的抗體。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN101292031SQ200680038868
公開(kāi)日2008年10月22日 申請(qǐng)日期2006年8月18日
發(fā)明者中川康子, 中谷智哉, 坂本佳正, 尾野雄一 申請(qǐng)人:衛(wèi)材R&D管理有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan