專利名稱:新的細胞組合物及其制備方法
新的細胞組合物及其制備方法[0001]相關(guān)申請的交叉參考[0002]本申請是美國專利申請系列號11/110，879(2005年04月21日提交)的繼續(xù)申請，該申請以其全部內(nèi)容引入本文作為參考。技術(shù)領(lǐng)域：
[0003]本發(fā)明涉及新的細胞(例如，肝細胞，等等)組合物及其制備和使用方法。特別地，本發(fā)明涉及加工這些細胞的制品以使它們能夠重復(fù)冷凍保存和解凍、同時保持基本存活力的方法。本發(fā)明還涉及已經(jīng)被重復(fù)地冷凍保存和解凍的細胞(例如，肝細胞)的制品。
背景技術(shù)：
[0004]肝細胞是實質(zhì)肝細胞，而且占肝胞質(zhì)團的60-80%。肝細胞在外源和內(nèi)源物質(zhì)的解毒、修飾和分泌中起關(guān)鍵作用(Ponsoda，X.等.(2004) " Drug Metabolism ByCultured Human Hepatocytes:How FarAre We From The In Vivo Reality " Altern.Lab Anim.32(2):101-110)。肝細胞的一種解毒功能是把氨變成尿素后排出。它們在蛋白質(zhì)合成和貯存、碳水化合物轉(zhuǎn)化和膽固醇、膽汁鹽和磷脂的合成中也很重要(Postic，C.等.(2004) " Role Of The Liver In The Control Of CarbohydrateAnd LipidHomeostasis，" Diabetes Metab.30(5):398-408)。肝細胞是體內(nèi)唯一產(chǎn)生白蛋白、纖維蛋白原和凝血因子的凝血酶原基團的細胞。它是脂蛋白、血漿銅藍蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和糖蛋白合成的主要位點。肝細胞產(chǎn)生它們自己的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和胞內(nèi)酶。肝細胞也是維生素B12和鐵的重要貯藏庫。[0005]由于這些特征，分離的和培養(yǎng)的肝細胞已經(jīng)成為用于肝功能研究的非常有吸引力的模型體系(Chesne，C.等.(I993) " Viability And Function InPrimary Culture Of Adult Hepatocytes From Various AnimalSpecies And HumanBeings After Cryopreser vation, " Hepatology18 (2):406-414 ;Guillouzo，A.等.(1986)" Isolated and CulturedHepatocytes, " Paris:les Editions INSERMand London:John LibbeyEurotext) ；Ponsoda.X.等.(2004) " Drug Metabolism ByCultured HumanHepatocytes:How Far Are We From The In Vivo Reality " Altern.LabAnim.32 (2):101-110 ;Gomez_Lechon，M.J.等.(2004) " HumanHepatocytes InPrimary Culture:The Choice To Investigate DrugMetabolism In Man，" Curr.DrugMetab.5(5):443-462 ；Lemaigre,F.等.(2004) " Liver Development Update:New EmbryoModels，Cell LineageControl，And Morphogenesis，" Curr Opin Genet Dev.14(5):582-590 ;Nanji，A.A.(2004)" Animal Models Of Nonalcoholic Fatty Liver DiseaseAndSteatohepatitis， " Clin Liver Dis.8 (3):559-574 ;Hewitt，N.J.等.(2004)Cryopreserved Rat， Dog And Monkey Hepatocytes -Measurement OfDrug MetabolizingEnzymes In Suspensions And Cultures." Hum ExpToxicol.23(6):307-316)。[0006]除了它們用于肝臟模型的用途以外，肝細胞還有可能用于生產(chǎn)生物人工肝臟(BAL)，或用于肝細胞移植，其能為患有肝臟疾病或肝功能衰竭的個體提供肝功能。生物人工肝臟(BAL)描述于 Anand，A.C.(1996)" Bioartificial Livers:The State Of TheArt, " Trop Gastroenterol.17(4):197-198,202-211 ；Gan.J.H.等.(2005) " HybridArtificial LiverSupport System For Treatment Of Severe Liver Failure， " WorldJGastroenterol.11(6):890-894 ;Fukuda， J.等.(2004) " HepatocyteOrganoidCulture In Elliptic Hollow Fibers To Develop A HybridArtificial Liver, " IntJ Artif Organs.27(12):1091-1099 ;Meng，Q.