專利名稱:用于檢測微生物的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測包含于食品或臨床樣品中微生物的方法，一種用于制備上述方法所使用的樣品的方法，以及一種用于檢測微生物的試劑盒。更確切地說，本發(fā)明涉及一種用于檢測微生物的方法和試劑盒，所述方法和試劑盒能夠區(qū)分包含于食品或臨床樣品中微生物的活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞。
背景技術(shù)：
習(xí)慣上使用平板培養(yǎng)法測定或食品、臨床樣品或環(huán)境中的活細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)。然而，平板培養(yǎng)法需要約2天的時(shí)間才能得到結(jié)果。此外，由于基于培養(yǎng)物的細(xì)菌檢測利用了通常所用的培養(yǎng)基，因此難以檢測環(huán)境中的受損細(xì)菌、由于人為應(yīng)激受損的細(xì)菌(特別是在狹義下，前者可稱為活而非可培養(yǎng)的(VNC)細(xì)胞，而后者則可稱為受損細(xì)胞)等，期望開發(fā) 一種快速且可靠的方法用于計(jì)數(shù)活細(xì)菌。
流式細(xì)胞儀(FCM)是一種以恒定流速在流動(dòng)池中流動(dòng)樣品使其通過激光束，并測定細(xì)胞或其他微粒散射光線或所述樣品發(fā)射熒光的技術(shù)。因?yàn)槠淠茉趩渭?xì)胞水平上檢測微生物，因此近年來不但在分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中用于檢測微生物，而且也用于檢測環(huán)境、乳制品、飲料、臨床材料等中的微生物(例如，專利文獻(xiàn)I和2，非專利文獻(xiàn)1-5)。
然而,用于該方法的FCM裝置(流動(dòng)細(xì)胞儀(flow cytometers))非常昂貴且尺寸很大，并且還需要熟練的操作技能。此外，在其中各種細(xì)菌污染物為非受損細(xì)菌、受損細(xì)菌和死細(xì)菌的食品領(lǐng)域?qū)嶋H應(yīng)用中，它們?nèi)匀痪哂幸M(jìn)行改進(jìn)或解決涉及經(jīng)濟(jì)性、安全性、易用性和可靠性以及區(qū)分微生物活細(xì)胞和死細(xì)胞現(xiàn)狀的問題。
例如，專利文獻(xiàn)I披露了一種通過利用離子螯合劑、蛋白酶、去污劑和細(xì)菌特異性熒光染料檢測來自液體樣品總細(xì)菌的方法。典型實(shí)例為EDTA的離子螯合劑必須在l_5mM的濃度下使用，如果濃度超過該水平，則細(xì)胞壁未受損的活細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜也會(huì)被破壞。用于專利文獻(xiàn)I中方法的離子螯合劑的優(yōu)選濃度為約6-17mM，因此存在死細(xì)菌和活細(xì)菌都被裂解的問題。此外，該方法的檢測極限為約104cfu/ml，因此如果在液體樣品中僅存在活細(xì)菌的條件下，液體樣品中活細(xì)菌計(jì)數(shù)低(103cfU/ml或更低)，則必須將細(xì)菌增殖到上述檢測極限水平。因此，其無法當(dāng)然被視為一種快速的方法。
專利文獻(xiàn)2披露了一種用蛋白酶、脂肪酶和核酸酶處理體液樣品，在包含硼酸鈉、EDTA、甲醛和非離子型洗滌劑(Triton X-100等)的緩沖液中通過溴化乙錠染色，裂解白細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞，溴化乙錠只對細(xì)菌進(jìn)行染色，基于熒光顯微鏡檢術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等檢測并定量細(xì)菌的方法。然而，結(jié)果顯示甚至在蛋白酶、脂肪酶和核酸酶處理后未裂解的白細(xì)胞和血小板仍留在體液樣品中，而活細(xì)菌則吸附在它們之上形成復(fù)合物，因此將活細(xì)菌和死細(xì)菌都染色，從而難以確定細(xì)菌是死是活。此外，盡管專利文獻(xiàn)2描述了該方法是一種在約2小時(shí)或更短，通常在45分鐘或更短的時(shí)間內(nèi)用于檢測密度低至10個(gè)細(xì)胞/ml (樣品)的細(xì)菌的方法，但實(shí)際上公開了除非至少104cfu/ml或更多的細(xì)菌存在于體液樣品中，否則就無法檢測的一個(gè)實(shí)例，因此其不適合于檢測少量微生物如存在于牛奶中的少量微生物。[0007]非專利文獻(xiàn)I披露了一種利用SYT063穿透活細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的特性以及T0-PR03只穿透死細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的特性，基于流式細(xì)胞術(shù)嘗試區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌的技術(shù)。此外，其披露了其中將活細(xì)胞和死細(xì)胞懸浮于無菌水中，并在該環(huán)境中嘗試區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞的一個(gè)實(shí)例。然而，死細(xì)胞是那些需要煮沸15分鐘的，而與真實(shí)食品中的死細(xì)菌相比，其細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受損更大。因此，該技術(shù)是一種只適用于諸如熟魚等有限范圍食品中的死細(xì)菌的技術(shù)，且沒有研究用于對牛奶等所進(jìn)行的超高溫巴氏滅菌以及最新食品的條件，并且只殺死食品的細(xì)菌而不使蛋白變性。
非專利文獻(xiàn)2披露了一種讓蛋白酶K作用于UHT(超高溫巴氏滅菌)牛奶以消化微膠粒酪蛋白，通過冷凍離心除去脂質(zhì)檢測牛奶中細(xì)菌，并測定其細(xì)菌總數(shù)(包括活細(xì)菌和死細(xì)菌)的方法，以及一種除上述蛋白酶K之外添加作為非離子型洗滌劑的O. 1% TritonX-100到原料乳中，檢測原料乳中細(xì)菌，并測定細(xì)菌總數(shù)(活細(xì)菌和死細(xì)菌計(jì)數(shù))的方法。然而，在非專利文獻(xiàn)2的方法中，即使讓蛋白酶K作用于UHT牛奶，微膠粒酪蛋白也不被完全消化，結(jié)果許多未完全消化的產(chǎn)物具有類似于細(xì)菌的大小。如果讓諸如SYTO BC或SYT09 的熒光核染色劑作用于上述產(chǎn)物，則會(huì)發(fā)生強(qiáng)的非特異性吸附，使得將它們難以與活細(xì)菌區(qū)分。此外，還存在的一個(gè)問題是一種被視為污染物牛奶組分的諸如牛白細(xì)胞(bovineleucocytes)和乳腺上皮細(xì)胞(mammaryepitheliocyte)的體細(xì)胞的細(xì)胞膜僅輕微受損，如果用SYTO BC、SYT09或碘化丙錠對它們?nèi)旧?，則事實(shí)上，碘化丙錠無法將其穿透，結(jié)果染色體DNA所發(fā)出的綠色熒光使得體細(xì)胞和活細(xì)菌的區(qū)分變得困難。
非專利文獻(xiàn)3披露了一種類似于專利文獻(xiàn)I方法的方法，不同之處在于對于測定酸乳酪或酸乳酪起子中乳酸菌活細(xì)菌計(jì)數(shù)不采用蛋白酶處理方法，并且該方法被描述為是一種使用非離子型洗滌劑和螯合劑組合的方法。該發(fā)明的特點(diǎn)在于，它是一種能破壞作為污染物的體細(xì)胞并有效地分離脂肪球的方法。然而，進(jìn)行上述處理的樣品含有大量源自牛奶的污染物，并且由于污染物所致，使得對于酸乳酪或酸乳酪起子，活性乳酸菌的檢測極限降低到約105cfu/ml的水平。因此，該方法需要非常精確的檢測條件，通過調(diào)節(jié)非離子型洗滌劑和螯合劑的濃度僅破壞體細(xì)胞而不損傷活細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。因此，該方法無法適用于區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌的方便且高靈敏的檢測方法。
盡管通常知道單疊氮乙錠(ethidium monoazide, EMA, 8_疊氮基_3_氨基_6_苯基-5-氯化乙基菲啶纟翁)能有效地作為一種抗癌劑，但其是一種針對存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的拓?fù)洚悩?gòu)酶Π(ΙΙ型拓?fù)洚悩?gòu)酶)的毒劑(例如非專利文獻(xiàn)5)。EMA無序嵌入染色體DNA中，然后通過可見光照射只有嵌入的EMA轉(zhuǎn)變?yōu)榈e，并通過共價(jià)連接與染色體DNA結(jié)合。例如，通過拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用，癌細(xì)胞調(diào)節(jié)DNA鏈的螺旋度，或使DNA鏈重旋以便進(jìn)行DNA鏈復(fù)制和基因表達(dá)(DNA轉(zhuǎn)錄)，并通過切割染色體DNA相應(yīng)位點(diǎn)再連接切割產(chǎn)物獲得重旋。在這種情況下，就EMA功能而言，通過在再連接時(shí)源自EMA的氮賓的共價(jià)連接作用抑制了通過拓?fù)洚悩?gòu)酶II的DNA再連接，結(jié)果增加染色體DNA的斷裂。沒有嵌入DNA鏈并以游離形式存在的EMA通過可見光轉(zhuǎn)變?yōu)榱u胺，但該羥胺并不抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性。
