專利名稱：:急性排斥反應中的mdr1snp的制作方法急性排斥反應中的MDR1SNP本發(fā)明涉及腎移植急性排斥反應的標記。腎移植通常伴隨移植體的急性排斥反應。鑒定免疫調(diào)節(jié)基因中的基因多態(tài)性將是有利的，這將用來預測個體不良移植后結(jié)果的風險，以及預觀t哪些患者更易產(chǎn)生不良副作用和/或哪些患者更可能發(fā)展成更嚴重疾病狀態(tài)和腎衰竭。此外，由于在靶標中或藥物的生物合成和代謝途徑中的遺傳變異可影響個體對治療的反應，與霉酚酸酯(MMF)或環(huán)孢素(CsA)代謝相關(guān)的基因多態(tài)性將用作預測對治療反應的標記。本發(fā)明基于多抗病性1(MDR1)基因座(C3435T)中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與腎移植排斥反應的相關(guān)性。該基因座對應于SeqIDNo.l的第176位。此位置上的多態(tài)性由下列組成即MDR1基因座外顯子26中此位置上的核苷酸C被T替換。MDR1是參與多抗病性的ABC轉(zhuǎn)運蛋白。已表明MDR1C3435T多態(tài)性與P-糖蛋白的表達水平和功能的差異以及增強的CsA清除相關(guān)。本發(fā)明涉及在患者中預測腎移植排斥反應的方法，其包括a)從已從患者中移取的樣品中分離核酸，和b)檢測SeqIDNo.1的第176位上存在的核苷酸，其中此位置上T的存在指示了腎移植排斥反應，以及c)任選檢測用于預測急性腎移植排斥反應的一種或多種的其他標記。該任選的一種或多種標記可以是存在于其他基因中的多態(tài)性。優(yōu)選地，上述方法的步驟c)包括檢測存在于Seq.IDNo.5第682位的核苷酸(-5920A)，其中此位置上A的存在指示了腎移植排斥反應，和/或檢測存在于SeqlDNo.6第3757位上的核苷酸(T3757C)，其中此位置上C的存在指示了腎移植排斥反應。SeqIDNo.5是指人白細胞介素10(ILIO)基因的啟動子序列。SeqIDNo.6是指人肌苷一磷酸脫氫酶2(IMPDH2)基因的外顯子1至13。優(yōu)選地，用于上述方法的樣品是全血。該樣品也可以是血清或血漿。可通過適合于基因分型的任何方法進行上文描述的核苷酸檢測。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法是雙脫氧序列分析。一個更優(yōu)選的方法是循環(huán)測序。在另一優(yōu)選實施方案中，該方法是使用只對一個等位基因退火而不對另一個等位基因退火的等位基因特異性引物進行的定量等位基因特異性PCR。一個這樣的定量PCR是動力熱循環(huán)(kineticthermalcycling，KTC)。一個更優(yōu)選的檢測法是與KTC一起的擴增受阻突變系統(tǒng)，該檢測法可用來在單管中分辨單核苷酸多態(tài)性(SNP),而不必用熒光探針(Higuchi等人，Biotechnology(1993),11，1026-1030)。檢測核苷酸的優(yōu)選方法是定量PCR。更優(yōu)選地該定量PCR是等位基因特異性定量PCR。為了使用上述方法檢測MDR1多態(tài)性，在最優(yōu)選的實施方案中使用SeqIDNo.7和SeqIDNo.8的等位基因特異性引物以及SeqIDNo.9的通用引物進行該等位基因特異性PCR。對于上述IL10多態(tài)性的其他任選檢測，最優(yōu)選的實施方案包括使用SeqIDNo.2和SeqIDNo.3的等位基因特異性引物以及SeqIDNo.4的通用引物進行等位基因特異性PCR。當上文中描述的方法包括聯(lián)合檢測SEQIDNo.1的第176位的MDR1基因核苷酸和SeqIDNo.5的第682位的IL10基因核苷酸，或聯(lián)合檢測SEQIDNo.1的第176位的MDR1基因核苷酸、SeqIDNo.5的第682位的IL10基因核普酸和SeqIDNo.6的第3757位的IMPDH2基因核苷酸時，上文中所描述方法的最優(yōu)選實施方案包括使用SeqIDNo.2和SeqIDNo.3的等位基因特異性引物和SeqIDNo.4的通用引物，來對上文中描述的IL10基因核苷酸進行方法的步驟c)?？梢栽谕环N反應混合物或在分開的反應混合物中進行上文所述方法的步驟c)中的額外任選的檢測。優(yōu)選地，用于上述方法的樣品是全血。該樣品也可以是血清或血漿。可通過適合用于基因分型的任何方法進行上文中該的核苷酸檢測?？赏ㄟ^差異核酸分析技術(shù)確定上述IMPDH2核酸序列中多態(tài)性的存在，該技術(shù)例如限制性片段長度多態(tài)性分析、使用質(zhì)鐠的PCR產(chǎn)物的直接質(zhì)量分析、侵入性分裂產(chǎn)物的直接分析(directanalysisofinvasivecleavageproduct)、基于延伸的技術(shù)例如ARMS(擴增受阻突變系統(tǒng))、ALEX(擴增受阻突變系統(tǒng)線性延伸)和COPS(竟爭性寡核苷酸引發(fā)系統(tǒng))、OLA(寡核苷酸連接測定)、侵入測定(Invaderassay)、直接序列分析或聚合i!H式反應分析。在一個優(yōu)選實施方案中，該方法是雙脫氧序列分析。一個更優(yōu)選方法是熱循環(huán)序列分析。對于上文描述的IMPDH2多態(tài)性的檢測，在最優(yōu)選實施方案中，使用SeqIDNo.10和SeqIDNo.11的引物進行該序列測定。檢測任一種多態(tài)性的核苷酸的優(yōu)選方法是定量PCR。在更優(yōu)選的實施方案中，該方法為使用只對一個等位基因而不對另一個等位基因退火的等位基因特異性引物的定量等位基因特異性PCR。一種這樣的定量PCR是動力熱循環(huán)(KTC)。一種更優(yōu)選檢測法是與KTC一起的擴增受阻突變系統(tǒng)(ARMS),該檢測法可用來在單管中分辨單核苷酸多態(tài)性(SNP)，而不用熒光探針(Higuchi等人，Biotechnology(1993)，11，1026-1030)。可以使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的多種差異核酸分析技術(shù)中的任一種來檢測不同于正常序列的核酸序列的存在。