等.(2004) " Hepatocyte Culture InBioartificial Livers With DifferentMembrane Characteristics， ” BiotechnolLett.26 (18):1407-1412 ;Sekido，H.等.(2004) " Usefulness Of Artificial LiverSupport For PretransplantPatients With Fulminant Hepatic Failure，" TransplantProc.36(8):2355-2356 ；W0 03/105663A2， W005/000376A2，和美國專利 6，759，245。肝細胞移植描述于 Chan，C.等(2004) " Hepatic TissueEngineering For AdjunctAnd Temporary Liver Support:CriticalTechnologies， 〃 Liver Transpl.10(11):1331-1342 ;Lee，S.W.等.(2004) " Hepatocyte Transplantation:State Of TheArt And Strategies ForOve rcoming Existing Hurdles， " Ann.Hepatol.3(2):48-53 ;Horslen，S.P.(2004) " Hepatocyte Transplantation， " Transplantation 77(10):1481-1486 ;Burlina，A.B.(2004) " Hepatocyte TransplantationForInborn Errors Of Metabolism， " J.1nherit.Metab.Dis.27 (3):373-83;和 Fox，1.J.等.(2004)〃 Hepatocyte Transplantation，〃 Am.J.Transplant.4Suppl.6:7_13。[0007]這種模型體系與生物人工肝臟(BAL)的發(fā)展中的限制因素是肝細胞、特別是人肝細胞的不穩(wěn)定的來源和有限利用率。新鮮的肝細胞只有從肝臟切除術(shù)或多器官供體的非可移植的肝臟獲得(Lloyd, T.D.R.等.(2003) Cryopreservation Of Hepatocytes:A ReviewOf CurrentMethods For Banking，" Cell and Tissue Culture Banking 4:3-15)。這種組織的供應(yīng)是不固定的，而且由于肝臟組織的功能壽命有限，從地理位置上講常常是不方便的(Smrzova，J.等.(2001)" Optimization OfPorcine Hepatocytes CryopreservationBy Comparison Of Viability AndEnzymatic Activity Of Fresh And CryopreservedCells， " Acta VeterinariaBrunensis 70:141-147)。[0008]解決該問題的一種方法涉及開發(fā)允許長時間保存肝細胞、同時保留其細胞功能的肝細胞儲藏條件。已經(jīng)開發(fā)了用于貯存肝細胞的冷凍保存方法來解決這種需要(參見，Lloyd, T.D.R.等.(2003) Cryopreservation Of Hepatocytes:A ReviewOf Current Methods ForBanking, ” Cell and Tissue Culture Banking 4:3-15 ；Loretz, LJ.等.(1989) ” Optimization Of Cryopreservation ProceduresFor Rat And HumanHepatocytes, " Xenobiotica.19 (5):489-498 ;Shaddock，J.G.等.(1993) " Cryopreservation And Long-Term Storage Of Primary RatHepatocytes: Effects On Substrate-Specific Cytochrome P450-DependentActivities And Unscheduled DNA Synthesis, " Cell Biol Toxicol.9(4):345-357;Novicki, D.L.等.(1982) " Cryopreservation Of Isolated Rat Hepatocytes, " InVitr0.18(4):393-399 ;Zaleski，J.等.(1993)" Preservation Of The Rate And ProfileOf Xenobiotic Metabolism In Rat Hepatocytes Stored In Liquid Nitrogen， " BiochemPharmacol.46 (I):111-116)。通常，這些措施包括在液氮(-196 °C )或冷凍的氮氣(_150°C)中貯藏。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有存活力的解凍細胞回收的能力取決于多種因素如冷凍速度、肝細胞的濃度、使用的冷凍保護劑的種類、和最終冷卻溫度。一般使用IO6IO7細胞/ml的細胞濃度。分離的肝細胞一般在懸浮液中孵育一段時間(例如，4-48小時)，以允許它們通過分離處理中回收。