1.一種改變生物體的真核種系細(xì)胞的方法，包括
向所述種系細(xì)胞中導(dǎo)入編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第一外來核酸序列，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA與所述種系細(xì)胞的染色體對(duì)的第一染色體和第二染色體的基因組DNA上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述一種或多種引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和所述一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)的引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的第二染色體和所述基因組DNA的第一染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割所述基因組DNA的第一染色體，并且以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割所述基因組DNA的第二染色體，
將所述第一外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第一染色體中，并且將所述第一外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第二染色體中，以賦予所述種系細(xì)胞對(duì)所述外來核酸序列的純合性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶產(chǎn)生雙鏈斷裂。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白是Cas9。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶產(chǎn)生單鏈斷裂。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白是Cas9缺刻酶。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，至少一個(gè)靶位置在必要基因內(nèi)，并且所述外來核酸序列相鄰地插入并替換所述必要基因的部分。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過同源重組來插入所述第一外來核酸。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述種系細(xì)胞是真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，RNA包含約10至約250個(gè)核苷酸。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，RNA包含約20至約100個(gè)核苷酸。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶與相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于多個(gè)相關(guān)靶位置處，以在多個(gè)切割位點(diǎn)處切割第一染色體或第二染色體。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，在所述多個(gè)切割位點(diǎn)處的切割去除了通過同源重組被第一外來核酸序列替換的DNA序列。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括使所述種系細(xì)胞生長(zhǎng)成生物體的步驟。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，還包括使所述生物體與相同物種的野生型生物體交配以產(chǎn)生包含帶有第一外來核酸序列的染色體對(duì)的第一染色體的后代種系細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，由所述后代種系細(xì)胞表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于染色體對(duì)的第二染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在所述靶位置處切割第二染色體，并且，
將所述第一外來核酸序列在所述切割位點(diǎn)處插入染色體對(duì)的第二染色體中以賦予所述后代種系細(xì)胞對(duì)外來核酸序列的純合性。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，重復(fù)使種系細(xì)胞生長(zhǎng)成生物體并將所述生物體與相同物種的野生型生物體交配的步驟以產(chǎn)生相同物種的對(duì)第一外來核酸序列純合的生物體的種群。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一外來核酸序列包含一個(gè)或多個(gè)選擇的基因序列。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一外來核酸序列包含一個(gè)或多個(gè)選擇的基因序列并且所述一個(gè)或多個(gè)選擇的基因序列在生物體的種群內(nèi)的生物體的基因組內(nèi)。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，將改變的生物體導(dǎo)入生物體種群中，并且改變的生物體的基因組中包含編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，并包含相應(yīng)的啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第二外來核酸序列，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA與所述第一外來核酸序列上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，并且其中所述第一側(cè)接序列包含與所述第一外來核酸序列上的靶位置的第一部分相同的第一序列，并且其中所述第二側(cè)接序列包含與所述第一外來核酸序列的靶位置的第二部分相同的第二序列，
其中，所述改變的生物體與生物體種群的成員交配以產(chǎn)生包含第二外來核酸序列和第一外來核酸序列的后代種系細(xì)胞，
其中，所述后代種系細(xì)胞表達(dá)所述第二外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于所述第一外來核酸序列上的相關(guān)靶位置，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在所述靶位置處切割第一染色體，并且，
其中，將所述第二外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述種系細(xì)胞的基因組中以賦予后代種系細(xì)胞對(duì)所述第二外來核酸序列的純合性。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，將改變的野生型生物體導(dǎo)入在基因組DNA的一個(gè)或多個(gè)靶位置上改變的種群中，使得所述一種或多種引導(dǎo)RNA與所述一個(gè)或多個(gè)靶位置不互補(bǔ)，并且防止其與所述一個(gè)或多個(gè)靶位置結(jié)合，使得所述第一外來核酸序列不進(jìn)入所述改變的野生型生物體的基因組。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，通過表達(dá)第二外來核酸序列來改變所述改變的野生型生物體，所述第二外來核酸序列編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，其共定位于第一外來核酸序列，以切割位點(diǎn)特異性的方式切割第一外來核酸序列，產(chǎn)生重編碼的等位基因。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括向所述種系細(xì)胞中導(dǎo)入編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第二外來核酸序列，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA與由所述第一外來核酸序列改變的所述一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