作為抑制上述拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性的物質(zhì)，除上述單疊氮乙錠之外，還已知有安吖RS、多柔比星、橢圓玫瑰樹堿、足葉乙苷、米托蒽醌、saintopin等。作為抑制具有類似于拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性的拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性的物質(zhì)，已知有喜樹堿、托泊替康等(例如非專利文獻(xiàn)6)。此外，在細(xì)菌中，作為抑制具有類似于上述酶活性的細(xì)菌DNA促旋酶活性的物質(zhì)，已知有環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星、培氟沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、萘啶酸、奧索利酸、批咯米酸等(例如非專利文獻(xiàn)7)。
然而，迄今為止根本就沒有報(bào)道過這些拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑和細(xì)菌DNA促旋酶抑制劑在為了實(shí)現(xiàn)快速和高靈敏度檢測的用于區(qū)分微生物的活細(xì)胞和死細(xì)胞的測試方法中用于樣品如含有微生物的食品和臨床樣品預(yù)處理的用途。
作為另一種用于檢測活細(xì)菌的方法，已有提及用于方便且快速檢測呼吸活性和酯酶活性的自動(dòng)系統(tǒng)(專利文獻(xiàn)3)。然而，通過該方法的檢測限于目標(biāo)細(xì)菌呼吸活性和酯酶活性能被準(zhǔn)確測定的情形。
作為不同于活細(xì)菌的微生物狀態(tài)，存在受損細(xì)胞、VNC(活而非可培養(yǎng)的)細(xì)胞和死細(xì)胞。已知一種利用在酯酶存在下發(fā)出綠色熒光的cFDA(羧基熒光素二乙酸酯)和碘化丙錠(PI)，通過流式細(xì)胞術(shù)用于檢測它們的方法(非專利文獻(xiàn)8)。然而，該方法還是一種只有當(dāng)對受損細(xì)胞的細(xì)胞壁損傷比較大時(shí)，能清楚區(qū)分活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞的方法。 因此，當(dāng)受損細(xì)胞為低溫長時(shí)巴氏滅菌(LTLT)或高溫短時(shí)巴氏滅菌(HTST)所致的表現(xiàn)為低度損傷的那些細(xì)胞、或由于環(huán)境應(yīng)激而表現(xiàn)為低度損傷的那些細(xì)胞時(shí)，通過該方法無法區(qū)分活細(xì)胞和受損細(xì)胞。
專利文獻(xiàn)I :日本國際專利申請未審查公開號9-510105
專利文獻(xiàn)2 :日本專利公開(Kokoku)號6-55157
專利文獻(xiàn)3 :日本專利特開2002-281998號
非專利文獻(xiàn)I Bokin Bobai，Vol. 31，No. 7，2003，pp. 357-363
非專利文獻(xiàn)2 :Applied and Environmental Microbiology, Vol. 66, No. 3,2000,pp.1228-1232
非專利文獻(xiàn)3 :Applied and Environmental Microbiology, Vol. 68, No. 6,2002,pp.2934-2942
非專利文獻(xiàn)4:Applied and Environmental Microbiology,Vol. 60,No. 12,1994,pp.4255-4262
非專利文獻(xiàn)5 Biochemistry, Vol. 36，No. 50，1997，pp. 15884-15891
非專利文獻(xiàn)6 :The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, No. 37,1995,pp.21429-21432
非專利文獻(xiàn)7 :The New England Journal of Medicine, Vol. 324, No. 6,1991,pp.384-394
非專利文獻(xiàn)8 :Applied and Environmental Microbiology, Vol. 68,2002,pp.5209-5216

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測微生物的方法，該方法通過利用經(jīng)濟(jì)的、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)能方便并快速地檢測食品和臨床樣品中的活微生物,適用于食品工廠和臨床領(lǐng)域自動(dòng)檢驗(yàn)，以及一種用于制備供前述方法使用的樣品的方法。此外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能區(qū)分活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞的試劑盒。[0028]用于解決問題的方法
鑒于前述背景，本發(fā)明的發(fā)明人對用于檢測食品和臨床樣品中所包含微生物的活細(xì)胞，尤其是用于檢測活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞的確信且實(shí)用的常規(guī)檢測方法進(jìn)行了刻苦研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使樣品中包含的微生物量非常少，通過識別包括食品和臨床樣品中所包含的死細(xì)胞在內(nèi)的多種污染物、用脂肪酶、蛋白酶、作為DNA嵌入劑的單疊氮乙錠等預(yù)處理食品或臨床樣品以便在樣品預(yù)處理步驟中有效去除污染物、用熒光染色樣品、并使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，還是有可能高度靈敏地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種制備用于通過流式細(xì)胞術(shù)檢測試樣中微生物的活細(xì)胞所使用的測量用樣品的方法，包括下列步驟
a)用具有分解試樣中除微生物細(xì)胞之外的其他細(xì)胞、蛋白膠?；蛑|(zhì)的活性的酶處理試樣的步驟，和b)用拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或DNA促旋酶抑制劑處理試樣的步驟。
本發(fā)明還提供了一種通過流式細(xì)胞術(shù)檢測試樣中微生物的活細(xì)胞的方法，包括下列步驟
a)用具有分解試樣中除微生物細(xì)胞之外的其他細(xì)胞、蛋白膠?；蛑|(zhì)的活性的酶處理試樣的步驟，
b)用拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或DNA促旋酶抑制劑處理試樣的步驟，
c)用核染色劑處理步驟a)和b)中處理的試樣的步驟，和
d)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測用核染色劑處理的試樣中微生物的步驟。
在制備用于通過流式細(xì)胞術(shù)檢測試樣中微生物的活細(xì)胞所使用的測量用樣品的方法，和通過流式細(xì)胞術(shù)檢測試樣中微生物的活細(xì)胞的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟a)之后進(jìn)行步驟b)。
在上述方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，試樣為牛奶、乳制品、由牛奶或乳制品作原料生產(chǎn)的食品、血樣、尿樣、脊髓液樣品、滑液樣品和胸膜液(pleural fluid)樣品之一。
在上述方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物為細(xì)菌。
在上述方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶選自脂解酶和蛋白酶。
在上述方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑選自安吖啶、喜樹堿、多柔比星、橢圓玫瑰樹堿、足葉乙苷、米托蒽醌、saintopin、托泊替康和CP-115,953。
在上述方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA促旋酶抑制劑選自環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星、培氟沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、萘啶酸、奧索利酸和吡咯米酸。
在上述方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑為單疊氮乙錠，并且該方法包括對添加單疊氮乙錠的試樣進(jìn)行可見光照射的步驟。
在上述方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括用核染色劑處理步驟a)和b)中處理的試樣的步驟C)。