此后，添加冷凍保護劑(如甘油、DMS0、聚乙烯吡咯烷酮或葡聚糖)，并冷凍肝細胞。本領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)了各種冷凍方法，均用來最小化或預(yù)防細胞內(nèi)結(jié)冰的發(fā)生。冷凍速度一般為 _0.05°C /min 到-50°C /min (參見，Lloyd，T.D.R.等(2003) CryopreservationOf Hepatocytes:A Review Of Current Methods For Banking， " Cell and TissueCulture Banking 4:3-15)0[0009]雖然用于肝細胞貯藏的冷凍保存方法的開發(fā)已經(jīng)顯著地促進了人類肝細胞的利用率，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)冷凍保存會導致細胞存活力顯著降低(例如，25-35% ) (Dou,M.等.(1992) " Thawed Human Hepatocytes InPrimary Culture，" Cryobiology 29:454-469 ;Alexandre， E.等.(2002)" Cryopreservation Of Adult Human HepatocytesObtained From Resected Liver Biopsies， " Cryobiology 44:103-113)。 Coundouris，J.A.等(1993)報道24小時之后存活力為67%，14天之后降低到49% (Coundouris,J.A.等.(1993)" Cryopreservation Of Human Adult Hepatocytes For Use In DrugMetabolism And Toxicity Studies." Xenobiotica.23(12):1399-1409) Adams，R.M.等已經(jīng)報道，利用特定的冷凍保存液體能使肝細胞的存活力提高到大于90%，但是，發(fā)現(xiàn)只有 16% 的細胞能復(fù)制(Adams，R.Μ.等(1995) " Effective CryopreservationAnd Long-Terns Storage Of Primary Human Hepatocytes With Recovery OfViability, Differentiation，And Replicative Potential，" Cell Transplant.4(6):579-586)。冷凍保存方法在美國專利5，795，711，6，136，525，5，895，745 ;國際專利公開W004/009766, W092/12722，W0/ 0153462，歐洲專利 EP0834252B，和美國專利申請公開號US20020039786A1，US20030134418A1中公開。當繼續(xù)冷凍保存時，較差的細胞回收限制了肝細胞在體外肝臟模型中的應(yīng)用。[0010]影響新鮮和冷凍保存的肝細胞應(yīng)用的第二個主要問題是肝臟酶表達的差異性，其在來自不同供體的組織中觀察到(L1.A.P.等(1999) " Present Status Of TheApplication Of Cryopreserved Hepatocytes In The Evaluation Of Xenobiotics:Consensus Of An International Expert Panel， " Chem Biol Interact.121(I):117-123 ；Li, A.P.等.(1999) " Copreserved Human Hepatocytes !CharacterizationOf Drug-Metabolizing Enzyme Activities And Applications In Higher ThroughputScreening Assays For Hepatotoxicity, Metabolic Stability, And Drug-DrugInteraction Potential，" Chem Biol Interact.121 (I):17-35 ；0f Brien, Z.Z.等.(未標明日期)"The Construction Of A Representative Human Cryopreserved HepatocytePool For Metabolism Study, " www.lionscience.com.repository/ISSX-2002.pdf)。對這種樣本差異性的一個解決方法是，合并來自不同來源的樣本，以產(chǎn)生具有“平均”肝細胞特征的“組合的”肝細胞制品。但是，已經(jīng)提到接收新鮮組織的頻率和分離以后需要立即冷凍保存肝細胞會妨礙肝細胞庫的制備。因此，許多公司(例如，Xenotech，LLC;BDBiosciences)并不銷售組合的肝細胞，從而迫使最終用戶解凍和混合來自幾個不同供體的肝細胞。即使合并的冷凍保存的人類肝細胞是一種用于新陳代謝研究的有效模型，但是這種困難仍然存在(Zhang，J.G.等.(未標明日期)"Validation Of Pooled CryopreservedHuman Hepatocytes As A Model For Metabolic Studies.(http://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/gentest/products/pdf/S04T126.pdf)。[0011]因此，盡管有這些現(xiàn)有技術(shù)進展，但是仍然需要能使肝細胞可用于醫(yī)學研究及其他目的的處理方法。此外還需要穩(wěn)定而且可重復(fù)的人類肝細胞的來源。本發(fā)明允許生產(chǎn)和利用可以重復(fù)冷凍保存和解凍而沒有不可接受的存活力喪失的肝細胞制品。本發(fā)明因此允許合并多個肝細胞樣本以生產(chǎn)合并的肝細胞制品，尤其是合并的冷凍保存的人類肝細胞制品。利用這種進步，合并的冷凍保存的人類肝細胞現(xiàn)在可從In VitroTechnologies (Baltimore, MD)購買獲得。