表達(dá)所述第二外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在所述靶位置處切割所述基因組DNA的染色體，以去除所述第一外來核酸序列，并且
將所述第二外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體中。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述第二外來核酸序列包含與所述第一外來核酸序列不同的遺傳修飾。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述第二外來核酸序列包含經(jīng)所述第一外來核酸序列修飾的所述染色體的野生型序列。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，至少一個(gè)靶位置在必要蛋白-編碼基因內(nèi)，并且所述外來核酸序列被插入所述必要基因中，使得所述必要蛋白的氨基酸序列被保留，但是所述基因的核苷酸序列被改變，使得一種或多種引導(dǎo)RNA與所述一個(gè)或多個(gè)靶位置不互補(bǔ)。
26.一種改變真核種系細(xì)胞的方法，包括
向所述種系細(xì)胞中導(dǎo)入編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的外來核酸序列，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA與所述種系細(xì)胞的染色體對(duì)的第一染色體和第二染色體的基因組DNA上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述一種或多種引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
表達(dá)所述外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的第一染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在所述靶位置處切割所述基因組DNA的第一染色體，
將所述外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第一染色體中，
表達(dá)插入的外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的第二染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在所述靶位置處切割所述基因組DNA，
將所述外來核酸序列在所述切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第二染色體中以賦予所述種系細(xì)胞對(duì)所述外來核酸序列的純合性。
27.一種使物種的兩個(gè)種群不能產(chǎn)生存活后代的方法，包括
改變所述物種的第一種群以包含第一外來核酸序列，所述第一外來核酸序列編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種第一引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)的啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列，其中一種或多種第一引導(dǎo)RNA與必要基因上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，并且所述必要基因的核苷酸序列已經(jīng)改變，使得所述一種或多種引導(dǎo)RNA與所述一個(gè)或多個(gè)靶位置不互補(bǔ)，但是編碼的必要蛋白的氨基酸序列被保留，
改變所述物種的第二種群以包含第二外來核酸序列，所述第二外來核酸序列編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種第二引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)的啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列，其中一種或多種第二引導(dǎo)RNA與必要基因上的與所述一種或多種第一引導(dǎo)RNA的靶位置不同的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，并且所述必要基因的核苷酸序列已經(jīng)改變，使得所述一種或多種第二引導(dǎo)RNA與所述一個(gè)或多個(gè)靶位置不互補(bǔ)，但是編碼的必要蛋白的氨基酸序列被保留，
使所述第一種群與所述第二種群交配以產(chǎn)生種系細(xì)胞，其中表達(dá)所述第一外來核酸序列以切割來自第二親本的必要基因，并且表達(dá)所述第二外來核酸以切割來自第一親本的必要基因。
28.一種替換在靶核酸序列中有突變的真核種系細(xì)胞中的等位基因的方法，包括
向所述種系細(xì)胞中導(dǎo)入編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第一外來核酸序列，
其中，所述多個(gè)引導(dǎo)RNA與和等位基因上的突變相鄰的染色體的基因組DNA上的多個(gè)靶位置互補(bǔ)，其中所述突變防止相應(yīng)的引導(dǎo)RNA與基因組DNA結(jié)合，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述多種引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在多個(gè)靶位置處切割基因組DNA的第一染色體，以去除包含所述突變的基因組DNA的部分，并目
將所述第一外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體中。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，靶位置中的至少一個(gè)位于對(duì)生物體的適應(yīng)性而言重要的基因，如必要基因中，使得去除所有靶位置的缺失事件是高度有害的，并且將通過自然選擇從種群中去除。
30.一種在多個(gè)基因處改變生物體的真核種系細(xì)胞的方法，包括
向所述種系細(xì)胞中導(dǎo)入編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第一外來核酸序列，以及對(duì)應(yīng)于多個(gè)基因的一種或多種其他外來核酸序列，
其中，所述多種引導(dǎo)RNA包含一種或多種基因特異性引導(dǎo)RNA，其與所述種系細(xì)胞的染色體的基因組DNA中的多個(gè)基因上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述多種引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的靶位置之一的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的相同靶位置的第二部分相同的第二序列，
其中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸序列各自含有對(duì)應(yīng)于其余靶位置的第一部分和第二部分的第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列，
表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在多個(gè)基因處切割所述基因組DNA的第一染色體，并且