在上述方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，核染色劑包括能穿透活細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁的第一染色劑，以及與第一染色劑相比，相對于穿透活細(xì)胞的細(xì)胞壁更容易地穿透死細(xì)胞的細(xì)胞壁的第二染色劑。
在上述方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，核染色劑為碘化丙錠和SYT09。
本發(fā)明還提供了一種用于制備通過流式細(xì)胞術(shù)檢測試樣中微生物的活細(xì)胞所使用的測量用樣品的試劑盒，其包含下列組分
選自脂解酶和蛋白酶的酶，
拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或DNA促旋酶抑制劑，和
核染色劑。
在上述試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑選自安吖啶、喜樹堿、多柔比星、橢圓玫瑰樹堿、足葉乙苷、米托蒽醌、saintopin、托泊替康和CP-115,953。
在上述試劑盒的優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA促旋酶抑制劑選自環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星、培氟沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、萘啶酸、奧索利酸和吡咯米酸。
在上述試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑為單疊氮乙錠。
發(fā)明的有益效果
利用本發(fā)明可通過流式細(xì)胞術(shù)方便且快速地區(qū)分食品和臨床樣品中的活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞。本發(fā)明的方法和試劑盒可應(yīng)用于自動(dòng)檢驗(yàn)，并具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。
附圖簡述
[圖I]該圖顯示了在對LP-處理組大腸桿菌(Escherichiacoli)懸浮液(活細(xì)菌和受損細(xì)菌)和LP-處理組表皮葡萄球菌(Staohylococcusepidermidis)懸浮液(活細(xì)菌和受損細(xì)菌)，以及未處理組大腸桿菌懸浮液(活細(xì)菌和受損細(xì)菌)和未處理組表皮葡萄球菌懸浮液(活細(xì)菌和受損細(xì)菌)進(jìn)行SYT09/PI染色后，F(xiàn)CM測量的結(jié)果。
[圖2]該圖顯示了在對LP-處理的接種大腸桿菌(活細(xì)菌)的UHT均質(zhì)牛奶(homogenized milk)和LP-處理的沒有接種細(xì)菌的UHT均質(zhì)牛奶進(jìn)行SYT09/PI染色后，F(xiàn)CM測量的結(jié)果。
[圖3]該圖顯示了在對LP-處理的接種大腸桿菌(活細(xì)菌和受損細(xì)菌)的LTLT非均質(zhì)牛奶、LP-處理的接種表皮葡萄球菌(活細(xì)菌和受損細(xì)菌)的LTLT非均質(zhì)牛奶以及LP-處理的沒有接種細(xì)菌的LTLT非均質(zhì)牛奶SYT09/PI染色后，F(xiàn)CM測量的結(jié)果。
[圖4]該圖顯示了在對LP-處理的和EMA-處理的大腸桿菌懸浮液(活細(xì)菌和受損細(xì)菌)以及表皮葡萄球菌懸浮液(活細(xì)菌和受損細(xì)菌)SYT09/PI染色后，F(xiàn)CM測量的結(jié)果O
[圖5]該圖顯示了在對LP-處理的和EMA-處理的接種大腸桿菌(活細(xì)菌)的UHT均質(zhì)牛奶、接種表皮葡萄球菌(活細(xì)菌)的UHT均質(zhì)牛奶以及沒有接種細(xì)菌的UHT均質(zhì)牛奶SYT09/PI染色后，F(xiàn)CM測量的結(jié)果。
[圖6]該圖顯示了在對LP-處理的和EMA-處理的接種大腸桿菌(活細(xì)菌和受損細(xì)菌)的非均質(zhì)牛奶SYT09/PI染色后，F(xiàn)CM測量的結(jié)果。
[圖7]該圖顯示了在對LP-處理的和EMA-處理的接種表皮葡萄球菌(活細(xì)菌和受損細(xì)菌)的LTLT非均質(zhì)牛奶SYT09/PI染色后，F(xiàn)CM測量的結(jié)果。
[圖8]該圖顯示了接種大腸桿菌(活細(xì)菌)和表皮葡萄球菌(活細(xì)菌)的UHT均質(zhì)牛奶在LP-處理和a)安吖啶、b)橢圓玫瑰樹堿、c)喜樹堿或d)環(huán)丙沙星處理后，對其SYT09/PI染色后，F(xiàn)CM測量的結(jié)果。
[圖9]該圖顯示了含有生理鹽水的微型管在沸水中浸沒的時(shí)間與該微型管中液體溫度的關(guān)系。
[
圖10]在EMA處理之前(N)或之后(E)提取和純化的大腸桿菌、克雷伯氏菌(Klebsiella)、朽1檬酸桿菌(Citrobacter)和沙門氏菌(Salmonella)(活細(xì)菌和受損細(xì)菌)染色體DNA的電泳照片。
[圖11]在EMA處理之前(N)或之后(E)提取和純化的大腸桿菌(受損細(xì)菌和死細(xì)菌)的染色體DNA的電泳照片。
[圖12]在EMA處理之前(N)或之后(E)提取和純化的表皮葡萄球菌(活細(xì)菌、受損細(xì)菌和死細(xì)菌)的染色體DNA的電泳照片。
[圖13]該圖顯示了在EMA處理之前和之后對大腸桿菌的活細(xì)菌、受損細(xì)菌和死細(xì)菌FCM測量的結(jié)果。
[圖14]該圖顯示了在EMA處理之前和之后對表皮葡萄球菌的活細(xì)菌、受損細(xì)菌和死細(xì)菌FCM測量的結(jié)果。
[圖15]該圖顯示了在EMA處理之前和之后對結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的活細(xì)菌以及對異煙酸和利福平處理的結(jié)核分枝桿菌的受損細(xì)菌和死細(xì)菌FCM測量的結(jié)果。
[圖16]該圖顯示了在EMA處理之前和之后，對李斯特菌(Listeria)的活細(xì)菌以及對氨芐青霉素和慶大霉素處理的李斯特菌的受損細(xì)菌和死細(xì)菌FCM測量的結(jié)果。
[圖17]該圖顯示了根據(jù)ATP法對大腸桿菌、表皮葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌和李斯特菌的活細(xì)菌、受損細(xì)菌和死細(xì)菌分類以及根據(jù)本發(fā)明的方法對上述細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分之間的
一致性。
[圖18]該圖顯示了根據(jù)酯酶法對大腸桿菌、表皮葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌和李斯特菌的活細(xì)菌、受損細(xì)菌和死細(xì)菌分類以及根據(jù)本發(fā)明的方法對上述細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分之間的
一致性。
[圖19]該圖顯示在EMA處理之前或之后對人血液中李斯特菌進(jìn)行FCM測量的結(jié)
果O
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案
以下，將詳細(xì)描述本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。然而，本發(fā)明并不限于以下優(yōu)選的實(shí)施方案，可在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行任意修改。
根據(jù)本發(fā)明，制備在流式細(xì)胞術(shù)(此后也簡寫為“FCM”)中所使用的測量樣品的方法是一種制備用于通過流式細(xì)胞術(shù)檢測試樣中微生物的活細(xì)胞所使用的測量用樣品的方法，其包括下列步驟
a)用具有分解試樣中除微生物細(xì)胞之外的其他細(xì)胞、蛋白膠粒或脂質(zhì)的活性的酶處理試樣的步驟，和
b)用拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或DNA促旋酶抑制劑處理試樣的步驟。
用于檢測試樣中微生物的活細(xì)胞的方法是一種使用通過上述制備供FCM使用的測量樣品的方法獲得的樣品檢測活細(xì)胞的方法，并且除上述步驟a)和b)之外進(jìn)一步包括下列步驟
c)用核染色劑處理步驟a)和b)中處理的試樣的步驟，和
d)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測用核染色劑處理的試樣中微生物的步驟。
在本說明書中，“試樣”指有待檢測存在于其中的微生物的活細(xì)胞的被檢對象，其并不特別受限，只要微生物能通過FCM檢測即可。例如牛奶、乳制品、用牛奶或乳制品作原料生產(chǎn)的食品、血樣、尿樣、脊髓液樣品、滑液樣品和胸膜液樣品等。牛奶、乳制品、用牛奶或乳制品作原料生產(chǎn)的食品特別優(yōu)選。在本發(fā)明中，試樣可以是任何一種上述產(chǎn)品和生物樣品自身，并且可以是通過稀釋或濃縮任何一種上述產(chǎn)品和生物樣品或?qū)θ魏我环N上述產(chǎn)品和生物樣品進(jìn)行除根據(jù)本發(fā)明方法的處理之外的預(yù)處理所獲得的試樣。預(yù)處理的例子包括熱處理、過濾、用抗生素處理等。