發(fā)明內(nèi)容
[0012]本發(fā)明涉及新的細胞(例如，肝細胞)組合物，及其制備和使用方法。特別地，本發(fā)明涉及處理細胞尤其是肝細胞的制品的方法，以使它們能夠重復(fù)冷凍保存和解凍，同時保持基本的存活力。本發(fā)明還涉及已經(jīng)重復(fù)地冷凍保存和解凍的細胞(例如，肝細胞)的制品。[0013]詳細地，本發(fā)明特別地涉及多次冷凍保存的肝細胞制品，其含有已經(jīng)冷凍和解凍至少兩次的肝細胞，其中所述制品中超過50%、更優(yōu)選70%或更多的肝細胞是有存活力的。[0014]本發(fā)明進一步涉及這種多次冷凍保存的肝細胞制品的實施方案，其中肝細胞選自人類肝細胞、豬肝細胞、猿肝細胞、犬肝細胞、貓肝細胞、牛肝細胞、馬肝細胞、羊肝細胞和嚙齒類動物肝細胞。[0015]本發(fā)明進一步涉及這種多次冷凍保存的肝細胞制品的實施方案，其中該制品包括多種來源的肝細胞的合并制品，這些來源可以具有相同的或不同的性別、種族、或健康狀態(tài)，或其為合并制品提供所需水平的代謝活性(尤其，其中代謝活性選自COUM、DEX、ECOD,7-HCG、7-HCS、ΜΕΡΗ、TEST、PHEN 和 CZX)。[0016]本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)所 需的多次冷凍保存的肝細胞制品的方法，該肝細胞能被冷凍和解凍至少兩次，并且其中該制品中超過50%、更優(yōu)選70%或更多的肝細胞是有存活力的，該方法包括:[0017](A)將已經(jīng)冷凍并解凍的肝細胞進行密度梯度分級分離(尤其是Percoll密度離心)，以從沒有存活力的肝細胞中分離有存活力的肝細胞，[0018](B)回收分離的有存活力的肝細胞，和[0019](C)冷凍保存回收的有存活力的肝細胞，從而形成所需的肝細胞制品。[0020]本發(fā)明進一步涉及這種方法的實施方案，其中肝細胞選自人類肝細胞、豬肝細胞、猿肝細胞、犬肝細胞、貓肝細胞、牛肝細胞、馬肝細胞、羊肝細胞和嚙齒類動物肝細胞。[0021]本發(fā)明進一步涉及這種方法的實施方案，其中所述制品包括多種來源的肝細胞的合并制品，這些來源可以具有相同的或不同的性別、種族、或健康狀態(tài)，或其為合并制品提供所需水平的代謝活性(尤其，其中代謝活性選自COUM、DEX、EC0D、7-HCG、7-HCS、ΜΕΡΗ、TEST、PHEN 和 CZX)。[0022]本發(fā)明還涉及一種研究體外藥物代謝的方法，包括在存在生物異源物質(zhì)(xenobiotic)時孵育多次冷凍保存肝細胞制品中的肝細胞，并測定生物異源物質(zhì)的新陳代謝結(jié)局，或生物異源物質(zhì)對肝細胞或?qū)ζ涿富虼x活性的影響，其中肝細胞已經(jīng)冷凍和解凍至少兩次，而且其中該制品中超過50%、更優(yōu)選70%或更多的肝細胞是有存活力的。[0023]優(yōu)選實施方案的描述:[0024]本發(fā)明涉及新的細胞組合物及其制備和應(yīng)用方法。具體地，本發(fā)明涉及處理細胞制品以使它們能夠重復(fù)冷凍保存和解凍、同時保持基本的存活力的方法。本發(fā)明的方法通常適用于多種細胞類型，包括肝細胞、腎細胞、脾細胞、胸腺細胞、骨髓細胞、干細胞、肌細胞(包括心肌細胞)、內(nèi)分泌細胞(包括胰腺細胞、腎上腺細胞、甲狀腺細胞，等等)、表皮細胞、內(nèi)胚層細胞，等等。下面根據(jù)優(yōu)選的細胞類型:肝細胞來舉例說明本發(fā)明的方法。[0025]本發(fā)明還涉及為了獲得可用于各種試驗、診斷和治療目的的高存活力制品而已經(jīng)重復(fù)冷凍保存和解凍的細胞(例如肝細胞)的制品。本發(fā)明擴展了肝細胞被冷凍保存和解凍以備隨后使用的能力，以使肝細胞制品能夠被重復(fù)地冷凍保存和解凍而沒有不可接受的存活力喪失。[0026]如這里使用的，術(shù)語“細胞制品”表示來自一個或多個來源的細胞的液體或冷凍組合物(例如，“肝細胞制品”表示來自一個或多個來源的肝細胞的組合物)。該來源可以是通過切除術(shù)、活檢從組織或從供體器官解離或分離的初級細胞，或者它們可以是次級的、無限增殖的或轉(zhuǎn)化的細胞培養(yǎng)物。這些細胞可以來源于任何哺乳動物來源，包括人類、豬、猿、犬、貓、牛、馬、羊或者嚙齒類動物來源。優(yōu)選使用人類、豬或者嚙齒類動物(尤其是大鼠)細胞。優(yōu)選地，這些制品中的超過50 %、更優(yōu)選70 %或更多的肝細胞是有存活力的。[0027]如這里使用的，術(shù)語“多次冷凍保存的細胞制品”表示已經(jīng)冷凍、而后解凍至少兩次的細胞制品(例如，“多次冷凍保存的肝細胞制品”表示已經(jīng)冷凍、而后解凍至少兩次的肝細胞制品)。這種制品可以已經(jīng)被冷凍和 解凍三、四、五次或更多次。