差異核酸分析技術(shù)包括但不限于熒光原位雜交(FISH)、直接的DNA測序、單鏈構(gòu)象分析(SSCP)、包括限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)的Southern印跡、聚合H^式反應(PCR)、多態(tài)性特異性寡核苷酸雜交和PCR-SSCP分析。關(guān)于評測和操作核酸和M酸序列的技術(shù)綜述，參見CurrentProtocolsInMolecularBiology,第I-III巻，F(xiàn)rederickM.Ausubel等人(編著)，1995。雜交法包括但不限于，反向點雜交法(Reversedotblot)、基因芯片孩t陣列分析(GeneChipmicroarray)、DASH、PNA和LNA探針、TaqMan和分子信標；等位基因特異性PCR包括但不限于，嵌入染料、FRET引物和ALphaScreen;引物延伸包括但不限于，SNPstream/GBA(geneticbit分析)、多重微測序法(multiplexminisequencing)/SNaPshot、焦確酸領(lǐng)'J序法(Pyrosequencing)、MassEXTEND/MassArray、GOOD測定法、微陣列微測序法/APEX(陣列引物延伸(arrayedprimerextension))、孩支陣列引物延伸、'標簽，測定法、編碼微球法、TDI(模板指導的整合)/熒光偏振法；寡核苷酸連接法包括但不限于，比色OLA法(寡核苷酸連接測定)、序列編碼的OLA法、微陣列連接法、連接,式反應、持鎖探針、滾環(huán)擴增；內(nèi)切核酸酶裂解法包括但不限于，限制性位點分析和侵入測定。這些方法描述于Syvanen，NatureRevGenet2,2001,930-942和本文引用的參考資料中。用于高標記復雜度(highmarkercomplexity)的多重平臺包括但不限于，基于小珠的多重基因分型、用于基因分型的高密度微陣列分析、再測序平臺(re-sequencingplatform)、基于孩吏陣列的差異基因表達分析。這些方法描述于Koch，NatureRevDrugDiscovery3，2004，749-761和本文引用的參考資料中。也可使用上面列出的方法的組合(例如作為非限定性實例，分子倒位揮:針與陣列雜交的組合，Hardenbol等人，Nat.Biotechnol.2003,21，673-678)。可使用許多方法直接檢測DNA序列變異。直接DNA測序(人工測序或自動化熒光測序)可檢測序列變異。除了雙脫氧序列分析外，也可使用焦磷酸測序?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)克隆待檢測個體MDR1區(qū)域中基因的等位基因。例如，從個體獲得血液樣品，將MDRl基因組DNA從此樣品中的細胞分離出來，并且連接入用于擴增的合適載體。然后可確定克隆的序列并將其與正常的MDR1序列比較。關(guān)于DNA克隆和測序的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，參見例如，CurrentProtocolsInMolecularBiology,第1巻，第7單元，F(xiàn)rederickM.Ausubul等人(編著)，1995。檢測DNA序列變異的另一種方法是單鏈構(gòu)象多態(tài)性測定法(SSCP)(Orita等人，1989)。該方法不檢測所有的序列改變，特別是當DNA片段大小大于200bp時，但可經(jīng)最優(yōu)化以檢測絕大部分的DNA序列變異。降低的檢測靈敏度是不利的，但在研究基礎上，SSCP的可能增加的通量使之成為對多態(tài)性檢測直接測序的吸引人的、可行的選擇。對在SSCP凝膠上具有動態(tài)遷移率的片段進行測序以確定DNA序列變異的確切性質(zhì)?；趦蓷l互補DNA鏈之間的錯配檢測的其他方法包括夾變性凝膠電泳(clampeddenaturinggelelectrophoresis，CDGE)(Sheffield等人，Am.J.Hum.Genet.，49:699-706(1991))、異源雙鏈分析(NA)(Mite等人，Genomics12:301-306(1992))和化學錯配裂解法(CMC)(Grompe等人，P.N.A.S.86:5855-5892(1989))?？赡軝z測這些類型的多態(tài)性的其他方法例如蛋白質(zhì)截短測定或不對稱測定法只檢測特定類型的多態(tài)性，而不檢測錯義多態(tài)性。目前可用的檢測DNA序列變異的方法的綜述可見于Grompe等人，NatureGenetics5:111-117，(1993)和Landegren等人，GenomeResearch8:769-776，(1998)的最近綜述?？墒褂肦FLP進行檢測DNA序列中多態(tài)性的快速預備性分析，其中使用一種或多種限制酶(優(yōu)選用許多種限制酶)切割DNA，然后在一系列Southern印跡中用IMPDH2、IL10或MDR1特異性探針對其進行分析。每一個印跡包含一系列正常個體和一系列具有異常骨形成的病例。顯示雜交片段(當用靠近或包含已知的多態(tài)基因座的序列探測時長度不同于對照DNA)的Southern印跡顯示可能的多態(tài)性。涉及RFLP的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，參見，例如，CurrentProtocolsInMolecularBiology,第1巻，第2單元，F(xiàn)rederickM.Ausubul等人(編著)，1995。限制性片段長度多態(tài)性分析因其能夠鑒定未表征的多態(tài)性而成為優(yōu)選的分析方法。特別地，通過只使用來自MDR1不同區(qū)域的序列作為探針，本領(lǐng)域技術(shù)人員可評測用于本文公開的MDR1C3435T多態(tài)性的核酸樣品，或備選地，該核酸樣品包括本文鑒定的或通過本領(lǐng)域熟知的染色體步行技術(shù)分離的近似序列。參見例如Ueghara等人，Mamm.Genome1(2):92-99(1991)。使用聚合酶驅(qū)動的擴增的核酸分析的特別優(yōu)選方法是聚合酶鏈式反應(PCR)。聚合酶鏈式反應和其他聚合酶驅(qū)動的擴增測定法可以通過使用聚合酶驅(qū)動的擴增循環(huán)實現(xiàn)超過百萬倍的拷貝數(shù)增加。在擴增后，可以將得到的核酸通過限制性內(nèi)切核酸酶消化來分析，測序或用作DNA探針的底物。