將所述第一外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體中。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其還包括向所述種系細(xì)胞中導(dǎo)入編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第二外來核酸序列，
其中，所述多種引導(dǎo)RNA與由所述第一外來核酸序列改變的所述多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
表達(dá)所述第二外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和多種引導(dǎo)RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在所述相關(guān)靶位置處切割所述基因組DNA的染色體，以去除所述第一外來核酸序列，并且
將所述第二外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體中。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述第二外來核酸序列包含與所述第一外來核酸序列不同的遺傳修飾。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述第二外來核酸序列包含經(jīng)所述第一外來核酸序列修飾的所述染色體的野生型序列。
34.一種使兩個(gè)種群不能互相產(chǎn)生后代的方法，包括
向所述第一種系細(xì)胞中導(dǎo)入編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第一組引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第一外來核酸序列，
其中，所述第一組引導(dǎo)RNA與染色體的基因組DNA上的第一組靶位置互補(bǔ)，
其中，所述第一組靶位置位于必要蛋白-編碼基因內(nèi)，并且將所述第一外來核酸序列插入必要基因，使得所述必要蛋白的氨基酸序列被保留，但是所述基因的核苷酸序列被改變，使得所述第一組引導(dǎo)RNA與一個(gè)或多個(gè)靶位置不互補(bǔ)。
其中編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼第一組引導(dǎo)RNA的核酸序列和保留必要蛋白的氨基酸序列的第一外來核酸序列在所述第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第一組引導(dǎo)RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的染色體上的第一組相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在第一組靶位置處切割基因組DNA的第一染色體，以去除必要基因內(nèi)的基因組DNA的部分，并且
將所述第一外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體中，并且
向所述第二種系細(xì)胞中導(dǎo)入編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第二組引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第二外來核酸序列，
其中，所述第二組引導(dǎo)RNA與染色體的基因組DNA上的第二組靶位置互補(bǔ)，
其中，所述第二組靶位置處于與所述第一組靶位置所處相同的必要蛋白-編碼基因內(nèi)，但與第一組靶位置中的任何一個(gè)均不同，并且將所述第二外來核酸序列插入所述必要基因，使得所述必要蛋白的氨基酸序列被保留但是所述基因的核苷酸序列被改變，使得所述第二組引導(dǎo)RNA與所述第二組靶位置不互補(bǔ)，
其中編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼第二組引導(dǎo)RNA的核酸序列和保留必要蛋白的氨基酸序列的第二外來核酸序列在所述第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
表達(dá)所述第二外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第二組引導(dǎo)RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的染色體上的第二組相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在第二組靶位置處切割基因組DNA的第一染色體，以去除必要基因內(nèi)的基因組DNA的部分，并且
將所述第二外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體中，
其中，從第一種系細(xì)胞和第二種系細(xì)胞產(chǎn)生的生物體的多個(gè)成熟后代不會(huì)存活，其中第一組引導(dǎo)RNA導(dǎo)致RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶切割所述第二外來核酸序列內(nèi)的第一組靶位置，并且所述第二組引導(dǎo)RNA導(dǎo)致RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶切割所述第一外來核酸序列內(nèi)的第二組靶位置。
35.一種從精母細(xì)胞僅產(chǎn)生Y染色體精子的方法，包括
向所述精母細(xì)胞中導(dǎo)入編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第一外來核酸序列，
其中，所述一種或引導(dǎo)RNA與所述精母細(xì)胞的X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶位置以及所述精母細(xì)胞的Y染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述一種或多種引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與Y染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與Y染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以及與所述精母細(xì)胞的X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶位置和所述精母細(xì)胞的Y染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)的一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與Y染色體上的靶位置互補(bǔ)的相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于Y染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割Y染色體，
將所述第一外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入Y染色體中，并且
其中，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與X染色體上的靶位置互補(bǔ)的相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于X染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割X染色體，以使所述X染色體無用。
36.一種從精母細(xì)胞僅產(chǎn)生Y染色體精子的方法，包括
使用相應(yīng)啟動(dòng)子序列從位于Y染色體上的序列表達(dá)RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA與所述精母細(xì)胞的X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)的相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于X染色體上的一個(gè)或多個(gè)相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在所述一個(gè)或多個(gè)靶位置處切割X染色體以使所述X染色體無用。