[0028]術(shù)語“合并制品”表示細胞(例如，肝細胞)制品，其中細胞(例如，肝細胞)來源于兩種、三種、四種、五種或更多種不同的來源，如不同的供體，來自不同組織樣本或不同的組織來源的活檢、組織切除，或不同的初級、次級、無限增殖化或轉(zhuǎn)化細胞(例如，肝細胞)培養(yǎng)物。這種合并制品的細胞可以是隨機選擇的細胞，或可以選擇為給合并制品提供所需水平的一種或多種新陳代謝活性(例如，具有所需水平的COUM、DEX、EC0D、7-HCG、7-HCS、ΜΕΡΗ、TEST、PHEN和/或CZX活性的肝細胞制品)，或所需的細胞特性(如，例如，來源于相同性別、年齡、種族(例如，高加索人，等等)或健康狀態(tài)(例如，感染肝炎病毒的肝臟的肝細胞，感染HIV-1的肝臟的肝細胞，健康肝臟的肝細胞，吸煙者的肝細胞，患有肝硬化或其他疾病或病癥的個體的肝細胞)的來源的肝細胞的制品)。例如，為了獲得具有最低DEX活性的合并的肝細胞制品，可以由批號067、CEK、ETR、PFM、VTA或WWM制備合并制品(參見，表 III)ο[0029]在一個優(yōu)選的實施方案中，以肝細胞為例說明，本發(fā)明的實施包括下列步驟中的某些或全部:分離肝細胞；第一次冷凍保存分離的初級肝細胞，以獲得第一次冷凍保存的肝細胞制品；解凍第一次冷凍保存的肝細胞制品，以獲得有存活力的肝細胞；并再處理(reformulation)解凍的活肝細胞，以允許它們通過重復(fù)冷凍保存和解凍進一步地忙藏和使用，而獲得有存活力的肝細胞。[0030]肝細胞的分離[0031]任何各種方法都可以使用或修改后來分離用于本發(fā)明的初級肝細胞。例如，用于分離肝細胞的適合的技術(shù)描述于Morsiani等，(1995)" Automated Liver CellProcessing Facilitates Large Scale Isolation AndPurification Of PorcineHepatocytes，" ASAIO Journal 41:155-161 和 Seglen，P.0.(1976) " Preparation OfIsolated Rat Liver Cells，" Meth.Cell Biol.13:29-83) 特別參考在 Li，A.P.等(1992)" Isolation AndCulturing Of Hepatocytes From Human Liver, " J.TissueCult.Meth.14:139-146中描述的兩步膠原酶消化方法。[0032]肝細胞可以培養(yǎng)在任何適合的肝細胞培養(yǎng)基中。作為舉例說明而非限制，可以提到下列培養(yǎng)基:Chee 必需培養(yǎng)基(Hamilton，G.A.等.(2001) " Effects Of MediumComposition On The Morphology AndFunction Of Rat Hepatocytes Cultured AsSpheroids And Monolayers, " InVitro Cell Dev Biol Anim.37(10):656-667;Zurlo，J.等.(1996)" Characterization Of A Primary Hepatocyte Culture SystemForToxicological Studies， " In Vitro Cell Dev Biol Anim.32(4):211-220;Arterburn, LM.等.(1995)" A Morphological Study Of DifferentiatedHepatocytesIn Vitro, " Hepatology 22(1):175-187)，改進的 Eagle 培養(yǎng)基(或 Dulbecco 改進的 Eagle 培養(yǎng)基)(Arikura, J.等.(2002) " UW Solution:A Promising Tool ForCryopreservation Of Primarily Isolated RatHepatocytes， " J HepatobiliaryPancreat Surg.9 (6):742-749 ；Washizu, 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;Ruegg，C.E.等.(1997) " Cytochrome-P450 Induction and Conjugated Metabolism InPrimaryHuman Hepatocytes After Cryopreservation, " In Vitro Toxicol.10:217-222)。[0034]分離的肝細胞的存活力可以使用任何類型的方法進行測定。優(yōu)選使用臺盼藍排除法測定這種存活力(參見，例如，Berry, Μ.N.等(1992) " TechniquesFor Pharmacological And Toxicological Studies WithIsolated HepatocyteSuspensions, " Life Sc1.51 (I):1_16)。因此，如這里使用的短語“有存活力的肝細胞”或“百分存活率”指如使用臺盼藍排除法確定的肝細胞存活率。[0035]分離的初級肝細胞的冷凍保存[0036]本發(fā)明的肝細胞優(yōu)選使用液氮冷凍保存，而且最優(yōu)選在其分離的36小時內(nèi)冷凍保存。對人類肝細胞的冷凍保存在Lloyd，T.D.R.等(2003)CryopreservationOf Hepatocytes:A Review Of Current MethodsFor Banking， " Cell andTissue Culture Banking 4:3-15中論述。