“微生物”是有待通過本發(fā)明方法進(jìn)行檢測的對象，其并不特別受限，只要能通過FCM檢測，并且拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、DNA促旋酶抑制劑或單疊氮乙錠能以不同的方式作用于該微生物的活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞即可。優(yōu)選的例子包括細(xì)菌、絲狀真菌、酵母等。細(xì)菌包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽性菌的例子包括葡萄球菌屬細(xì)菌例如表皮葡萄球菌、鏈球菌屬細(xì)菌、李斯特菌屬細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌、分枝桿菌屬細(xì)菌等。革蘭氏陰性菌的例子包括埃希氏桿菌屬細(xì)菌例如大腸桿菌、以腸桿菌屬細(xì)菌為代表的腸道菌群、沙門氏菌屬細(xì)菌、弧菌屬細(xì)菌、假單胞菌屬細(xì)菌等。
在本發(fā)明中，“活細(xì)菌(活細(xì)胞)”指當(dāng)其在通常優(yōu)選的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)能增殖、以及在優(yōu)選的條件下該細(xì)胞處于具有細(xì)胞代謝活性的狀態(tài)(活且可培養(yǎng)的狀態(tài))下能增殖的細(xì)胞，并且還是一種基本上沒有細(xì)胞壁損傷的細(xì)胞。作為如上所述的代謝活性，例如ATP活性、酯酶活性等。
“受損細(xì)菌”(受損細(xì)胞 或活而非可培養(yǎng)的細(xì)胞)是一種由于其因人為應(yīng)激或環(huán)境應(yīng)激損傷，即使當(dāng)其處于最佳培養(yǎng)條件下也幾乎無法增殖的狀態(tài)的細(xì)胞，其顯示較活細(xì)胞更低水平的代謝活性，但與死細(xì)胞相比則顯示顯著水平的代謝活性(受損或活而非可培養(yǎng)的[VNC]態(tài))。盡管基于導(dǎo)致?lián)p傷的應(yīng)激類型，在狹義下可區(qū)分VNC細(xì)胞和受損細(xì)胞，但在本發(fā)明中相對于活細(xì)胞或死細(xì)胞，在狹義下的VNC細(xì)胞和受損細(xì)胞可都稱為受損細(xì)胞。
在食品衛(wèi)生檢查領(lǐng)域和臨床檢查領(lǐng)域中，檢測通過使用中度熱處理或施用抗生素而具有受損細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)菌引起了特別注意，本發(fā)明提供了一種用于檢測微生物的方法，其能區(qū)分所有狀態(tài)的細(xì)胞，不但包括對活細(xì)胞的檢測，還包括區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，以及區(qū)分活細(xì)胞和受損細(xì)胞。
“死細(xì)胞”是一種處于即使在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，也無法增殖、不具有代謝活性(死亡狀態(tài))的狀態(tài)的細(xì)胞。此外，其處于盡管細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)仍能維持，但細(xì)胞壁自身高度受損，且具有弱通透性的核染色劑如碘化丙錠可穿透該細(xì)胞壁的狀態(tài)。
活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量單位通常表示為細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞)/ml?；罴?xì)胞的數(shù)量可近似為通過在適宜的平板培養(yǎng)基上于最佳條件下培養(yǎng)細(xì)胞所形成的集落數(shù)量(cfu/ml(集落形成單位/ml))?？赏ㄟ^對活細(xì)胞懸浮液進(jìn)行熱處理例如在沸水中熱處理，制備死細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)樣品。在該情況下，在上述樣品中死細(xì)胞的數(shù)量可近似為熱處理前活細(xì)胞懸浮液的cfu/ml。盡管對于制備死細(xì)胞，在沸水中熱處理時(shí)間依不同類型的微生物而改變，但實(shí)施例中所述細(xì)菌的死細(xì)胞例如可通過約12分鐘的熱處理來制備。與用于制備死細(xì)胞的沸水熱處理時(shí)間相比，可通過在沸水中熱處理較短的時(shí)間制備受損細(xì)胞。舉例來說，可通過約50秒的熱處理制備實(shí)施例中所述細(xì)菌的受損細(xì)胞。在該情況下，受損細(xì)胞的數(shù)量可近似為熱處理前活細(xì)胞懸浮液的cfu/ml。此外，還可通過用抗生素處理制備受損細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)樣品。在這種情況下，受損細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量可近似為用抗生素處理活細(xì)胞懸浮液后除去抗生素，測定可見光(波長600nm)透射率即濁度，并與已知活細(xì)胞密度的活細(xì)胞懸浮液比較濁度后將細(xì)胞在適宜的平板培養(yǎng)基上于最佳條件下培養(yǎng)時(shí)所形成的集落數(shù)量(Cfu/ml) ο
“蛋白膠?！笔窃嚇又兴哪z粒，其含有作為組分的蛋白并且被核染色劑非特異性染色，其例子包括微膠粒酪蛋白。
以下，將闡明本發(fā)明方法的每一步。
(I)步驟 a)
在該步驟中，用具有分解試樣中除微生物細(xì)胞之外的其他細(xì)胞、蛋白膠粒或脂質(zhì)的活性的酶處理試樣。
一般來說為了通過FCM檢測細(xì)菌，應(yīng)當(dāng)讓細(xì)菌以至少約IOOcf的量通過檢測器。然而，當(dāng)通過FCM檢測試樣如牛奶中的活細(xì)胞時(shí),不僅僅是細(xì)菌,大量污染物組分如體細(xì)胞、 脂肪球和微膠粒酪蛋白，擁入FSC(向前散射光)-SSC(側(cè)散射光)上的門限(gate)(細(xì)菌門限)中，因此即使有約IOOcfu的細(xì)菌通過檢測器，也無法檢測它們。因此，優(yōu)選通過用酶處理除去或減少試樣中存在的除微生物之外的其他細(xì)胞、蛋白膠粒、脂質(zhì)等。
在試樣為牛奶、乳制品或由牛奶或乳制品作原料生產(chǎn)的食品的情況下，試樣中存在的除微生物之外的其他細(xì)胞的例子包括牛白細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞等。此外，在試樣為生物樣品例如血樣、尿樣、脊髓液樣品、滑液樣品或胸膜液樣品情況下，細(xì)胞的例子包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞(粒性白細(xì)胞、中性白細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)、血小板等。
上述酶并不特別受限，只要酶能分解上述污染物并且不損傷作為所選擇的檢測對象的微生物活細(xì)胞即可，其例子包括脂解酶和蛋白酶。盡管可單獨(dú)使用一種酶，或可聯(lián)合使用兩種或更多種酶，但優(yōu)選既使用脂解酶又使用蛋白酶。
脂解酶的例子包括脂肪酶、磷酸酶等，蛋白酶的例子包括蛋白酶K、鏈霉蛋白酶等。
盡管用這些酶進(jìn)行處理的條件并不特別受限，但能適當(dāng)?shù)氐玫酱_定，例如，對于脂肪酶條件為10-50U/ml的終濃度、25-37°C的溫度以及30分鐘或更久的處理時(shí)間，對于蛋白酶K條件為10-50U/ml的終濃度、25-37°C的溫度以及30分鐘或更久的處理時(shí)間。
用脂解酶和蛋白酶的處理優(yōu)選以(i)用脂解酶處理和(ii)用蛋白酶處理的次序進(jìn)行，或同時(shí)添加它們進(jìn)行處理。盡管處理后可容許這些酶存在于試樣中，但優(yōu)選通過離心等將這些酶與細(xì)胞分離。
⑵步驟b)
在該步驟中，用拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或DNA促旋酶抑制劑處理試樣。優(yōu)選在步驟a)之后進(jìn)行步驟b)。
用于本發(fā)明的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和DNA促旋酶抑制劑指不抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶和DNA促旋酶切割DNA活性，但抑制DNA再連接或增強(qiáng)DNA切割正向速率的那些抑制劑。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和DNA促旋酶抑制劑優(yōu)選通過共價(jià)連接與微生物的染色體DNA結(jié)合的那些抑制齊U、嵌入染色體DNA中并在可見光照射下通過共價(jià)連接與染色體DNA結(jié)合的那些抑制劑、僅僅嵌入染色體DNA的那些抑制劑或與拓?fù)洚悩?gòu)酶或DNA促旋酶形成復(fù)合物的那些抑制劑。
盡管優(yōu)選既使用拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑又使用DNA促旋酶抑制劑，但也可使用其中的任何一種。
拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和DNA促旋酶抑制劑優(yōu)選為對活細(xì)胞和受損細(xì)胞、死細(xì)胞、體細(xì)胞如牛白細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等具有不同作用的那些抑制劑，更優(yōu)選為相對于活細(xì)胞的細(xì)胞壁，對受損細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁以及體細(xì)胞如牛白細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等的細(xì)胞膜具有更高通透性的那些抑制劑。
拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的例子包括安吖啶、喜樹堿、多柔比星、橢圓玫瑰樹堿、足葉乙苷、米托蒽醌、saintopin、托泊替康、CP-115,953等。可單獨(dú)使用一種拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，或可聯(lián)合使用兩種或更多種拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。
DNA促旋酶抑制劑的例子包括環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星、培氟沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、萘啶酸、奧索利酸、吡咯米酸等?？蓡为?dú)使用一種DNA促旋酶抑制劑，或可聯(lián)合使用兩種或更多種DNA促旋酶抑制劑。
可適當(dāng)?shù)卮_定用于拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或DNA促旋酶抑制劑處理的條件。例如，通過添加不同濃度的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或DNA促旋酶抑制劑到作為檢測對象的微生物的活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞的懸浮液中、放置一段時(shí)間、然后通過離心等收獲細(xì)胞、用核染色 劑染色細(xì)胞并通過FCM分析細(xì)胞，可確定能容易地區(qū)分活細(xì)胞與受損細(xì)胞和死細(xì)胞的條件。此外，通過添加不同濃度的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑到活細(xì)胞和上述不同細(xì)胞(含有受損細(xì)胞的活細(xì)胞)的懸浮液中、保持預(yù)定的一段時(shí)間、然后通過離心等收獲活細(xì)胞和上述不同的細(xì)胞、用核染色劑染色細(xì)胞并通過FCM分析細(xì)胞，可確定能容易地區(qū)分作為檢測對象的微生物的活細(xì)胞與體細(xì)胞如牛白細(xì)胞、血小板等的條件。上述條件的例子包括，具體而言，對于安吖啶=1-100 μ g/ml的終濃度、25-37°C的溫度和5分鐘-48小時(shí)的處理時(shí)間，對于橢圓玫瑰樹堿0. 05-5 μ g/ml的終濃度、25-37°C的溫度和10分鐘-48小時(shí)的處理時(shí)間，對于喜樹堿1-100 μ g/ml的終濃度、25-37°C的溫度和10分鐘-48小時(shí)的處理時(shí)間，對于環(huán)丙沙星0. 4-40 μ g/ml的終濃度、25-37°C的溫度和10分鐘-48小時(shí)的處理時(shí)間，對于足葉乙苷1-100 μ g/ml的終濃度、25-37°C的溫度和5分鐘-48小時(shí)的處理時(shí)間，以及對于米托蒽醌0. 1-10 μ g/ml的終濃度、25-37°C的溫度和10分鐘-48小時(shí)的處理時(shí)間。在試樣于預(yù)定條件下處理后，優(yōu)選通過稀釋和/或離心分離等除去抑制劑終止處理。
相對于活細(xì)胞的細(xì)胞壁，上述拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和DNA促旋酶抑制劑更易于穿透受損細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁。因此，認(rèn)為如果處理時(shí)間在上述范圍內(nèi)，則抑制劑基本上不穿透活細(xì)胞的細(xì)胞壁，但它們穿透受損細(xì)胞、死細(xì)胞和包括受損細(xì)胞在內(nèi)的活的體細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儍H具有細(xì)胞膜而無細(xì)胞壁。估計(jì)拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或DNA促旋酶抑制劑穿透體細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞，接著通過共價(jià)連接與染色體DNA無序結(jié)合，嵌入DNA中或與拓?fù)洚悩?gòu)酶形成復(fù)合物體，并進(jìn)一步抑制DNA通過體細(xì)胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶II或拓?fù)洚悩?gòu)酶I、受損細(xì)胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶IV或拓?fù)洚悩?gòu)酶I、III或DNA促旋酶的再連接，或增強(qiáng)了 DNA切割的正向速率，導(dǎo)致染色體DNA斷裂。
認(rèn)為如果在用穿透活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁的核染色劑如SYT09染色中，與活細(xì)胞相比受損細(xì)胞的染色體DNA擇優(yōu)斷裂，則與活細(xì)胞相比受損細(xì)胞的染色強(qiáng)度弱，結(jié)果有可能在通過FCM的檢測中區(qū)分活細(xì)胞和受損細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑為單疊氮乙錠，并且該方法包括對添加單疊氮乙錠的試樣照射可見光的步驟。與微生物的活細(xì)胞的細(xì)胞壁相比，單疊氮乙錠(EMA)更易于穿透受損細(xì)胞的細(xì)胞壁。因此，認(rèn)為EMA基本上無法穿透活細(xì)胞的細(xì)胞壁，但能穿透受損細(xì)胞的細(xì)胞壁和包括受損細(xì)胞在內(nèi)的活的體細(xì)胞的細(xì)胞膜，因?yàn)樗鼈兊募?xì)胞膜不是細(xì)胞壁。當(dāng)血液中白細(xì)胞和血小板為活細(xì)胞時(shí)，在無菌水或低滲鹽溶液中EMA更易于穿透細(xì)胞的細(xì)胞膜。EMA透入體細(xì)胞和受損細(xì)胞，并無序地嵌入染色體DNA，然后僅嵌入的EMA通過可見光照射轉(zhuǎn)變?yōu)榈e，并通過共價(jià)連接與染色體DNA結(jié)合。估計(jì)之后其抑制DNA通過體細(xì)胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶II、受損細(xì)胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶IV或DNA促旋酶的再連接，導(dǎo)致染色體DNA斷裂。
可適當(dāng)?shù)卮_定用于EMA處理的條件。例如，通過添加不同濃度的EMA到作為檢測對象的微生物的活細(xì)胞和受損細(xì)胞的懸浮液中、保持一段時(shí)間、然后用可見光照射它們、根據(jù)需要通過離心等收獲細(xì)胞、用核染色劑染色細(xì)胞并通過FCM分析細(xì)胞，可確定能容易地區(qū)分活細(xì)胞和受損細(xì)胞的條件。
也可通過使用不同照射時(shí)間進(jìn)行上述這樣的實(shí)驗(yàn)適宜地確定可見光照射的優(yōu)選條件。具體來說，用EMA處理優(yōu)選使用O. 5-100 μ g/ml的終濃度、在4_10°C的溫度下持續(xù)5分鐘-48小時(shí)的條件進(jìn)行。此外，EMA處理優(yōu)選在光屏蔽的條件下進(jìn)行。作為可見光，優(yōu)選含500-700nm組分的可見光。用于可見光照射的條件的具體例子包括距離試樣10-50cm照射100-750W的可見光5分鐘-2小時(shí)。優(yōu)選在低溫下進(jìn)行可見光照射，例如用冰冷卻樣品。
(3)步驟 c)
在該步驟中，用核染色劑處理步驟a)和b)中處理的試樣。核染色劑包含能穿透活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁的至少一種第一染色劑。“能穿透活細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁的染色劑”指對于活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁的通透性基本上相同的試劑，即使通透性不同，與下述第二染色劑相比，該試劑對活細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁的通透性差異較小。第一染色劑的具體例子包括例如SYT09。