37.一種從精母細(xì)胞僅產(chǎn)生X染色體精子的方法，包括
使用相應(yīng)啟動(dòng)子序列從位于X染色體上的序列表達(dá)RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA與所述精母細(xì)胞的Y染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與Y染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)的相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于Y染色體上的一個(gè)或多個(gè)相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在所述一個(gè)或多個(gè)靶位置處切割Y染色體以使所述Y染色體無用。
38.一種從精母細(xì)胞僅產(chǎn)生含Y染色體精子的方法，包括
修飾Y染色體以編碼第一外來核酸序列和第二外來核酸序列，
其中，所述第一外來核酸序列編碼第一RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第一組引導(dǎo)RNA以及相應(yīng)啟動(dòng)子序列，
其中，所述第二外來核酸序列編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第二組引導(dǎo)RNA，以及相應(yīng)啟動(dòng)子序列與第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的第二核酸序列與編碼第二組引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶無法識(shí)別所述第二組引導(dǎo)RNA并且所述第二RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶無法識(shí)別所述第一組引導(dǎo)RNA，
其中，所述第一組引導(dǎo)RNA與非性染色體的染色體的基因組DNA上的多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
其中，在減數(shù)分裂之前，在種系中表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生第一RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第一組RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于基因組DNA的染色體上的第一組相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在第一組靶位置處切割基因組DNA的染色體，使得細(xì)胞修復(fù)機(jī)制將第二外來核酸序列從Y染色體拷貝到基因組DNA的染色體上，
其中在減數(shù)分裂前或減數(shù)分裂期間表達(dá)位于基因組DNA的染色體上的第二外來核酸序列的拷貝，以產(chǎn)生第二RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白和第二組引導(dǎo)RNA，
其中，所述第二RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)的第二組引導(dǎo)RNA共定位于X染色體上的一個(gè)或多個(gè)相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在所述一個(gè)或多個(gè)靶位置處切割X染色體，以使所述X染色體無用。
39.一種從精母細(xì)胞僅產(chǎn)生含X染色體精子的方法，包括
修飾X染色體以編碼第一外來核酸序列和第二外來核酸序列，
其中，所述第一外來核酸序列編碼第一RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第一組引導(dǎo)RNA以及相應(yīng)啟動(dòng)子序列，
其中，所述第二外來核酸序列編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第二組引導(dǎo)RNA，以及相應(yīng)啟動(dòng)子序列與第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的第二核酸序列與編碼第二組引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶無法識(shí)別所述第二組引導(dǎo)RNA并且所述第二RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶無法識(shí)別所述第一組引導(dǎo)RNA，
其中，所述第一組引導(dǎo)RNA與非性染色體的染色體的基因組DNA上的多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
其中，在減數(shù)分裂之前，在種系中表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生第一RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第一組RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于基因組DNA的染色體上的第一組相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在第一組靶位置處切割基因組DNA的染色體，使得細(xì)胞修復(fù)機(jī)制將第二外來核酸序列從X染色體拷貝到基因組DNA的染色體上，
其中在減數(shù)分裂前或減數(shù)分裂期間表達(dá)位于基因組DNA的染色體上的第二外來核酸序列的拷貝，以產(chǎn)生第二RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白和第二組引導(dǎo)RNA，
其中，所述第二RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與Y染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)的第二組引導(dǎo)RNA共定位于Y染色體上的一個(gè)或多個(gè)相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在所述一個(gè)或多個(gè)靶位置處切割Y染色體，以使所述Y染色體無用。
40.一種用修飾的X染色體產(chǎn)生雌性后代排除雄性后代的方法，所述X染色體具有編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與精子的Y染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列互補(bǔ)的一種或多種引導(dǎo)RNA以及與精子的X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列互補(bǔ)的一種或多種引導(dǎo)RNA，與第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第一外來核酸序列，在卵母細(xì)胞中表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與Y染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列以及X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列互補(bǔ)的一種或多種引導(dǎo)RNA，其中編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述一種或多種引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列之間，其中所述第一側(cè)接序列包含與基因組DNA的X染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，其中所述第二側(cè)接序列包含與基因組DNA的X染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與Y染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列以及X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列互補(bǔ)的一種或多種引導(dǎo)RNA，其中將具有Y染色體的野生型精子與含修飾的X染色體的卵母細(xì)胞結(jié)合導(dǎo)致將所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶與靶向Y染色體的一種或多種引導(dǎo)RNA共定位于Y染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶切割Y染色體使卵母細(xì)胞不能后續(xù)發(fā)育成雄性生物體，并且