當包含特定多態(tài)性的序列是已知的時，可產(chǎn)生靶向這些序列的多種PCR引物。例如，可使用側(cè)翼連接多態(tài)性的序列擴增這些序列。對于序列特異性PCR的變異，可使用在其3，端與MDR1C3435T多態(tài)性雜交的引物。如果特定的多態(tài)性不存在，則不能觀察到擴增產(chǎn)物。也可使用如歐洲專利申請公開號0332435和Newton等人，1989中公開的擴增受阻多態(tài)性系統(tǒng)(ARMS),然后使用常規(guī)技術(shù)通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析擴增產(chǎn)物以鑒定任何差異，然后對這些產(chǎn)物進行測序并將其與正常基因序列比較。其他合適的擴增法包括連接酶鏈式反應(LCR)(參見Wu和Wallace,Genomics4:560(1989)，Landegren等人,Science241:1077(1988))、轉(zhuǎn)錄擴增(Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美國86:1173(1989))、和自動維持序列擴增(Guatelli等人，Proc.Nat.Acad.Sci.美國87:1874(19卯))以;^于核酸的序列擴增(NASBA)。后兩種擴增法包括基于等溫轉(zhuǎn)錄的等溫反應，該方法分別以大約30或100比1的比率產(chǎn)生了作為擴增產(chǎn)物的單鏈RNA(ssRNA)和雙鏈DNA(dsDNA)。本發(fā)明的引物對可用于使用PCR確定特定MDR1序列的核苷酸序列。例如，可將單鏈DNA引物對與MDR1序列內(nèi)的序列或圍繞MDR1序列的序列退火以引發(fā)擴增基因本身的DNA合成。這些引物的完整組可用于基因編碼性序列的所有核苷酸的合成。引物組優(yōu)選可用于合成內(nèi)含子和外顯子序列。此外，也可使用等位基因特異性引物。此類引物只對其中C3435被T替換的MDR1等位基因退火，從而將只在突變等位基因作為模板存在的情況下擴增產(chǎn)物。也可使用等位基因特異性探針篩選已使用PCR擴增的MDR1區(qū)域的DNA序列。這些探針是核酸寡聚物，其每個都包含具有C3435T多態(tài)性的基因序列的區(qū)域。例如，一個寡聚物可以是大約20個核苷酸長，對應于MDR1多態(tài)序列的一部分。可在例如尼龍濾器上進行等位基因特異性探針與擴增的MDR1序列的雜交。在嚴格雜交條件下對特定探針的雜交表明組織中存在與等位基因特異性探針相同的多態(tài)性。檢測多態(tài)性的另一個優(yōu)先使用的方法包括使用質(zhì)鐠法。在對包含MDR1C3435T多態(tài)性的DNA序列進行PCR擴增后，使用在目的多態(tài)性上游一個M處結(jié)束的引物進行內(nèi)部引物延伸反應。通過在引物延伸反應中只使用雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，引物只延伸代表多態(tài)性的一個堿基。直接使用MALDI-TOF(基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時間)質(zhì)鐠法確定延伸的引物的確切質(zhì)量，雜合子產(chǎn)生2個可被明確區(qū)分的峰。也可通過質(zhì)傳法或通過基于熒光的方法檢測侵入性裂解產(chǎn)物?；谔囟ǖ慕Y(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切核酸酶(裂解酶)識別特異性DNA結(jié)構(gòu)(通過特異性雜交產(chǎn)生的)的能力檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)。將侵入性探針和標記的信號探針設計為與靶標DNA雜交，從而侵入性探針通過至少一個代表SNP位點的堿基與信號探針重疊。信號-探針靶標雙鏈體的這種侵入替換了包含標記的單鏈副翼(single-strandedflap)。副翼和部分侵入雙鏈體之間的接合點只有在切割位點上有互補對的情形中才被酶識別并切割，從而釋放信號探針的未雜交區(qū)域?？扇缟纤龌蛲ㄟ^直接凝膠分析或針對片段上的標簽的酶聯(lián)抗體實現(xiàn)切割的片段的檢測。在切割后，新信號探針雜交并重復該過程，從而使切割的信號探針聚集。因此以該方式擴增信號，并且該擴增增加了該技術(shù)的總體靈敏性。反之亦然，可將包含幾種多態(tài)性的寡核苷酸固定在尼龍濾器("SNP帶")上，并將其與從個體DNA獲得的多重PCR反應產(chǎn)物雜交以進行等位基因特異性雜交(Cheng等人，Clin.Chem.Lab.Med.(1998)36(8):561-566，RMS，Alameda)。大多數(shù)上迷診斷測定法包括作為關(guān)鍵元件的核酸探針。當將探針用于檢測靶標序列的存在時，可處理待分析的生物樣品例如血液或血清以提取核酸。如上面所討論的，可以以各種方法例如變性、限制性消化、電泳或斑點印跡法制備樣品核酸以有助于靶標序列的檢測。分析物核酸的被把向區(qū)通常必須是至少部分單鏈，從而與探針的靶向序列形成雜交體。如果序列是天然單鏈，則不需要變性。但是如果序列是雙鏈，可能需要對序列進行變性?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)進行變性?？稍诖龠M探針中的靶標序列與分析物中的假定被靶向序列形成穩(wěn)定雜交體的條件下孵育靶標核酸、探針和分析物。可將用于結(jié)合分析物的探針區(qū)域制備為與人MDR1基因的被耙向區(qū)完全互補。因此，需要高等嚴格性條件以防止假陽性。然而，只有在探針與在基因組中唯一的染色體區(qū)域互補時，才^f吏用高等嚴格性的條件。雜交的嚴格性由雜交期間和洗滌過程中的許多因素所確定，包括溫度、離子強度、堿基組成、探針長度和曱酰胺的濃度。這些因素概述于例如Maniatis等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,1982和Sambrook等人，1989中。在某些情況下，希望形成更高級雜交體例如三鏈體、四鏈體等，以提供檢測靶標序列的方法。