此外，核染色劑優(yōu)選進(jìn)一步包含與第一染色劑相比，相對于細(xì)胞和受損細(xì)胞更易于穿透死細(xì)胞的細(xì)胞壁的第二染色劑。換句話說，第二染色劑是一種能將活細(xì)胞和死細(xì)胞染為不同顏色的染色劑。第二染色劑的例子包括碘化丙錠(PD。當(dāng)這些核染色劑穿透入細(xì)胞時(shí)，它們嵌入染色體DNA，并通過激光束照射受激發(fā)射熒光。例如，如果用λ 488nm的激光束照射嵌入DNA的SYT09和PI，它們會(huì)達(dá)到激發(fā)態(tài)，并且SYT09和PI分別發(fā)射具有λ 518nm的中心波長(center wavelength)的綠色突光以及具有λ 617nm的中心波長的紅色突光。
在用染色劑染色中，如果在試樣中存在的活細(xì)胞和死細(xì)胞以及除微生物之外的體細(xì)胞之間存在明確差異，則可使用這樣的染色劑在某種程度上區(qū)分活細(xì)胞。然而，即使能穿透物理受損的死細(xì)胞的染色劑也許不能穿透輕微受損的細(xì)胞，因此與活細(xì)胞相比只顯示很小的染色差異。在這種情況下，僅用第二染色劑就難以明確區(qū)分活細(xì)胞和受損細(xì)胞。
然而，通過上述步驟b)的處理斷裂受損細(xì)胞的染色體，由此變得更不可能為染色劑所染色，因此就有可能通過用第一染色劑染色區(qū)分活細(xì)胞和受損細(xì)胞等。此外，通過使用第二染色劑，通過FCM對細(xì)胞進(jìn)行二維檢測就成為可能。因此，在本發(fā)明中，盡管可僅通過用第一染色劑染色檢測活細(xì)胞，但使用第二染色劑卻能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞以提高檢測準(zhǔn)確性，因此優(yōu)選既使用第一染色劑又使用第二染色劑。
可同時(shí)或分別使用第一染色劑和第二染色劑進(jìn)行染色。
用染色劑染色的條件并不特別受限，可使用通常用于微生物染色體DNA染色的條件。具體來說，對于SYT09優(yōu)選將染色劑以4. 0-6. O μ M的終濃度添加到細(xì)胞懸浮液中，對于PI優(yōu)選將染色劑以25. 0-35. O μ M的終濃度添加到細(xì)胞懸浮液中，并在15_25°C下反應(yīng)10-20分鐘。[0122](4)步驟 d)
在該步驟中，通過FCM檢測用上述步驟c)中核染色劑處理的試樣中的微生物。通過FCM檢測微生物的原理如下。
如果諸如微生物的顆粒成直線排列并依次用氬激光束(λ 488nm)照射，則光線以相對于激光束軸1.5-19°的小角度散射。該散射光稱為向前散射光(FSC)，散射角度基本上與顆粒大小成正比。同時(shí)以相對于激光束軸約90°的角度散射的光線稱為側(cè)散射光(SSC)，據(jù)說反映了包括DNA結(jié)構(gòu)在內(nèi)的顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。因此，如果將FSC-SSC圖畫為x-y圖，則水平軸代表顆粒大小，垂直軸代表顆粒內(nèi)在結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。
如果用上述第一核染色劑和第二核染色劑染色細(xì)菌，并用激光束照射，則對于個(gè)體細(xì)胞標(biāo)出位于FSC-SSC圖上某一特定區(qū)域的點(diǎn)。通過使用FCM分析軟件(例如，CellQuest Ver. 3. I, Becton Dickinson, Sydney, Australia),圍繞著圖上特定區(qū)域的四周(門 限)，選擇性檢出僅有細(xì)菌顆粒的區(qū)域，并只聚焦在所檢出的顆粒上，就可創(chuàng)建活細(xì)胞和死細(xì)胞的點(diǎn)圖(參見圖1-8) ο
優(yōu)選使用下列條件進(jìn)行FCM測量。即優(yōu)選使用15mW氬激光束(波長λ = 488nm)作為激發(fā)光，并分別測定向前散射光(FSC，< 15° )、側(cè)散射光(> 15° )和三種熒光信號FL1-3。對于熒光信號FL1-3的測量，對綠色熒光(FLl)優(yōu)選使用515_545nm特別是530nm的帶通濾波器，對黃橙色熒光(FL2)優(yōu)選使用564-606nm特別是585nm的帶通濾波器，以及對紅色熒光(FL3)優(yōu)選使用655-800nm特別是670nm的長波長帶通濾波器。
此外，測量優(yōu)選使用如下檢測器設(shè)定值來進(jìn)行FSC E02, SSC :376，F(xiàn)Ll 709, FL2 736和FL3 :811(所有都通過使用對數(shù)增益來表示)，％補(bǔ)償?shù)脑O(shè)定值為FL1_FL2 :0. 0，F(xiàn)L2-FL1 0. 0,FL2-FL3 :0. O 和 FL3-FL2 :0.0，F(xiàn)SC 信號 150% 的閾值(邊界值)，低流速 FCM檢測懸浮液的進(jìn)料速率12μ 1/min，進(jìn)入FSC-SSC圖上門限中的細(xì)胞計(jì)數(shù)(顆粒數(shù)量)為5，000, 000,以及30秒的測量時(shí)間。
例如，在優(yōu)選的條件下，在SYT09/PI圖上SYT09陽性和PI陰性區(qū)(SYT09 (+) · PK-))中標(biāo)繪活細(xì)胞和受損細(xì)胞，并主要在SYT09陽性和PI陽性區(qū)(SYT09 (+) · PI(+))中標(biāo)繪死細(xì)胞。SYT09陰性和陽性的邊界以及PI陰性和陽性的邊界由SYT09的IO3的熒光強(qiáng)度和PI的2X IO2的熒光強(qiáng)度所代表。門限設(shè)定值優(yōu)選FSC 102-2 X IO3 和 SSC : 10-2 X IO2。
可使用商業(yè)上可得到的FCM裝置進(jìn)行通過FCM的分析。用于FCM的條件并不特別受限，通常用于微生物如細(xì)菌檢測和分離的條件可用于本發(fā)明中。
在本發(fā)明中，“活細(xì)胞檢測”包括既測定試樣中活細(xì)胞的存在與否，也測定試樣中活細(xì)胞的數(shù)量。此外，“活細(xì)胞檢測”還包括區(qū)分活細(xì)胞與受損細(xì)胞和/或死細(xì)胞，以及測定活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞各自存在與否?；罴?xì)胞的數(shù)量并不限于絕對數(shù)量，可以是相對于對照試樣的相對數(shù)量。
<3>本發(fā)明的試劑盒
本發(fā)明的第一試劑盒是一種用于制備上述供FCM測量使用的第一樣品的試劑盒，包含選自作為酶組分的脂解酶和蛋白酶的酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或DNA促旋酶抑制劑以及核染色劑。
本發(fā)明的第二試劑盒是一種用于制備上述供FCM測量使用的第二樣品的試劑盒，包含選自作為酶組分的脂解酶和蛋白酶的酶、單疊氮乙錠和核染色劑。
在上述試劑盒中，選自脂解酶和蛋白酶的酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或DNA促旋酶抑制劑以及核染色劑與本發(fā)明方法中所說明的那些酶、抑制劑和核染色劑相同。
除上述組分之外，本發(fā)明的試劑盒還可包含稀釋劑、描述本發(fā)明方法的說明書等。
實(shí)施例
以下，本發(fā)明將根據(jù)下列實(shí)施例進(jìn)行更具體的說明。然而，本發(fā)明并不受限于下列的實(shí)施例。
[試樣]
在下列實(shí)施例和對照實(shí)施例中，將通過使用大腸桿菌DH5 α (以下也簡稱為“大腸桿菌”)和表皮葡萄球菌KD菌株(以下也簡稱為“表皮葡萄球菌”)進(jìn)行下列處理所制備的試樣用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
(I)通過使用流式細(xì)胞儀檢測處于生理鹽水懸浮液中的活細(xì)胞和受損細(xì)胞(稱為“未處理組”)。
(2)用脂肪酶和蛋白酶K處理活細(xì)胞和受損細(xì)胞的生理鹽水懸浮液，然后通過使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞(稱為“LP-處理的組”)。上述(I)和(2)的樣品的結(jié)果示于對照實(shí)施例I中。
(3)將活細(xì)胞和受損細(xì)胞懸浮于進(jìn)行超高溫巴氏滅菌(1301，2秒，稱為“研11'”)的牛奶以及進(jìn)行低溫長時(shí)巴氏滅菌(63°C，30*#j#S“LTLT”)的牛奶中，并用脂肪酶和蛋白酶K處理懸浮液。通過使用流式細(xì)胞儀檢測懸浮液中的細(xì)胞(稱為“Μ-LP-處理組”)。此外，通過使用流式細(xì)胞儀檢測用脂肪酶和蛋白酶K處理的牛奶中的細(xì)胞。結(jié)果示于對照實(shí)施例2和3中。
(4)對上述(2)的樣品進(jìn)行進(jìn)一步的單疊氮乙錠(EMA)處理，并通過使用流式細(xì)胞儀檢測檢測其中的細(xì)胞(稱為“LPE-處理組”)。結(jié)果示于實(shí)施例I中。
(5)對上述(3)的樣品進(jìn)行進(jìn)一步的EMA處理，并通過使用流式細(xì)胞儀檢測檢測其中的細(xì)胞(稱為“M-LPE-處理組”)。結(jié)果示于實(shí)施例2和3中。
(6)如上述(5)相同方法所獲得的樣品，條件是EMA處理換為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑處理或DNA促旋酶抑制劑處理(稱為“Μ-LPD-處理組”)。結(jié)果示于實(shí)施例4中。
[對照實(shí)施例I]
使用流式細(xì)胞儀檢測懸浮于生理鹽水中的大腸桿菌和表皮葡萄球菌的活細(xì)胞和受損細(xì)胞(LP-處理或未處理的)