將具有X染色體的野生型精子與含有修飾的X染色體的卵母細(xì)胞結(jié)合導(dǎo)致將所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和所述一種或多種引導(dǎo)RNA共定位至X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶切割所述X染色體并且將所述第一外來核酸序列插入所述X染色體。
41.一種用修飾的Y染色體產(chǎn)生雄性后代排除雌性后代的方法，所述Y染色體具有編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與位于發(fā)育必要的基因內(nèi)的X染色體上的一種或多種靶核酸序列互補(bǔ)的一種或多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)的啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第一外來核酸序列，其中所述第一側(cè)接序列包含與X染色體上的必要基因的第一部分相同的第一序列，其中所述第二側(cè)接序列包含與X染色體上的必要基因的第二部分相同的第二序列，并且修飾的Y染色體還包含編碼X染色體上的必要基因的第二核酸序列，其經(jīng)改變使得由所述一種或多種引導(dǎo)RNA識(shí)別的一個(gè)或多個(gè)靶位置與一個(gè)或多個(gè)引導(dǎo)RNA識(shí)別的序列不互補(bǔ)，使得具有野生型X染色體的卵母細(xì)胞與具有修飾的Y染色體的精子結(jié)合導(dǎo)致表達(dá)所述第一外來核酸序列，產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列互補(bǔ)的一種或多種引導(dǎo)RNA，將所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和所述一種或多種引導(dǎo)RNA共定位至X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶切割X染色體以去除必要基因并向其中插入第一核酸序列，產(chǎn)生由于Y染色體上必要基因的額外拷貝而保留活力的修飾的X染色體，并且
將具有野生型X染色體的卵母細(xì)胞與具有修飾的X染色體的精子結(jié)合，導(dǎo)致表達(dá)第一外來核酸序列以產(chǎn)生RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列互補(bǔ)的一種或多種引導(dǎo)RNA，將所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和所述一種或多種引導(dǎo)RNA共定位于X染色體上的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶切割X染色體以去除必要基因并將所述第一外來核酸序列插入X染色體，其中受精卵因此缺少必要X染色體基因。
42.一種生成有生育力雄性和無生育力雌性的方法，其中修改權(quán)利要求41所述的方法使X染色體上的必要基因僅對(duì)生育而言必要，使缺少該基因的生物體無生育力。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述第一核酸序列還含有第三側(cè)接序列和第四側(cè)接序列，其中所述第三側(cè)接序列包含與生育力必要基因的第一部分相同的第三序列，其中所述第四側(cè)接序列包含與生育力必要基因的第二部分相同的第四序列，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶位于所述第三側(cè)接序列和所述第四側(cè)接序列之間，并且所述第一核酸序列還含有與位于生育力必要基因內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)靶序列互補(bǔ)的第二組引導(dǎo)RNA，表達(dá)所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第二組引導(dǎo)RNA，將所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和所述一種或多種引導(dǎo)RNA共定位至生育力必要基因內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶切割所述生育力必要基因并且向其中插入所述第一核酸序列。
44.一種進(jìn)行受控種群抑制的方法，其中將權(quán)利要求43所述的Y染色體釋放到待抑制的種群中并且將權(quán)利要求30所述的RNA引導(dǎo)基因驅(qū)動(dòng)釋放到待保護(hù)的種群中，所述RNA引導(dǎo)的基因驅(qū)動(dòng)改變了被權(quán)利要求43所述的Y染色體靶向的生育力必要基因內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)靶序列，使得它們與權(quán)利要求43所述的Y染色體所采用的引導(dǎo)RNA不互補(bǔ)但是所述基因編碼的蛋白質(zhì)保留相同氨基酸序列，使得Y染色體在待抑制的種群中僅產(chǎn)生雄性子代并且在與已經(jīng)被在待保護(hù)的群中釋放的RNA引導(dǎo)基因驅(qū)動(dòng)修飾的雌性交配后產(chǎn)生有生育力的雄性子代和無生育力的雌性子代。
45.一種進(jìn)行靶向種群抑制或滅絕的方法，包括向待抑制或滅絕的種群中釋放權(quán)利要求44所述的Y染色體。
46.一種進(jìn)行靶向種群抑制或滅絕的方法，包括向靶向種群中釋放性別偏移染色體。
47.一種阻斷基因從經(jīng)工程改造的生物體流向相同物種的野生型生物體的方法，包括首先修飾野生型生物體的基因組使得對(duì)應(yīng)于來自基因中間的那些的序列插入所述基因的野生型拷貝遠(yuǎn)端的另一個(gè)染色體區(qū)，所述基因必須以2個(gè)功能性拷貝存在以使生物體存活并被稱為必要基因，并且隨后
向經(jīng)工程改造的生物體的種系導(dǎo)入第一外來核酸序列，所述第一外來核酸序列編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列和第三側(cè)接序列和第四側(cè)接序列，以及編碼與所述必要基因相同的蛋白質(zhì)但不使用相同核酸序列并且在下文中稱為重編碼的必要基因的序列，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA與插入染色體的遠(yuǎn)端區(qū)的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，并且也與所述必要基因內(nèi)的序列互補(bǔ)，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述一種或多種引導(dǎo)RNA的核酸序列以及第三側(cè)接序列和第四側(cè)接序列以及重編碼的必要基因在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與染色體的遠(yuǎn)端區(qū)的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與染色體的遠(yuǎn)端區(qū)的靶位置的第二部分相同的第二序列，