除了威基組成、互補鏈的長度和雜交核酸之間的核苷酸堿基錯配的數(shù)目外，核酸雜交還受到這些條件如鹽濃度、溫度或有機溶劑的影響，這些是容易為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的。嚴格溫度條件通常包括超過30C、一般超過37'C，并且優(yōu)選超過45'C的溫度。嚴格鹽條件通常低于1000mM，一般低于500mM，并且優(yōu)選低于200mM。但是參數(shù)的組合遠比任何單個參數(shù)的量度重要。探針序列也可在某些條件下與雙鏈體DNA特異性雜交，從而形成三鏈體或其他更高級的DNA復合物。此類探針的制備和合適的雜交條件在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。通常通過使用標記的探針檢測所得的雜交體(如果有的話)。備選地，探針可以不被標記，但可通過與被標記的配體特異性結(jié)合而被直接或間接地檢測到。合適的標記和用于標記探針和配體的方法在本領(lǐng)域是已知的，其包括，例如，可通過已知方法(例如，切口平移、隨機引發(fā)或激酶法)摻入的放射性標記、生物素、熒光基團、化學發(fā)光基團(例如，二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane),特別是被觸發(fā)的二氧雜環(huán)丁烷)、酶、抗體等。該基本方案的變通方案在本領(lǐng)域是已知的，并且包括有助于將待檢測的雜交體與外來材料分離和/或放大來自被標記的部分的信號的那些變通方案。許多這樣的變通方案綜述于例如Matthews&Kricka，Anal.Biochem.，169:1，1988;Landegren等人，Science,242:229，1988;Mittlin，1989;美國專利號4,868,105;和EPO公開號225,807中?？赏ㄟ^與多核苷酸探針雜交來檢測具有與急性腎移植排斥反應相關(guān)的具有多態(tài)性的核酸序列，該探針在嚴格至中等嚴格的雜交和洗滌條件下與靶標序列的核酸序列形成穩(wěn)定的雜交體。本發(fā)明允許設計優(yōu)先對多態(tài)性區(qū)域雜交的探針。優(yōu)先靶向特定序列的探針的設計和它們使用的雜交條件在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。參見例如CurrentProtocolsInMolecularBiology,第I-III巻，F(xiàn)rederickM.Ausubel等人，編著，1995。例如，如果期望探針對靶標序列完全互補，那么使用嚴格性條件。如果期望存在一些錯配，例如如果預期存在變體使得探針不完全互補，那么可降低雜交嚴格性。為了使噪聲減少至最小，選擇排除非特異性/偶然性結(jié)合的條件。用于IMPDH2、IL10或MDR1基因中多態(tài)性的探針可以是任何合適的長度，該探針靠近或^t跨整個或部分的多態(tài)性并且允許對該區(qū)域優(yōu)先雜交。如果靶標序列包含與探針的序列相同的序列，探針可以是短的，例如在大約8至30個g對的范圍內(nèi)，因為即使在嚴格性條件下，雜交體也將是相對穩(wěn)定的。如果預期與探針具有一定程度的錯配，即，如果懷疑探針將與變體區(qū)域雜交，那么可使用以所需特異性與靶標序列雜交的更長的探針。探針可包括連接標記或報告分子的分離的多核苷酸并且可以通過標準方法用于分離具有與目的序列相似或相似序列的其他多核苷酸序列。關(guān)于用于制備和標記探針的技術(shù)參見例如Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1992?？赏ㄟ^使用同源多核苷酸選擇其他相似的多核苷酸。包含本發(fā)明的合成寡核苷酸或其他多核苷酸的探針可從天然發(fā)生的或重組的單鏈或雙鏈多核苷酸產(chǎn)生，或通過化學方法合成。也可通過切口平移、克列諾填充反應(Klenowfill-inreaction)或本領(lǐng)域已知的其他方法標記探針。具有優(yōu)先結(jié)合靶標特異性序列的適當大小和序列的探針的設計以及它們所用的雜交條件在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。參見，例如，CurrentProtocolsInMolecularBiology,第1巻，第2、4和6單元，F(xiàn)rederickM.Ausubel等人(編著)，1995。來自多態(tài)性序列的具有至少大約8個核苷酸，通常至少大約15個核苷酸，并且少于大約6kb，通常少于大約l.Okb的多核苷酸序列的部分優(yōu)選用作揮:針。也包括具有多態(tài)性序列的特異性部分的揮:針。此外，也可將與多態(tài)性區(qū)域相似的探針用于評測核酸樣品。如上面所指出的，本發(fā)明涵蓋許多基于非pcr的篩選測定法。一個方法是將核酸探針(或類似物例如替代正常磷酸二酯鍵的膦酸甲基酯主鏈)與以低濃度存在的DNA靶標雜交。該探針可具有共價連接至該探針的酶，從而使共價鍵不干擾雜交的特異性。然后可將該酶-探針-綴合物耙標核酸復合物與游離探針酶綴合物分離，然后加入底物以進行酶檢測。酶促活性觀察為顯色或光輸出量的改變，這使得靈敏性增加。關(guān)于涉及寡聚脫氧核苷酸-堿性磷酸酶綴合物的制備和它們作為雜交探針的用途的實例參見Jablonski等人，N.A.R.，14:6115-6128,1986。兩步驟標記擴增方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。這些測定法基于這樣的原理工作，即小配體(例如地高新配基、生物素等)連接至能夠特異性結(jié)合MDR1基因區(qū)域序列的核酸探針。等位基因特異性4果針也包括在本實例的范圍內(nèi)，并且示例性等位基因特異性探針包括包含本專利申請的預先確定的多態(tài)性的探針。在一個實例中，連接至核酸探針的小配體被抗體-酶綴合物特異性識別。在該實例的一個實施方案中，將地高新配基附著至核酸探針。通過綴合至堿性磷酸酶綴合物的抗地高新配基抗體檢測雜交。堿性磷酸酶修飾化學發(fā)光底物，然后該底物可被檢測。關(guān)于用于標記根據(jù)本實施方案的核酸探針的方法參見Martin等人，BioTechniques9:762-768，19卯。在另一個實例中，小配體由能夠特異性結(jié)合第一配體的第二配體-酶綴合物識別。本實例的眾所周知的實施方案是生物素-抗生物素蛋白類型的相互作用。