(I)樣品制備
1-1.制備活細(xì)胞和受損細(xì)胞懸浮液
1-1-1.大腸桿菌懸浮液
在L肉湯培養(yǎng)基中接種大腸桿菌DH5a，并在10°C下靜置培養(yǎng)12小時(shí)，然后在4°C和3，OOOxg下冷凍離心培養(yǎng)物10分鐘以收獲細(xì)胞。將所收獲的細(xì)胞懸浮于生理鹽水(Otsuka Pharmaceutical,該生理鹽水將用于以下說明書中)中，并離心懸浮液以再次收獲細(xì)胞。再次重復(fù)相同的操作來洗滌細(xì)胞。
將洗滌的細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，對懸浮液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，并將O. Iml懸浮液加到L瓊脂培養(yǎng)基上并培養(yǎng)以測定活細(xì)胞計(jì)數(shù)。最后將上述細(xì)胞懸浮液調(diào)節(jié)至4X IO6Cfu/ml以獲得活細(xì)胞懸浮液。
將Iml體積的活細(xì)胞懸浮液倒入2ml體積的微型管中，并浸沒于100°C沸水中50秒以制備受損細(xì)胞懸浮液。分別地，制備另一受損細(xì)胞懸浮液，并施加O. Iml體積到L瓊脂培養(yǎng)基上以確認(rèn)該細(xì)胞不形成集落。
1-1-2.表皮葡萄球菌懸浮液
在L肉湯培養(yǎng)基中接種表皮葡萄球菌KD菌株，并在37°C下靜置培養(yǎng)18小時(shí)，然后在4°C和3，OOOxg下冷凍離心培養(yǎng)物10分鐘以收獲細(xì)胞。將所收獲的細(xì)胞懸浮于生理鹽水(Otsuka Pharmaceutical)中，并離心懸浮液以再次收獲細(xì)胞。再次重復(fù)相同的操作來洗漆細(xì)胞。將洗滌的細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，對懸浮液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，并將O. Iml懸浮液加到L瓊脂培養(yǎng)基上并培養(yǎng)細(xì)胞以測定活細(xì)胞計(jì)數(shù)。最后將上述細(xì)胞懸浮液調(diào)節(jié)至4 X IO7Cfu/ml以獲得活細(xì)胞懸浮液。
將Iml體積的活細(xì)胞懸浮液倒入2ml體積的微型管中，并浸沒于100°C沸水中50秒以制備受損細(xì)胞懸浮液。分別地，制備另一受損細(xì)胞懸浮液，并施加O. Iml體積到L瓊脂培養(yǎng)基上以確認(rèn)該細(xì)胞不形成集落。
1-2.活細(xì)胞和受損細(xì)胞懸浮液的脂肪酶處理和蛋白酶K處理
將Iml體積的上述1-1-1和1_1_2中制備的大腸桿菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)和表皮葡萄球菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)分別倒入2ml體積的微型管中。向懸浮液添加用生理鹽水調(diào)節(jié)至189U/ml的100 μ I脂肪酶(E. C. 3. I. I. 3，Sigma)，并在37°C下溫育懸浮液30分鐘以進(jìn)行脂肪酶處理。
向進(jìn)行了脂肪酶處理的每種細(xì)胞懸浮液添加20μ I的1250U/ml蛋白酶Κ(Ε.C. 3. 4. 21. 64，Sigma)溶液，并在37°C下溫育混合物30分鐘以進(jìn)行蛋白酶K處理。
在脂肪酶處理和蛋白酶K處理(以下也稱為“LP處理”)后，在4°C和14，OOOxg下冷凍離心10分鐘收獲細(xì)胞，并將收獲的細(xì)胞懸浮于生理鹽水中以分別制備LP-處理組大腸桿菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)和LP-處理組表皮葡萄球菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)。
此外，在上述方法中，添加100 μ I生理鹽水而非脂肪酶，添加20 μ I生理鹽水而非蛋白酶K，并以相同方式處理以分別制備未處理組大腸桿菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)和未處理組表皮葡萄球菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)。
(2) FCM檢測方法
向取300 μ I體積的LP-處理組大腸桿菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)、LP-處理組表皮葡萄球菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)、未處理組大腸桿菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)和未處理組表皮葡萄球菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)分別添加O. 9 μ I SYT09/PI熒光染色劑(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability kit, Molecular Probes, SYT09/PI = 1/1混合)，在光屏蔽下于室溫反應(yīng)15分鐘以制備每種樣品。對于這些樣品，通過使用 FCM 測量裝置-FACS Calibu (BectonDickinson)進(jìn)行測量。
測量條件如下。當(dāng)使用15mW氬激光(波長λ = 488nm)作為激發(fā)光時(shí)，以及作為陽極溶液(sheath solution)輸送FCM樣品液體時(shí),使用Becton Dickinson產(chǎn)物。此外，分別測定向前散射光(FSC，<15° )、側(cè)散射光(>15° )和三種熒光信號FL1-3。對于熒光信號FL1-FL3的測定，530nm(515-545nm)的帶通濾波器用于綠色熒光(FLl)，585nm(564_606nm的帶通濾波器用于黃橙色熒光(FL2)以及670nm(655-800nm)的長波長的帶通濾波器用于紅色熒光(FL3)。
檢測器的設(shè)定值分別為FSCE02, SSC :376，F(xiàn)Ll :709，F(xiàn)L2 :736 和 FL3 :811 (所有都通過使用對數(shù)增益來表示)，使用FL1-FL2 :0. 0，F(xiàn)L2-FL1 :0. 0，F(xiàn)L2_FL3 :0. O和FL3-FL2
0.0的％補(bǔ)償?shù)脑O(shè)定值，F(xiàn)SC信號150設(shè)定為閾值(邊界值)，F(xiàn)CM檢測懸浮液的進(jìn)料速率設(shè)定為12 μ 1/min，進(jìn)入FSC-SSC圖上門限中的細(xì)胞計(jì)數(shù)(顆粒數(shù)量)為5，000，000和30秒的測量時(shí)間，以進(jìn)行該測量。
(3)檢測結(jié)果
該檢測的結(jié)果示于圖I。
SYT09顯示高的細(xì)胞壁通透性并穿透活細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁，而PI則顯示低的 細(xì)胞壁通透性并僅能穿透物理受損死細(xì)胞的細(xì)胞壁。因此，最初，在SYT09/PI圖上活細(xì)胞的結(jié)果應(yīng)標(biāo)繪于SYT09(+) · PI (-)區(qū)中，而死細(xì)胞的結(jié)果則應(yīng)標(biāo)繪于SYT09(+) · PI (+)區(qū)中。事實(shí)上，當(dāng)比較未處理組大腸桿菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)和未處理組表皮葡萄球菌懸浮液(活細(xì)胞和受損細(xì)胞)的結(jié)果時(shí)，PI并不穿透活細(xì)胞，也不穿透受損細(xì)胞，則活細(xì)胞和受損細(xì)胞無法被清楚地區(qū)分。因此，估計(jì)100°C沸水浸沒50秒(條件類似于超高溫滅菌(商品化牛奶))后細(xì)菌細(xì)胞壁受損程度并不顯著。此外，在活細(xì)胞和受損細(xì)胞之間SYT09染色中所觀察到的熒光強(qiáng)度存在著小差異，估計(jì)該差異是由受損細(xì)胞的染色體DNA為熱所部分分解所致，因而降低了 SYT09嵌入染色體DNA中的有效性。
即使進(jìn)行LP處理，對于特別是大腸桿菌，活細(xì)胞和受損細(xì)胞也無法清楚地區(qū)分。當(dāng)比較未處理組大腸桿菌懸浮液(活細(xì)胞)和LP-處理組大腸桿菌懸浮液(活細(xì)胞)的結(jié)果時(shí)，在活的大腸桿菌的圖上可看到部分標(biāo)繪在SYT09(+) · PI (-)區(qū)中的點(diǎn)移到SYT09(-) -PI (-)區(qū)中，降低了活細(xì)胞的檢測有效性，這是由于進(jìn)行LP處理之故。與表皮葡萄球菌相比該現(xiàn)象更加顯著。然而，當(dāng)通過FCM獨(dú)立檢測來自牛奶的活細(xì)胞和受損細(xì)胞，應(yīng)除去污染物即體細(xì)胞如牛白細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞、微膠粒酪蛋白和脂質(zhì)，這樣做是認(rèn)為LP處理是不可避免的。
[對照實(shí)施例2]
使用流式細(xì)胞儀檢測懸浮于超高溫巴氏滅菌均質(zhì)牛奶中的大腸桿菌活細(xì)胞(LP-處理的)