其中，所述第三側(cè)接序列包含與所述必要基因的第三部分相同的第三序列，
其中，所述第四側(cè)接序列包含與所述必要基因的第四部分相同的第四序列，
表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以及與所述染色體遠(yuǎn)端區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)靶位置和所述必要基因內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)的一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與靶位置互補(bǔ)的相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位至染色體遠(yuǎn)端區(qū)的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在染色體遠(yuǎn)端區(qū)中切割靶序列，
將所述第一外來核酸序列插入所述染色體遠(yuǎn)端區(qū)中，
其中，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與靶位置互補(bǔ)的相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位至野生型必要基因中的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式切割所述野生型必要基因，
在第三側(cè)接區(qū)和第四側(cè)接區(qū)之間將序列插入所述必要基因的野生型拷貝中，從而破壞其功能，使得
經(jīng)工程改造的生物體在染色體的遠(yuǎn)端區(qū)中有2個(gè)重編碼拷貝的必要基因并且沒有野生型必要基因的功能性拷貝，并且將經(jīng)工程改造的生物體與野生型生物體雜交導(dǎo)致破壞所述必要基因的野生型拷貝而不將重編碼必要基因的其他拷貝插入所述染色體遠(yuǎn)端區(qū)。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述必要基因位于X染色體上并且不需要2個(gè)拷貝來提供活力，并且所述遠(yuǎn)端區(qū)也位于X染色體上，并且對(duì)所述生物體的第一修飾也修飾Y染色體，使得下文中稱為雄性必要基因的雄性生育力或活力所需基因以保留編碼的雄性必要蛋白的氨基酸序列的方式在其核酸序列上重編碼，并且將非功能性的另一拷貝的雄性必要基因相鄰插入雄性必要基因的重編碼拷貝，并且所述第一核酸序列還包含第五側(cè)接序列，所述第五側(cè)接序列包含與所述雄性必要基因的第五部分相同的第五序列，并且所述第一核酸序列還包含第六側(cè)接序列，所述第六側(cè)接序列包含與所述雄性必要基因的第六部分相同的第六序列，并且所述第一核酸序列還包含對(duì)應(yīng)于野生型雄性必要基因內(nèi)的經(jīng)重編碼以賦予基因非功能性的序列的第二組引導(dǎo)RNA，并且編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列和編碼所述引導(dǎo)RNA的核酸序列以及第三側(cè)接序列和第四側(cè)接序列以及重編碼的必要基因在所述第五側(cè)接序列和所述第六側(cè)接序列之間，所述第五側(cè)接序列和所述第六側(cè)接序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，具有2個(gè)修飾的X染色體的雌性與具有修飾的Y染色體的雄性交配產(chǎn)生活的雄性后代，因?yàn)樗鯮NA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶并不切割重編碼或非功能雄性必要基因并且修飾的Y染色體不切割修飾的X染色體上的必要基因，并且來自具有2個(gè)修飾的X染色體的雌性的卵母細(xì)胞由具有野生型Y染色體的精子受精，導(dǎo)致所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶切割野生型雄性必要基因并且在第五側(cè)接序列和第六側(cè)接序列之間的位置上拷貝所述序列并產(chǎn)生無生育力或不能存活的雄性，并且由具有修飾的Y染色體的精子受精的來自野生型雌性的卵母細(xì)胞導(dǎo)致所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶切割所述必要基因并且產(chǎn)生不能存活的雄性后代，共同包含修飾的和野生型X染色體的精子和卵的結(jié)合導(dǎo)致所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶切割所述野生型必要基因而不拷貝所述重編碼的必要基因，產(chǎn)生具有一個(gè)修飾的X染色體和一個(gè)破壞的X染色體的雜合雌性后代，并且這些雜合雌性與野生型雄性交配產(chǎn)生不能存活或無生育力的雄性或雜合雌性，并且雜合雌性和含有修飾的Y染色體的雄性的一半雄性后代存活。
49.一種阻斷基因從含有獨(dú)特遺傳多樣性的亞群流向其余的野生種群的方法，包括釋放權(quán)利要求30所述的RNA引導(dǎo)的基因驅(qū)動(dòng)，所述基因驅(qū)動(dòng)僅能在第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列之間的靶位置上含有獨(dú)特多樣性的種群中傳播，其還將靶位點(diǎn)插入染色體的遠(yuǎn)端區(qū)，其中所述RNA引導(dǎo)的基因驅(qū)動(dòng)編碼第一和第二側(cè)接序列用于將所述RNA引導(dǎo)的基因驅(qū)動(dòng)插入所述獨(dú)特多樣性區(qū)并且其編碼第三和第四側(cè)接序列用于將靶位點(diǎn)插入遠(yuǎn)端區(qū)，并且隨后
釋放已經(jīng)通過將第二外來核酸序列導(dǎo)入第一次修飾的生物體的種系中進(jìn)行二次修飾的生物體，所述第二外來核酸序列編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和第二組引導(dǎo)RNA以及第三組引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列和第五側(cè)接序列和第六側(cè)接序列和第七側(cè)接序列和第八側(cè)接序列和第九側(cè)接序列和第十側(cè)接序列以及編碼與必要基因相同的蛋白質(zhì)但不采用相同核酸序列并在下文中稱為重編碼的必要基因的序列，
其中，所述第二組引導(dǎo)RNA與插入染色體的遠(yuǎn)端區(qū)的第一組靶位置互補(bǔ)，并且也與所述必要基因內(nèi)的序列互補(bǔ)，
其中，所述第三組引導(dǎo)RNA與在第一核酸序列內(nèi)獨(dú)特發(fā)現(xiàn)的一組靶序列互補(bǔ)，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述一種或多種引導(dǎo)RNA的核酸序列以及第七側(cè)接序列和第八側(cè)接序列和第九側(cè)接序列和第十側(cè)接序列以及重編碼的必要基因在所述第五側(cè)接序列和所述第六側(cè)接序列之間，
其中，所述第五側(cè)接序列包含與染色體的遠(yuǎn)端區(qū)的靶位置的第五部分相同的第五序列，
其中，所述第六側(cè)接序列包含與染色體的遠(yuǎn)端區(qū)的靶位置的第六部分相同的第六序列，
其中，所述第七側(cè)接序列包含與所述必要基因的第七部分相同的第七序列，
其中，所述第八側(cè)接序列包含與所述必要基因的第八部分相同的第八序列，
其中，所述第九側(cè)接序列包含與第一側(cè)接序列的第九部分相同的第九序列，
其中，所述第十側(cè)接序列包含與第二側(cè)接序列的第十部分相同的第十序列，
表達(dá)所述第二外來核酸序列以產(chǎn)生所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以及與所述染色體遠(yuǎn)端區(qū)中的第二組靶位置和所述必要基因內(nèi)的第二組靶位置互補(bǔ)的第二組RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與靶位置互補(bǔ)的相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位至染色體遠(yuǎn)端區(qū)的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在染色體遠(yuǎn)端區(qū)中切割靶序列，