關(guān)于標參見Nguyen等人，BioTechniques13:116-123,1992。本發(fā)明的核酸探針測定法可使用能夠檢測IMPDH2、IL10和MDR1多態(tài)性的核酸探針的組合，這也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此，在檢測多態(tài)性在細胞樣品中存在的一個實例中，使用超過一種對該基因互補的探針并且特別地不同探針的數(shù)目可選擇地是兩種或三種不同的核酸探針序列?；旌衔锇軌蚪Y(jié)合等位基因特異性多態(tài)性的探針，該等位基因特異性多態(tài)性是在患者(該患者在該區(qū)域具有變異)群體中鑒定的。在本實施方案中，可使用任何數(shù)目的探針，該探針優(yōu)選包括對應于患有急性腎移植排斥反應的患者中的大部分多態(tài)性的探針。上述檢測多態(tài)性的任一種方法也可用于上文中描述的IMPDH2和IL10多態(tài)性的《壬選檢測。"多核苷酸，，和"核酸"是指單鏈或雙鏈分子，其可以是由核苷酸堿基A、T、C和G組成的DNA或包含堿基A、U(T的替代物)、C和G的RNA。多核苷酸可代表編碼鏈或其互補鏈。多核苷酸分子在序列上可以與天然存基酸的備選密碼子(參見，Lewin"GenesV"OxfordUniversityPress第7章，第171-174頁(1994)。此外，多核苷酸分子可包含表示上述氨基酸的保守性取代的密碼子。多核普酸可表示基因組DNA或cDNA。核酸也可以是合成產(chǎn)生的DNA(例如，PCR擴增的產(chǎn)物)。本文所用的"特異性雜交，，是指第一核酸的以使第一核酸不與除了第二核酸外的任何核酸雜交(例如，當?shù)谝缓怂釋Φ诙怂峋哂斜绕渲袑⑦M行雜交的樣品中的任何其他核酸更高的相似性時)的方式與第二核酸雜交的能力。用于雜交的"嚴格性條件"是本領(lǐng)域的術(shù)語，是指孵育和洗滌條件，例如這樣的溫度和緩沖液濃度，即它們允許特定的核酸與第二核酸雜交；第一核酸可完全(即，100%)與第二核酸互補，或第一核酸與第二核酸可享有小于完全互補(例如，70%、75%、85%、95%)的一定程度的互補性。例如，可使用將完全互補的核酸與具有較少互補性的核酸區(qū)分開的某些高等嚴格性條件。在CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel，F(xiàn).M.等人,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&Sons,(2001)，其全部教導在本文引用作為參考)中的第2.10.1-2.10.16和第6.3.1-6.3.6頁中解釋了用于核酸雜交的"高等嚴格性條件"、"中等嚴格性條件"和"低等嚴格性條件"。確定雜交的嚴格性的確切條件不僅僅取決于離子強度(例如，0.2xSSC、O.lxSSC)、溫度(例如，室溫、42°C、68。C)和去穩(wěn)定劑例如甲酰胺的濃度或變性劑例如SDS的濃度，還取決于諸如核酸序列的長度、組成、雜交序列之間的錯配百分比和該序列的亞型在其他非同一性序列內(nèi)發(fā)生的頻率的因素。因此，可通過改變一個或多個這些參數(shù)同時保持兩個核酸分子之間的同一性或相似性的相似程度來確定相當?shù)臈l件。通常，使用條件為以使相互之間的至少大約60%,至少大約70%，至少大約80%,至少大約90%或至少大約95%或更加同一的序列保持相互雜交。通過將雜交條件從無雜交發(fā)生時的嚴格性水平改變至第一次觀察到雜交時所處的水平，可確定允許給定的序列與樣品中最相似序列雜交(例如，選擇性地)的條件。示例性條件描述于Krause，M.H.和S.A.Aaronson，MethodsinEnzymology200:546-556(1991)，和Ausubel，等人，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWUey&Sons,(2001)中，該文獻資料描述了用于中等或低等嚴格性條件的洗滌條件的確定。洗滌是其中通常設置條件以確定雜交體的最低互補水平的步驟。通常，從只有同源性雜交發(fā)生的最低溫度開始，最終洗滌溫度每減少1°C(保持ssc濃度恒定)將使得雜交的序列之間的最大錯配程度增加1%。通常，SSC的濃度加倍導致L減少17。C。通過使用這些指導方針，根據(jù)所搜尋的錯配水平，可經(jīng)驗性地確定用于高、中或低等嚴格性的洗滌溫度。例如，低等嚴格性洗滌可包括室溫下在包含0.2xSSC/0.1。/。SDS的溶液中洗滌10分鐘；中等嚴格性洗滌可包括42°C下在預溫熱(42。C)的包含0.2xSSC/0.1%SDS的溶液中洗滌15分鐘；并且高等嚴格性洗滌可包括68。C下在預溫熱(68。C)的包含0.1xSSC/0.1%SDS的溶液中洗滌15分鐘。此外，可重復或連續(xù)地進行洗滌以獲得本領(lǐng)域內(nèi)已知的期望結(jié)果。如在本領(lǐng)域內(nèi)已知的，可通過改變作實例給出的一個或多個參數(shù)，同時保持靼標核酸分子與使用的引物或探針之間的同一性或相似性的相似程度來確定相當?shù)臈l件。在相關(guān)方面，將本發(fā)明的核酸片段在測定法例如本文描述的測定法中用作探41"或引物。叫采針，，或"引物，，是以堿基特異性方式與核酸分子的互補鏈雜交的寡核苷酸。這類探針和引物包括如在Nielsen等人，Science254:1497-1500(1991)中所描述的多肽核酸。探針或引物包含核苷酸序列的區(qū)域，該區(qū)域與核酸分子的至少大約15個，例如大約20至25個，以及在某些實施方案中大約40、50或75個連續(xù)核苷酸雜交，該核酸分子包含來自SeqIDNo.1(其中第176位上的C被T置換)的連續(xù)核苷酸序列?？墒褂脴藴实姆肿由飳W技術(shù)和本文提供的序列信息鑒定和分離本發(fā)明的核酸分子，例如上述核酸分子。例如，可使用基于SeqIDNo.1、5或6或這類序列的互補序列設計的合成寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈式反應擴增和分離核酸分子。