用于肝細胞冷凍保存的適合的方法也可在下列文獻中找到:Adams，R.Μ.等(1995) " Effective Cryopreservation AndLong-Term Storage Of PrimaryHuman Hepatocytes With Recovery Of Viability,Differentiation, AndReplicati ve Potential， " Cell Transplant.4(6):579-586;Chesne, C.等.(1993) " Viability And Function In Primary Culture Of AdultHepatocytesFrom Various Animal Species And Human Beings 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(I):111-116。[0037]優(yōu)選地，分離的肝細胞懸浮在冷凍保護培養(yǎng)基中，并將懸浮的細胞分裝到冷凍-安全容器中。冷凍保護培養(yǎng)基一般包括肝細胞培養(yǎng)基，其含有至少一種使冷凍保存的有害作用(如在冷凍過程中形成細胞內(nèi)結(jié)冰)最小化的冷凍保護劑。作為例子而非限制，列出了下列常用的冷凍保護劑:二甲亞砜(DMSO)、聚乙二醇、氨基酸、丙二醇和甘油。本發(fā)明的一種優(yōu)選冷凍保護劑是DMS0。用于肝細胞冷凍保存的適合的冷凍保護劑和方法可見，例如:Lore, L.J.等(1989) " OptimizationOf CryopreservationProcedures For Rat And Human Hepatocytes, " Xenobiotica.19(5):489-498 ；Chesne,C.等.(1993)" Viability AndFunction In Primary Culture Of Adult HepatocytesFrom Various AnimalSpecies And Human Beings After Cryopreservation, " Hepatologyl8(2):406-414 ；Diener, B.等.(1993) " A Method For TheCryopreservationOf Liver Parenchymal Cells For Studies OfXenobiotics, " Cryobiology 30(2):116-127 ；Lawrence, J.N.等.(1991) " Development Of An Optimal Method For TheCryopreservation OfHepatocytes And Their Subsequent Monolayer Culture.Toxicology InVitro, " 5(1):39-51 ；Houle, R.等.(2003) " Retention ofTransporterActivities in Cryopreserved,Isolated Rat Hepatocytes," Drug Metab.Disposit.31 (4):447-451 ；Silva, J.M.等.(1999) " Induction 0fCytochrome-P450 InCryopreserved Rat And Human Hepatocytes, " Chem-Biol Interact 121:49-63。[0038]分離的肝細胞優(yōu)選懸浮于準備用于冷凍的冷凍保護培養(yǎng)基中。懸浮的細胞優(yōu)選地以大約IO5細胞/ml到大約4 X IO7細胞/ml的細胞密度分裝到抗冷凍容器中。優(yōu)選的冷凍體積范圍為0.1-10.0ml0優(yōu)選的冷凍體積是1.0ml0[0039]分裝的肝細胞然后優(yōu)選使用控制速度的冷凍過程進行冷凍保存，最優(yōu)選以大約-l°c /min到大約-25°c /min的冷凍速度冷凍保存，直到達到大約_90°C的最終溫度。在冷凍保存過程的初始階段，可以使用引晶(seeding)在已經(jīng)冷卻到培養(yǎng)基冰點以下的細胞懸液中誘導控制的結(jié)晶或結(jié)冰。這種引晶用來使與結(jié)冰相關(guān)的損害最小化，并因此有益于細胞存活力。適合的引晶方法包括將冷的金屬棒插入到冷凍容器中，并向冷凍容器中引入液氮。一旦已經(jīng)達到要求的最終溫度，即可將冷凍的細胞樣本轉(zhuǎn)入到液氮冷凍機中進行長期儲存。冷凍的樣本可以在液氮相或在液氮的氣相中貯藏。優(yōu)選在液氮的氣相中貯藏。冷凍的樣本可以這種方式貯藏幾天、幾個月或幾年，在液氮的氣相中貯藏的時間長度對解凍后的存活力與功能具有很小的影響。[0041]冷凍保存的肝細胞的解凍[0042]可以通過從存在的液氮或液氮蒸汽中移出冷凍的樣本，對其進行解凍而用于進一步處理。優(yōu)選通過把樣本立即置于溫度為大約37°C到大約42°C的預(yù)熱水浴中對冷凍樣本進行解凍。優(yōu)選地，細胞至少解凍到當樣本容器倒置時可以移去冰塊的階段。然后優(yōu)選迅速地處理解凍的細胞，以從與DMSO的接觸中移出細胞，例如通過Percoll梯度離心(如下所述)或通過連續(xù)洗滌。[0043]在一個優(yōu)選的實施方案中，將細胞解凍到完全InVitroGRO CP培養(yǎng)基中(InVitro Technologies, Baltimore, MD ；Roymans, D.等.