將所述第一外來核酸序列插入所述染色體遠(yuǎn)端區(qū)中，
其中，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與靶位置互補(bǔ)的相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位至野生型必要基因中的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式切割所述野生型必要基因，
在第七側(cè)接區(qū)和第八側(cè)接區(qū)之間將序列插入所述必要基因的野生型拷貝中，從而破壞其功能，
表達(dá)與獨(dú)特地位于所述第一核酸序列內(nèi)的序列互補(bǔ)的第三組引導(dǎo)RNA，
其中，所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和與第一核酸序列內(nèi)的序列互補(bǔ)的相關(guān)引導(dǎo)RNA共定位于所述第一核酸序列內(nèi)的靶序列，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式切割所述第一核酸序列內(nèi)的靶序列，
用第九側(cè)接區(qū)和第十側(cè)接區(qū)之間的序列替換所述第一核酸序列，使得
經(jīng)工程改造的生物體在染色體的遠(yuǎn)端區(qū)中沒有第一核酸序列的拷貝并且有必要基因的2個(gè)重編碼拷貝并且沒有野生型必要基因的功能性拷貝，并且將經(jīng)工程改造的生物體與野生型生物體雜交導(dǎo)致破壞所述必要基因的野生型拷貝而不將重編碼的必要基因的其他拷貝插入所述染色體遠(yuǎn)端區(qū)。
50.一種種系細(xì)胞，包含：
編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的外來核酸序列，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA對(duì)所述種系細(xì)胞的染色體對(duì)的第一染色體和第二染色體的基因組DNA上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述一種或多種引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列。
51.一種改變生物體的真核種系細(xì)胞的方法，包括
將第一外來核酸序列導(dǎo)入所述種系細(xì)胞，所述第一外來核酸序列編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列，并且包含敏化核酸，所述敏化核酸的表達(dá)在生物體接觸化學(xué)物、化合物或條件時(shí)對(duì)所述生物體是有害的，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA對(duì)所述種系細(xì)胞的染色體對(duì)的第一染色體和第二染色體的基因組DNA上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述一種或多種引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和所述一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)的引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的第二染色體和所述基因組DNA的第一染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割所述基因組DNA的第一染色體，并且以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割所述基因組DNA的第二染色體，
將所述第一外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第一染色體中，并且將所述第一外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第二染色體中，以賦予所述種系細(xì)胞對(duì)所述外來核酸序列的純合性，并且
表達(dá)賦予所得生物體對(duì)所述化學(xué)物、化合物或條件敏感性的敏化核酸，使得所得生物體在接觸所述化學(xué)物、化合物或條件時(shí)死亡或者無生育力。
52.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述敏化核酸的表達(dá)增加了所述化學(xué)物、化合物或條件對(duì)所述生物體的毒性。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，使所述種系細(xì)胞生長(zhǎng)成生物體，并且將所述敏化核酸傳至后代，以產(chǎn)生包含所述敏化核酸的生物體種群，并且其中所述敏化核酸增加了所述化學(xué)物、化合物或條件對(duì)所述生物體的毒性。
54.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述生物體是雜草或害蟲。
55.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述敏化核酸是替換現(xiàn)有基因的敏化基因。
56.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述敏化基因是野生種群中現(xiàn)有突變基因的精確或密碼子改變的祖先形式，使得現(xiàn)有的突變形式被祖先形式替換。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述現(xiàn)有基因獲得了對(duì)殺蟲劑、除草劑或殺真菌劑產(chǎn)生抗性的突變。
58.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)物或化合物是殺蟲劑、除草劑或殺真菌劑。
59.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述殺蟲劑、除草劑或殺真菌劑是以下之一：由Cry1A.105、CryIAb、CryIF、Cry2Ab、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、mCry3A或VIP產(chǎn)生的Bt毒素、2，4-D或草甘膦。
60.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述敏化基因替換現(xiàn)有基因，所述現(xiàn)有基因的功能是生物體存活或繁殖所需的。
61.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)物是前藥并且所述敏化基因編碼相應(yīng)的前藥-轉(zhuǎn)化酶。
62.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，酶/化學(xué)物對(duì)是胞嘧啶脫氨酶/5-溴尿嘧啶或硝基還原酶/CB1954。
63.一種控制雜草或害蟲種群的方法，所述雜草或害蟲種群的基因組中包含敏感基因驅(qū)動(dòng)，其中所述敏感基因驅(qū)動(dòng)在化學(xué)物、化合物或條件存在時(shí)賦予所述雜草或害蟲種群對(duì)毒性的易感性，所述方法包括
使所述雜草或害蟲種群接觸有效量的所述化學(xué)物、化合物或條件以殺死所述雜草或害蟲、降低所述雜草或害蟲的繁殖或者使所述雜草或害蟲無生育力以抑制繁殖。
64.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)物或化合物是除草劑，或殺蟲劑或殺真菌劑。
65.一種改變包含第一敏化基因驅(qū)動(dòng)的生物體的真核種系細(xì)胞的方法，包括