一般參見PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification(H.A.Erlich編著，F(xiàn)reemanPress,NY,NY,1992);PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis等人編著，AcademicPress,SanDiego,CA，1990);Mattila等人，Nucl.AcidsRes.19:4967(1991);Eckert等人，PCRMethodsandApplications1:17(1991);PCR(McPherson等人編著,IRLPress,Oxford);和美國專利4,683,202?？墒褂胏DNA、mRNA或基因組DNA作為才莫板擴增核酸分子，將該擴增的核酸分子克隆入合適的載體，然后通過DNA序列分析進行表征。為實現(xiàn)用于評估患者對急性腎移植排斥反應易感性的方法，本發(fā)明也涉及試劑盒，該試劑盒包含至少一種用于檢測MDR1基因中的C3435T多態(tài)性的試劑、說明了根據(jù)上文中描述的評測對急性腎移植排斥反應易感性的任一種方法的步驟的說明書和用于試劑盒內(nèi)容物的容器。在優(yōu)選的實施方案中，至少一種用于檢測MDR1基因中的C3435T多態(tài)性的試劑包含能夠與SeqIDNo.l的核酸或其中第176位上的核苷酸C被T置換的SeqIDNo.l的核酸特異性雜交的核酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該至少一種用于檢測MDR1基因中的C3435T多態(tài)性的試劑包含核酸引物，其在嚴格性條件下與SeqIDNo.1雜交和可用于包含第176位的SeqIDNo.1的部分的PCR擴增。這類核酸可以是SeqlDNo.7、8和/或9的核酸。在更優(yōu)選實施方案中，試劑盒額外地包含至少一種檢測IL10基因中的-592>人多態(tài)性和/或IMPDH2基因中的T3757C多態(tài)性的試劑。在最優(yōu)選的實施方案中，試劑盒包含SeqIDNo.7至9和/或2至4和/或10至11的核酸。實施例實施例1分組描述(Cohortdescription)在參與CAESAR臨床研究的536名患者中的237名同意本文描述的藥物遺傳學研究的高加索人移植患者的組中進行分析。CAESAR是12個月的、開放標記的、受控的多中心前瞻性研究，其經(jīng)設計用于評估腎功能、移植物和患者存活以及在從頭初期腎同種異體移植受者中活組織檢查證明的急性排斥反應(BPAR)。主要目的是通過減少或取消環(huán)孢菌素的使用，使腎毒性減少至最低并且增強長期腎功能和移植物的存活，而沒有不利地影響功效。在移植前將患者隨機歸入3組中的l個組。(1)daclizumab(dac)、霉酚酸酯(MMF)、糖皮質(zhì)激素(CS)、低劑量環(huán)孢菌素(CsA)，接著戒斷藥物(weaning)(第4個月)和停藥(第6個月);(2)dac、MMF、CS、低劑量CsA;(3)MMF、CS、標準劑量的CsA?；颊叩倪x擇提交研究方案和知情同意表用于在各個國家得到地區(qū)性倫理審查委員會(localethicalcommittee)批準。所有患者提供了同意將他們的血液樣品用于基因分型的書面知情同意表。如果患者改變了主意，可在最長一個月后撤消樣品。為所有樣品分配新的獨立編號，然后在樣品收集后一個月，將新的編號和原始編號之間的聯(lián)系刪除。這是附加的確保患者機密性的措施；然而，因此也不可能重新獲得基于患者姓名和原始臨床試驗中所使用的編號的基因型信息。在大約15年的時間內(nèi)，消毀所有血液和DNA樣品。樣品的制備在EDTA管中收集單一血液樣品(9ml)。冷凍這些樣品并在其被送至Basel,瑞士的RocheCentralSampleOffice(CSO)之前將其在-20和-70。C之間貯存，在CSO將它們整分入3個管中并在條形碼標簽上分配新的、獨立的代碼以確?；颊吣涿?。將兩份血液樣品(lml和4ml)送至位于Basel,瑞士的RocheCenterforMedicalGenomics(RCMG)的RocheSampleRepository(RSR)。將剩下的4ml整分試樣在-80。C下貯存在Basel,Switzerland的CSO。按照已建立的標準操作方法，使用GCP指導方針在RSR對樣品進行所有方法。使用基于硅膠的提取方法(MagNAPureLCDNA分離試劑盒I，RocheMolecularBiochemicals)從200nl全血提取DNA。使用擴增受阻突變系統(tǒng)(ARMS)(用于MDR1和IL10中的SNP)和序列測定分析(用于IMPDH2中的SNP)的組合就兩個不同的單核苷酸多態(tài)性(SNP)對樣品進行基因分型，該擴增受阻突變系統(tǒng)(ARMS)是根據(jù)Newton等人，NucleicAcidsRes.(1989)，17(7)，2503-16所述的，基于PCR引物和被擴增的模板之間的3，端錯配。通過使用擴增受阻突變系統(tǒng)(ARMS,NucleicAcidsRes.(1989)，17(7)，2503-16)和使用聚合i!M式反應的動力熱循環(huán)儀(KTC)模式進行DNA中兩個點突變的分析。該方法使得能夠區(qū)分單管中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，而不必使用熒光探針(Higuchi等人，Biotechnology(1993)，11，1026-1030)。在KTC模式中，使用DNA嵌入染料和附帶有熒光檢測CCD照相機的熱循環(huán)儀(ABI-GeneAmp7卯0序列檢測系統(tǒng))監(jiān)控雙鏈擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生。在每一個退火和變性循環(huán)中測量PCR擴增平板的每一個小孔中的熒光。使用來自PE-Biosystem的SDS軟件將相對熒光達到0.5的闊值時所處的循環(huán)定義為Ct。將擴增反應^:計為等位基因特異性的，這樣如果多態(tài)性存在那么擴增反應是陽性的，而如果多態(tài)性不存在那么擴增反應是陰性的。對于每一個雙等位基因多態(tài)性，設置擴增平板的一個小孔對于等位基因1是特異性的，并且設置第二小孔對于等位基因2是特異性的。對于待檢測的每一個多態(tài)性，設計三種引物-兩種等位基因特異性引物和一種通用引物(表3)。等位基因l的反應物包含等位基因l特異性引物和通用引物，而等位基因2的反應物包含等位基因2特異性引物和通用引物。