(2004) " Determination OfCytochrome P450 1A2 And Cytochrome P4503a4Induction In Cryopreserved HumanHepatocytes, " Biochem Pharmacol.67 (3):427-437)。培養(yǎng)基如下制備:在水浴中解凍Torpedo 抗生素混合物(In Vitro Technologies, Baltimore MD)到 37°C直到解凍，然后從水浴中移出。然后將1.0ml Torpedo抗生素混合物與45ml InVitroGROCP培養(yǎng)基混合。在添加Torpedo抗生素混合物后，完全培養(yǎng)基的儲藏期限是7天。當解凍單個小瓶時，將InVitroGRO CP培養(yǎng)基預(yù)熱到大約37°C。添加5ml加熱的InVitroGRO CP培養(yǎng)基到無菌的50ml錐形管中。從冷凍器中小心地移出冷凍的肝細胞小瓶。如果小瓶貯藏在液相中，則小心地除去它的蓋子，輕輕除去小瓶中存在的任何液氮，而且在把小瓶置于水浴中之前把蓋子重新蓋上。優(yōu)選地，然后立即把小瓶浸入37°C水浴中，并輕輕地搖晃小瓶直到冰塊完全融解，但是不要長于使小瓶完全解凍所花的時間。從小瓶上除去任何標簽，以便更容易地觀察到小瓶的內(nèi)含物可能是有幫助的。然后將解凍的內(nèi)容物注入到預(yù)熱的InVitroGRO CP培養(yǎng)基中。然后將1.0ml預(yù)熱的InVitroGRO CP培養(yǎng)基加入到每個小瓶中，以重懸任何剩余的細胞。然后倒出小瓶的內(nèi)含物，或移液到肝細胞懸浮液中。肝細胞優(yōu)選通過輕輕地倒置接收容器(例如，小瓶、試管，等等)幾(例如，3)次來重懸。[0044]當解凍多個小瓶時，優(yōu)選地將所有的小瓶同時在水浴中解凍。如前所述，培養(yǎng)基(優(yōu)選地，InVitroGRO CP培養(yǎng)基)應(yīng)該加熱到37°C。需要保證有足夠的培養(yǎng)基，以允許5ml預(yù)熱的InVitroGRO CP培養(yǎng)基用于每小瓶的冷凍保存肝細胞。在小瓶已經(jīng)解凍之后，應(yīng)該迅速地除去其蓋子，并將其內(nèi)含物注入到無菌管中或燒杯中，其中每個解凍的小瓶至少含有5ml預(yù)熱的InVitroGRO CP培養(yǎng)基。例如，25ml培養(yǎng)基優(yōu)選用于在可以容納50ml體積的容器中的5個小瓶。[0045]如果需要，可以使用臺盼藍排除法來測定總細胞數(shù)和活細胞數(shù)。可以用InVitroGRO CP培養(yǎng)基將細胞稀釋到0.70X IO6活細胞/ml。[0046]再處理解凍的肝細胞以允許進一步冷凍保存和解凍[0047]本發(fā)明的一個方面涉及再處理解凍細胞的能力，以便它們可以在一個或多個隨后的時機再冷凍和再解凍。這種多次冷凍保存的肝細胞制品具有許多用途。它們可用于生物人工肝臟、肝臟細胞移植、肝臟輔助醫(yī)療裝置、肝細胞移植和體外應(yīng)用。特別地，多次冷凍保存的肝細胞制品可用于體外藥物代謝研 究(例如，用于鑒定具有獨特特征(例如，新陳代謝多態(tài)性、遺傳多態(tài)性，等等)的肝細胞)，用于研究生物異源物質(zhì)的新陳代謝結(jié)局，研究生物異源物質(zhì)在改變肝細胞的藥物代謝酶模式中的作用，用于測定生物異源物質(zhì)對肝臟酶與功能(例如膽固醇代謝)的IC5tl的抑制研究，用于生物異源物質(zhì)的基因誘導研究，用于生物異源物質(zhì)的蛋白質(zhì)誘導研究，用于生物異源物質(zhì)對肝細胞的毒性評價，生物異源物質(zhì)的轉(zhuǎn)運研究(例如研究P-糖蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、有機離子轉(zhuǎn)運體、有機陽離子轉(zhuǎn)運體，等等)，用于生物異源物質(zhì)的新陳代謝清除研究，用于功效分析(例如脂蛋白加工、糖異生、蛋白質(zhì)分泌等等)。多次冷凍保存的肝細胞制品還可用于研究或繁殖肝炎病毒及其他感染病毒和傳染物。回收的細胞可以再處理以用于DNA、mRNA或蛋白質(zhì)組研究，或用于新陳代謝多態(tài)性的研究。多次冷凍保存的肝細胞制品也可用于新陳代謝清除研究和功效分析(例如，脂蛋白加工、糖異生、蛋白質(zhì)分泌等等)。可再處理細胞用于接種大規(guī)模孵育的生物反應(yīng)器，或作為模型用于經(jīng)由微RNA的基因調(diào)節(jié)，或用于與其他細胞類型(例如來自肝臟的非實質(zhì)細胞或來自其他來源的細胞，例如Caco-2細胞)一起的聯(lián)合系統(tǒng)。[0048]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，這種再處理包括，在下一次再冷凍之前，分離有存活力的細胞和沒有存活力的細胞。密度梯度離心優(yōu)選用于該目的。例如，可以使用30% Percoll 梯度離心方法(Madan, A.等.(1999)" Effect of Cryopreservation onCytochrome P-450 Enzyme Induction in Cultured Rat Hepatocytes, " Drug Metab.Dispos.27(3):327-335 ；Sun, E.L.等.(1990) " Cryopreservation Of CynomologusMonkey(Macaca fascicularis)Hepatocytes For Subsequent Culture And ProteinSynthesis Studies," In vitro Cell Development and Biology25:147-150 ；Lawrence,J.N.