將第二外來核酸序列導(dǎo)入所述種系細(xì)胞，所述第二外來核酸序列編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列，并且包含第二敏化核酸序列，所述第二敏化核酸序列的表達(dá)在生物體接觸化學(xué)物、化合物或條件時(shí)對(duì)所述生物體是有害的，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA對(duì)所述包含第一敏化基因驅(qū)動(dòng)的種系細(xì)胞的染色體對(duì)的包含第一敏化基因驅(qū)動(dòng)的第一染色體和第二染色體的基因組DNA上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述所述第二外來核酸序列的一種或多種引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
表達(dá)所述第二外來核酸序列以產(chǎn)生所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和所述一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)的引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的第二染色體和所述基因組DNA的第一染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割所述基因組DNA的第一染色體，并且以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割所述基因組DNA的第二染色體，其中去除所述第一外來核酸序列，
將所述第二外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第一染色體中，并且將所述第二外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第二染色體中以賦予所述種系細(xì)胞對(duì)所述第二外來核酸序列的純合性，并且
表達(dá)賦予所得生物體對(duì)所述化學(xué)物、化合物或條件敏感性的第二敏化核酸序列，使得所得生物體在接觸所述化學(xué)物、化合物或條件時(shí)死亡或者無生育力。
66.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，向野生種群中導(dǎo)入所得生物體，使得所得生物體與野生型生物體的后代包含所述第二敏化核酸序列。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述生物體是雜草或害蟲。
68.一種改變包含第一敏化基因驅(qū)動(dòng)的生物體的真核種系細(xì)胞的方法，包括
將第二外來核酸序列導(dǎo)入所述種系細(xì)胞，所述第二外來核酸序列編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列，并且包含第二敏化核酸序列，所述第二敏化核酸序列的表達(dá)在生物體接觸化學(xué)物、化合物或條件時(shí)對(duì)所述生物體是有害的，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA對(duì)所述包含第一敏化基因驅(qū)動(dòng)的種系細(xì)胞的染色體對(duì)的包含第一敏化基因驅(qū)動(dòng)的第一染色體和第二染色體的基因組DNA上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述所述第二外來核酸序列的一種或多種引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
表達(dá)所述第二外來核酸序列以產(chǎn)生所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和所述一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)的引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的第二染色體和所述基因組DNA的第一染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割所述基因組DNA的第一染色體，并且以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割所述基因組DNA的第二染色體，
將所述第二外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第一染色體中，并且將所述第二外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第二染色體中以賦予所述種系細(xì)胞對(duì)所述第二外來核酸序列的純合性，并且
表達(dá)賦予所得生物體對(duì)所述化學(xué)物、化合物或條件敏感性的第二敏化核酸序列，使得所得生物體在接觸所述化學(xué)物、化合物或條件時(shí)死亡或者無生育力。
69.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，向野生種群中導(dǎo)入所得生物體，使得所得生物體與野生型生物體的后代包含所述第二敏化核酸序列。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述生物體是雜草或害蟲。
71.一種改變生物體的真核種系細(xì)胞的方法，包括
向所述種系細(xì)胞中導(dǎo)入編碼RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和一種或多種引導(dǎo)RNA，并且包含相應(yīng)啟動(dòng)子序列以及第一側(cè)接序列和第二側(cè)接序列的第一外來核酸序列，
其中，所述一種或多種引導(dǎo)RNA對(duì)所述種系細(xì)胞的染色體對(duì)的第一染色體和第二染色體的基因組DNA上的一個(gè)或多個(gè)靶位置互補(bǔ)，
其中，編碼所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶的核酸序列與編碼所述一種或多種引導(dǎo)RNA的核酸序列在所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間，
其中，所述第一側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第一部分相同的第一序列，
其中，所述第二側(cè)接序列包含與所述基因組DNA的第一染色體或第二染色體上的靶位置的第二部分相同的第二序列，
其中，所述生物體需要被外來核酸序列切割并替換的位于所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間的序列的至少一個(gè)拷貝來存活或產(chǎn)生活的后代，
表達(dá)所述第一外來核酸序列以產(chǎn)生所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和所述一種或多種RNA，其中所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶和相關(guān)的引導(dǎo)RNA共定位于所述基因組DNA的第二染色體和所述基因組DNA的第一染色體上的相關(guān)靶位置，并且所述RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白核酸酶以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割所述基因組DNA的第一染色體，并且以切割位點(diǎn)特異性的方式在靶位置處切割所述基因組DNA的第二染色體，
將所述第一外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第一染色體中，并且將所述第一外來核酸序列在切割位點(diǎn)處插入所述基因組DNA的染色體對(duì)的第二染色體中，以賦予所述種系細(xì)胞對(duì)所述外來核酸序列的純合性，并且
在發(fā)育階段進(jìn)行上述表達(dá)和插入步驟，在所述階段中，生物體不再需要被外來核酸序列切割并替換的以產(chǎn)生遺傳負(fù)荷的位于所述第一側(cè)接序列和所述第二側(cè)接序列之間的序列來存活或產(chǎn)生有生育力的后代。
72.一種按照前述任一項(xiàng)權(quán)利要求進(jìn)行靶向種群抑制或滅絕的方法，其包括向所述靶向種群中釋放RNA引導(dǎo)的遺傳負(fù)荷驅(qū)動(dòng)。