表l:用于多態(tài)性檢測的寡核苷酸引物列表標記引物核苷酸序列SEO引物<table>complextableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>每一種dATP、dCTP和dGTP50nm25拜TTP和75拜dUTP,4%DMSO，2pMROX(絲國羅丹明)0.1xSyBr綠(分子探針，Eugene，OR)，2%甘油，尿嘧啶N-糖基化酶(UNG,2個單位)，SZ05GoldDNA聚合酶(3個單位)和每孔20^1體積的引物。表1中列出了用于各測定的引物濃度。然后將5nl體積中的5ngDNA加入各小孔。為減少被預先存在的擴增產(chǎn)物污染的可能性，測定方法包括將dUTP摻入至擴增產(chǎn)物中并且進行溫育步驟來對預先存在的包含U的產(chǎn)物進行UNG降解(Longo等人，Gene(19卯)，93,125-128)。使用分項樣本工作站(aliquotingrobot)(Tecan)在384孔擴增平板中制備擴增反應物，通過實驗室管理數(shù)據(jù)庫產(chǎn)生的條形碼標簽鑒定該擴增平板。設置用于工作站運行方法的參數(shù)以使交叉污染的可能性減少至最低。對于每平板的81個樣品，以一式兩份運行5個樣品并分析兩份結(jié)果以確定它們匹配。熱循環(huán)條件如下在50。C下2分鐘以進行任何之前的污染性PCR產(chǎn)物的UNG降解，在95°C下12分鐘以進行SZ05GoldDNA聚合酶激活，45個循環(huán)在95。C下變性和在表1中指定的退火溫度下退火，然后以1度的增量從60。至95。C進行1分鐘的解離步驟。在ABIGeneAmp7900序列檢測系統(tǒng)儀中進行擴增反應。將解離曲線的第一個微商通過SDS軟件產(chǎn)生，并且根峰的特定產(chǎn)物擴增:而不是J特異'li引物對引起的。根據(jù)K.M.Ririe等人，Anal.Biochem.(1997)，245，154-160的方法，通過PCR期間DNA解鏈曲線的分析進行產(chǎn)物區(qū)分。確定每一個擴增反應的循環(huán)閾值Ct并且將等位基因1和等位基因2的Ct之間的差(6Ct)用作測定結(jié)果。具有-3.0和3.0之間的3Ct的樣品被認為是雜合的(A1/A2)。具有低于-3.0的SCt的樣品被認為對于Al是純合的(A1/A1);具有高于3.0的6Ct的樣品被認為對于A2是純合的(A2/A2)。在大多數(shù)情況下，明確確定3組基因型之間的SCt差異，由于誤差重新檢測Ct值接近3.0的樣品。對47個細胞系DNA的組(panel)進行每一個測定以在各測定平板上鑒定具有合適基因型的細胞系(A1/A1、Al/A2和A2/A2)以用作對照。細胞系DNA獲自CorrielInstitute,并且使用Qiagen提取試劑盒(QiaAmpDNA血液試劑盒，Valencia,CA)提取該DNA。通過DNA測序^Hi細胞系DNA的基因型。將三種細胞系DNA(A1/A1、A1/A2和A2/A2)在每一個臨床試驗樣品的平板上用作對照，并且用來確定平板之間的差異性。分析獲得的對照細胞系的Ct值以確定獲得的臨床試驗樣品的3Ct值的截斷值。通過SDS軟件產(chǎn)生包括每孔Ct值的數(shù)據(jù)文件并將其輸入實驗管理數(shù)據(jù)庫。從數(shù)據(jù)庫提取具有由獨立代碼鑒定的終基因型的數(shù)據(jù)文件，并將其與也由獨立代碼鑒定的臨床數(shù)據(jù)匹配以進行統(tǒng)計分析。對于IMPDH2，使用ABI毛細管測序儀和BigDyechemistry(ABI)通過雙鏈DNA序列測定進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型。用于擴增外顯子7/內(nèi)含子7交界處的引物示于表l中并且也用作測序引物。公共可獲得的基因組序列用作引物設計的參考資料。使用這些引物對組靶向所有多態(tài)性引物IL10-5920AAS1對應于由SEQIDNO:5中位置定義的IL10啟動子序列中的第668至682位。引物IL10-5920AAS2對應于由SEQIDNO:5中位置定義的IL10的啟動子序列中的第668至682位。通用引物IL10-5920A對應于由SEQIDNO:5中位置定義的IL10的啟動子序列中第708至685位的互補鏈并與該區(qū)域雜交。引物MDR1C3435TAS1對應于由SEQIDNO:l中位置定義的MDR1的外顯子26中第193至176位的互補鏈并與該區(qū)域雜交。引物MDR1C3435TAS2對應于由SEQIDNO:l中位置定義的MDR1的外顯子26中第194至的互補鏈并與該區(qū)域雜交。通用引物MDR1C3435T對應于由SEQIDNO:l中位置定義的MDR1的外顯子26中的第154。引物IMPDH2T3757CF對應于由SEQIDNO:6中位置定義的IMPDH2的內(nèi)含子6中第3938至第3919位的互補鏈并與該區(qū)域雜交。引物IMPDH2T3757CR對應于由SEQIDNO:6中位置定義的IMPDH2的內(nèi)含子8中第3497至第3516位。對于IMPDH2PCR，使用MJresearchTetradPCR儀在20ul反應物中對20納克基因組DNA進行PCR擴增。對于IMPDH2片段的擴增，條件如下50mMTrispH8.3，10mMKC1，1.5mMMgCl2，每一種dNTP為0.2mM，參每一種引物0.4nM,以及0.6單位AmpliTaqGold聚合酶。熱循環(huán)方案組成如下95C下進行15分鐘的初始溫育，然后35個循環(huán)(94X:下進行l(wèi)分鐘，61C下進行30秒，72。C下進行1分鐘)，以及一個在72'C下進行5分鐘的終延伸步驟。然后，在Tecanbiorobot上使用MilliporePCRCleanup平板純化PCR擴增片段。按照廠商說明書，使用ABIBigDyeterminatorchemistry在MJTetradPCR儀上進行循環(huán)測序。在測序后，使用Polyphred軟件(由UniversityofWashington許可)進行多態(tài)性分析。實施例2單變量snp分析首先對每種多態(tài)性進行分析。通過使用邏輯回歸模型(logisticregressionmodel),在調(diào)整處理組的性別和年齡(編碼為兩類變量，<=50歲，>50歲)后，評估BPAR(活組織檢查證明的急性排斥反應)發(fā)生與每種多態(tài)性之間的相關(guān)性。