(I)樣品制備
向以與對照實(shí)施例I中相同的方法制備的Iml的I. I X 107cfu/ml大腸桿菌懸浮液(活細(xì)胞)中添加9ml商品化均質(zhì)牛奶(進(jìn)行了超高溫巴氏滅菌(130°C，2秒)，以下也稱為“UHT均質(zhì)牛奶”)稀釋該懸浮液10倍，以相同方式連續(xù)稀釋已稀釋懸浮液來制備接種
1.I X IO2-L I X 106cfu/ml大腸桿菌(活細(xì)胞)的UHT均質(zhì)牛奶。如上述UHT均質(zhì)牛奶，當(dāng)其在所使用的瓊脂培養(yǎng)基上于37°C溫育48小時(shí)以及于25°C溫育72小時(shí)時(shí)，確認(rèn)沒有形成集落。
然后，如對照實(shí)施例I所述，對不同稀釋度的接種大腸桿菌(活細(xì)胞)的UHT均質(zhì)牛奶和沒有接種大腸桿菌的UHT均質(zhì)牛奶進(jìn)行相同的脂肪酶處理和蛋白酶K處理(LP處理)。換句話說，將Iml體積的接種大腸桿菌(活細(xì)胞)的UHT均質(zhì)牛奶和沒有接種大腸桿菌的UHT均質(zhì)牛奶分別倒入2ml體積微型管中。添加用生理鹽水調(diào)節(jié)至189U/ml的100 μ I脂肪酶(E. C. 3. I. I. 3, Sigma)到樣品中，并在37°C下溫育混合物30分鐘進(jìn)行脂肪酶處理。
向進(jìn)行脂肪酶處理的每種樣品添加20 μ I的1250U/ml蛋白酶K(E. C. 3. 4. 21. 64，Sigma)溶液，并在37°C下溫育混合物30分鐘進(jìn)行蛋白酶K處理。
在脂肪酶處理和蛋白酶K處理后，添加880 μ I生理鹽水到每種樣品中，并在4°C和14，OOOxg下冷凍離心樣品10分鐘。用藥簽徹底除去存在于上層中的脂層，也除去存在于中間層中的水層。添加2ml生理鹽水到殘留
權(quán)利要求
1.一種制備測量用樣品的方法，所述的測量用樣品用于通過流式細(xì)胞術(shù)檢測試樣中微生物的活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞，該方法包括下列步驟 a)用具有分解試樣中除微生物細(xì)胞之外的其他細(xì)胞、蛋白膠?；蛑|(zhì)的活性的酶處理試樣的步驟，和 b)用拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或DNA促旋酶抑制劑處理試樣的步驟，所述拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑選自單疊氮乙錠、安吖啶、喜樹堿、多柔比星、橢圓玫瑰樹堿、足葉乙苷、米托蒽醌、saintopin、托泊替康和CP-115,953,所述DNA促旋酶抑制劑選自環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星、培氟沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、萘啶酸、奧索利酸和吡咯米酸，其中當(dāng)所述拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑為單疊氮乙錠時(shí)，對添加單疊氮乙錠的試樣進(jìn)行可見光照射； c)用核染色劑處理在步驟a)和b)中已經(jīng)處理過的試樣，其中核染色劑包含能穿透活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁的第一染色劑，和與第一染色劑相比，相對于活細(xì)胞和受損細(xì)胞更容易穿透死細(xì)胞的細(xì)胞壁的第二染色劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I的方法，其中在步驟a)之后進(jìn)行步驟b)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I的方法，其中試樣由牛奶、乳制品、由牛奶或乳制品作原料生產(chǎn)的食品、血樣、尿樣、脊髓液樣品、滑液樣品和胸膜液樣品的任何一種組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I的方法，其中微生物是細(xì)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求
I的方法，其中酶選自脂解酶和蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求
I的方法，其中核染色劑由碘化丙錠和SYT09組成。
7.一種通過流式細(xì)胞術(shù)檢測試樣中微生物的活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞的方法,包括下列步驟 a)用具有分解試樣中除微生物細(xì)胞之外的其他細(xì)胞、蛋白膠?；蛑|(zhì)的活性的酶處理試樣的步驟， b)用拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或DNA促旋酶抑制劑處理試樣的步驟，所述拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑選自單疊氮乙錠、安吖啶、喜樹堿、多柔比星、橢圓玫瑰樹堿、足葉乙苷、米托蒽醌、saintopin、托泊替康和CP-115,953,所述DNA促旋酶抑制劑選自環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星、培氟沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、萘啶酸、奧索利酸和吡咯米酸，其中當(dāng)所述拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑為單疊氮乙錠時(shí)，對添加單疊氮乙錠的試樣進(jìn)行可見光照射； c)用核染色劑處理步驟a)和b)中處理的試樣的步驟，其中核染色劑包含能穿透活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞壁的第一染色劑，和與第一染色劑相比，相對于活細(xì)胞和受損細(xì)胞更容易穿透死細(xì)胞的細(xì)胞壁的第二染色劑，和 d)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測用核染色劑處理的試樣中微生物的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7的方法，其中在步驟a)之后進(jìn)行步驟b)。
9.根據(jù)權(quán)利要求
7的方法，其中試樣由牛奶、乳制品、由牛奶或乳制品作原料生產(chǎn)的食品、血樣、尿樣、脊髓液樣品、滑液樣品和胸膜液樣品的任何一種組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求
7的方法，其中微生物為細(xì)菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求
7的方法，其中酶選自脂解酶和蛋白酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求
7的方法，其中核染色劑由碘化丙錠和SYT09組成。
13.一種用于制備測量用樣品的試劑盒，所述的測量用樣品用于通過權(quán)利要求
I所述的流式細(xì)胞術(shù)檢測試樣中微生物的活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死細(xì)胞，所述的試劑盒包含下列組分 選自脂解酶和蛋白酶的酶， 拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或DNA促旋酶抑制劑，所述拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑選自單疊氮乙錠、安B丫唆、喜樹堿、多柔比星、橢圓玫瑰樹堿、足葉乙苷、米托蒽醌、saintopin、托泊替康和CP-115，953，所述DNA促旋酶抑制劑選自環(huán)丙沙星、氧氟沙星、依諾沙星、培氟沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、萘啶酸、奧索利酸和吡咯米酸；和核染色劑。
專利摘要
根據(jù)如下步驟，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測試樣中微生物的活細(xì)胞、受損細(xì)胞、VNC細(xì)胞和死細(xì)胞a)用具有分解試樣中除微生物細(xì)胞之外的其他細(xì)胞、蛋白膠?；蛑|(zhì)的活性的酶處理試樣的步驟，b)用拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和/或DNA促旋酶抑制劑處理試樣的步驟，c)用核染色劑處理步驟a)和b)中處理的試樣的步驟，和d)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測用核染色劑處理的試樣中微生物的步驟。
文檔編號C12Q1/37GKCN101287843 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200680034742
公開日2012年11月7日 申請日期2006年2月17日
發(fā)明者副島隆志, 吉田真一 申請人:森永乳業(yè)株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (2),