等.(1991) " Development Of An Optimal Method For The CryopreservationOf Hepatocytes And Their Subsequent Monolayer Culture.Toxicology InVitro, " 5(1):39-51 ；Dou, M.等.(1992) " Thawed Human Hepatocytes In PrimaryCulture, " Cryobiology 29(4):454-69 ;Utesch, D.等.(1992) " CharacterizationOf CryopreservedRat Liver Parenchymal Cells By Metabolism Of DiagnosticSubstratesAnd Activities Of Related Enzymes, " Biochemical Pharmacology44:309-315。例如，解凍的細胞可以重懸在預(yù)熱的(大約37°C )30% Percoll等滲分級分離緩沖液中，然后于室溫以IOOXg離心二十分鐘，來沉淀活細胞。棄掉上清夜，并把細胞重懸于培養(yǎng)基中，直接用于隨后的冷凍保存步驟，或在冷凍保存之前進一步處理。[0049]將先前冷凍-解凍的制品進行冷凍而產(chǎn)生的冷凍保存制品將優(yōu)選具有大于50%、更優(yōu)選70%或以上的解凍后細胞存活力。這種高存活力使本發(fā)明能實現(xiàn)肝細胞的反復(fù)凍融，而沒有不可接受的細胞損失或不需要更大的樣本來源。[0050]合并的肝細胞制品[0051]本發(fā)明使肝細胞能夠反復(fù)凍融的能力另外促進了合并的肝細胞制品的生產(chǎn)，尤其是合并的人類肝細胞制品的生產(chǎn)。如上所討論的，個體肝臟樣本產(chǎn)生具有不同新陳代謝能力的肝細胞。為了促進肝細胞的可重復(fù)使用或研究，需要通過合并來自不同來源的肝細胞，以獲得組合的或“平均”肝細胞制品，來使因這種樣本差異性引起的肝細胞差異最小化。因此可制備這種組合的肝細胞制品，以便提供具有“平均”肝細胞樣本的新陳代謝活性的制品，或其肝細胞酶功能接近新鮮分離的肝細胞的制品。這樣的新陳代謝活性可包括，例如，下列酶活性中的一些或全部:香豆素 -羥 化酶(COUM)、右美沙芬O-脫甲基酶(DEX)、7_乙氧基香豆素O-脫乙基酶(ECOD)、負責7-羥基香豆素(7-HCG)的II期代謝作用的活性、負責7-羥基香豆素(7-HCS)的II期代謝作用的活性、美芬妥英4-羥化酶(ΜΕΡΗ)、睪酮6 ( β )-羥化酶(TEST)、甲苯磺丁脲4-羥化酶(TOLB)、非那西丁 O-脫乙基酶(PHEN)或氯唑沙宗6-羥化酶(CZX)。表I提供了用于分析這種新陳代謝活性的底物、測量方法和分析單位。[0052]
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)所需的多次冷凍保存的肝細胞制品的方法，所述的肝細胞能被冷凍至少兩次，而且其中在最后的解凍后所述制品中超過70%的肝細胞是有存活力的，所述方法包括以下連續(xù)步驟: (A)對已經(jīng)冷凍和解凍的肝細胞進行密度梯度分級分離，以從沒有存活力的肝細胞中分離出有存活力的肝細胞， (B)回收分離的有存活力的肝細胞，和 (C)冷凍保存回收后的有存活力的肝細胞，從而形成所述的所需肝細胞制品。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的密度梯度分級分離包括通過涂有聚乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒的密度離心。
3.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的肝細胞選自人類肝細胞、豬肝細胞、猿肝細胞、犬肝細胞、貓肝細胞、牛肝細胞、馬肝細胞、羊肝細胞和嚙齒類動物肝細胞。
4.權(quán)利要求
3的方法，其中所述的肝細胞是人類肝細胞。
5.權(quán)利要求
1的方法，其中所述的制品包括來自同種的多個來源的肝細胞的合并制品O
6.權(quán)利要求
5的方法，其中所述的多種來源是相同性別、種族或健康狀態(tài)的。
7.權(quán)利要求
5的方法，其中所述肝細胞的合并制品中的肝細胞為所述的合并制品提供所需水平的代謝活性。
8.權(quán)利要求
7的方法，其中所述代謝活性選自COUM、DEX、ECOD、7-HCG、7_HCS、ΜΕΡΗ、TEST、PHEN 和 CZX。
9.權(quán)利要求
1的方法，其中所述制品中超過80%的肝細胞是有存活力的。
專利摘要
本發(fā)明涉及新的細胞(例如，肝細胞，等等)組合物，及其制備和使用方法。特別地，本發(fā)明涉及處理這些細胞的制品以使它們能夠重復(fù)冷凍保存和解凍、同時保持基本的存活力的方法。本發(fā)明還涉及已經(jīng)重復(fù)地冷凍保存和解凍的細胞(例如，肝細胞)的制品。
文檔編號C12N5/071GKCN101501186 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200680018373
公開日2013年6月19日 申請日期2006年3月30日
發(fā)明者D·德賴登, J·哈迪 申請人:塞爾希斯體外生物公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (3),