使用基因型測試(Sasieni1997)測試每種多態(tài)性的基因型與BPAR的發(fā)生之間不存在相關(guān)性的假說。此測試是基因型和BPAR發(fā)生之間的無關(guān)性測試，在MDR1C3435T和IL10-5920A的情況下，該測試遵從具有2個自由度的卡方檢驗法。對于IMPDH2T3757C，將C/C純合組與C/T基因型混合，因為其只包含2個個體。因此，基因型測試只具有l(wèi)個自由度df。將基因型測試的I型誤差設定為0.05，不進行針對多重比較的調(diào)整。對MDR1C3435T多態(tài)性，也進行等位基因傾向性測試(allelictrendtest)(Sasieni，1997)以檢驗此多態(tài)性的等位基因與BPAR的發(fā)生之間不存在相關(guān)性。等位基因傾向性測試檢測1個等位基因的存在與BPAR的發(fā)生之間的無關(guān)性。計算對應的優(yōu)勢率和其95%的置信區(qū)間(參見下表)。對于IMPDH2T3757C，在相對置信區(qū)間為95%時計算相應的優(yōu)勢率({C/CUC/T)對T/T)。對于IL10-592C>A，通過將C/C和A/C類型混合在一起也計算隱性編碼測試(recessivecodingtest)。計算對應的具有1df的卡方以及相對于A/C或C/C基因型，與A/A基因型關(guān)聯(lián)的BPAR的優(yōu)勢率。如表2中所示，通過使用基因分型測試，3個多態(tài)性均是顯著的。MPDH2C等位基因的存在將發(fā)生BPAR的幾率增加了幾乎3倍(優(yōu)勢率(OR)2.99，95%CI:1.27-6.99;p=0.012);MDR1T等位基因的存在幾乎使風險加倍(OR1.98,95%CI:1.24-3.14;p=0.004);IL10A等位基因的存在與幾乎高5倍的幾率相關(guān)(OR4.76，95%CI:1.59-14.26;p=0.005)。對于這3種多態(tài)性，未檢測到處理組與基因型之間的顯著相互作用。_表2:單變量藥物遺傳學分析結(jié)果_〈table>Complextableseeoriginaldocumentpage２２</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>圖例n:每組樣本量；OR:優(yōu)勢率(事件的幾率:無事件的幾率)[95%的OR置信區(qū)間；基因型測試、等位基因傾向性測試、隱性編碼測試參見正文；df:自由度；p:p-值；BPAR:活組織檢查證明的急性排斥反應；df:自由度。實施例3多變量snp分析在邏輯回歸模型中組合3種顯著的多態(tài)性(參見表2)以評估其他兩種多態(tài)性的作用對其顯著性的影響。使用上述的編碼代入3種多態(tài)性。如前面所述，考慮處理組性別和年齡進行分析。結(jié)果示于表3中。當包含在相同的多變量模型中時，3種多態(tài)性在5%的I型誤差水平上均是顯著的。表3:多變量藥物遺傳學結(jié)果<table>complextableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>權(quán)利要求1.用于預測患者急性腎移植排斥反應的方法，其包括a)從已從患者移取的樣品中分離核酸，以及b)檢測SEQIDNo.1的第176位上存在的核苷酸，其中T在該位置上的存在指示了急性腎移植排斥反應，c)任選檢測用于預測急性腎移植排斥反應的一種或多種其他標記。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述一種或多種其他標記是存在于SEQIDNo.5第682位上的核苷酸和/或存在于SEQIDNo.6的第3757位上的核苷酸。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述樣品是全血。4.權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中通過雙脫氧序列分析和/或等位基因特異性定量PCR實現(xiàn)所述檢測。5.權(quán)利要求l至4中任一項的方法，其中使用SeqIDNo.7和SeqIDNo.8的等位基因特異性引物和SeqIDNo.9的通用引物，和/或SeqIDNo.2和SeqIDNo.3的等位基因特異性引物和SeqIDNo.4的通用引物進行所述等位基因特異性PCR，和/或使用SeqIDNo.10和SeqIDNo.11的等位基因特異性引物進行所述雙脫氧序列分析。6.用于評估患者對急性腎移植排斥反應易感性的試劑盒，其包含至少一種用于檢測MDR1基因中的C3435T多態(tài)性的試劑、說明根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的方法的步驟的說明書，以及用于試劑盒內(nèi)容物的容器。7.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中至少一種用于檢測MDR1基因中的C3435T多態(tài)性的試劑包含這樣的核酸，其能夠特異性地與SeqIDNo.1的核酸雜交，或與其中第176位上的核苷酸C被T置換的SeqIDNo.1的核酸雜交。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的試劑盒，其額外地包含至少一種檢測IL10基因中-5920A多態(tài)性和/或IMPDH2基因中T3757C多態(tài)性的試劑。9.上文所述的方法和試劑盒，其特別參考前述實施例。專利摘要本發(fā)明涉及用于預測急性腎移植排斥反應的方法，該方法通過檢測MDR1基因外顯子26中的多態(tài)性進行，任選與檢測IMPDH2和IL10基因(已發(fā)現(xiàn)與該疾病相關(guān))的多態(tài)性組合進行。文檔編號C12Q1/68GKCN101198708SQ200680021116公開日2008年6月11日申請日期2006年6月7日發(fā)明者A·沃爾伽利,D·費恩茲勒,K·林德派因特納,L·哈希莫托,L·埃塞奧克斯,M·拉希福德,M·特魯曼,O·斯普雷斯申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan